CN107890475A - 淫羊藿提取物的制备方法与制得的提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及淫羊藿提取物的制备方法与制得的提取物。本发明将水煎提取获得的淫羊藿药液经过大孔吸附树脂和工业色谱(DAC250)分离纯化。经检测，该方法制得的提取物中含有90wt％～95wt％的黄酮类化合物。实验表明，提取物能够显著的改善AKP和/或StrACP水平，促进钙沉积、提高骨密度值、骨小梁数量，从而具有改善骨质疏松的作用，本发明提供提取物在改善骨质疏松方面的效果显著优于其他方法制得的淫羊藿提取物，p<0.05。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及淫羊藿提取物的制备方法与制 得的提取物。
背景技术
骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特 征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢疾病，通常是由于骨生成 和骨吸收的代谢失衡所致。据统计骨质疏松患者高达7000万以上，WHO已将 骨质疏松和糖尿病、心血管疾病共同列为危害人类健康的“三大杀手”，骨 质疏松所导致的骨折使致死率大幅提高。目前临床上对于治疗骨破坏相关疾 病如骨质疏松没有特效药物，常用药物双磷酸盐类存在不良反应多或疗效不 确切或价格昂贵等问题，临床应用受到限制。
淫羊藿收载于《中国国共和国药典》2015版，主要功效为补肾阳，强筋 骨，祛风湿。现代药理研究表明，淫羊藿总黄酮通过提高骨形态发生蛋白和 骨保护素，达到抑制骨吸收和促进骨形成的目的，可以双向调节骨代谢，临 床研究表明：淫羊藿总黄酮可以显著提高骨质疏松患者腰椎的股骨颈的骨密 度达4％以上，并缓解腰脊疼痛、腰肌酸软等临床症状，具有广阔的市场前景。
但是，淫羊藿药材中黄酮类化合物的含量较低，即使针对黄酮类物质进 行提取，所得提取物对骨质疏松的缓解效果也不甚理想，而又由于并非所有 的的黄酮类物质都对骨质疏松有改善作用，当富集方法不当时，所得提取物 对骨质疏松的改善效果也十分有限。故而，进一步研究淫羊藿的提取方法， 提高提取物对骨质疏松的改善效果，仍是本领域研究的难点。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供淫羊藿提取物的制备方法 与制得的提取物，本发明提供的提取物能够更有效的改善原发性骨质疏松。
本发明提供的淫羊藿提取物的制备方法，包括：
步骤1：淫羊藿生药以水煎煮所得药液浓缩至相对密度为1.10～1.20，获 得稠膏A；
步骤2：所述稠膏A以水稀释后上大孔吸附树脂柱，依次以蒸馏水、85v/v％ 乙醇洗脱，收集85v/v％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20， 获得稠膏B；
步骤3：所述稠膏B以水稀释后经DAC色谱分离，所述DAC色谱的流 动相A相为乙腈，B相为水，洗脱程序为：
0～10min 流动相A相的体积分数为20％；
11min～20min 流动相A相的体积分数为35％；
21min～40min 流动相A相的体积分数为40％；
收集28min～40min的洗脱液，经浓缩、干燥，获得淫羊藿提取物。
本发明提供的方法中，淫羊藿生药与水的体积比为1：(15～30)；所述煎 煮的次数为3次，每次1～3h。
具体的，药液的制备方法为：取淫羊藿生药，加15～30倍体积的水煎煮 1～3小时，滤过，滤液备用；药渣再加15～30倍体积的水煎煮1～3小时，滤 过，滤液备用；药渣再加15～30倍体积的水煎煮1～3小时，滤过，滤液备用； 合并3次提取所得滤液。
所述药液的浓缩采用减压浓缩法。
本发明提供的方法中，所述稠膏A以等体积水稀释；
稀释后上大孔吸附树脂柱的量为1/2柱体积；
所述蒸馏水的体积为3～4倍柱体积；
所述85v/v％乙醇的体积为4～5倍柱体积。
所述稠膏A稀释后还经过室温静置4～6小时，离心，吸取上清液上大孔 吸附树脂柱。
所述大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂。
本发明提供的方法中，步骤2所述洗脱的流速为40mL/min。
所述回收乙醇并浓缩用减压浓缩法。
本发明提供的方法中，所述稠膏B以等体积水稀释；
稀释后上DAC柱的量为1/5柱体积。
本发明提供的方法中，步骤3所述洗脱的流速为300mL/min；检测波长 270nm；柱压10Mpa。
本发明提供的方法中，所述DAC柱尺寸为250×600mm，填料为C18， 粒径为10μm。
本发明提供的提取方法工艺简单，所得提取物中淫羊藿总黄酮的质量分 数为90％～95％(UV)。经Q-TOF MS分析及含量测定，其中，宝藿苷II (C26H28O10)8wt％～12wt％、箭藿苷A(C33H40O15)3wt％～7wt％、淫羊藿 次苷I(C27H30O11)2wt％～6wt％、箭藿苷B(C32H38O14)8wt％～12wt％、 鼠李糖基淫羊藿次苷II(C33H40O14)15wt％～20wt％、宝藿苷VII(C33H40O15) 2wt％～5wt％。经效果验证，该组分对骨质疏松的改善活性最强，与其他提 取方法相比存在显著性差异。
本发明提供的制备方法制得的淫羊藿提取物。
本发明提供的淫羊藿提取物，包括宝藿苷Ⅱ、宝藿苷Ⅶ、箭藿苷A、淫 羊藿次苷Ⅰ、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
实验表明，细胞培养中，本申请提取物能够促进促MC3T3-E1分泌AKP， 动物实验中，与假手术组比较，模型组大鼠血清AKP、StrACP显著升高 (P<0.01)，而提取物能够抑制AKP、StrACP含量的升高，该效果有统计学 意义(P<0.05)。
本发明提供的淫羊藿提取物在制备改善AKP和/或StrACP水平的制剂中 的应用。
细胞实验表明，本发明提供的淫羊藿提取物处理的成骨细胞的吸光度值 与正常对照组比较有统计学差异(P<0.01)动物实验表明，给药8周后模型组 与假手术组比较大鼠骨密度值、骨小梁数量明显降低，骨小梁分离度显著增 加,有统计学差异(P<0.01)。与模型组比较，提取物的骨密度值、骨小梁数量显 著上升，骨小梁分离度明显下降(P<0.05)。
本发明提供的淫羊藿提取物在制备促进钙沉积和/或提高骨密度的制剂中 的应用。
基于以上结果，本发明提供的淫羊藿提取物能够改善骨质疏松。
本发明提供的淫羊藿提取物在制备改善骨质疏松的药物中的应用。本发 明实施例中，所述骨质疏松为原发性骨质疏松。
本发明将水煎提取获得的淫羊藿药液经过大孔吸附树脂和工业色谱 (DAC250)分离纯化。经检测，该方法制得的提取物中含有90wt％～95wt％ 的黄酮类化合物。实验表明，提取物能够显著的改善AKP和/或StrACP水平， 促进钙沉积、提高骨密度值、骨小梁数量，从而具有改善骨质疏松的作用， 本发明提供提取物在改善骨质疏松方面的效果显著优于其他方法制得的淫羊 藿提取物，p<0.05。
附图说明
图1示茜素红染色结果。
具体实施方式
本发明提供了淫羊藿提取物的制备方法与制得的提取物，本领域技术人 员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类 似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在 本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明 显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适 当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
取淫羊藿药材，加生药15～30倍体积的水煎煮1～3小时，滤过，滤液 备用；药渣再加15～30倍体积的水煎煮1～3小时，滤过，滤液备用；药渣 再加15～30倍体积的水煎煮1～3小时，滤过，滤液备用；
合并3次提取所得滤液，减压浓缩至相对密度d＝1.10～1.20(50～60℃) 的稠膏A，放冷(至室温)，向稠膏A中添加生药材等质量的水使溶解，室温 静置约4～6小时，离心，吸取上清液，通过D101型大孔树脂柱(上清液：树 脂＝1:2)，以蒸馏水(3～4倍量柱床体积)洗脱，流速为40ml/分，弃去水洗脱 液，再以85％乙醇(4～5倍量柱床体积)洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓 缩至相对密度d＝1.10～1.20(50～60℃)的稠膏B；
稠膏B以等体积水稀释，上样，过DAC柱(填料C18-10μm，250×600mm)， 所述DAC色谱的流动相A相为乙腈，B相为水，流速：300mL/min；检测波 长：270nm；柱压：10Mpa；洗脱程序为：
分别于如下时间段收集流分：
Fr1：0～6min；Fr2：7～13min；Fr3：14～20min；Fr4：21～27min；Fr5：28～34min；Fr6：35～40min；Fr7：41～47min；Fr8：48～54min；Fr9：55～60min；Fr10：61～67min。
合并流分Fr5-6、流分Fr7-10，共得到6个流分，浓缩、干燥、粉碎，得 到6种提取物粉末。依次命名为提取物A(Fr1)、B(Fr2)、C(Fr3)、D(Fr4)、 E(Fr5-6)、F(Fr7-10)。
对比例1
取淫羊藿药材，加生药15～30倍体积的70v/v％乙醇煎煮1～3小时，滤过， 滤液备用；药渣再加15～30倍体积的70v/v％乙醇煎煮1～3小时，滤过，滤液 备用；药渣再加15～30倍体积的70v/v％乙醇煎煮1～3小时，滤过，滤液备用；
合并3次提取所得滤液，减压浓缩至相对密度d＝1.10～1.20(50～60℃)的 稠膏A，放冷(至室温)，向稠膏A中添加生药材等质量的水使溶解，室温静 置约4～6小时，离心，吸取上清液，通过D101型大孔树脂柱(上清液：树脂 ＝1:2)，流速为40ml/分，弃去水洗脱液，再以90v/v％乙醇(4～5倍量柱床体 积)洗脱，收集洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度d＝1.10～1.20(50～60℃)， 干燥，粉碎，得到提取物G；
提取物检测：
对各提取物进行总黄酮含量测定：
供试品溶液的制备：分别取本品约20mg，精密称定，置25ml量瓶内， 加60％乙醇20ml，超声处理(功率250W，频率20kHZ)使溶解，加60％乙 醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
精密吸取淫羊藿苷供试品溶液0.5ml，置50ml的量瓶中，加甲醇稀释至 刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，作为对照品溶液。分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试 剂为空白，照紫外—可见光光度法(中国药典2015年版)在270nm波长处 测定吸收度，计算，即得。结果如表：
表1 提取UV检测结果
主要药效学实验：
实验一：淫羊藿组合物对成骨细胞的影响
1、实验目的
通过考察药物诱导成骨细胞分化的效果，评价组合物抗骨质疏松活性。
2、材料与方法
2.1实验用药物及试剂
各提取物，江苏康缘药业股份有限公司提供，批号20170516；a-MEM培 养基，Gibco，规格500mL/瓶，批号1749128；血清，Gibco，规格500mL/瓶， 批号1616964；
L-抗坏血酸，Sigma，规格2g/瓶，批号1002098420；β-甘油磷酸，Sigma， 规格100g/瓶，批号101692569；地塞米松，Sigma，规格500mg/瓶，批号 101713120；
碱性磷酸酶(AKP)测试盒，南京建成生物工程研究所，规格96T，批号 20160923；蛋白裂解试剂盒，QIAGEN，批号154026726；DMSO，Sigma， 规格250ml；BCA蛋白定量试剂盒，普利莱，规格500次，批号p1511；茜素 红染色液(2％Alizarin Red S)，ScienCell，规格100mL/瓶，批号19199； Hexadecylpyridinium chloride monohydrate(CPC)，Sigma，规格25g/瓶，批号 SLBP2571V。
2.2实验仪器
SW-OJ-2FD超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；CO2培 养箱，Thermo公司；C1028自动细胞计数仪，invitrogen公司；LD4-2A台式 低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；BXM-30R高压蒸汽灭菌器， 上海博讯实业有限公司医疗器械；BS224S型电子分析天平：赛多利斯科学仪 器(北京有)限公司；XMTD-8222型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有 限公司；Milli-Q Advantage A10型超纯水仪：美国Millipore公司；FlexStation 3钙流工作站，美国Molecular Devices公司。
2.3细胞株
鼠原MC3T3-E1细胞，从中科院上海细胞库购入。
2.4诱导试剂和组合物配制
诱导试剂配制：已知地塞米松分子量392.46，L-抗坏血酸分子量176.13， β-GP分子量306.11。地塞米松(10-8mol/mL)：10mg地塞米松溶于 100ulDMSO，得到100mg/ml的母液，取40ul母液加入960ul培养液中，得到 4mg/ml的溶液，取4mg/ml的溶液1ul加入999ul培养液的0.004mg/ml溶液， 使用时培养液稀释成千分之一，得到终浓度0.004*10-3mg/ml。L-抗坏血酸 (50ug/mL)：取100mg的L-抗坏血酸溶于10ml的PBS中，得到10mg/mL 的L-抗坏血酸，用时培养基稀释成终浓度50ug/mL。β-GP(10mmol/L)：取 β-GP 1.53g加入4ml PBS配置成1.25mmol/ml的母液，使用时用培养液稀释 成终浓度为10mmol/L。
组合物配制：取组合物以DMSO溶解成25mg/ml的母液，用时稀释千分 之一。
2.5实验方法
2.5.1鼠原MC3T3-E1细胞，将细胞置于75cm2培养瓶里(含10％胎牛血 清的a-MEM培养基)，2-3天换液1次，待细胞长满后，用0.25％的胰酶消化 1-2分钟，按1:3比例传代至75cm2培养瓶中。培养至细胞完全汇片后，加0.25％ 的胰酶消化，轻轻吸出细胞，离心重悬后调整细胞密度1.0×105个/ml备用。
2.5.2接种至24孔培养板中，细胞完全贴壁后，正常对照组细胞用普通 的a-MEM培养基培养，诱导对照组细胞换条件培养液：a-MEM+L-抗坏血酸 (50μg/mL)+β-GP(10mmol/L)+地塞米松(10-8mol/mL)，各组合物组在诱 导组的基础上加入相应组合物药液，以后每隔三天换一次液，培养诱导7d， 各组分别收集样品裂解后，4℃，10000g离心10min，取上清液，定蛋白，进 行AKP活力检测。
2.5.3茜素红染色及矿化结节萃取物OD值检测：细胞接种至24孔，分组 如下：正常对照组、诱导对照组、2.5.2中筛选出的诱导成骨分化效果最佳的 组合物组。细胞培养、换液等同2.5.2。培养诱导21d后，按茜素红染色液的 操作步骤进行染色并拍照留存后，矿化结节以10％CPC溶液室温充分溶解 15min后，按组别分别加入酶标板测定562nm吸光度值。
3、结果
3.1诱导7天的AKP检测结果
碱性磷酸酶(AKP)是成骨细胞分泌、反映成骨细胞成骨能力的重要生 化标志物。诱导7天的AKP实验结果发现，与正常对照组比较，诱导对照组 细胞分泌的AKP差异显著(p<0.01)，说明诱导分化成功。各提取物组分泌的 AKP活性明显增强，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)，表明提取物 促MC3T3-E1分泌AKP的能力较强，其中以提取物E诱导成骨分化的作用最 佳，显著高于其他提取物(p<0.05)。结果见表2：
表2 组合物对AKP的影响
| 组别 | 剂量 | n | AKP活力(金氏单位/100mL) |
| 正常对照 | — | 3 | 1.42±0.23 |
| 诱导对照 | — | 3 | 2.35±0.22** |
| 提取物A | 25μg/mL | 3 | 2.67±0.28** |
| 提取物B | 25μg/mL | 3 | 3.07±0.33** |
| 提取物C | 25μg/mL | 3 | 2.95±0.29** |
| 提取物D | 25μg/mL | 3 | 3.18±0.35** |
| 提取物E | 25μg/mL | 3 | 4.27±0.33** |
| 提取物F | 25μg/mL | 3 | 3.58±0.36** |
| 提取物G | 25μg/mL | 3 | 3.46±0.30** |
注：**示与正常对照组比较存在极显著差异，p<0.01
3.2茜素红染色及矿化结节萃取物OD值检测
针对提取物E进行分析，成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、 胞外基质成熟、胞外基质矿化等阶段。成骨细胞增殖期成骨细胞数量开始增 加，不断合成、分泌I型胶原最终矿化形成骨结节。茜素红染色分析结果显示， 成骨细胞诱导培养21d后，与正常对照组比较，组合物诱导产生钙结节效果 较好，结果见图1。利用10％的CPC定量检测钙沉积量，562nm吸光度下检 测OD值，发现提取物E组的吸光度值与正常对照组比较有统计学差异 (P<0.01)，结果见表3。
表3 组合物对钙沉积量的影响
| 组别 | 剂量 | n | OD值 |
| 正常对照 | — | 3 | 0.136±0.007 |
| 诱导对照 | — | 3 | 0.240±0.019** |
| 提取物E | 25μg/mL | 3 | 0.436±0.011** |
注：**示与正常对照组比较存在极显著差异，p<0.01
实验二、淫羊藿组合物对去卵巢骨质疏松大鼠的影响
1、实验目的
通过双侧卵巢切除造成大鼠骨质疏松模型，观察组合物对去卵巢大鼠骨 质疏松的保护作用。
2、材料与方法
2.1实验用动物及饲养条件
SD大鼠，SPF级，雌性，体重180～220g，由北京维通利华实验动物技 术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2016-0011。大鼠接收后放入实验室环 境中分笼饲养，保持环境温度20～26℃，湿度40～70％。饲以实验动物用配 合饲料(北京华阜康生物科技有限公司提供)。
2.2实验用药物及试剂
提取物E，江苏康缘药业股份有限公司，批号20170516；注射用青霉素 钠，山东鲁抗医药股份有限公司，规格160万单位/支，批号160455；水合氯 醛，国药集团化学试剂有限公司，批号20130426，规格250g/瓶；羧甲基纤维 素钠(CMC-Na)，天津市福晨化学试剂厂，批号20130320，规格500g/瓶； 多聚甲醛(Paraformaldehyde)，ALDRICH，规格1kg/瓶，批号MKBZ2389；碱 性磷酸酶(AKP)测试盒(酶标仪法)，南京建成生物工程研究所，规格96T， 批号20170701；
StrACP测试盒，南京建成生物工程研究所，规格50T/24样，批号 20170701。
2.3实验仪器
BXM-30R高压蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗器械；BS224S 型电子分析天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；XMTD-8222型电 热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；Milli-Q Advantage A10型超纯水 仪：美国Millipore公司；TDZ4-WS低速自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机 仪器有限公司；FlexStation 3钙流工作站，美国Molecular Devices公司。
2.4实验方法
2.4.1造模、分组及给药
取3月龄雌性大鼠，腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，无菌条件下，迅 速于腹部剪开约3cm切口，取出双侧卵巢扎紧输卵管后切除，假手术组不切 除卵巢，缝合切口。术后连续3d腹腔注射青霉素预防创口感染。术后2个月， 假手术组除外，造模组动物分为模型、提取物E(0.189g/kg)共2组，每组6 只。每组大鼠按体重分别灌胃给药(假手术组、模型组给予等体积的 0.5％CMC-Na)，每日一次，连续给药8周。
2.4.2取材与指标检测
最后一次给药后1h，每只大鼠麻醉，腹主动脉取血并3000r/min离心收 集血清；每只大鼠剥离后肢右侧股骨，剔尽软组织，放置于4％多聚甲醛溶液 中。
血清指标：利用试剂盒分别测定碱性磷酸酶(AKP)、抗酒石酸酸性磷酸 酶(TRAP)含量。
骨密度等：右侧股骨外送上海怀宇生物科技有限公司，置SkyScan1172高 分辨率台式microCT中进行扫描，运用专用骨骼分析软件进行数据分析处理。
3、结果
3.1组合物对去卵巢骨质疏松大鼠血清ALP、StrACP的影响
随着年龄的增加，众多妇女绝经后不仅骨量急剧下降，腹中脂肪也随之 增加，易发生骨质疏松和代谢综合征。碱性磷酸酶主要存在于成骨细胞，骨 代谢速率增加的代谢性骨病血清AKP显著升高。抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP) 可由破骨细胞释放，进入血循环，骨吸收活跃时血清StrACP升高。由表4可 知，与假手术组比较，模型组大鼠血清AKP、StrACP显著升高(P<0.01)。 与模型组比较，组合物能够抑制AKP、StrACP含量的升高，有统计学意义(P<0.05)。
表4 组合物对去卵巢骨质疏松大鼠血清AKP、StrACP的影响
| 组别 | 剂量 | n | AKP(金氏单位/100mL) | StrACP(U/L) |
| 假手术 | — | 6 | 5.90±0.92** | 7.01±0.62** |
| 模型 | — | 6 | 9.16±2.01 | 9.88±1.17 |
| 组合物 | 0.189g/kg | 6 | 7.17±0.98* | 8.07±1.11* |
与模型组比较：**P＜0.01，*P＜0.05
3.2组合物对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度等的影响
骨组织的强度不仅取决于骨量，还取决于其结构、形状及内在的生物力 学性能。Micro-CT是一种分辨率极高，专门用来检测生物标本、材料内部三 维结构及材料特性的小型CT。本实验发现，给药8周后模型组与假手术组比 较大鼠骨密度值、骨小梁数量明显降低，骨小梁分离度显著增加,有统计学差 异(P<0.01)。与模型组比较，组合物的骨密度值、骨小梁数量显著上升，骨小 梁分离度明显下降(P<0.05)。结果见表4。
表5 组合物对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度等的影响
| 组别 | 剂量 | n | BMD(g/cc) | Tb.N(1/mm) | Tb.Sp(mm) |
| 假手术 | — | 6 | 0.331±0.018** | 2.802±0.196** | 0.218±0.022** |
| 模型 | — | 6 | 0.121±0.019 | 0.876±0.188 | 1.118±0.223 |
| 组合物 | 0.189g/kg | 6 | 0.162±0.035* | 1.312±0.347* | 0.870±0.191* |
与模型组比较：**P＜0.01，*P＜0.05
采用HPLC-MS对提取物E做进一步检测
色谱条件：采用十八烷基键合硅胶为填充剂，Agilent SB-C18色谱柱(2.1 ×100mm，1.8μm)；以乙腈为流动相A，0.1％甲酸为流动相B，按下表中的 规定进行梯度洗脱；流速0.3ml/min；柱温45℃；检测波长270nm。
表6 洗脱程序
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0 | 30 | 70 |
| 30 | 45 | 55 |
实验采用外标法，供试品或标准品采用加甲醇稀释，超声使溶解，摇匀， 即得。测定时分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱 仪，测定，即得。
经3次测定检测，提取物e中按干燥品计算，含宝藿苷Ⅱ(C26H28O10) 8％～12％、箭藿苷A(C33H40O15)3％～7％、淫羊藿次苷Ⅰ(C27H30O11)2％～ 6％、箭藿苷B(C32H38O14)8％～12％、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ(C33H40O14) 15％～20％、宝藿苷Ⅶ(C33H40O15)2％～5％。各组分3次测定的平均值如表 7：
表7 各组分含量
| 化合物 | 含量(％) |
| 宝藿苷Ⅱ | 10.96 |
| 箭藿苷A | 5.18 |
| 淫羊藿次苷Ⅰ | 3.14 |
| 箭藿苷B | 9.56 |
| 鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ | 17.49 |
| 宝藿苷Ⅶ | 3.52 |
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.淫羊藿提取物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：淫羊藿生药以水煎煮所得药液浓缩至相对密度为1.10～1.20，获得稠膏A；
步骤2：所述稠膏A以水稀释后上大孔吸附树脂柱，依次以蒸馏水、85v/v％乙醇洗脱，收集85v/v％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10～1.20，获得稠膏B；
步骤3：所述稠膏B以水稀释后经DAC色谱分离，所述DAC色谱的流动相A相为乙腈，B相为水，洗脱程序为：
收集28min～40min的洗脱液，经浓缩、干燥，获得淫羊藿提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淫羊藿生药与水的体积比为1：(15～30)；所述煎煮的次数为3次，每次1～3h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述稠膏A以等体积水稀释；
稀释后上大孔吸附树脂柱的量为1/2柱体积；
所述蒸馏水的体积为3～4倍柱体积；
所述85v/v％乙醇的体积为4～5倍柱体积。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述洗脱的流速为40mL/min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述稠膏B以等体积水稀释；
稀释后上DAC柱的量为1/5柱体积。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述洗脱的流速为300mL/min；检测波长270nm；柱压10Mpa。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述DAC柱尺寸为250×600mm，填料为C18，粒径为10μm。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法制得的淫羊藿提取物。
9.根据权利要求8所述的淫羊藿提取物，其特征在于，包括宝藿苷Ⅱ、宝藿苷Ⅶ、箭藿苷A、淫羊藿次苷Ⅰ、箭藿苷B、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
10.权利要求8或9所述的淫羊藿提取物在制备改善AKP和/或StrACP水平的制剂中的应用。
11.权利要求8或9所述的淫羊藿提取物在制备促进钙沉积和/或提高骨密度的制剂中的应用。
12.权利要求8或9所述的淫羊藿提取物在制备改善骨质疏松的药物中的应用。
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