CN103520193A - 一种药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种药物组合物，其组份包括：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rc、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg3。本发明还提供所述药物组合物的制备方法。本发明所述药物组合物成分明确，与现有技术的三七总皂苷相比质量稳定、可控性好，急性毒性、异常毒性、溶血等试验结果表明，本发明所述药物组合物安全性更高，具有广泛的临床应用前景。

Description

一种药物组合物及其制备方法

本申请为2009年9月24日提交中国专利局、申请号为200910175602.x、发明名称为“一种药物组合物及其制备方法”的中国专利申请的分案申请，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种药物组合物及其制备方法。

背景技术

三七与人参、西洋参同属五加科人参属，三者均为名贵中药材。近代对三七与人参的化学成分研究表明，三七皂苷与人参皂苷近似，均以达玛烷型皂苷为主，但三七的总皂苷含量高，在皂苷组成方面有意义的人参皂苷Rb1和Rg1均高于人参。

皂苷是三七主要活性成分之一，此外，还含止血有效成分三七素，以及多糖、氨基酸、挥发油、黄酮及微量元素等。从三七中提取分离得到的单体皂苷有人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、三七皂苷R1、R2、R4等，三七中的不同皂苷其药理作用各不相同，各组份间有的具有协同增效作用，有的起拮抗作用，从而使三七总皂苷表现出的药理作用很独特。本发明多组份组合物三七总皂苷含有可定量的十个组份外，还含其它多种组份，因此，也应具有广泛的药理作用。从三七总皂苷的药理文献资料可知其具有以下各方面的药理作用：

1.对心血管系统的作用

（1）对心脏的作用：人参皂苷Rbl和人参皂苷Re均可减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡,而人参皂苷Rbl的效果优于人参皂苷Re；人参皂苷Re对心肌缺血造成的心脏损害,有显著的保护作用；人参皂苷Rbl可能具有抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。另有报道三七皂苷能扩张冠脉,增加冠脉血流量,三七总皂苷能增加心肌营养血流量，改善心肌微循环，明显降低心肌耗氧量；三七总皂苷还被证明是三七治疗缺血性心脏病的基础。

（2）对血管、血压的作用：人参二醇组皂苷可致血压明显下降,三醇组皂苷可引起血压升高。据报告,人参皂苷Re及Rg1对狗血管呈扩张作用,Rb2、Rc仅有微弱血管扩张,认为Rg1引起降压前的升压作用最大。三七有扩张血管、降低血压作用，目前普遍认为三七总皂苷是钙通道阻滞剂。同时，三七能扩张脑血管，降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善脑血循环，对脑缺血损伤有保护作用。

（3）抗休克作用：人参二醇组皂苷能抑制血管紧张素转化酶的活性，改善微循环，增加有效循环血量，提高休克犬的存活率。人参三醇皂苷具有抗休克作用，快速改善心肌缺血和缺氧，治疗和预防冠心病。三七总皂苷能降低耗氧量和抗实验性心肌缺血提示其可能具有抗休克和改善休克时心功能障碍的作用；三七总皂苷对兔失血性休克及肠道缺血性休克具有一定疗效。

（4）抗心律失常：人参二醇组皂苷能降低离体大鼠右心房的自律性,在治疗量时对多种模型的心律失常均有明显的对抗作用。三七总皂苷对几种实验性心律失常模型(氯仿诱发的小鼠心室纤颤、氯化钡和乌头碱诱发的心律失常)均有明显对抗作用。还有实验证明三七中人参三醇苷对整体大鼠结扎冠脉诱发心肌缺血及再灌注损伤所致心律失常具有明显的抑制作用。

2.对血液和造血系统的影响

现代药理学研究表明三七不但具有良好的止血、活血化瘀双向药理作用，还具有明显的补血作用，能促进血液中红细胞、白细胞、血小板等各类血液细胞分裂生长，增加数目，并保持正常水平。三七总皂苷对家兔、大白鼠实验性血栓形成均有明显抑制作用；静脉注射可以明显抑制凝血所致弥漫性血管内凝血、动物血小板数目的下降和纤维蛋白降解产物的增加。三七总皂苷还可明显降低冠心病患者的血小板黏附和聚集，亦可改善微循环，抗血栓形成。

3.对中枢神经系统的作用

人参皂苷Rg类有中枢兴奋作用,Rb类呈镇静作用；Rg1与学习过程有关，而Rb1与记忆和安定作用有关。

（1）益智作用：三七皂苷Rg1和Rb1能显著增强小鼠的学习和记忆能力，对亚硝酸钠及40%乙醇造成的小鼠记忆不良均有不同程度的对抗作用。

（2）镇静、镇痛作用：三七总皂苷、三七单体Rb1均有显著的镇静作用，并能协同中枢抑制药的抑制作用，同时，对化学性和热刺激性引起的疼痛均有明显的镇痛作用。

（3）对神经细胞的作用：人参皂苷Rb1对缺血性脑损伤有保护作用，但并不呈剂量依赖性；实验发现低浓度人参皂苷Rbl对诱导细胞增殖有明显促进作用，高浓度则显示抑制作用。实验观察三七总皂苷对模型细胞的保护作用，发现三七总皂苷对能量代谢障碍引起的神经细胞损伤有保护作用。人参皂苷Rb1可能是三七对神经细胞起保护作用的主成分之一。

对脑出血受损神经元的保护作用，对脑缺血性损伤的保护作用，对脊髓损伤后的保护作用，对老年性痴呆病理损害的保护作用。

4.对免疫系统的作用：有研究表明人参皂苷Rg3在体外能明显增强自然杀伤(NK)细胞的吞噬活性，而NK细胞的吞噬功能属于机体非特异性免疫功能；人参皂苷Rbl可以增强体液免疫。

5.抗衰老作用：三七总皂苷具有抗衰老、预防动脉硬化的作用，其中二醇型皂苷具有清除氧自由基的作用，而人参皂苷Rg1则通过抗氧化作用和抑制胞内钙超载，从而抑制神经细胞凋亡和前炎因子增多，延缓衰老。

6.抗肿瘤作用：三七总皂苷可通过直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长或转移、诱导肿瘤细胞凋亡或诱导肿瘤细胞分化使其逆转、增强和刺激机体免疫功能等多种方式起到抗肿瘤作用。另外，人参皂苷Rg3、Rh2的抗癌作用也有相关报道。

7.对糖代谢的影响：三七皂苷有升高或降低血糖的作用，且三七皂苷对血糖的影响取决于动物状态及机体血糖水平，因而具有自动双向调节血糖的功能。

8.促进视网膜节细胞再生。

9.抗纤维化：抗肝纤维化，抗肺纤维化，防治肾间质纤维化。

10.抗炎作用：对多种实验性炎症模型有良好的抗炎活性。

2009年03月25日公开的发明专利“三七总皂苷的药物组合物”，该发明申请保护的组合物以三七中的五个主要皂苷成分：人参皂苷Rb1、Rg1、Rd、Re及三七皂苷R1为基础，再组合人参皂苷Rb2或Rb3或Rb2和Rb3。专利中还说明了组合物的制备方法，该发明采用的是先分离提纯各组份，再将它们混合的方法，这不仅弃去了许多有效成分，还使其制备成本相当高。

另外，现有技术三七总皂苷含有5种可定量组份，总含量为65%～80%,还含有相当比例的未知杂质，这些杂质的药物间相互作用不明确，从而在临床的质量控制及应用方面带来诸多问题，增加了不良反应如皮肤过敏、寒战、丘疹、心悸、气短等的发生概率。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的三七总皂苷杂质含量高、副作用多的缺陷，提供一种药物组合物，其有效成分含量可定量，可定量的皂苷组份、氯化钠及总氨基酸的总含量大于90%，质量稳定可控，安全性高。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种药物组合物，其组份包括：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rc、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg3。

所述药物组合物各组分优选的重量百分比为：

优选地，本发明药物组合物还有重量百分比为0.1%-1.0%的氯化钠。

更优选地，本发明药物组合物还含有重量百分比为0.2%-1.2%的总氨基酸。

本发明所述药物组合物经过常规加工直接或间接加入药学上可接受的辅料制成注射液、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸、合剂、糖浆剂。

在本发明的实施例中，具体提供一种三七总皂苷注射剂及其制备方法，该注射剂与现有的三七总皂苷注射剂相比，结构明确组份增加、结构明确组份含量明显提高、质量更稳定可控、安全性更好。

本发明还提供所述组合物在制备治疗冠心病、脑卒中、心绞痛、高血压、高血脂、视网膜中央静脉栓塞的药物中的应用。

为了克服现有技术制备方法复杂且成本高的缺陷，本发明还提供所述药物组合物优选由下述制备方法制成：

步骤1：三七用60%-85%乙醇浸润，磨碎成粗粉，加乙醇回流提取2～4次，每次0.5～2小时，收集提取液，过滤；

步骤2：取滤液回收乙醇，上大孔吸附树脂柱，依次用水和60%～80%的乙醇液洗脱，将醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，60%～80%乙醇液洗脱，将洗脱液减压浓缩，上三氧化二铝柱，70%-80%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩；

步骤3：将步骤2所得浓缩液再用丙酮重结晶精制，干燥，即得本发明所述三七总皂苷。

更优选地，步骤1回流步骤所用乙醇浓度为60%～85%。

更优选地，步骤1回流步骤所用乙醇用量为三七重量的5～13倍。

药材来源，五加科植物三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）的干燥根及根茎。本发明所述方法制备的药物组合物，其有效成分含量可定量，可定量皂苷组份、氯化钠及总氨基酸的总含量大于90%，质量稳定，可控性增强，安全性提高。

本发明对三七中的皂苷部分进行整体的提取分离，在去除杂质的同时尽量保留较多的有效成分，以及调整提取物中主要皂苷组份的比例，采用丙酮精制步骤使主要成分保持人参皂苷Rb1的含量比人参皂苷Rg1高5%～10%，在保证药效的同时使二者在不良反应方面有互相抑制作用。

与市售的三七总皂苷相比，本发明所述药物组合物的优点在于：

1.经毒理、药理实验证明，最大耐受量与半数致死剂量均明显提高；

2.还具有提高衰老状态下内源性抗氧化酶活性，清除体内氧自由基，提高机体的免疫功能的作用；

3.改善缺血心肌的血流动力学功能以及心肌缺氧耐受功能；

4.可降低MDA含量、提高SOD活力，减轻自由基反应对脑组织的损害，对缺血脑组织发挥保护作用；

5.本发明所述药物组合物中人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1的比例即可保证药效的发挥，又能避免溶血不良反应的发生。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例不是对本发明的限定。

实施例1、制备本发明所述药物组合物

称取三七10公斤，用重量比1倍量的60～85%乙醇浸润、泡软，湿法磨碎成粗粉，分别加干药材重量5、6、6倍的70%乙醇，回流提取3次，每次1小时，收集提取液，过滤。取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0.5g生药的溶液，上大孔吸附树脂柱D101或HPD100，分别用水、70%乙醇液洗脱，醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，70%乙醇液洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，洗脱液浓缩，上三氧化二铝柱，85%乙醇洗脱，洗脱液浓缩。再以丙酮重结晶精制，干燥，得本发明所述药物组合物。

有效成分含量测定

对照提取物溶液的制备：精密称取在60℃减压干燥2小时的三七总皂苷对照提取物适量，加70%甲醇溶解，制成每1ml含2.5mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品适量，加70%甲醇溶解并稀释成每1ml含三七总皂苷2.5mg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照提取物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml（4.6×150mm，5μm）或1.5ml（4.6×250mm，5μm）；检测波长为203nm；柱温25℃。人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度应大于1.5，理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

氯化钠测定方法：

按GB/T 5009.40-2003方法，采用等离子体发射光谱仪测定。

氨基酸测定方法：

按GB/T 5009.124-2003方法，采用氨基酸分析仪测定。

结果：各组份含量为：人参皂苷Rb1：34.1%，人参皂苷Rg1：28.6%，三七皂苷R1：9.1%，人参皂苷Rd：7.2%，人参皂苷Re：5.1%，人参皂苷Rh1：1.7%，人参皂苷Rc：1.2%，人参皂苷Rg3：1.2%，人参皂苷Rb2：1.1%，人参皂苷Rf：0.9%，氯化钠：0.6%，氨基酸：0.9%，上述各组份总含量为91.7%。

实施例2 制备本发明所述药物组合物

称取三七10公斤，用重量比1倍量的60～85%乙醇浸润、泡软，湿法磨碎成粗粉，加重量为药材重量8、10、10倍的80%乙醇，回流提取3次，每次1小时，收集提取液，过滤。取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0.5g生药的溶液，上大孔吸附树脂柱，分别用水、75%乙醇液洗脱，醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，75%乙醇液洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，洗脱液浓缩，上三氧化二铝柱，80%乙醇洗脱，洗脱液浓缩。再以丙酮重结晶精制，干燥，得本发明所述药物组合物。

有效成分含量测定方法、条件同实施例1。

结果：各组份含量为：人参皂苷Rb1：36.5%，人参皂苷Rg1：27.3%，三七皂苷R1：8.9%，人参皂苷Rd：9.7%，人参皂苷Re：4.9%，人参皂苷Rh1：2.0%，人参皂苷Rc：1.6%，人参皂苷Rg3：1.3%，人参皂苷Rb2：1.0%，人参皂苷Rf：0.8%，氯化钠：0.5%，氨基酸：0.8%上述各组份总含量为95.3%。

实施例3 制备本发明所述药物组合物

称取三七10公斤，用重量比1倍量的85%乙醇浸润、泡软，湿法磨碎成粗粉，每次加重量为干药材重量13倍的85%乙醇，回流提取4次，每次2小时，收集提取液，过滤。取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0.5g生药的溶液，上大孔吸附树脂柱，分别用水、80%乙醇液洗脱，醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，80%乙醇液洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，洗脱液浓缩，上三氧化二铝柱，80%乙醇洗脱，洗脱液浓缩。再以丙酮重结晶精制，干燥，得本发明所述药物组合物。

有效成分含量测定方法、条件同实施例1。

结果：各组份含量为：人参皂苷Rb1：40.0%，人参皂苷Rg1：35.0%，三七皂苷R1：7.0%，人参皂苷Rd：7.0%，人参皂苷Re：4.0%，人参皂苷Rh1：0.5%，人参皂苷Rc：0.5%，人参皂苷Rg3：0.5%，人参皂苷Rb2：0.5%，人参皂苷Rf：0.3%，氯化钠：0.1%，氨基酸：0.2%。上述各组份总含量为95.6%。

实施例4 制备本发明所述药物组合物

称取三七10公斤，用重量比1倍量的60%乙醇浸润、泡软，湿法磨碎成粗粉，每次加干药材重量5倍的80%乙醇，回流提取2次，每次0.5小时，收集提取液，过滤。取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0.5g生药的溶液，上大孔吸附树脂柱，分别用水、60%乙醇液洗脱，醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，60%乙醇液洗脱，收集乙醇洗脱部分，减压浓缩，洗脱液浓缩，上三氧化二铝柱，70%乙醇洗脱，洗脱液浓缩。再以丙酮重结晶精制，干燥，得本发明所述药物组合物。

有效成分含量测定方法、条件同实施例1。

结果：各组份含量为：人参皂苷Rb1：30.0%，人参皂苷Rg1：25.0%，三七皂苷R1：15.0%，人参皂苷Rd：10.0%，人参皂苷Re：7.0%，人参皂苷Rh1：3.0%，人参皂苷Rc：2.0%，人参皂苷Rg3：2.0%，人参皂苷Rb2：3.0%，人参皂苷Rf：1.0%，氯化钠：1.0%，氨基酸：0.2%。上述各组份总含量为99.2%。

实施例5 本发明所述药物组合物注射液的制备

取实施例1所得药物组合物，加配制量30～50%注射用水，充分搅拌使溶解完全，加入适量针用活性炭，先用包有滤纸的砂棒粗滤，冷藏过滤，加水至总量，加入适量针用活性炭吸附，用0.1mol/L氢氧化钠调pH值至6.0～7.0，滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，取样检验pH值及含量等项。用0.2μm孔径过滤器精滤，灌装，熔封，灭菌即得。

有效成分含量测定方法、条件同实施例1。

结果：各成分含量为人参皂苷Rb1：33.5%，人参皂苷Rg1：28.5%，三七皂苷R1：9.0%，人参皂苷Rd：7.9%，人参皂苷Re：5.2%，人参皂苷Rh1：1.5%，人参皂苷Rc：1.0%，人参皂苷Rg3：1.1%，人参皂苷Rb2：1.0%，人参皂苷Rf：0.6%，氯化钠：0.6%，氨基酸：0.9%，上述各组份总含量为90.8%。

实施例6 本发明所述药物组合物注射用冻干粉针剂的制备

取实施例2所得药物组合物，加新鲜注射用水适量，充分搅拌使溶解完全，使三七总皂苷浓度约为10%。加入适量氯化钠，充分搅拌使溶解，再加入与氯化钠等量的甘露醇，充分搅拌使溶解完全。加入适量针用活性炭，搅拌吸附30分钟，先用包有滤纸的砂棒过滤除去活性炭，滤液再经0.45μm微孔滤膜过滤。取样检验pH值及含量等项。总配药液用0.1mol/L氢氧化钠调pH值至6.0～7.0，用0.2μm孔径过滤器精滤，灌装，冷冻干燥，压塞，轧盖，即得。

有效成分含量测定方法、条件同实施例1。

结果：各成分含量为人参皂苷Rb1：36.8%，人参皂苷Rg1：27.5%，三七皂苷R1：9.1%，人参皂苷Rd：9.2%，人参皂苷Re：5.1%，人参皂苷Rh1：2.0%，人参皂苷Rc：1.1%，人参皂苷Rg3：1.1%，人参皂苷Rb2：1.0%，人参皂苷Rf：0.8%，氯化钠：0.6%，氨基酸：0.8%，上述各组份总含量为95.1%。

实施例7 本发明所述药物组合物的药效学研究

1、对心肌缺血大鼠血流动力学的影响

实验动物：选用Wistar大鼠60只，雄性，体质量250～300g。

药物与试剂：实施例1样品，三七总皂苷（市售）；0.9%氯化钠注射液、戊巴比妥钠注射液。

仪器：MP-100多导生理记录仪、电子分析天平。

造模：大鼠给3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，将大鼠仰位固定于自制鼠板上；胸部剪毛，将心电图电极针埋在左下肢及右上肢皮下，沿左侧第7肋间剪开皮肤，少量剥离胸肌，剪开心包，将心脏轻轻挤压出胸壁外，分离左冠状动脉前降支（LAD），在离LAD起始部2mm处穿线（用穿有5-0缝合线的3/8弯针钩）后，把心脏迅速放回胸腔，术后稳定10min左右，结扎冠状动脉，立即做心电图，进行记录并缝合。心电图显示ST段显著抬高或异常T波时；即表明急性心肌缺血造模成功。30只大鼠完成了本实验，实验中有20只大鼠因手术死亡或结扎后心电图没有明显变化(心电图Ⅱ导联ST段没有抬高)退出研究。

实验分组：将急性心肌缺血模型大鼠30只；随机分为模型组、实施例1组、市售三七总皂苷组，共3组；另将10只未造模的同龄大鼠作为假手术组。

观察方法：给药组按60mg/kg·d灌服，假手术组及模型组灌服等量生理盐水，共7d。各组分别治疗至时间终点；再次戊巴比妥钠腹腔麻醉。首先静脉推注肝素全身抗凝；手术分离股动脉和右颈总动脉。后应用十六导生理记录仪检测心脏血流动力学参数。股动脉插管记录动脉收缩压（SBP）和动脉舒张压（DBP），右颈总动脉插管至左心室记录压力曲线；记录心率（HR）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室最大收缩（+）和舒张（-）速率(±dp/dt max)，结果见表2。

结果:模型大鼠心电图的影响结扎大鼠冠脉前降支后，各组S-T段明显抬高，与假手术组相比，P<0.05，但各组间无明显差异。3小时后S-T段下降，下降的波幅度以实施例1组明显，但与模型组比较无统计学差异。见表1。

表1 各组心电图S-T段变化波幅比较

组别	n	结扎后	△S-T
				假手术组	10	0±0	0±0
模型组	10	0.341±0.066	0.052±0.028
				实施例1组	10	0.407±0.113	0.062±0.037

市售注射液组

10

0.298±0.097

0.054±0.022

注：与假手术组相比，P<0.05，△S-T=结扎后3h下降幅度。

表1结果表明，模型组的左室舒张末期压（LVEDP）明显高于假手术组，两组比较有统计学差异，P<0.05；各给药组的LVEDP明显低于模型组，与模型组比较有统计学差异，P<0.05。

表2 各给药组对心功能的影响

表2结果表明：模型组±dp/dt max明显低于假手术组，两组比较有统计学差异，P<0.05，实施例组±dp/dt max明显高于模型组、LVEDP明显低于模型组，与模型组相比较有统计学差异，P<0.05，市售三七总皂苷组±dp/dt max高于模型组，与模型组比较有统计学差异，P<0.05，提示可提高心室壁顺应性，改善心脏功能。HR等参数各组比较无统计学差异。

本实验显示，模型组与假手术组相比，±dp/dt max降低、LVEDP升高，这与梗死后心脏前负荷增加有关。同时给药组均能在一定程度上改善左室收缩及舒张功能，其中实施例1组作用最明显。

参照上述实验方案，对实施例1-6其他的药物组合物进行心肌缺血大鼠血流动力学的影响试验，结果表明，与实施例1的样品的结果相似，组间差别无统计学意义。

实施例8、本发明所述药物组合物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

实验动物：健康Wistar大鼠40只，雌雄兼用，体重(280～320)g。按性别、体重，随机分为4组(10只/组)，每组雌雄比例接近，即假手术组、模型组、尼莫地平对照（Nim）组、实施例2样品组。

造模：取5cm长3.0号钓鱼用单尼龙线，头端快速加热使之成光滑球面，在距头端18㎜处作标记，置肝素生理盐水中浸泡备用。以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射(ip)麻醉，颈部正中切开，钝性分离至颈前肌，于右侧颈前肌旁分离右侧颈总动脉（CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，沿ICA分离结扎翼腭动脉(PPA)，分离过程中电凝血管小分支以防出血，结扎并切断ECA两分支枕动脉、甲状腺上动脉，结扎并分离ECA主干一段,用动脉夹暂时阻断CCA和ICA血流，轻轻向下拉ECA残端，在ECA近CCA交界处剪一小切口，将制备好的尼龙线栓子经ECA切口缓慢向ICA入颅方向推进，以CCA分叉处为标记，尼龙线插入深度距分叉处(18.5±0.5)mm，即阻断大脑中动脉。术毕缝合皮下组织和皮肤,外留1cm长尼龙线头。阻断2h后，轻轻提拉所留线头至有阻力时，提示尼龙线头端已至颈外动脉残端，血流再通，再灌注24h，假手术组除不插尼龙线外其余步骤同上。

给药方法：各组于缺血前5min第一次ip给药，以后每隔12h给药1次，共给药4次，实施例2组以三七总皂苷计给药剂量为25mg/kg，尼莫地平注射液给药剂量为1mg/kg，均为临床等效剂量；假手术组和模型组给予等体积生理盐水。

指标测定

(1)脑梗死灶测量缺血再灌注实验末取出鼠脑，冠状面均匀切成2mm厚脑组织片5～6片，置于2%TTC磷酸缓冲液37℃浸染10min。正常脑组织染成红色、缺血区呈灰白色，境界清晰。将各脑切片置于玻璃平板与扫描平板之间，应用扫描仪进行图像采集，然后用计算机图像分析系统测量每个切片的面积、脑梗死面积(TTC不着色区)，计算脑梗死占每片脑面积百分比。亦可分离梗死组织与正常组织，分别称重，计算梗死组织占每片湿重的百分率。

(2)脑组织含水量于缺血2h再灌注24h末快速取出鼠脑，将梗死侧脑用滤纸吸干表面水分称重后，置160℃烤箱中烘干至恒重，按下式计算脑组织含水量：含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

(3)脑组织MDA含量、SOD 活性测定 缺血再灌注实验末快速断头取脑，用冰生理盐水制成10%的匀浆，3000r/min离心15min取上清液，全部分离过程在0～4℃下进行。测定MDA含量、SOD活性。采用硫代巴比妥酸盐法测定MDA含量，邻苯三酚自氧化法测定SOD活性，考马斯亮兰法测定上清液蛋白含量，按试剂盒说明书操作进行。

结果

（1）脑梗死灶测量及脑组织含水量

模型组与假手术组比较，脑组织含水量显著增加(P<0.01)；实施例2组与模型组比较,脑组织含水量减少(P<0.01)，脑梗死面积显著减小(P<0.05)。结果见表3。

表3 脑组织含水量及梗死范围

组别	n	脑含水量(%)	脑梗死范围(%)
				假手术组	10	75.02±0.51	0
模型组	10	83.20±0.33▲▲	30.62±3.2
				Nim组	10	76.85±20.01**	14.43±0.32**

实施例2组

10

76.05±0.15**

17.42±5.02*

注:与假手术组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01；与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

（2）脑细胞SOD活力及MDA含量的变化

模型组与假手术组比较，SOD活力显著降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)；实施例2组与模型组比较，SOD活力显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 脑细胞SOD活力及MDA含量

组别	n	SOD(NUPmg·prot)	MDA(nmolPmg·prot)
				假手术组	10	288.01±23.81	4.43±0.17
模型组	10	105.20±10.03▲▲	12.82±0.21▲▲
				Nim组	10	142.35±20.01**	8.63±1.02*
实施例2组	10	122.85±25.12*	6.02±1.02*

本研究结果显示，模型组与假手术组比较，脑组织含水量显著增加(P<0.01)；实施例2组与模型组比较，脑组织含水量减少(P<0.01)，脑梗死面积显著减小(P<0.05)，提示实施例2样品对局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用。本研究结果显示，模型组与假手术组比较，SOD活力显著降低(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01)；实施例1组与模型组比较，SOD活力显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。提示实施例2样品可降低MDA含量、提高SOD活力，减轻自由基反应对脑组织的损害，对缺血脑组织发挥保护作用。

参照上述实验方案，对实施例1-6其他的药物组合物进行对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用试验，结果表明，与实施例2的样品的结果相似的，组间差别无统计学意义。

实施例9.本发明所述药物组合物的抗衰老作用

实验分组：选取2月龄左右,体重(200±20)g,清洁级SD健康大鼠36只,雌雄各半。将实验大鼠随机分成3组,即青年对照组、衰老模型组、实施例3组,每组12只。

动物模型的建立：将大鼠适应性喂养1w后，衰老模型组、实施例3组皮下注射25%的D-半乳糖溶液125mg/kg·d-1，连续40d；青年对照组每日皮下注射等剂量0.9%生理盐水1次，连续40d。

实验方法：取实施例3样品适量加蒸馏水至100ml，用力振摇溶解，每1ml溶液含三七总皂苷12mg。

给药方法：实施例3组在造模同时给予实施例3样品溶液，每只大鼠按成年人每日剂量的20倍灌胃给药，连续40d。青年对照组和衰老模型组在相同条件下每日均喂普通饲料，自由摄食。

标本采集：将大鼠固定好，剪开腹股沟动脉处皮毛，局部消毒，分离并剪断腹股沟动脉，血全部放入塑料离心管中，4℃以3000r/min离心10min，吸取血清用于IL-2、IL-6含量及SOD活性、MDA含量测定。采血后，断颈处死大鼠，立即剖腹取出肝脏，剥离干净，生理盐水冲洗，滤纸吸干，液氮冻存(-196℃)备用，用于测定线粒体DNA含量。

指标及测定方法：肝细胞mtDNA相对含量测定(SDS碱变性法检测)。血清SOD活性测定(采用黄嘌呤氧化酶法测定)，血清MDA含量测定(采用硫代巴比妥酸显色法测定)，试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。血清IL-2含量测定(用ELISA法)，血清IL-6含量测定(用ELISA法)，试剂盒均由深圳晶美生物工程有限公司提供。

结果：

（1）各组肝细胞mtDNA相对含量比较

造模40d后，衰老模型组与青年对照组比较，肝细胞mtDNA相对含量明显升高，有显著性差异(P<0.05)；实施例3组与衰老模型组比较，肝细胞mtDNA相对含量明显降低,有显著性差异(P<0.05)。结果见表5。

表5 各组肝细胞mtDNA相对含量比较

组别	n	肝细胞mtDNA
			青年对照组	12	1.075 0±0.296 17
衰老模型组	12	4.190 0±0.537 11*
			实施例3组	12	3.265 0±1.008 65△

注：与青年对照组相比，*P<0.05；与衰老模型组相比，△P<0.05。

（2）各组血清SOD活性、MDA含量比较

造模40d后，衰老模型组与青年对照组比较，血清SOD活性明显降低，血清MDA含量明显升高，有显著性差异(P<0.05)；实施例3组与衰老模型组比较，血清SOD活性明显升高，血清MDA含量明显降低，有显著性差异(P<0.05)。结果见表6。

表6 各组血清SOD活性、MDA含量比较

组别	n	SOD活性	MDA含量
				青年对照组	12	596.095 0±45.491 80	7.932 5±0.600 35
衰老模型组	12	286.055 8±20.225 36*	12.156 7±0.895 67*
				实施例3组	12	349.170 8±77.237 40△	11.205 0±1.222 07△

注：与青年对照组相比，*P<0.05；与衰老模型组相比，△P<0.05

（3）各组血清IL-2、IL-6含量比较

造模40d后，衰老模型组与青年对照组比较，血清IL-2含量明显降低，血清IL-6含量明显升高，有显著性差异(P<0.05)；实施例3组与衰老模型组比较，血清IL-2含量明显升高，血清IL-6含量明显降低，有显著性差异(P<0.05)。结果见表7。

表7 各组血清IL-2、IL-6含量比较

组别	n	IL-2(ng/mL)	IL-6(pg/mL)
				青年对照组	12	7.52±1.08	117.67±11.80
衰老模型组	12	5.64±1.46*	140.24±18.23*
				实施例3组	12	7.04±1.71△	124.65±12.96△

注：与青年对照组相比，*P<0.05；与衰老模型组相比，△P<0.05。

实验结果表明，实施例3样品能够提高衰老状态下大鼠血清SOD活性，降低衰老大鼠肝细胞mtDNA的相对含量及MDA含量；同时还能够增加衰老状态下大鼠血清IL-2含量，降低IL-6含量，说明三七总皂苷具有提高衰老状态下内源性抗氧化酶活性，清除体内氧自由基，保护肝细胞mtDNA，提高机体的免疫功能，从多方面延缓机体衰老的作用。

参照上述实验方案，对实施例1-6其他的药物组合物进行抗衰老试验，结果表明，与实施例3的样品的结果相似，组间差别无统计学意义。

实施例10、本发明所述药物组合物对大鼠慢性高眼压视网膜损伤的保护作用

实验动物：健康Sprague-Dawlay大鼠42只，雌雄不限，体重200～240g，8～12周龄，经检查无明显歪颈，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圆，对光反应灵敏。适应性驯养3天后连续测3天眼压，剔除平均眼压高于或低于正常眼压区间(9～16mmHg)者。

动物分组及给药：6只为正常对照组，6只为正常用药组(实施例4样品按三七总皂苷计200mg/kg)，其余30只按Akira法烙闭大鼠右眼上巩膜静脉，制作大鼠持续性高眼压模型，观察10天眼压稳定在30mmHg以上者纳入实验。随机分为生理盐水组、量效关系组，分别给予实施例4样品按三七总皂苷计50mg/kg(A组)、100mg/kg(B组)、150mg/kg(C组)和200mg/kg(D组)，灌胃治疗1个月，每日1次。每周测量眼压1次。各组实验期满后取视网膜做全层铺片，甲酚固紫染色行RGCL神经元计数。

计算机图像分析：每张待测视网膜铺片通过视乳头对称画线，将其分为颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限，将每一象限视网膜分为3等份，即中央、中间及周边3区，各分区随机取3个点，每点面积为32500μm2，对每点的视网膜神经元细胞进行计数后换算成每平方毫米的细胞数(细胞数/mm2)，将每区3点细胞密度的均数作为该区的神经元密度。通过形态学易于辨别RGCL中的血管内皮细胞，具有浓染的核且无尼氏物质的细胞为胶质细胞，这两种细胞均不纳入RGCL神经元计数。

结果

正常SD大鼠右眼及左眼RGCL神经元计数分别为347710±12716/mm2及348811±9112/mm2，双眼比较差异无显著性(P>0.05)。且从中央区到周边区神经元计数逐渐减少。正常对照组与正常给药组比较差异无显著性(P>0.05)，正常对照组与各浓度治疗组实验眼RGCL计数差异均有显著性(P<0.05)，各浓度治疗组实验眼与其自身对照眼RGCL计数差异均有显著性(P<0.05)，生理盐水组与C组实验眼RGCL计数差异有显著性(P<0.05，见表8)。

表8、各实验组双眼RGCL神经元计数

组别	眼数	右眼	左眼
				正常对照组	6	347710±12716	348811±9113
正常给药组	6	345615±10915	346618±11319
				生理盐水组	6	216617±1011911	346319±12112

A组	6	216116±1011111	352311±11615
				B组	6	221514±911311	350515±12113
C组	6	245615±981111	350615±12817
				D组	6	223610±861311	346715±13517

注:1)与正常组及自身对照眼比较差异有显著性意义(P<0.05)；2)两者比较差异有显著性意义(P<0.05)，按神经元直径(d)将其分为小(d≤8μm)、中(8～14μm)、大(d≥14μm)3组。正常组、生理盐水组及C组RGCL大神经元两两比较差异均有显著性(P<0.01),即大神经元对高眼压视神经损伤更敏感(见表9)。

表9、各组RGCL大、中、小神经元计数

组别	眼数	细胞数/mm2	小神经元	中神经元	大神经元
						对照组	6	347710±12716	104617±11413	208612±12116	34411±431311）
盐水组	6	216617±10119	101619±8314	108316±9317	6612±81011）
						C组	6	245615±9811	100512±9611	134514±11914	10519±91711）

注:1)两两比较差异均有显著性(P<0.01)

参照上述实验方案，对实施例1-6其他的药物组合物进行对大鼠慢性高眼压视网膜损伤的保护试验，结果表明，与实施例4的样品的结果相似，组间差别无统计学意义。

实施例11．本发明所述药物组合物的急性毒性试验

受试药物：实施例3样品，市售血塞通注射液。对照品：25％葡萄糖注射液，20ml/瓶，

实验动物：SPF级ICR小鼠，雌雄各100只，3～4周龄，体重18.0～22.0g。

试验方法：根据预试验结果，以500mg/kg体重的剂量为最高剂量，以0.85的剂间比向下设4个剂量，共5组，试验过程中可根据动物死亡情况上下设置剂量。小鼠静脉注射给药后至少连续观察4小时，以后每天至少观察一次，连续14天。主要观察动物饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应症状及其起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆及恢复时间等。给药前及给药后第3、7、14天称体重。解剖观察：对观察期死亡的动物和观察结束后脱颈椎处死的动物进行解剖，观察各组织和器官的体积、颜色、质地等有无异常。组织病理学检查：如解剖观察到组织、器官出现异常时，及时取材进行组织病理学检查。

结果：采用小鼠一次静脉注射LD50测定试验，观察、比较实施例3与市售血塞通注射液的急性毒性反应。结果显示：实施例3样品小鼠单次静脉注射的LD50为383mg/kg，最大耐受量为256mg/kg，市售血塞通注射液小鼠单次静脉注射的LD50为293mg/kg，最大耐受量为187mg/kg。说明实施例3样品小鼠的最大耐受量与半数致死剂量均高于市售血塞通注射液。

参照上述实验方案，对实施例1-6其他的药物组合物进行急性毒性试验，结果表明，与实施例3的样品的急毒结果相似的，组间差别无统计学意义。

实施例12．本发明所述药物组合物的异常毒性试验

参照《中国药典》2005版一部附录ⅩⅧB异常毒性检查法，对实施例4样品和市售注射用血塞通冻干粉针进行异常毒性检查，小鼠尾静脉缓慢注射供试液0.5ml（2.5mg）/只，给药小鼠饮食活动正常，饲养观察48h无死亡，两种样品的最大给药剂量分别为：实施例4样品：25mg/ml，市售注射用血塞通冻干粉针：12mg/ml，表明本发明制成的冻干粉针剂比市售的注射用血塞通冻干粉针异常毒性试验发生死亡的最小剂量要大一倍多。

上述两项试验结果表明，本发明产品在毒性和异常毒性两方面，与目前市售的三七总皂苷注射剂相比，毒性反应剂量明显提高，说明本发明产品在安全性方面有显著改善。

参照上述实验方案，对实施例1-6其他的药物组合物进行异常毒性试验，结果表明，与实施例4的样品的结果相似，组间差别无统计学意义。

实施例13．本发明所述药物组合物的溶血性试验

依据《中药、天然药物刺激性和溶血性研究技术指导原则》的试验方法进行溶血试验，观察本发明产品及相关三七总皂苷注射剂样品在不同浓度下的溶血与凝聚情况。

药物：本发明实施例3、实施例4样品，市售血塞通注射液、注射用血塞通。2%红细胞混悬液的制备：取兔血20-30ml，除去纤维蛋白原，加氯化钠注射液约10倍量洗涤，1500r/min离心15min，弃上清液，重复2-3次，直至上清液不显红色为止，弃上清液，将所得红细胞用氯化钠注射液配制成2%红细胞混悬液，供试验用。

供试液的制备：精密取实施例3、实施例4样品，分别加氯化钠注射液稀释/溶解为每1ml含15mg和25mg的溶液作为供试液。

检验方法：分别取试管7支，其中1～5号管为受试药物管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按下表所示加入2％红细胞混悬液、氯化钠注射液、蒸馏水，混匀后立即置于37℃±0.5℃的恒温水箱中进行温育。开始每隔15分钟观察一次，1小时后间隔1小时观察一次，连续24小时。

试管编号	1	2	3	4	5	6	7
								2%红细胞混悬液	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
氯化钠注射液	2.0	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5	0
								蒸馏水	0	0	0	0	0	0	2.5
受试药物	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	0	0

如试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。

如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物置于载玻片上，在载玻片边缘滴加2滴氯化钠注射液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为凝聚。

结果判断：

当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，15mg/ml若供试品第3管（0.3ml）中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，判供试品符合规定；若供试品管第3管（0.3ml）中的溶液在3小时内发生溶血和凝聚，判供试品不符合规定。

试验结果：本发明实施例3、实施例4样品在浓度高达25mg/ml浓度下第3管（0.3ml）中的溶液在3小时内没有发生溶血和凝聚，第1管（0.5ml）3小时开始发生溶血反应，第2管（0.4ml）5小时开始发生溶血反应；15mg/ml，浓度下未发生溶血反应。血塞通注射液及注射用血塞通在浓度为15mg/ml浓度时第2管（0.4ml）中的溶液在3小时已发生溶血反应，其它3、4、5管未发生溶血现象。

溶血是很多皂苷类成份的特性，三七总皂苷中人参皂苷Rg1有溶血作用，而人参皂苷Rb1则有抗溶血作用，因此，当二者比例适当时，既可保证药效的发挥，又能避免溶血不良反应的发生。本发明在三七总皂苷的制备充分考虑了二者的比例关系，因此，其溶血浓度远大于市售血塞通注射液，从而更能提高产品的安全性。

参照上述实验方案，对实施例1-5其他的药物组合物进行溶血试验，结果表明，与实施例3、4的样品的结果相似，组间差别无统计学意义。

附：

本分案申请对应的母案权利要求如下：

1.一种药物组合物，其组份包括：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rc、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg3。

2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组分的重量百分

比为：

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于还有重量百分比为0.1%-1.0%的氯化钠。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于还含有重量百分比为0.2%-1.2%的总氨基酸。

5.根据权利要求1或2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物经过常规加工直接或间接加入药学上可接受的辅料制成注射液、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸、合剂或糖浆剂。

6、权利要求1-5任一项所述药物组合物在制备治疗冠心病、脑卒中、心绞痛、高血压、高血脂、视网膜中央静脉栓塞的药物中的应用。

7.权利要求1-4任一项所述药物组合物的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：三七用60%-85%乙醇浸润，磨碎成粗粉，加乙醇回流提取2～4次，每次0.5～2小时，收集提取液，过滤；

步骤2：取滤液回收乙醇，上大孔吸附树脂柱，依次用水和60%～80%的乙醇液洗脱，将醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，60%～80%乙醇液洗脱，将洗脱液减压浓缩，上三氧化二铝柱，70%-80%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩；

步骤3：将步骤2所得浓缩液再用丙酮重结晶，干燥，即得本发明所述药物组合物。

8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1回流步骤所用乙醇浓度为60%～85%。

9、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1回流步骤所用乙醇用量为三七重量的5～13倍。

Claims (9)

1.一种药物组合物，其组份包括：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rc、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rg3。

2.权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组分的重量百分

比为：

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于还有重量百分比为0.1%-1.0%的氯化钠。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于还含有重量百分比为0.2%-1.2%的总氨基酸。

5.根据权利要求1或2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物经过常规加工直接或间接加入药学上可接受的辅料制成注射液、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、滴丸、合剂或糖浆剂。

6.权利要求1-5任一项所述药物组合物在制备治疗冠心病、脑卒中、心绞痛、高血压、高血脂、视网膜中央静脉栓塞的药物中的应用。

7.权利要求1-4任一项所述药物组合物的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：三七用60%-85%乙醇浸润，磨碎成粗粉，加乙醇回流提取2～4次，每次0.5～2小时，收集提取液，过滤；

步骤2：取滤液回收乙醇，上大孔吸附树脂柱，依次用水和60%～80%的乙醇液洗脱，将醇洗脱液浓缩，再上大孔离子交换树脂柱，60%～80%乙醇液洗脱，将洗脱液减压浓缩，上三氧化二铝柱，70%-80%乙醇洗脱，将洗脱液浓缩；

步骤3：将步骤2所得浓缩液再用丙酮重结晶，干燥，即得本发明所述药物组合物。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1回流步骤所用乙醇浓度为60%～85%。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1回流步骤所用乙醇用量为三七重量的5～13倍。