CN101401815B - 海螵蛸多糖提取物cbp-s及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是从海螵蛸中制备的多糖提取物CBP-S及其用途。多糖提取物CBP-S的主要成分为CBP-S1和CBP-S2，其中，CBP-S1的单糖组成为：Rha:Fuc:Man:Glc:Gal:GlcN:GalN＝1:2.8:1:6.8:3.2:2.8:2.2，以β-1，4-Glc连接为主，而CBP-S2的单糖组分为：Rha:Fuc:Man:Glc:Gal:GlcN:GalN＝1:5.6:1:5.6:2.6:3.6:2.8，以β-1，4-Glc和1，3，4连接的岩藻糖为主。经动物实验，本发明海螵蛸多糖提取物CBP-S对急性胃粘膜损伤具有保护作用，因此可以制备保护胃黏膜的药物。

Description

海螵蛸多糖提取物CBP-S及其用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是从海洋生物海螵蛸中提取的一种多糖CBP-S及其用途。

背景技术

海螵蛸是海洋曼氏生物无针乌贼的内壳，为传统中药材。《本草纲目》记载海螵蛸具有各种收敛作用，可治多种内外出血，对胃溃疡及部分慢性胃炎等有效，可临床用于皮肤溃疡、褥疮等的治疗。它本身作为食品加工行业的废料，少数回收作为中药材，大部分都没有得到很好的利用，造成资源严重的浪费。关于其有效成分的报道不多，本发明人曾从海螵蛸中提取到一种多糖CPS-1并申请了专利(“海螵蛸多糖CPS-1及其制备方法和用途”，专利号200510110082.6)。但至今未见有关从海螵蛸中提取到多糖CBP-S的报道。

发明内容

本发明提供一种从海螵蛸中提取到的能防护胃黏膜急性损伤的多糖提取物，命名为CBP-S。经动物实验表明，海螵蛸多糖提取物CBP-S能减轻胃黏膜的急性损伤，具有保护胃黏膜细胞的作用。

本发明海螵蛸多糖提取物CBP-S的制备方法如下：

1.制备提取液：

将干品海螵蛸粉碎成粉末，按常规加水煮沸8-10小时，趁热抽滤得到滤液，浓缩滤液，离心弃沉淀，上清液用氯仿：正丁醇＝4：1的sevage法反复萃取至水相不含蛋白质，得提取液；

2.制备海螵蛸多糖提取物粗品：

浓缩上述提取液，加入等体积冰浴预冷的5％ TAC，混合液于冰浴下搅拌匀，将其装入3000D的透析袋流水透析2天，再用蒸馏水透析1天，以除去小分子杂质和盐类，浓缩后，加入三倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，室温静置过夜，次日，离心弃上清，将沉淀冷冻干燥，得海螵蛸多糖提取物粗品；

3.分离纯化，制备海螵蛸多糖提取物CBP-S：

将海螵蛸多糖提取物粗品热水浴中溶于适量蒸馏水，离心取上清，将沉淀再次热水浴中溶于蒸馏水，离心取上清，合并上清液，按常规上样于DEAE SepharoseF.F XK-50离子交换柱，依次用蒸馏水和0.5mol/L NaCl溶液洗脱，用部分自动接收仪分别收集蒸馏水和0.5mol/L NaCl溶液洗脱液，取0.5mol/L NaCl溶液洗脱液，用硫酸-苯酚法检测各收集管中洗脱液的多糖，以管号为横坐标，以分光光度计检测的OD值为纵坐标绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线，合并洗脱峰部分的洗脱液，减压浓缩，浓缩液用流水透析2天，再用蒸馏水透析1天，冷冻干燥，得海螵蛸多糖提取物CBP-S。

4.海螵蛸多糖提取物CBP-S的成分分析：

1)将上述海螵蛸多糖提取物CBP-S复溶于适量蒸馏水，离心弃沉淀，上清液上样于Sepharose CL-6B凝胶柱，用蒸馏水洗脱，用硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，方法同前，绘制的洗脱曲线有两个峰，分别合并两个峰的洗脱液，离心取上清，分别将上清液用HPLC进行纯度检测，确定为两种较纯的多糖组分，分别命名为CBP-S1和CBP-S2，洗脱液冷冻干燥后，得CBP-S1和CBP-S2干品；

2)将上述CBP-S1和CBP-S2干品分别复溶于适量蒸馏水，离心弃沉淀，上清液分别上样于Sepharcryl S-300凝胶柱进行进一步纯化，纯化至HPLC洗脱曲线为单一对称峰后，分别对CBP-S1和CBP-S2进行结构测定。

经过紫外(200-400nm)扫描、红外扫描、单糖组分测定(气相色谱)等检测手段，分别确定了CBP-S1和CBP-S2的结构单元，它们均有7种单糖组成，其中，CBP-S1各单糖及其之间的比例为：Rha:Fuc:Man:Glc:Gal:GlcN:GalN＝1:2.8:1:6.8:3.2:2.8:2.2，以β-1，4-Glc连接为主，而CBP-S2单糖之间的比例为：Rha:Fuc:Man:Glc:Gal:GlcN:GalN＝1:5.6:1:5.6:2.6:3.6:2.8，以β-1，4-Glc和1，3，4连接的岩藻糖为主。

上述测定结果说明，本发明海螵蛸多糖提取物CBP-S主要包含两种多糖成分CBP-S1和CBP-S2，CBP-S1和CBP-S2虽然由相同的单糖组成，但所含单糖的比例不同，因而具有不同的分子量。

动物实验表明，本发明海螵蛸多糖提取物CBP-S配成的溶液对小鼠进行灌胃给药后，能有效预防无水乙醇对小鼠胃黏膜细胞的损伤。因此本发明海螵蛸多糖提取物CBP-S可用于制备防护胃黏膜急性损伤的药物。

附图说明

图1为海螵蛸多糖提取物粗品的DEAE SepharoseF.F凝胶柱洗脱曲线

图2为海螵蛸多糖提取物CBP-S1的HPLC洗脱曲线

图3为海螵蛸多糖提取物CBP-S2的HPLC洗脱曲线

图4为海螵蛸多糖提取物CBP-S1糖醛酸还原前的气相分析图谱

图5为海螵蛸多糖提取物CBP-S1糖醛酸还原后的气相分析图谱

图6为海螵蛸多糖提取物CBP-S2糖醛酸还原前的气相分析图谱

图7为海螵蛸多糖提取物CBP-S2糖醛酸还原后的气相分析图谱

图8为海螵蛸多糖提取物CBP-S1红外光谱分析图谱

图9为海螵蛸多糖提取物CBP-S2红外光谱分析图谱

图10为无水乙醇诱导后用药和不用药小鼠胃黏膜损伤比较图

图11为无水乙醇诱导后用药和不用药小鼠溃疡指数比较图本

图12为无水乙醇诱导后用药和不用药小鼠溃胃黏膜HE染色组织学变化的比较图

图13为无水乙醇诱导后用药和不用药小鼠胃液pH影响的比较图

图14为无水乙醇诱导后用药和不用药小鼠胃黏膜中NO、GSH、SOD和MDA影响的比较图

具体实施方式

现结合附图和实施例，对本发明作详细描述。

1.材料

海螵蛸干品购于浙江舟山。

2.试剂

苯酚、硫酸、氯仿、乙醇(分析纯)，中国医药集团上海化学试剂公司产品。

硼氢化钠(NaBH4)、二甲亚砜(DMSO)、葡萄糖及Dextran系列葡聚糖标准品，SIGMA公司产品。

3.仪器

H-S电热恒温水浴锅，江苏东台电器厂产品。

旋转蒸发仪

 011型，瑞士

CHI公司产品。

BECKMAN CUOLTER J-251型高速离心机，BECKMAN CUOL TER公司产品。

DEAE Sepharose F.F填料、Sephacryl S-300填料、Sepharose CL-6B填料、自动部分收集仪，Pharmacia Biotech公司产品。

高效液相HP1100，Agilent公司产品。KS-804、KS-805柱，Agilent公司产品。

实施例1：制备海螵蛸多糖提取物CBP-S

(一)制备海螵蛸多糖提取物粗品

将750g海螵蛸干品粉碎后，加水2L煮10小时，趁热纱布过滤，残渣重复提取两次，合并3次提取液，用旋转蒸发仪浓缩至12L，5000rpm离心10分钟后弃沉淀。上清液用氯仿与正丁醇的体积比为4:1的sevage法萃取多次除蛋白，至水相不含蛋白质，浓缩提取液，加入等体积冰浴冷却后的5％(w/v)三氯乙酸(TAC)，于冰浴条件下用磁力搅拌器搅拌10分钟，装入3000D的透析袋中流水透析2天，再对蒸馏水透析1天以除去小分子杂质和盐类，每2小时更换蒸馏水一次。浓缩透析后溶液，加入三倍体积的95％乙醇(工业纯)，使乙醇的终浓度为75％，搅拌均匀，室温静置过夜。次日，8000rpm×10分钟离心收集沉淀，冷冻干燥后得到海螵蛸多糖提取物粗品1g，得率约为1.3‰。

(二)分离纯化，制备海螵蛸多糖提取物CBP-S

取海螵蛸多糖提取物粗品500mg，加入蒸馏水2.5ml，80℃水浴加热溶解30分钟，离心取上清，沉淀再加入蒸馏水2.5ml，80℃水浴加热溶解30分钟，离心取上清。合并两次上清，上样于DEAESepharose F.F柱，依次用蒸馏水和0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，用自动部分收集仪分别收集洗脱液，按常规用苯酚硫酸法(苯酚和硫酸的体积比为5：1，下同)进行显色反应，用分光光度计测OD值，以管号为横坐标，OD值为纵坐标，绘制洗脱曲线图，见图1，根据洗脱曲线，分别合并蒸馏水和0.5mol/L氯化钠溶液的含有多糖的洗脱液并浓缩之，流水透析2天，再对蒸馏水透析1天，冷冻干燥，得到蒸馏水洗脱部分海螵蛸多糖中性组分CBP-W和0.5mol/L氯化钠溶液洗脱部分海螵蛸多糖酸性组分CBP-S，冷冻干燥，得CBP-S干品53mg。

将上述所得的CBP-S以蒸馏水0.05g/ml的比例溶于蒸馏水，80℃水浴加热溶解10分钟，离心取上清，同法将沉淀复溶于蒸馏水，离心取上清，合并两次上清，上样于Sepharose CL-6B凝胶柱，用蒸馏水洗脱，洗脱速度为每小时10毫升，用自动部分收集仪收集洗脱液，用苯酚硫酸法进行显色反应并绘制洗脱曲线，方法同前，洗脱曲线出现两个峰，分别将两个峰各管洗脱液离心弃沉淀，上清按常规方法上样于HPLC进行纯度检测，将纯度单一的含糖洗脱液合并浓缩并冷冻干燥，分别得CBP-S1 22mg，CBP-S2 28mg。

海螵蛸多糖CBP-S1和CBP-S2的含糖量和表观分子量的测定：

CBP-S1和CBP-S2的进一步纯化：将上述所得的CBP-S1和CBP-S2分别以0.05g/ml的比例溶于蒸馏水，80℃水浴加热溶解10分钟，离心取上清，同法将沉淀复溶于蒸馏水，离心取上清，合并两次上清，上样于Sephacryl S-300分子凝胶柱进行分离纯化，用蒸馏水洗脱，洗脱速度为每小时10毫升，用自动部分收集仪收集洗脱液，用苯酚硫酸法进行显色反应并绘制洗脱曲线，方法同前，根据洗脱曲线合并含糖洗脱液，然后上样于HPLC，观察电脑生成的洗脱曲线，直到CBP-S1和CBP-S2经过HPLC检测的洗脱曲线各为单一对称峰，见图2和图3。分别合并CBP-S1和CBP-S2洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥得纯CBP-S1和CBP-S2。

1.用分光光度法测定海螵蛸多糖CBP-S1和CBP-S2的含糖量：

(1)标准曲线的绘制：先用标准葡萄糖配制成浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml的水溶液，然后使用苯酚硫酸法分别进行显色反应，再用分光光度计测定OD值，以糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)测定海螵蛸多糖提取物CBP-S1和CBP-S2的含糖量：将海螵蛸多糖提取物CBP-S1和CBP-S2分别配制成1mg/ml浓度的溶液，用苯酚硫酸法分别进行显色反应，然后用分光光度计测定OD值，对照葡萄糖标准曲线，得对应的糖浓度。计算出海螵蛸多糖CBP-S1和CBP-S2的含糖量分别为95.62％和93.45％。

2.用HPLC法来测定CBP-S1和CBP-S2的表观分子量：

(1)标准曲线的绘制：将Dextran T系列标准分子量分别为5000，10000，100000，400000，1000000的葡聚糖配制成2mg/ml水溶液，分别用0.45μm针式微孔滤膜过滤后依次进样于HPLC，测定保留时间。HPLC的色谱条件为：分离柱为KS-805、KS-804串联柱；流动相为水；VWD检测器检测波长为254nm；示差检测器(RID)检测池温度为40℃；分析时间为40分钟；进样体积为25μl。以保留时间为横坐标，标准葡聚糖的分子量为纵坐标，作标准曲线。

(2)测定海螵蛸多糖提取物CBP-S1和CBP-S2的表观分子量：将海螵蛸多糖提取物CBP-S1和CBP-S2分别配制成2mg/ml的水溶液，用0.45μm针式微孔滤膜过滤后进样于HPLC，测定保留时间。HPLC的色谱条件为：分离柱为KS-805、KS-804串联柱；流动相为水；VWD检测器检测波长为254nm；示差检测器(RID)检测池温度为40℃；分析时间为40分钟；进样体积为25μl。根据保留时间，对照标准曲线上可得CBP-S1和CBP-S2的表观分子量分别为360KD和87KD。

海螵蛸多糖CBP-S1和CBP-S2的结构测定

(一)单糖组分分析

气相色谱法测定单糖组分(GS)：

水解：分别取海螵蛸多糖提取物CBP-S1和CBP-S2 2mg，各置于10ml安瓿瓶中，分别加入3ml 2mol/L的三氟乙酸(TFA)充分溶解后，封口，置于121℃烘箱水解6小时，得水解液；

还原：分别在水解液中加入1-2ml甲醇，60℃旋转蒸干，重复3次以完全除去TFA。残留物中加100mg NaBH₄，并加2ml水，充分溶解，室温静置还原过夜，得还原液；

乙酰化：分别在还原液中滴加冰醋酸并不断摇晃，以除去多余的NaBH₄，无气泡生成时说明NaBH₄已反应完全，于旋转蒸发仪上浓缩至粘稠液体后，加入甲醇：乙酸＝5：1的混合液3-5ml，反复蒸2次，再用纯甲醇蒸3次，得白色粉末。放入烘箱105℃，15分钟，去除水分，加醋酸酐3ml，加热溶解并封口以防塞子爆出，置于烘箱101℃乙酰化1小时。

萃取：分别将CBP-S1和CBP-S2白色粉末置室温冷却，加甲苯，45℃蒸3-4次至无酸味，粉末加5ml氯仿移入60ml分液漏斗中，加水后混匀，水溶液用氯仿萃取3次，10ml/次，合并氯仿层，加蒸馏水洗氯仿层3次，5ml/次，氯仿层加无水硫酸钠除残余水分，浓缩氯仿层至适量(约0.5ml)装于液相小瓶用于GC分析。CBP-S1还原前后的分析结果见图4和图5；CBP-S2还原前后的分析结果见图6和图7，由图4-7看出，CBP-S1和CBP-S2均有7种单糖组分。它们的比例分别为CBP-S1为Rha:Fuc:Man:Glc:Gal:Gl cN:GalN＝1:2.8:1:6.8:3.2:2.8:2.2；CBP-S2为Rha:Fuc:Man:Glc:Gal:GlcN:GalN＝1:5.6:1:5.6:2.6:3.6:2.8

(二)糖醛酸含量检测

标准曲线绘制：取6个洁净的大试管，分别移取25μl，35μl，60μl，70μl，100μl，125μl葡萄醛酸标准液(15mg/25ml)，补水至250μl，冰浴冷却后，加入1.4ml浓硫酸，摇匀，置85℃水浴中保温20分钟，取出，冷却至室温后加入50μl0.1％咔唑，室温放置2小时后，于530nm处测定OD值，以标准葡萄糖醛酸含量为横坐标，以530nm OD值为纵坐标绘制标准曲线。

准确称取样品CBP-S1和CBP-S2分别为1.86mg和1.61mg，均配成10ml溶液，于10ml带塞试管中加入250μl多糖样品溶液，冰浴冷却，加1.4ml浓硫酸，摇匀后放冷至室温，加50μl 0.1％咔唑溶液，混匀后室温静置2小时，同上法于530nm处测定吸光度值。根据上述绘制的浓度-吸光度标准曲线，由样品OD值推算样品的糖醛酸含量，计算得到CBP-S1和CBP-S2的糖醛酸含量分别为19.31％和21.37％。

(三)甲基化分析

基本原理：先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进而将多糖中的糖苷键水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。多糖甲基化完全后，水解成各种部分甲基化单糖，再经还原、乙酰化、气相分析或气相-质谱联用分析。

步骤与方法：称取糖醛酸还原后冷冻干燥的海螵蛸多糖样品40mg于50ml小锥形瓶中，经P₂O₅充分干燥过夜，加5-10ml无水DMSO搅拌溶解，再加200mgNaOH粉末搅拌反应30分钟。用1ml注射器慢慢逐滴滴加1mlCH₃I，约30分钟内加完，待CH₃I完全加入后，放在磁力搅拌器上反应2小时。反应完毕后加水2ml终止反应，将溶液转入透析袋中，自来水透析除NaOH、DMSO，约4天后将样品液重新冷冻干燥，重复以上操作5次。将冻干后的样品用10ml氯仿溶解，转入分液漏斗，水洗氯仿3次，氯仿层蒸干为完全甲基化多糖。

甲基化样品加5ml 90％甲酸100℃水解反应6小时，加压蒸干，再加入2-3ml甲醇，蒸干三次。残留物用4ml 2mol/L TFA溶解，转入10ml安瓿瓶，封口，110℃烘箱中水解反应2小时，取出，减压蒸干，再加1-3ml甲醇蒸干三次，残余物加入100mgNaBH₄和3ml水，室温还原反应过夜。加入冰醋酸反应除去过量的NaBH₄，于旋转蒸发仪浓缩至粘稠液体，加入甲醇：冰醋酸(5：1)3-5ml，蒸干三次，再加甲醇蒸干两次，得白色粉末。放入烘箱105℃、15分钟除去水分，加入3ml乙酸酐，101℃烘箱中乙酰化反应1小时，取出，加甲苯50℃水浴加压蒸干至粉末状。用5ml水将粉末状物溶解后转至60ml分液漏斗中，再用10ml氯仿萃取三次，合并氯仿，用5ml水洗三次，分出氯仿层，用无水硫酸钠干燥浓缩至0.5ml，用于GC-MS检测分析。

(四)红外光谱(IR)检测

经P₂O₅干燥过夜的海螵蛸多糖CBP-S1和CBP-S2样品和其甲基化后的样品各1mg，分别与KBr压片，BrukerVerctor22红外光谱仪常规检测。结果见图8和图9。

海螵蛸多糖提取物CBP-S对小鼠急性胃黏膜损伤保护的试验

1.材料

海螵蛸多糖提取物CBP-S由实施例1制得。

雄性KM小鼠，体重19±2g，购自第二军医大学实验动物中心。动物饲养于22±3℃，相对湿度50％的环境中(下同)。

2.试剂

试剂：法莫替丁注射液，上海信宜金朱药业有限公司产品，批号

050901；无水乙醇(分析纯)，上海振兴化工一厂产品，批号：

200508356；甲醛溶液：上海太平洋化工(集团)公司产品，批号

GB685-93；SOD，MDA，NO，GSH，GPT和GOT试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

3.仪器

酶标仪Versa Max(Molecular Devices)

H-S电热恒温水浴锅(江苏东台电器厂)

Bechman coulter J-251型高速离心机(Bechman)

722S型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司产品)

4.实验方法及结果

4.1急性毒性实验

急性毒性实验按照Lima ZP等方法，CBP-S低、中、高三个剂量组，将CBP-S用生理盐水配制成相应浓度的溶液，使每只每天按体重0.1ml/10g灌胃给药，低、中、高三个剂量组的给药剂量分别为按体重100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg，每组小鼠12只在灌胃给药后30、60、120、240和360分钟时，仔细观察各组动物的活动情况。在7天的实验时间内，记录各组动物的体重，观察其出现的任何不良症状或死亡。动物处死前，分别收集正常组和CBP-S各剂量组的动物血液，测定上清中的谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活性，结果见表1。

表1CBP-S对小鼠GOT和GPT活性影响

 

正常对照

100mg/kg(3d)

200mg/kg(3d)

400mg/kg(3d)

100mg/kg(5d)

200mg/kg(5d)

400mg/kg(5d)

GOT(U/L)

9.96±0.47

9.45±0.25

10.12±1.72

9.50±0.47

9.43±0.16

9.51±0.85

9.67±0.42

GPT(U/L)

6.23±0.24

5.70±0.50

5.60±1.36

5.78±0.87

6.09±0.55

6.00±0.52

5.70±0.48

由表1可见，CBP-S各剂量组的小鼠在实验7天时间内，未见体重减轻或任何不良生理状态。血清中的谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的含量较正常组没有显著改变(p>0.05)。

4.2无水乙醇诱导的小鼠胃黏膜损伤实验

将KM小鼠随机分为6组，每组10只，即正常组对照组、造模对照组、阳性药对照组和CBP-S低、中、高三个剂量组。阳性药为法莫替丁。

1)正常组对照组，每只每天用0.2ml生理盐水灌胃一次，于第3天和第5天，按体重0.1ml/10g用生理盐水灌胃，禁食禁水2h之后处死；

2)造模对照组，每只每天用0.2ml生理盐水灌胃一次，于第3天和第5天，各用无水乙醇灌胃一次，剂量为按体重0.1ml/10g，禁食禁水2h之后处死；

3)阳性药对照组，用生理盐水将法莫替丁配制成浓度为5mg/ml的溶液，每只每天分别灌胃给药，剂量为按体重0.1ml/10g，分别于第3天和第5天各用无水乙醇灌胃一次，剂量为按体重0.1ml/10g，禁食禁水2h之后处死；

4)CBP-S低、中、高三个剂量组，将CBP-S用生理盐水配制成相应浓度的溶液，使每只每天按体重0.1ml/10g灌胃给药时，低、中、高三个剂量组的给药剂量分别为按体重100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg，分别于第3天和第5天用无水乙醇各灌胃一次，剂量为按体重0.1ml/10g，禁食禁水2h之后处死。

各组小鼠脱臼处死后，先向胃中注入0.5ml10％甲醛溶液，并将整个胃取出，置于10％甲醛溶液中，5min后沿胃大弯剪开，置于盛有10％甲醛溶液的培养皿中，展开，10×显微镜观察。图像积分法计算：充血或出血，记1分；坏死或伤及粘膜肌层，记1.5分。用PHOTOSHOP7.0网格计数的方法，大于半格计为一格。由三个不同的人分别计数，数据以mean±SD表示。按以下公式得到溃疡指数(UI)：

结果：无水乙醇诱导后，造模组胃黏膜出现充血和出血，部分区域伤及胃黏膜下层，见图10A；CBP-S低剂量组给药3天组虽然表面仍有不同程度的损伤，但是黏膜损伤的区域较造模组有明显的减少，见图10B；CBP-S中剂量组给药3天，虽然黏膜损伤区域较造模组没有差异，但是损伤仅是表面的充血和出血，没有出现明显的细胞损伤，见图10C；CBP-S高剂量组给药3天，黏膜损伤进一步减轻，不仅没有细胞损伤，而且充血和出血的区域也较造模组显著减轻，见图10D。图10E为法莫替丁给药3天，未见明显的出血和损伤。CBP-S低剂量组给药5天的胃黏膜损伤程度比给药3天的损伤程度轻，虽然还有少量的黏膜细胞损伤，但是损伤区域显著减少，见图10F。同样CBP-S中、高剂量组给药5天也较给药3天的损伤程度轻，见图10G和图10H，而且CBP-S高剂量组给药5天几乎观察不到出血或损伤。可见CBP-S对胃黏膜损伤具有防护作用，且有剂量依赖性。

溃疡指数(UI)用来表示胃黏膜损伤程度，结果见图11。CBP-S低、中、高剂量组给药3天的UI依给药剂量的增加而减少(P<0.05)，溃疡指数从33.71％到9.01％，给药5天从20.72％到2.06％(P<0.05)。高剂量组的UI接近阳性药组，而高剂量给药5天的UI接近正常对照组。进一步说明了CBP-S对胃黏膜损伤具有防护作用，且有剂量依赖性。

4.3实验小鼠胃溃疡组织HE染色

同上分组，KM小鼠脱臼处死，打开腹腔，向胃内注入10％福尔马林溶液，取出胃，浸泡于10％福尔马林溶液，10min后取出，沿胃大弯剪开，置于盛有10％福尔马林溶液的小培养皿中，取相同部位1×0.5×0.5cm的黏膜组织，石蜡包埋后进行HE染色。染色后的切片于10倍显微镜下观察。

结果造模对照组的胃黏膜上皮及腺体变性，局部黏膜出血坏死，黏膜细胞脱落，间质少数淋巴、中性粒细胞浸润，肌层细胞破裂，见图12A。

CBP-S低剂量组给药3天的小鼠胃局部黏膜上皮及腺体有变性坏死及部分脱落，但是较造模对照组黏膜细胞脱落数量显著减少，间质及黏膜下血管轻度充血，淋巴，中性粒细胞及嗜酸性粒细胞侵润程度减轻，而且黏膜和肌层细胞之间出现空泡的数量和体积都显著减少，见图12B，CBP-S低、中剂量组给药5天的黏膜上皮及腺体无明显异常，部分胃黏膜上皮及腺体层次增多，间质及黏膜系少数淋巴，及个别中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润。CBP-S低剂量组给药5天，淋巴细胞和中性粒细胞浸润程度较给药3天的有所减轻，结果见图12C。CBP-S中剂量组的各种炎症细胞数量明显减少，而且黏膜细胞基本完整，能更显著地保护细胞的形态，见图12D。结果表明CBP-S对急性胃黏膜损伤具有防护作用。

4.4实验小鼠胃酸pH值测定

同上分组，KM小鼠脱臼处死，在胃贲门处剪一个小口，将胃内容物置于离心管中，3500rpm×10min，取上清，加入9倍体积的双蒸水，用含有1％酚酞的0.1mol/L NaOH滴定，测定其pH值。

胃酸的pH用mean±S.E.M来表示，结果见图13。造模对照组的小鼠于第3天和第5天无水乙醇灌胃后，胃酸的pH值分别下降至2.72±0.26和2.80±0.08，而CBP-S低、中、高剂量组的小鼠无水乙醇灌胃后，均能显著提高其pH值(p<0.05)。CBP-S高剂量组的小鼠胃酸的pH值上升较明显，且接近阳性药对照组。但是，CBP-S各剂量组第3天和第5天胃酸的pH值变化不大。

4.5实验小鼠胃粘膜NO、GSH、SOD和MDA测定

将上述实验小鼠胃内容物排空后用pH7.4PBS冲洗3次，用小刀刮取胃粘膜组织，样品置于-70℃冰箱保存。测试时，样品用PBS按照试剂盒的要求，分别配制成1％及10％的组织匀浆。用NO、GSH、SOD和MDA的检测试剂盒进行测定，结果见图14。

1)MDA测定结果

以分组为横坐标，以MDA含量为纵坐标作图，见图14A，造模对照组小鼠胃黏膜的MDA含量显著上升，CBP-S低、中剂量组给药3天，没有明显降低胃黏膜组织中的MDA含量(P>0.05)。而CBP-S高剂量组给药3天的胃黏膜的MDA含量较造模对照组显著下降(P<0.05)。CBP-S各剂量组给药5天，小鼠胃黏膜中的MDA均显著下降，而各剂量组之间MDA含量没有差异。CBP-S低、中剂量组给药3天和5天的MDA含量无显著差异。

2)SOD测定结果

以分组为横坐标，以SOD活性为纵坐标作图，见图14B，不同剂量CBP-S给药后，小鼠胃黏膜的SOD活性均有显著地上升。在给药3天的时候，CBP-S低剂量组的SOD活性较造模对照组显著提高，活性接近正常对照组。而CBP-S中、高剂量组的SOD活性更是超过正常对照组，且该两组之间没有差异。给药5天后，低、中、高剂量组的SOD活性没有差异，且均超过正常对照组。

3)NO测定结果

以分组为横坐标，以NO含量为纵坐标作图，见图14C，造模组小鼠胃黏膜中的NO含量显著降低，虽然给药3天和5天的CBP-S低剂量组小鼠胃黏膜中NO的含量较造模对照组没有显著差异(P>0.05)，但是CBP-S中、高剂量组均能有效地提高黏膜NO的含量(P<0.05)，而且这两个剂量组的黏膜NO含量相近。

4)GSH测定结果

以分组为横坐标，以GSH含量为纵坐标作图，见图14D，在造模对照组中，GSH的含量较正常对照组显著降低，而CBP-S中、高剂量组给药3天均能显著提高GSH的含量。给药5天，CBP-S低、中、高剂量组的GSH含量升高。低、中剂量组GSH的含量接近正常对照组，用高剂量组则高于正常对照组(P<0.05)。

综上所述，CBP-S能显著提高无水乙醇诱导的胃黏膜损伤小鼠的胃黏膜组织中NO和GSH的含量，提高SOD的活性，降低MDA的含量。

本发明制备方法简单，海螵蛸多糖提取物CBP-S对无水乙醇诱导的小鼠胃黏膜细胞损伤具有防护作用，因此本发明海螵蛸多糖提取物CBP-S可用于制备防护急性胃黏膜损伤的药物。

Claims (2)

1.一种海螵蛸多糖提取物CBP-S在制备防护急性胃黏膜损伤药物中的应用，海螵蛸多糖提取物CBP-S的制备方法如下：

1)制备提取液：

将干品海螵蛸粉碎成粉末，按常规加水煮沸8-10小时，趁热抽滤得到滤液，浓缩滤液，离心弃沉淀，上清液用氯仿∶正丁醇＝4∶1的sevage法反复萃取至水相不含蛋白质，得提取液；

2)制备海螵蛸多糖粗品：

浓缩上述提取液，加入等体积冰浴预冷的5％TAC，于冰浴下搅匀，将其装入3000D的透析袋流水透析2天，再用蒸馏水透析1天，以除去小分子杂质和盐类，浓缩后，加入三倍体积的95％乙醇，搅拌均匀，室温静置过夜，次日，离心弃上清，将沉淀冷冻干燥，得海螵蛸多糖提取物粗品；

3)分离纯化：

将海螵蛸多糖提取物粗品热水浴中溶于适量蒸馏水，离心取上清，将沉淀再次热水浴中溶于蒸馏水，离心取上清，合并上清液，按常规上样于DEAE SepharoseF.F XK-50离子交换柱，依次用蒸馏水和0.5mol/LNaCl溶液洗脱，用部分自动接收仪分别收集蒸馏水和0.5mol/L NaCl溶液洗脱液，取0.5mol/L NaCl溶液洗脱液，用硫酸-苯酚法检测各收集管中洗脱液的多糖含量，以管号为横坐标，以分光光度计检测的OD值为纵坐标绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线，合并洗脱峰部分的洗脱液，减压浓缩，浓缩液用流水透析2天，再用蒸馏水透析1天，冷冻干燥，得海螵蛸多糖提取物CBP-S。

2.按权利要求1所述的海螵蛸多糖提取物CBP-S在制备防护急性胃黏膜损伤药物中的应用，其特征在于多糖提取物CBP-S的主要成分为CBP-S1和CBP-S2，其中，CBP-S1的单糖组成为：Rha∶Fuc∶Man∶Glu∶Gla∶GluN∶GalN＝1∶2.8∶1∶6.8∶3.2∶2.8∶2.2，以β-1，4-Glc连接为主，而CBP-S2的单糖组分为：Rha∶Fuc∶Man∶Glu∶Gla∶GluN∶GalN＝1∶5.6∶1∶5.6∶2.6∶3.6∶2.8，以β-1，4-Glc和1，3，4连接的岩藻糖为主。

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