CN111253459A - 一种三七皂苷炮制品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七皂苷炮制品及其制备方法和应用。将三七总皂苷用水溶解后置于水合反应釜中，控制温度120℃，反应27小时。反应液冷却后再经柱层析分离、浓缩、干燥后得到所需三七皂苷炮制品。所得炮制品中包含20(S)‑Rh1、20(R)‑Rh1、Rk3、Rh4、20(S)‑Rg3、20(R)‑Rg3、Rk1、Rg5，共8种单体成分。本发明的三七皂苷炮制品具有显著地减肥和降血脂效果，可以作为开发减肥、降血脂等疾病药物的原料。同时该三七皂苷炮制品在制备减肥和降血脂类保健品或食品中也具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于三七药物加工及应用领域。具体是涉及一种三七皂苷炮制品及其制备方法，同时，本发明还涉及该炮制品在制备治疗肥胖和高血脂症药物中的应用，以及该炮制品在改善肥胖和高血脂保健品或食品中的应用。
背景技术
肥胖在全球流行，每年至少有280万人死亡可归咎于超重或肥胖。肥胖曾被视为高收入国家的问题，而现在低收入和中等收入国家也广泛存在这一问题。据世界卫生组织全球统计，在2016年时全球约有13％的成人(男性11％，女性15％)肥胖，肥胖流行率在1975年和2016年之间增长近三倍。
高脂血症是导致脂肪肝、2型糖尿病、动脉粥样硬化、脑中风等多种代谢性疾病的主要原因。突出表现为甘油三酯(TG)水平过高，所引发的疾病严重影响人们的生活。
目前，减肥降脂药物或相关保健品的研究，已经成为医药领域研究的热点。然而，临床常见的降血脂药物仍以西药为主，如他汀类，但可引起横肌纹溶解或急性肾衰竭等副作用。因此，从天然产物中开发一种安全有效、毒副作用低的降血脂药物，仍是当前急需解决的问题。
三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属植物，又名田七、金不换。味甘微苦，性温，为我国传统“生熟异用”名贵中药，即“生消熟补”，也是云南独具特色的中药材资源，作为云南白药的主要成分被广泛使用，其活性成分主要是三七总皂苷。传统认为三七具有止血散瘀、消肿定痛的功效，现代药理学表明其具有促进造血、保护心肌细胞和脑组织、抗血栓、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等功效。随着人们对药用植物三七的不断开发利用，更多的活性三七皂苷单体成分和三七皂苷炮制品的功效也被逐渐发现。三七皂苷的炮制始见明代文献记载，传统的炮制方法有：蒸制、酒制、黄精汁制。截止目前为止，各种不同的三七皂苷炮制方法已有相关专利报道。而关于三七皂苷炮制品的相关研究还主要集中在心脑血管系统、神经系统、免疫系统等方面，对于三七皂苷炮制品在改善肥胖和高血脂中的应用尚未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种三七皂苷的炮制品，以扩展三七的深加工技术，挖掘三七皂苷炮制品的药用功效。
本发明的目的还在于提供所述三七皂苷炮制品的制备方法。
本发明的目的还包括提供所述三七皂苷炮制品在制备治疗肥胖和高血脂症药物中的应用，以及所述三七皂苷炮制品在制备减肥和降血脂类保健品或食品中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。
一种三七皂苷炮制品，其特征在于：该炮制品中包含8种三七皂苷单体化合物，分别是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5；8种三七皂苷单体化合物的化学结构式如下所示：
所述的8个单体化合物包含其各自在药学上可接受的盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐和乙二酸盐。
所述的8个单体化合物包含其各自在C-3或者C-6位苷键断裂产生的次级苷，或在20位侧链发生转变所产生的一系列化合物。
所述的三七皂苷炮制品的制备方法，采用以下步骤：
(1)将三七总皂苷溶解于纯净水中，加热超声促溶，将溶解液置于水合反应釜中；
(2)将水合反应釜置于恒温干燥箱中，待干燥箱温度升至120℃时计时反应27小时，待水合反应釜外壁冷却到常温后倒出反应液；
(3)取反应液进行树脂柱层析，在柱子中加入D101树脂，待树脂充分沉降后，先用水平衡4-5个柱体积，然后将反应液过滤后加入柱子中，用水洗脱4～5个柱体积，然后放干柱子，直至无水从柱子中滴出，随后加入10倍柱体积的95％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，经浓缩、干燥即得到所需的三七皂苷炮制品。
所述的三七皂苷炮制品在制备治疗肥胖症药物中的应用。
所述的三七皂苷炮制品在制备治疗高血脂症药物中的应用。
所述的三七皂苷炮制品在制备减肥类保健食品中的应用。
所述的三七皂苷炮制品在制备降血脂类保健食品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次发现三七总皂苷经所述方法炮制后，得到的最终产物具有显著降低动物白色脂肪组织重量和机体血脂的功能。体内实验结果显示：该三七皂苷炮制品能够显著改善高脂诱导小鼠的肥胖症状，减轻其白色脂肪组织重量；并发现其降低小鼠血清总胆固醇、甘油三酯的效果显著。体外实验结果显示：该三七皂苷炮制品可有效抑制体外脂肪细胞的分化成熟，明显降低脂肪细胞内甘油三酯含量。实验证明，本发明的三七皂苷炮制品具有显著的减肥和降血脂效果，可以作为开发减肥、降血脂等疾病药物的原料。同时，也为三七皂苷炮制品在制备减肥和降血脂类保健品或食品中的应用提供了科学依据。
2、本发明的炮制方法不同于传统方法，是利用水合反应釜，控制反应时间和反应温度，对三七皂苷进行炮制。在制备过程中，本发明采用低廉可重复使用的层析树脂分离材料，制备分离过程未使用有毒、昂贵有机溶剂，操作简便、成本低廉、经济环保。为丰富三七皂苷炮制品制备方法的开发和三七皂苷炮制品的大量制备提供重要依据。
附图说明
图1为三七总皂苷与本发明三七皂苷炮制品的HPLC检测结果对比图。
图2为本发明三七皂苷炮制品对高脂(HFD)诱导小鼠体重和体内白色脂肪组织重量的影响。
图3为本发明三七皂苷炮制品对3T3-L1脂肪细胞脂肪分化成熟的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步地详细说明，但附图和实施例并不是对本发明的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例1
制备三七皂苷炮制品：
取10克三七总皂苷，加入400ml纯净水超声加热辅助溶解。将充分溶解的样品倒入水合反应釜中。随后，将水合反应釜置于恒温干燥箱中，待干燥箱温度升至120℃时计时反应27小时，待水合反应釜外壁冷却到常温后倒出反应液。将反应液过滤加入装有D101树脂的已经用纯净水平衡好的层析柱中。先用水洗脱4-5个柱体积，然后放干柱子，直至无水从柱子中滴出。随后加入10倍柱体积的95％以上乙醇洗脱。收集95％乙醇洗脱部分，转移至旋转蒸发仪中，控制水浴锅温度50度以下，进行浓缩。将浓缩得到的浸膏转移置干燥箱中，控制温度50度以下，真空干燥24小时得到所需的三七皂苷炮制品3g。
对制得的三七皂苷炮制品进行HPLC检测，发现其中主要包含8种三七皂苷单体化合物，分别是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5；8种三七皂苷单体化合物的化学结构式如上所示。
对三七总皂苷与本发明的三七皂苷炮制品分别进行HPLC检测，检测结果如图1所示。由图1可知，炮制前的三七总皂苷HPLC结果显示，主要含有5种单体成分，分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd。本发明的三七皂苷炮制品HPLC结果显示，主要含有8种单体成分，分别为20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5。可以看出经本发明方法炮制，使三七总皂苷化学成分完全发生了改变。
实施例2
本发明的三七皂苷炮制品可进一步制成不同剂型的药物，举例如下：
1、片剂
采用湿法制粒，称量三七皂苷炮制品粉末10mg，一水乳糖50-100mg和微晶纤维素25-50mg，加羧甲基纤维素钠1.2mg，过60目筛，混合，反复2次，加入聚维酮10-50mg制粒，过20目筛，置于55℃鼓风干燥箱干燥，再加入羧甲基纤维素钠1mg，硬脂酸镁1-5mg，混合，压片机压片。
2、胶囊剂
称量三七皂苷炮制品粉末10mg，一水乳糖50-100mg和微晶纤维素25-50mg，加羧甲基纤维素钠1.2mg，过60目筛，混合，反复2次，加入聚维酮10-50mg制粒，过20目筛，置于55℃鼓风干燥箱干燥，再加入羧甲基纤维素钠1mg，硬脂酸镁1-5mg，混合，填充于胶囊壳中。
3、滴丸剂
筛选的处方为：药物：基质质量比为1:150，PEG4000，料温85℃，混匀，加热熔融，混合液转移至滴丸机，滴制温度为60℃，滴头直径为5mm，冷凝剂为二甲基硅油，冷凝温度为0℃；滴速为60滴/分钟，滴距为5cm，滴丸机出口处取出滴丸，去除表面冷凝剂，干燥，包装。
应用实施例1---本发明三七皂苷炮制品对高脂诱导小鼠肥胖及血脂的影响研究
6周健康雄性C57BL/6小鼠，购于北京维通利华实验动物有限公司。动物饲养于无菌条件：室温为22-25℃，相对湿度65％，动物自由饮水摄食。其中模型组动物给予60％高脂饲料喂养10周，正常组给予普通饲料和正常饮用水。动物按照体重均匀分为正常组，模型组，40mg/kg三七皂苷炮制品，40mg/kg奥利司他组。动物每天给药1次，给药期间监测小鼠饮食量和体重变化，第28天给药两小时后，处死动物，取部分附睾脂肪保存于4％多聚甲醛，用乙醇梯度脱水，进行石蜡切片，切片厚度为5μm，脱蜡后使用苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察。
1、对小鼠体重和体脂的影响，结果显示，在小鼠饮食不受影响的情况下，三七皂苷炮制品可以降低肥胖动物的体重(图2A和B)。(A-B)为小鼠体重变化，n＝6。组合物处理后，HFD小鼠附睾脂肪组织体积、体重和脂肪细胞体积显著缩小(图2C和D)。图2中，(C-D)为小鼠总体脂量和白色脂肪重量，n＝6。Normal，正常饮食对照组；HFD，高脂饮食组；HFD+Orlistat(奥利司他，阳性对照)，40mg/kg；HFD+N-PNS(三七皂苷炮制品)，40mg/kg。组间比较使用独立样本T检验，代号##表示与空白组比较有极显著差异(P<0.01)，代号*表示与模型组比较有显著差异(P<0.05)，代号**表示与模型组比较有极显著差异(P<0.01)。
2、取小鼠血清，离心检测甘油三酯(TG)，总胆固醇(T-CHO)的含量。结果显示，组合物处理后，HFD小鼠血清中TG和T-CHO水平也显著降低(图2E和F)。图2中，(E-F)为小鼠白色脂肪组织(附睾脂肪组织)及冰冻切片HE染色，标尺为100μm，n＝6。组间比较使用独立样本T检验，*P<0.05，**P<0.01，误差线为标准差。
图2中，(G-H)分别为小鼠血清中甘油三脂(TG)、总胆固醇(T-CHO)的含量，n＝6。组间比较使用独立样本T检验，*P<0.05，**P<0.01，误差线为标准差。
由图2可知，三七皂苷炮制品通过显著减轻腹部和肠系膜脂肪重量而降低总体脂肪含量，从而改善HFD诱导小鼠肥胖症状；形态学观察及石蜡切片显示，给予三七皂苷炮制品后HFD小鼠白色脂肪大小显著减小。同时降低血清中甘油三酯和总胆固醇水平，发挥降血脂作用。
应用实施例2----本发明三七皂苷炮制品对3T3-L1脂肪细胞脂肪生成影响的研究
1、取三七皂苷炮制品，加入含0.5％DMSO的DMEM培养基溶解，制得浓度分别为6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的药液。
2、将生长状态良好的3T3-L1脂肪细胞接种于6孔板中，细胞长满后饥饿2天后，分为空白组、模型组和给予不同浓度的三七皂苷炮制品。
3、用0.5％的油红O染色拍照，按照TG试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京)说明书中所示操作，测定细胞内TG含量。
4、结果显示，与空白组相比，模型组中TG显著升高(P<0.05)；细胞给予组合物后，细胞内TG的含量下降显著，且呈浓度梯度依赖性。
图3为三七皂苷炮制品对3T3-L1脂肪细胞脂肪分化成熟的影响。
图3中，(A)3T3-L1脂肪细胞油红O染色图片，标尺为100μm。(B-C)分别为3T3-L1脂肪细胞油红O染色量化和细胞内TG的含量。组间比较使用独立样本T检验，*P<0.05，**P<0.01，误差线为标准差。
由图3可知，三七皂苷炮制品可抑制3T3-L1脂肪细胞的脂肪细胞分化成熟，且抑制效果呈浓度梯度依赖性。油红O染色量化与测定细胞内TG含量量化结果一致，均降低脂质的积累，证明由于三七皂苷炮制品抑制TG的合成，最终导致脂肪细胞体积减小。
通过以上应用实施例可知，三七总皂苷经炮制后化学成分发生完全改变，生成8种稀有皂苷单体，使得药理活性增强。通过动物体内实验结果显示，三七皂苷炮制品可显著改善高脂诱导小鼠肥胖症状，降低腹部白色脂肪和肠系膜重量，同时降低血清中甘油三脂及胆固醇水平。细胞体外实验结果显示三七皂苷炮制品可抑制脂肪细胞的分化成熟，最终导致脂滴积累减少。说明，该三七皂苷炮制品具有显著减肥和降血脂效果，可作为开发减肥和降血脂相关疾病药物及保健品或食品的原料。
Claims (8)
1.一种三七皂苷炮制品，其特征在于：该炮制品中包含8种三七皂苷单体化合物，分别是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5；8种三七皂苷单体化合物的化学结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的三七皂苷炮制品，其特征在于：所述的8种三七皂苷单体化合物包含其各自在药学上可接受的盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐和乙二酸盐。
3.根据权利要求1所述的三七皂苷炮制品，其特征在于：所述的8种三七皂苷单体化合物包含其各自在C-3或者C-6位苷键断裂产生的次级苷，或在20位侧链发生转变所产生的一系列化合物。
4.根据权利要求1所述的三七皂苷炮制品，其特征在于：该三七皂苷炮制品通过以下方法制备得到：
(1)将三七总皂苷溶解于纯净水中，加热超声促溶，将溶解液置于水合反应釜中；
(2)将水合反应釜置于恒温干燥箱中，待干燥箱温度升至120℃时计时反应27小时，待水合反应釜外壁冷却到常温后倒出反应液；
(3)取反应液进行树脂柱层析，在柱子中加入D101树脂，待树脂充分沉降后，先用水平衡4-5个柱体积，然后将反应液过滤后加入柱子中，用水洗脱4～5个柱体积，然后放干柱子，直至无水从柱子中滴出，随后加入10倍柱体积的95％以上乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，经浓缩、干燥即得到所需的三七皂苷炮制品。
5.权利要求1所述的三七皂苷炮制品在制备治疗肥胖症药物中的应用。
6.权利要求1所述的三七皂苷炮制品在制备治疗高血脂症药物中的应用。
7.权利要求1所述的三七皂苷炮制品在制备减肥类保健食品中的应用。
8.权利要求1所述的三七皂苷炮制品在制备降血脂类保健食品中的应用。
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