CN1837243A - 海螵蛸多糖cps－1及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是从海螵蛸中提取的多糖CPS－1及其制备方法和用途。制法为：将海螵蛸粉末水煮得提取液；将提取液醇沉，透析，冷冻干燥，得海螵蛸多糖粗品；再依次用DEAESepharose F.F离子交换柱、Sephacryl S－300分子凝胶柱、Sepharose CL－6B凝胶柱分离纯化，得本发明海螵蛸多糖CPS－1。经动物实验，本发明多糖CPS－1具有治疗溃疡性结肠炎的作用，因此可用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是从海螵蛸中提取的多糖CPS-1及其制备方法和用途。
背景技术
海螵蛸，又名乌贼骨，是海洋动物金乌贼、针乌贼或无针乌贼的内壳，为传统中药材。其性咸、涩、温，有收敛止血、涩精止带、制酸、敛疮等作用，应用广泛。它本身作为食品加工行业的废料，少数回收作为中药材，大部分都没有得到很好的利用。海螵蛸往往与其他中药配伍在临床用于治疗各种溃疡，具有很好的疗效。但其有效成分至今未确定，也未见有关多糖成分的报道。
发明内容
本发明从海螵蛸中提取到一种具有抗溃疡作用的海螵蛸多糖，命名为CPS-1。经过建立小鼠实验性溃疡性结肠炎动物模型，发现海螵蛸多糖CPS-1具有加速溃疡组织愈合、保护肠组织的作用。因此可用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
本发明海螵蛸多糖CPS-1的制备方法如下：
1.制备水提取物溶液：将海螵蛸固体粉碎成粉末，加水煮沸8-10小时，趁热抽滤得到滤液，将滤液浓缩，离心弃沉淀。上清液用氯仿与正丁醇的体积比为4∶1的sevage法萃取多次除蛋白，至水相不含蛋白质，得到水提取物溶液。
2.制备海螵蛸多糖粗品：将上述提取物溶液加乙醇沉淀过夜，离心弃上清，将沉淀复溶于蒸馏水，离心去不溶物，将上清再次醇沉，离心去上清。沉淀加蒸馏水溶解，流水透析至少36小时。将透析液冷冻干燥，得海螵蛸多糖粗品。
3.分离纯化，制备海螵蛸多糖CPS-1：将所得海螵蛸多糖粗品热水浴中溶于蒸馏水，离心收集上清，将不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀。将两次上清液合并，上样于DEAE Sepharose F.F离子交换柱，依次用蒸馏水、0.3mol/L氯化钠溶液进行洗脱，并用自动部分收集仪将洗脱液依次收集于试管中。使用体积比5∶1的硫酸-苯酚法分别对各个试管中的洗脱液取样进行显色反应，然后用分光光度计测480nm处OD值。依次以管号为横坐标，OD值为纵坐标，作洗脱曲线。根据洗脱曲线，将氯化钠溶液洗脱峰部位的洗脱液合并并且浓缩之，流水透析至少36小时，冷冻干燥，得淡黄色固体。将淡黄色固体复溶于蒸馏水，用同样方法依次上样于SephacrylS-300分子凝胶柱和Sepharose CL-6B凝胶柱进行分离纯化，合并洗脱峰的洗脱液，然后用HPLC检测其纯度，如果HPLC洗脱曲线呈单一对称峰，就说明该洗脱液纯度达标；如果不是呈单一对称峰，则将洗脱液浓缩后，再次用同样的方法上样于Sephacryl S-300分子凝胶柱和Sepharose CL-6B凝胶柱进行分离纯化，直到HPLC的洗脱曲线为单一对称峰，再将该洗脱液浓缩后冷冻干燥，即得本发明海螵蛸多糖CPS-1。
动物实验是将海螵蛸多糖CPS-1配制成注射液，腹腔注射于患有溃疡性结肠炎的小鼠，具有明显的治疗作用。因此本发明海螵蛸多糖CPS-1可用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
附图说明
图1为海螵蛸多糖粗品经DEAE Sepharose F.F凝胶柱的洗脱曲线
图2为洗脱液纯化后呈现单一对称峰的HPLC洗脱曲线
图3为本发明海螵蛸多糖CPS-1对各组小鼠血清中EGF、PDGF、TNF-a的含量影响
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作详细描述。
1.材料
海螵蛸干品购于浙江舟山
2.试剂
苯酚、硫酸、氯仿、乙醇(分析纯)(中国医药集团上海化学试剂公司)
硼氢化钠(NaBH4)二甲亚砜(DMSO)，葡萄糖及Dextran系列葡聚糖标准品(SlGMA公司)
3.仪器
H-S电热恒温水浴锅(江苏东台电器厂)
旋转蒸发仪BCHI 011型(瑞士BCHI公司)
BECKMAN COULTER J-251型高速离心机(BECKMAN COULTER公司)
DEAE Sepharose F.F填料，Sephacryl S-300填料，Sepharose
CL-6B填料，自动部分收集仪(Pharmacia Biotech公司)
高效液相H P1100(Agilent公司)KS-804、KS-805柱(Agilent公司)
实施例1：制备海螵蛸多糖CPS-1
(一)制备海螵蛸多糖粗品
将5kg海螵蛸粉碎3分钟，加水16L煮10个小时，趁热纱布过滤，残渣重复提取两次，合并3次水提液，用旋转蒸发仪浓缩至12L，5000rpm离心10分钟后弃沉淀。上清液用氯仿与正丁醇的体积比为4∶1的sevage法萃取3次除蛋白，至水相不含蛋白质，然后加入3倍体积量乙醇醇沉过夜。离心弃上清，将沉淀复溶于蒸馏水，再5000rpm离心10分钟，弃去不溶物，上清用乙醇第二次醇沉，离心去上清，沉淀用蒸馏水溶解，流水透析36小时。透析液冷冻干燥，得到海螵蛸多糖粗品10g。
(二)分离纯化，制备海螵蛸多糖CPS-1
取海螵蛸多糖粗品1g，加入蒸馏水5ml，80℃水浴加热溶解30分钟，离心取上清，不溶物再加入蒸馏水5ml，80℃水浴加热溶解30分钟，离心取上清。合并两次上清，上样于DEAE Sepharose F.F柱，依次用蒸馏水、0.3mol/L氯化钠溶液洗脱，用自动部分收集仪收集洗脱液于试管中，用体积比5∶1的硫酸-苯酚法分别对各试管中的洗脱液取样进行显色反应，用分光光度计测480nm处OD值，以管号为横坐标，OD值为纵坐标，绘制洗脱曲线图见图1，根据洗脱曲线合并0.3mol/L氯化钠溶液洗脱峰部位的洗脱液并浓缩之，流水透析48小时，冷冻干燥，得淡黄色固体0.78g。
将上述淡黄色固体0.5g溶于3ml蒸馏水，上样于SephacrylS-300分子凝胶柱，蒸馏水洗脱。同法用自动部分收集仪收集洗脱液，用体积比5∶1的硫酸-苯酚法进行显色反应，用分光光度计测480nm处OD值，以管号为横坐标，OD值为纵坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线合并洗脱峰部位的洗脱液，取样用HPLC检测其纯度，观察电脑生成的洗脱曲线，见其不是单一对称峰，说明纯度不够，故将洗脱液浓缩后，用同样的方法上样于Sepharose CL-6B凝胶柱进行分离纯化，合并洗脱峰部位的洗脱液，经HPLC检测洗脱曲线为单一对称峰，见图2，表明该洗脱液纯度好，于是将洗脱液浓缩后冷冻干燥，得本发明海螵蛸多糖CPS-1 100mg。
(三)检测海螵蛸多糖CPS-1含糖量和表观分子量
1.用分光光度法测定海螵蛸多糖CPS-1含糖量：
(1)标准曲线的绘制：先用标准葡萄糖配制成浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml的水溶液，然后使用体积比5∶1的硫酸-苯酚法分别进行显色反应，再用分光光度法来测定480nm处OD值，以糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)测定海螵蛸多糖CPS-1的含糖量：将海螵蛸多糖CPS-1配制成1mg/ml浓度的溶液，用体积比5∶1的硫酸-苯酚法进行显色反应，然后用分光光度计测定480nm处OD值，对照葡萄糖标准曲线，得对应的糖浓度。计算可得海螵蛸多糖CPS-1的含糖量为96.6％。
2.用HPLC法来测定CPS-1表观分子量：
(1)标准曲线的绘制：将Dextran T系列标准分子量分别为5000，10000，100000，400000，1000000的葡聚糖配制成2mg/ml水溶液，分别用0.45μm针式微孔滤膜过滤后依次进样于HPLC，测定保留时间。HPLC的色谱条件为：分离柱为KS-805，KS-804串联柱；流动相为水；VWD检测器检测波长为254nm；示差检测器(RID)检测池温度为40℃；分析时间为40分钟；进样体积为25μl。以保留时间为横坐标，标准葡聚糖的分子量为纵坐标，作标准曲线。
(2)测定海螵蛸多糖CPS-1的表观分子量：将海螵蛸多糖CPS-1配制成2mg/ml的水溶液，用0.45μm针式微孔滤膜过滤后进样于HPLC，测定保留时间。HPLC的色谱条件同上。根据保留时间，对照上述标准曲线，其表观分子量为1.1×105道尔顿。
实施例2：制备海螵蛸多糖CPS-1
将5kg海螵蛸粉碎5分钟，加水12L煮9个小时，趁热纱布过滤，残渣重复提取两次，合并3次水提液，用旋转蒸发仪浓缩至12L，5000rpm离心10分钟后弃沉淀。上清液用氯仿与正丁醇的体积比为4∶1的sevage法萃取3次除蛋白，至水相不含蛋白质，然后加入3倍体积量的乙醇醇沉过夜。离心弃上清，将沉淀复溶于蒸馏水，再5000rpm离心10分钟，弃去不溶物，上清用乙醇第二次醇沉，离心去上清，沉淀用蒸馏水溶解，流水透析40小时。透析液冷冻干燥，得到海螵蛸多糖粗品9g。
分离纯化及测定海螵蛸多糖CPS-1的含糖量和表观分子量的方法同实施例1。计算得海螵蛸多糖CPS-1的含糖量为95.7％，其表观分子量为1.1×105道尔顿。
实施例3：制备海螵蛸多糖CPS-1
将5kg海螵蛸粉碎8分钟，加水14L煮14个小时，趁热纱布过滤，残渣重复提取两次，合并3次水提液，用旋转蒸发仪浓缩至12L，5000rpm离心10分钟后弃沉淀。上清液用氯仿与正丁醇的体积比为4∶1的sevage法萃取3次除蛋白，至水相不含蛋白质，然后加入3倍体积量的乙醇醇沉过夜。离心弃上清，将沉淀复溶于蒸馏水，再5000rpm离心10分钟，弃去不溶物，上清用乙醇第二次醇沉，离心去上清，沉淀用蒸馏水溶解，流水透析48小时。透析液冷冻干燥，得到海螵蛸多糖粗品12g。
分离纯化及测定海螵蛸多糖CPS-1的含糖量和表观分子量的方法同实施例1。计算得海螵蛸多糖CPS-1的含糖量为98.5％，其表观分子量为1.1×105道尔顿。
实施例4：海螵蛸多糖CPS-1对小鼠溃疡性结肠炎的治疗试验
1材料
海螵蛸多糖CPS-1由实施例1制得。
BALA/C小鼠购于第二军医大学实验动物中心供，9周龄，体重为25±2.2g。
2试剂
葡聚糖硫酸钠(DSS)(Sigma公司，相对分子质量5000)
小鼠EGF ELISA检测试剂盒(上海西唐生物公司)
小鼠TNF-a ELISA检测试剂盒(上海西唐生物公司)
小鼠PDGF ELISA检测试剂盒(上海西唐生物公司)
3仪器
BIO-RAD 680型酶标仪(BIO-RAD公司)
BECKMAN台式高速离心机(BECKMAN公司)
4.实验方法及结果
4.1小鼠溃疡性结肠炎治疗模型的建立
30只BALA/C小鼠随机分为5组，每组6只，分别为空白组，阳性对照组，阴性对照组，CPS-1低浓度组和CPS-1高浓度组。除空白组正常饲养外，其余每组小鼠自由饮用5％的DSS水溶液诱导溃疡性结肠炎，饮用共7天，即建成急性溃疡性结肠炎模型。从饮用S％DSS水溶液第3天开始，阳性对照组的小鼠每天注射0.1ml溃疡性结肠炎治疗药物复方磺胺水溶液，浓度为2.5mg/ml；CPS-1低浓度组每天注射0.1ml浓度为2mg/ml的海螵蛸多糖CPS-1水溶液；CPS-1高浓度组每天注射0.1ml浓度为5mg/ml的海螵蛸多糖CPS-1水溶液；阴性对照组则每天注射0.1ml生理盐水。
4.2实验小鼠的动物及细胞水平观察
4.2.1实验小鼠一般情况的观察
实验小鼠在饮用5％DSS溶液第2天起，每天分别作大便隐血检测，并观察腹泻及肉眼血便情况。记录造模前后实验小鼠体重的变化，各组平均值见表1：
| 组别 | 模型前体重(g) | 模型后体重(g) |
| 空白阳性对照阴性对照CPS-1(低浓度)CPS-1(高浓度) | 25.21±0.5624.86±0.3725.62±0.1324.79±0.5925.53±0.22 | 35.15±0.2330.84±0.8524.47±0.6323.57±0.7633.11±0.74 |
表1造模前后小鼠体重变化(平均体重±SD)
由表1可见，海螵蛸多糖CPS-1高浓度治疗组小鼠的体重与空白对照组接近，比阳性对照组略重，明显高于阴性对照组，说明海螵蛸多糖CPS-1对实验小鼠的溃疡性结肠炎具有治疗作用。
4.2.2实验小鼠实体显微镜检查
饮用5％DSS水溶液7天后，第8天将每组小鼠用颈椎脱臼法处死。打开腹腔，分离出全结肠，置于D-hank’s液中。沿肠系膜附着部剪开肠壁，肠内容物冲洗干净后在滤纸上将肠壁展开，甲苯胺蓝染色后置实体显微镜下观察肠粘膜的改变。实体显微镜下可见阴性对照组实验小鼠的肠粘膜广泛充血、水肿，局部有糜烂、出血，并可找到明显的溃疡灶，尤其以下半段结肠显著。阳性对照组、CPS-1低剂量组实验小鼠的肠粘膜溃烂程度不高，明显的溃疡灶并不发生在组内每只动物身上。而空白组和CPS-1高剂量组实验小鼠的肠粘膜轻微溃烂，偶尔有明显的溃疡灶出现。由此可见，海螵蛸多糖CPS-1对实验小鼠的溃疡性结肠炎具有明显的治疗作用，而且海螵蛸多糖CPS-1浓度越大，治疗效果越好。
4.4实验小鼠血中细胞因子含量的检测比较
4.4.1实验小鼠血标本的制备：每组实验小鼠进行眼眶取血0.2ml，加入肝素钠抗凝，5000rpm离心15分钟后，弃沉淀并得到血清。分别标记序号备用。
4.4.2实验小鼠血中EGF、TNF-a、PDGF含量的测定：使用小鼠ELISA试剂盒对血清样品中的EGF、TNF-a、PDGF含量进行定量检测。酶标仪读板后结果对照试剂盒中提供的标准曲线分别计算出每种细胞因子的含量，并用统计学方法进行误差分析和显著性差异分析。最后将结果用EXCEL软件作图见图3。
由图3可见，海螵蛸多糖CPS-1能够明显的提高实验小鼠血液中EGF和PDGF的表达水平，而TNF-a的表达水平却有所下降。EGF表达的增加，有助于溃疡组织的愈合，PDGF同样对溃疡组织的修复起到积极作用，而TNF-a的表达水平一直是溃疡组织炎症程度的标志性细胞因子。因此，海螵蛸多糖CPS-1能够对溃疡组织的愈合起到积极作用，一方面促进EGF和PDGF的表达，加快细胞修复过程，另一方面，抑制TNF-a的表达，从而缓解炎症。
本发明制备方法简单，上述实验证实了海螵蛸多糖CPS-1对实验小鼠的溃疡性结肠炎具有显著的治疗作用，因此本发明海螵蛸多糖CPS-1可用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。
Claims (3)
1、海螵蛸多糖CPS-1的制备方法，步骤如下：
(1)制备水提取物溶液：将海螵蛸固体粉碎成粉末，加水煮沸8-10小时，趁热抽滤得到滤液，将滤液浓缩，离心弃沉淀；上清液用氯仿与正丁醇的体积比为4∶1的sevage法萃取多次除蛋白，至水相不含蛋白质，得到水提取物溶液；
(2)制备海螵蛸多糖粗品：将上述提取物溶液加乙醇沉淀过夜，离心弃上清，将沉淀复溶于蒸馏水，离心去不溶物，将上清再次醇沉，离心去上清；沉淀加蒸馏水溶解，流水透析至少36小时；将透析液冷冻干燥，得海螵蛸多糖粗品；
(3)分离纯化，制备海螵蛸多糖CPS-1：将所得海螵蛸多糖粗品热水浴中溶于蒸馏水，离心收集上清，将不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀，将两次上清液合并，上样于DEAE SepharoseF.F离子交换柱，依次用蒸馏水、0.3mol/L氯化钠溶液进行洗脱，并用自动部分收集仪将洗脱液依次收集于试管中；使用体积比5∶1的硫酸-苯酚法分别对各个试管中的洗脱液取样进行显色反应，然后用分光光度计测480nm处OD值；依次以管号为横坐标，OD值为纵坐标，作洗脱曲线；根据洗脱曲线，将氯化钠溶液洗脱峰部位的洗脱液合并并且浓缩之，流水透析至少36小时，冷冻干燥，得淡黄色固体；将淡黄色固体复溶于蒸馏水，用同样方法依次上样于SephacrylS-300分子凝胶柱和Sepharose CL-6B凝胶柱进行分离纯化，合并洗脱峰部位的洗脱液，然后取样用HPLC检测纯度，观察电脑生成的洗脱曲线，若为单一对称峰，表明纯度好，如果不是单一对称峰，则将洗脱液浓缩后，再次用Sephacryl S-300分子凝胶柱和SepharoseCL-6B凝胶柱进行分离纯化，直到HPLC的洗脱曲线为单一对称峰；再将该洗脱液浓缩后冷冻干燥，即得本发明海螵蛸多糖CPS-1。
2、权利要求1所述方法制备的海螵蛸多糖CPS-1。
3、权利要求2所述海螵蛸多糖CPS-1在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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