CN101332211B - 一种水蛭提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水蛭提取物的制备方法：将水蛭加水匀浆后，经可控酶解、有机溶剂沉淀、超滤、阴离子交换层析制得水蛭提取物。该水蛭提取物可用于制备具有抗凝作用、溶栓作用、抑制血小板聚集作用及神经保护作用的药物。本发明从中药现代化的技术要求出发，采用可控酶解技术提取水蛭中的肽类成分，结合生物制药技术，采用超滤、凝胶层析的分离技术进一步进行纯化，得到了比传统水蛭提取物纯度更高、活性更强的提取物。该方法突破了传统动物药在提取、分离方面的瓶颈，解决了传统动物药以原粉应用时用量大、味道腥臭的问题，进一步提高了动物药提取物活性和质量可控性，大大提高了药材的利用率。

Description

一种水蛭提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种水蛭提取物及其制备方法与应用。

背景技术

水蛭功效为破血、逐瘀、消癥。可用于癥瘕痞块，血瘀经闭，跌打损伤，血小板增多症，及脑出血。水蛭始载于《神农本草经》：“主逐恶血，瘀血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道。”《本草纲目》：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。”

水蛭作为一味传统活血化瘀中药，具有破血、逐瘀、通经之功能，由于水蛭抗凝作用得到肯定，以及近年来对活血化瘀治疗各种疑难病的不断深入研究，水蛭的药用也倍受青睐。在中医临床上用单味水蛭或配伍复方，使用煎剂、散剂、胶囊剂和口服液等剂型，内服给药，治疗心脑血管疾病疗效显著。然而临床疗效确切的水蛭制剂多为干燥药材原粉制成的中成药，如活血通脉胶囊，抗血栓片等，这类制剂由于具有水蛭药材的腥臭味，不良反应较多，同时由于成分复杂，不易控制药材质量，药效波动大。

水蛭作为传统中药，临床应用很广泛，但是有效成分并不明确，文献报道其中的蛋白质、多肽等为主要有效成分。有效成分不明确是动物类药材的固有的问题，采用传统的提取、浓缩工艺方法，使有些成分分解、破坏，或提取不出来，易使有效成分损失，不适宜动物类药材。

可控酶解采用内切肽酶对蛋白质进行水解，并通过控制某一参数大小，来确定水解的终点，以获得尽可能多的目标分子量的肽类物质。通过可控酶解方法，就有可能把蛋白质中所蕴藏的功能区肽片段释放出来，制备出具有各种各样生理活性的生物活性肽。因此，国内外关于蛋白水解物和活性肽产品的开发极为活跃。近年来人们在生物活性肽方面取得了很大进展，越来越多生物活性肽被发现并分离出来，并确定了结构。目前国内外已从蛋白质水解物中分离出具有多种生理活性的生物活性肽，例如促进钙铁吸收的酪蛋白磷酸肽、抗病毒肽、ACE抑制肽等，当前已有部分活性肽实现了工业化。

因此，结合可控酶解技术研究水蛭提取物及其制备工艺，对于提高水蛭提取物的生理活性，增强水蛭提取物的质量可控性，解决水蛭提取纯化工艺的瓶颈问题具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种采用可控酶解法制备的水蛭提取物及其制备方法，以提高水蛭提取物的质量可控性及生理活性。本发明还提供了水蛭提取物的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种水蛭提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取水蛭干燥全体粉碎成40～120目粉末，加入8～15倍量的水，或取水蛭鲜活全体，加入1～5倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH至7～9，按每1g底物加入2000～20000U酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制温度40℃～60℃，酶解2～12小时，冷却至室温；

(3)向上述酶解液中加入1～5倍体积的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液减压回收，残渣加水溶解，微孔滤膜过滤；

(4)将上述滤液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将上述超滤液的pH调整至7.5～9.5，通过阴离子交换树脂，先用水或pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液或pH7～9、0.01～0.05mol/L的二乙醇胺-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐，浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥即得到水蛭提取物。

所述步骤(1)中，水蛭干燥全体粉碎成80～100目粉末，加入9～13倍量的水；或用水蛭鲜活全体，加入2～4倍量的水。

所述步骤(2)中，调整pH为8～9，按每1g底物加入5000～10000U蛋白酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶(当同时加入胰蛋白酶和胰酶时，两者之间没有比例的限定)，控制温度45℃～55℃，酶解4～10小时，冷却至室温。

所述步骤(3)中，向酶解液中加入2～4倍体积的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液60℃以下减压回收溶媒，残渣加水溶解，微孔滤膜过滤。

所述步骤(5)中，阴离子交换树脂是以纤维素为基质的阴离子交换树脂、以葡聚糖为基质的阴离子交换树脂或以琼脂糖为基质的阴离子交换树脂中的任一种；所述用于洗脱的氯化钠溶液为0.1～2mol/L的氯化钠水溶液或含0.1～2mol/L氯化钠的pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液或含0.1～2mol/L氯化钠的pH7～9、0.01～0.05mol/L三乙醇胺-盐酸缓冲液；所述脱盐采用钠滤法或葡聚糖凝胶法。

一种水蛭提取物，是由以上制备方法制得的。

所述水蛭提取物在制备具有抗凝作用药物中的应用。

所述水蛭提取物在制备具有溶栓作用药物中的应用。

所述水蛭提取物在制备具有抑制血小板聚集作用药物中的应用。

所述水蛭提取物在制备具有神经保护作用药物中的应用。

本发明从中药现代化的技术要求出发，采用可控酶解技术提取水蛭中的肽类成分，结合生物制药技术，采用超滤、凝胶层析的分离技术进一步进行纯化，得到了比传统水蛭提取物纯度更高、活性更强的提取物。该方法突破了传统动物药在提取、分离方面的瓶颈，解决了传统动物药以原粉应用时用量大、味道腥臭的问题，进一步提高了动物药提取物活性和质量可控性，大大提高了药材的利用率。具体来说，本发明具有以下突出的有益效果：

1、突破了传统提取方法：水蛭在传统用药中大多数情况下以原粉的形式应用，这是因为水蛭的有效成分并不明确，文献报道其中的蛋白质、多肽、微量元素等为有效成分，采用传统的提取、浓缩工艺方法，使有些成分分解、破坏，或提取不出来，易使有效成分损失，不适宜动物类药材。在本发明的技术方案中，采用可控酶解技术，把蛋白质内部存在着功能区的多肽链打开，把具有生物活性的肽片段释放出来，从而可制备出具有更强生理活性的生物活性肽，再采用超滤、离子交换层析等生物制药技术对样品进行纯化，从而得到纯度高、生物活性强的水蛭提取物，与传统提取方法得到的提取物相比有了质的飞跃，突破了传统的提取方法。

2、提高了药材的利用率：在传统的临床复方应用中，水蛭的日用量一般为6～9g，而单独使用时则日用量可达12～15g。而采用可控酶解技术后，由于打开蛋白质内部存在的功能区，释放出具有生物活性的肽片段，其活性有着大幅度的提高，而有效剂量也大大降低，折合生药材的量为2～3g，仅为传统用量的1/3左右，大大提高药材的利用率。

3、改善了中药的质量：水蛭在传统用药中大多数情况下以原粉的形式应用，由于水蛭本身的腥臭味道会引起恶心、呕吐等不良反应，还由于动物组织进行灭菌时不彻底，容易导致微生物限度超标。而采用本专利方法对水蛭进行处理，经过酶解、乙醇或/和丙酮沉淀、超滤、离子交换层析，除去了大部分的杂质，同时也由于除去了有害的微生物和内毒素等，制得的水蛭提取物可以作为注射制剂的原料药，改变了传统中药“粗大黑”的形象，外在质量显著提高；而多种纯化手段的使用，使得水蛭提取物的纯度大大提高，有效物质基本明确，水蛭提取物的质量可控性已经达到化学药物的水平。中药疗效的物质基础的阐明，为中药进入国际医药市场创造良好的生产条件。

4、增强了药品的活性：中药治疗疾病作用机理较为复杂，不仅仅通过一种途径治疗缺血引起的损害，往往通过调节与之有关的各个方面，共同达到治疗作用，由此所引出的问题也较为明显，即作用靶点多，作用强度不够，因此在急性疾病中往往是在西药的基础上起辅助作用。水蛭也存在这样的问题，传统的临床应用主要是用在心脑血管疾病的稳定期或者恢复期，基本不能在急性期应用。而本发明制备的水蛭提取物活性大大增强，在治疗急性病当中有着与化学药相类似的治疗效果，还可以注射给药，这一点对急性期病人也有着重要意义。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：制备水蛭提取物，步骤如下：

(1)取水蛭干燥全体粉碎成100目粉末，加入8倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH到8.5，按每1g底物加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解6小时，冷却至室温；

(3)向酶解液中加入2倍体积的丙酮冷藏沉淀，过滤，取滤液60℃以下减压回收，残渣加水溶解，0.45微米微孔滤膜过滤；

(4)将上述药液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将超滤液的pH调整至8.0，通过Q Sepharose树脂，先用水冲洗，冲洗液弃去，以1mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，G10葡聚糖凝胶脱盐，浓缩，冷冻干燥得到水蛭提取物。

实施例2：制备水蛭提取物，步骤如下：

(1)取水蛭鲜活全体，加入2.5倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH到8.5，按每1g底物加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶和胰酶，其中胰酶提供蛋白酶活力占总蛋白酶活力的2％，控制温度50℃，酶解8小时，冷却至室温；

(3)向酶解液中加入3倍体积的乙醇冷藏沉淀，过滤，取滤液减压回收至无醇味，加入2倍体积的丙酮冷藏沉淀，过滤，取滤液60℃以下减压回收，残渣加水溶解，0.45微米微孔滤膜过滤；

(4)将上述药液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将超滤液的pH调整至7.8，通过DEAE Sepharose树脂，先用pH7.8的0.02mol/L二乙醇胺-盐酸缓冲液冲洗，冲洗液弃去，以含0.5mol/L氯化钠的pH7.8、0.02mol/L Tris-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，G10葡聚糖凝胶脱盐，浓缩，冷冻干燥得到水蛭提取物。

实施例3：制备水蛭提取物，步骤如下：

(1)取水蛭鲜活全体，加入2.5倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH至8.0，按每1g底物加入10000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解4小时，冷却至室温；

(3)向酶解液中加入3倍体积的乙醇冷藏沉淀，过滤，取滤液60℃以下减压回收，残渣加水溶解，0.45微米微孔滤膜过滤；

(4)将上述药液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将超滤液的pH调整至7.9，通过DE-52树脂，先用pH7.9、0.02mol/L Tris-盐酸缓冲液冲洗，冲洗液弃去，以含1mol/L氯化钠的pH8.0、0.02mol/L三乙醇胺-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，钠滤脱盐，浓缩，喷雾干燥得到水蛭提取物。

实施例4：制备水蛭提取物，步骤如下：

(1)取水蛭干燥全体粉碎成100目粉末，加入15倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH至8.0，按每1g底物加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解6小时，冷却至室温；

(3)向酶解液中加入2倍体积的丙酮冷藏沉淀，过滤，取滤液60℃以下减压回收，残渣加水溶解，0.45微米微孔滤膜过滤；

(4)将上述药液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将超滤液的pH调整至8.8，通过QA52树脂，先用水冲洗，冲洗液弃去，以0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，G10葡聚糖凝胶脱盐，浓缩，冷冻干燥得到水蛭提取物。

实施例5：制备水蛭提取物，步骤如下：

(1)取水蛭鲜活全体，加入1.5倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH至8.0，按每1g底物加入8000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解4小时，冷却至室温；

(3)向酶解液中加入3倍体积的乙醇冷藏沉淀，过滤，取滤液60℃以下减压回收，残渣加水溶解，0.45微米微孔滤膜过滤；

(4)将上述药液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将超滤液的pH调整至8.2，通过DEAE-SephadexA50树脂，先用pH8.0、0.01mol/LTris-盐酸缓冲液冲洗，冲洗液弃去，以含0.4mol/L氯化钠的pH8.0、0.03mol/L三乙醇胺-盐酸缓冲液洗脱，收集洗脱液，钠滤脱盐，浓缩，喷雾干燥得到水蛭提取物。

实施例6：制备水蛭提取物，步骤如下：

(1)取水蛭干燥全体粉碎成100目粉末，加入8倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH到8.5，按每1g底物加入6000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度50℃，酶解7小时，冷却至室温；

(3)向酶解液中加入3倍体积的丙酮冷藏沉淀，过滤，取滤液60℃以下减压回收，残渣加水溶解，0.45微米微孔滤膜过滤；

(4)将上述药液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将超滤液的pH调整至8.5，通过QAE-SephadexA50树脂，先用水冲洗，冲洗液弃去，以0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，G10葡聚糖凝胶脱盐，浓缩，冷冻干燥得到水蛭提取物。

实验例1：水蛭提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

1.1试验材料

1.1.1药物与试剂

受试药：依本发明技术方案得到的水蛭提取物。

阳性对照药：血塞通注射液，规格：250mg/5ml，中国昆明兴中制药有限责任公司，批号：060401。

试剂：12500μ/ml肝素注射液：上海生物化学制药厂，批号：060407。

1.1.2动物

Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重260-300g，由山东大学实验动物中心提供，合格证编号：SCXK(鲁)-2003004。

1.1.3仪器

聚乙稀管(内经1mm，2mm)，动脉夹，丝线(4^#、7^#)，手术器械等。

电子分析天平，AB204-S型，梅特勒公司产品。

8453E型紫外分光光度计，安捷伦科技公司产品。

1.2方法与结果

1.2.1分组及给药

取Wistar大鼠72只，分为6组(即假手术组，模型组、血塞通20mg/kg组、水蛭提取物20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg组)，每组12只，雌雄各半。各组动物于缺血后，即刻舌静脉给药，6小时后再给药一次。假手术组与模型组给予等量的生理盐水。

1.2.2实验方法

手术过程：

大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA和CCA，用静脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于距ECA与ICA分叉处约0.5cm的颈总动脉处作一切口，插入一端涂有石蜡的尼龙线(0.285mm)，插入深度为1.85±0.5mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留线头至略有阻力以实现大脑中动脉再灌注。在缺血3小时和再灌注0.5小时内用电灯维持大鼠肛温在35-36℃左右。假手术与其他模型鼠一样分离颈总动脉、颈内动脉及颈外静脉，但只结扎右侧颈总动脉CCA。

神经症状评分：神经病学检查评分参照Zea Longa 5分制评分标准，如表1所示。

表1Zea Longa5分制评分标准

脑梗塞范围测定：

动物于缺血3小时再灌注21小时后断头，迅速置于冰盘上取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，后将大脑均匀切成5片放入盛有TTC的瓶中，并将放入37℃孵育30min，孵育后将其转入10％福尔马林溶液固定。非缺血部分染成玫红色，缺血部位呈白色。脑组织固定后仔细将缺血部分分开并称重，按以下公式确定脑梗塞范围：

1.3结果

上述试验结果用±sd表示，统计学采用组间比较t检验。

1.3.1对缺血再灌注大鼠神经症状的影响

水蛭提取物对缺血再灌注大鼠神经症状试验结果见表2。

表2水蛭提取物对缺血再灌注大鼠神经症状的影响(±sd)

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果显示，假手术组动物无行为异常改变，而模型组12只大鼠均出现偏瘫样症状，主要表现为不能完全伸展左侧前爪、向左侧转圈、向左侧倾倒。水蛭提取物组20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg组在再灌注21小时后均可改善大鼠神经症状，其中20mg/kg、10mg/kg组统计差别明显(P＜0.01和0.05)。5mg/kg剂量组神经症状有一定的改善，但未能显示出统计意义。

1.3.2对缺血再灌注大鼠脑梗范围的影响

对缺血再灌注大鼠脑梗范围试验结果见表3。

表3水蛭提取物对缺血再灌注大鼠脑梗范围的影响(±sd)

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

试验结果显示，手术后1天，假手术组未见脑组织异常改变，模型组、给药组大鼠均有不同程度梗塞灶，水蛭提取物20mg/kg、10mg/kg组的大鼠梗塞程度明显减轻，与模型组比较差异显著(P＜0.01和0.05)。5mg/kg剂量组梗塞程度有一定的改善，但未能显示出统计意义。

实验例2：水蛭提取物对三氯化铁诱导家兔颈静脉血栓的溶栓作用

2.1试验材料

2.1.1药物与试剂

受试药、阳性药：同实验例1。

试剂：戊巴比妥钠：批号：060402，进口分装，配成3％溶液备用。

肝素：上海生物化学制药厂，批号：050407。配制成0.5％溶液备用。

生理盐水注射液：北京双鹤药业股份有限公司产品，批号：0604282。

三氯化铁：批号：060224，北京化学试剂公司。

2.1.2动物：家兔40只，体重2.0-3.0kg，雌雄兼用。

2.1.3仪器：Powerlab/8SP数据记录分析仪，澳大利亚ADInstrument Pty.Ltd.产品。

MFV-2100电磁血流量计，日本光电公司产品。

2.2方法与结果

2.2.1分组及给药

取家兔40只，分为5组，每组8只，雌雄各半。在颈静脉血栓形成并老化30min后，静脉注射给药，观察时间为给药后120min。

2.2.2方法

手术过程：试验前动物禁食12小时，自由饮水。3％戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉动物。动物仰卧位固定在手术台上，颈部正中切口，分离出一侧颈静脉，长度3cm左右，将直径2.5～3.5mm的电磁流量计探头安放在合适位置，电磁流量计探头连接于MFV-2100电磁流量计上，记录颈静脉的血流量；右前肢建立静脉通道，供给药、补液和取血用。

血栓模型制备：在血流探头近心端取长度约1cm的血管，在此段血管内用特制的血管钳夹闭静脉，使血管内膜粗糙，每次夹闭20sec，间隔5min，重复6次。将颈静脉的近心端和远心端用静脉夹阻断血流，用浸有三氯化铁溶液的棉线绕动物一圈，20min后去掉静脉夹，电磁流量计读数为零，表明颈静脉已形成稳定的血栓，稳定10min后即可进行各项参数的观察和测定。

手术完毕及模型成功后，将所有信号输入powerlab/8SP记录仪并经生物信号采集和处理系统进行连续信号采集，试验参数由计算机全程进行监控和显示并储存于计算机上，试验结束后，作脱机处理进行数据分析、打印原始记录。

检测指标：栓塞静脉再通的判定：连续记录颈静脉血流量，以给药后血流量回升达到基础值的50％以上，为颈静脉血管再通，再灌注后血流量再次降至零为再栓塞。

试验数据统计学处理：所有数据以±sd表示。采用配对t检验比较给药前后均数差异显著性，非配对t检验比较组间均数差异显著性。

2.3结果

家兔静脉注射水蛭提取物高、中、低组给药剂量分别按20、10、5mg/kg计算，血塞通注射液按20mg/kg计算。结果见表4。

表4水蛭提取物对栓塞颈静脉再通率及再通时间的影响(±sd)

与阴性对照组比较(x²检验)**P＜0.05-0.01。因低剂量组再通时间动物数只有2只，固未进行统计学处理。

试验结果显示，血栓形成后，血管外观呈暗红色，血栓形成段血流呈终止状态。生理盐水对照组在整个试验过程中(120min)未见栓塞血管再通。水蛭提取物高剂量组8只动物给药后有8只动物的血流量均有不同程度增加，平均血管再通时间为25.0±14.3min，再通率为100％(8/8)。水蛭提取物中、低剂量组血管再通率分别为50％和37.5％。再通时间为35.2和56.7min，血流再通时间比对照明显缩短。血管再通率增加和血管再通时间的改变，提示该药具有促进纤溶活性的作用。

实验例3：水蛭提取物溶栓作用(血清药理)

3.1试验材料

3.1.1药物与试剂：受试药同前。

阳性对照药：尿激酶：广东天普生化医药股份有限公司，为白色粉末，1万单位/瓶，批号20060401。受试剂量为1万单位/kg。尿激酶功能为溶血栓，用于治疗血栓性脑梗塞，脑血栓。

3.1.2动物：Wistar大鼠50只，雄性，体重250-270g，由山东大学实验动物中心提供，合格证编号：SCXK(鲁)-2003004。

3.1.3仪器

SHZ-22型水浴箱振荡器，江苏太仓医疗器械厂产品；

电子分析天平，AB204-S型，梅特勒公司产品；

DGG-9140A型鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司产品。

3.2方法与结果

3.2.1分组及给药

取Wistar大鼠50只，分为5组(即对照组、水蛭提取物20、10、5mg/kg组、尿激酶1万单位/kg组)，每组10只，雌雄各半。腹腔注射给药2次，假手术组、模型组给予等量的生理盐水(0.8ml/100g体重)。每三次给药时腹腔注射每日剂量的一半，另一半舌下静脉注射给药，给药半小时后经颈动脉取血。静置半小时。2500转/分离心，15分钟，取血清1ml备用。

3.2.2方法

取250g体重雄性大鼠1只，经颈总静脉放血至一米长、直径3mm的塑料管中，夹闭两端，垂直放置24h后取出血块，精密称取约50mg的血块，放入以备制好的1ml含药血清中，37℃水浴24h后取出血块称重(大于原血栓重的，按原血栓重计算)，计算相对溶栓率。

3.2.3结果

将溶栓率进行组间比较，进行t检验，见表5。

表5水蛭提取物体外溶栓作用(±sd)

与模型组相比，**P＜0.01。

结果显示：水蛭提取物高剂量组具有一定的溶栓作用，中、低剂量溶栓作用较弱。尿激酶1万单位/kg组亦有较强的溶栓作用。

实验例4：水蛭提取物对ADP(二磷酸腺苷)所诱导的兔血小板聚集的影响

4.1试验材料

4.1.1药物及试剂

受试药：水蛭提取物。实验前以生理盐水稀释到0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875、0.00094mg/ml。

血小板活化因子(PAF)系美国sigma公司产品，规格：1mg、0.5mg。

4.1.2动物

家兔，雄性，体重2.5-3.0kg。

4.1.3仪器

LG-PABER-I血小板聚集分析仪，北京世帝公司产品，

400R低温离心机，德国Heraeus产品。

4.2方法与结果

4.2.1分组及给药

取血后随机分为7组，即生理盐水对照组及水蛭提取物0.3mg/ml、0.15mg/ml、0.075mg/ml、0.0375mg/ml、0.01875mg/ml、0.0094mg/ml剂量组(试验主要观察药物不同剂量抗血小板聚集作用，固只设生理盐水对照组，而未设阳性药对照组)。实验前动物禁食12h，取血后体外给药。

4.2.2方法

家兔以3％戊巴比妥纳1ml/kg耳缘静脉注射麻醉，颈总静脉取血，用3.8％枸橼酸纳溶液抗凝(体积比为1∶9)，以900rpm离心10min，吸出上层血浆后，再以3000rpm离心10min制成血小板数为4～4.5×10/L，用比浊法测定血小板聚集率。实验时先取300μlPRP比浊管内，以PPP调透光率为100，将PRP放入预温孔中，加入ADP溶剂或药物10μl，37℃温育10min，依入检测孔中，加入ADP应用液10μl，记录最大聚集率。以如下公式计算抑制率。

4.2.3结果

表6水蛭提取物体外给药对PAF诱导的家兔血小板聚集的影响(±sd)

与模型组相比**P＜0.01。

结果表明水蛭提取物体外给药对ADP胶原所诱导的家兔血小板聚集具有显著的抑制作用，并在0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875、0.0094mg/ml范围内呈一定的剂量依赖性。

实验例5：水蛭提取物对MCAT大鼠凝血的影响

5.1实验材料

5.1.1药物与试剂

受试药、阳性药同试验例1。

试剂：PT、APTT为武汉中太生物技术有限公司产品，。

5.1.2动物

Wistar大鼠72只，雄性，体重190～210g，由山东大学实验动物中心提供，合格证编号：SCXK(鲁)-2003004。

5.1.3仪器

STA-R全自动血凝仪，法国Dignostica Stago公司产品。

400R低温离心机，德国Heraeus产品。

5.2方法与结果

5.2.1分组与给药

取Wistar大鼠72只，分为6组(即假手术组、MCAT模型组、水蛭提取物20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg组、血塞通注射液20mg/kg组)，每组12只，雌雄各半。造模前预防腹腔注射给药，每天一次，共两天；造模后给药一次。

5.2.2方法

大鼠腹腔注射3％异戊巴比妥0.1ml/100g麻醉。大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切除，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨和颞骨接合处靠近口侧1mm处作一直径2.5mm骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。置一小片塑料薄膜保护血管周围组织。将吸有50％三氯化铁溶液10μl的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。假手术组大鼠除不滴加三氯化铁溶液外，其余手术步骤同模型组。

于末次给药后4h颈总静脉放血，以3.8％枸橼酸纳(V/V为1∶9)抗凝，以1500rpm离心10min，在全自动血凝仪上分别测定凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)值。

5.2.3结果

水蛭提取物对MCAT大鼠凝血的影响结果组间比较，进行t检验，结果见表7。

表7水蛭提取物对MCAT大鼠凝血的影响(±sd)

与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

结果显示，水蛭提取物各个剂量组均能延长MCAT大鼠的APTT，而对MCAT大鼠的PT只有水蛭提取物高剂量组显示出较好的作用。

本发明个技术方案所制得的水蛭提取物均可以达到以上效果。

综上所述，本发明的水蛭提取物具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集及神经保护作用，对研制具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集或神经保护作用的药物具有一定的指导意义。

Claims (10)

1.一种水蛭提取物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

(1)取水蛭干燥全体粉碎成40～120目粉末，加入8～15倍量的水，或取水蛭鲜活全体，加入1～5倍量的水，匀浆；

(2)取匀浆液，调整pH至7～9，按每1g底物加入2000～20000U酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制温度40℃～60℃，酶解2～12小时，冷却至室温；

(3)向上述酶解液中加入1～5倍体积的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液减压回收，残渣加水溶解，微孔滤膜过滤；

(4)将上述滤液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，收集分子量小于5000Da的部分；

(5)将上述超滤液的pH调整至7.5～9.5，通过阴离子交换树脂，先用水或pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液或pH7～9、0.01～0.05mol/L的二乙醇胺-盐酸缓冲液冲洗，将冲洗液弃去，然后以0.1～2mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，脱盐，浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥即得到水蛭提取物。

2.根据权利要求1所述的水蛭提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为：取水蛭干燥全体粉碎成80～100目粉末，加入9～13倍量的水；或用水蛭鲜活全体，加入2～4倍量的水。

3.根据权利要求1所述的水蛭提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)为：取匀浆液，调整pH为8～9，按每1g底物加入5000～10000U蛋白酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制温度45℃～55℃，酶解4～10小时，冷却至室温。

4.根据权利要求1所述的水蛭提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)为：向酶解液中加入2～4倍体积的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，过滤，取滤液60℃以下减压回收溶媒，残渣加水溶解，微孔滤膜过滤。

5.根据权利要求1所述的水蛭提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，阴离子交换树脂是以纤维素为基质的阴离子交换树脂、以葡聚糖为基质的阴离子交换树脂或以琼脂糖为基质的阴离子交换树脂中的任一种；所述用于洗脱的氯化钠溶液为0.1～2mol/L的氯化钠水溶液或含0.1～2mol/L氯化钠的pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-盐酸缓冲液或含0.1～2mol/L氯化钠的pH7～9、0.01～0.05mol/L三乙醇胺-盐酸缓冲液；所述脱盐采用钠滤法或葡聚糖凝胶法。

6.一种水蛭提取物，其特征在于：所述水蛭提取物是以权利要求1所述方法制得的。

7.权利要求6所述水蛭提取物在制备具有抗凝作用药物中的应用。

8.权利要求6所述水蛭提取物在制备具有溶栓作用药物中的应用。

9.权利要求6所述水蛭提取物在制备具有抑制血小板聚集作用药物中的应用。

10.权利要求6所述水蛭提取物在制备具有神经保护作用药物中的应用。