CN109620847B - 一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法，所述方法步骤如下：(1)水蛭原液的制备：将经过清洗处理的水蛭进行粗粉碎，加入3‑6倍量生理盐水，静置4‑16小时；(2)酶解：将水蛭原液加入1‑5.5％的复合酶，加入适量酸剂调节PH值5‑7，保持一定温度下，反复酶解多次，收集滤液；(3)提取液纯化去腥：滤液加入1‑2％的NaCl，充分搅拌，静置放冷，过滤析出的沉淀，收集滤液；(4)提取液浓缩：滤液浓缩至相对密度1.05‑1.15，得到水蛭提取浓缩液。

Description

一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药有效成分的提取方法，特别涉及一种中药脑血疏口服液中水蛭抗凝成分的制备方法，属中药制剂技术领域。
背景技术
脑血管病是当今世界危害人类健康的三大疾病之一，是中老年人的多发病，死亡率很高，在我国脑血管病占死因的第二位。国内报道脑出血死亡率为38％～43％，幸存者约有50％～70％患者留有严重的后遗症，生活不能自理，不仅病人遭受极大痛苦，也给家庭和社会造成负担。
中药治疗脑血管病有其独特的优势，如已经上市的中药脑血疏口服液，其配方和工艺描述在中国专利200810100200.9(授权公告号CN 101279018 B)，“一种中药脑血疏制剂”中，该专利描述了一种由中药黄芪、水蛭、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黄、川芎等制成中药制剂，经过实验发现，该制剂具有益气、活血、化瘀作用，主治中风急性期及恢复早期，属气虚血瘀证。
水蛭为脑血疏口服液的君药，其味咸苦气平，咸入血走血，苦泄结，具有破血、逐瘀、通经的功效。现有的脑血疏口服液中水蛭的制备工艺为加水煎煮提取粗制品，存在以下问题：1、高温提取后抗凝血活性成分含量下降，导致脑血疏口服液临床疗效不理想；2、水蛭本身固有的腥臭异味较为显著,致使患者在服用脑血疏口服液时易出现恶心、呕吐等不适反应，临床依从性及耐受性差。
发明内容
针对上述问题，本发明在现有技术的基础上进行了多重改进，特别是在提取工艺上进行了大量的筛选，提供了一种脑血疏口服液中水蛭抗凝成分的制备方法，通过该方法制备得到的脑血疏口服液，具有抗凝成分含量高、异味小、口感好、药液澄明度高、质量稳定等优点。本发明是通过以下技术方案实现的：
一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)水蛭原液的制备：将经过清洗处理的水蛭进行粗粉碎，加入3-6倍重量比例的生理盐水，静置4-16小时；
(2)酶解：将水蛭原液加入1-5.5％重量比例的复合酶，加入酸剂调节PH值5-7，静置0.5-2小时后，重复以上操作1-3次,收集滤液；
(3)提取液纯化去腥：滤液加入1-2％重量比例的NaCl，充分搅拌，静置放冷，过滤析出的沉淀，收集滤液；
(4)提取液浓缩：滤液浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液。
其中步骤(2)中所述的复合酶，为以下两种或两种以上的混合物：中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶。
优选的，其中步骤(2)中所述的复合酶以重量份计，比例为：中性蛋白酶0.5-1.5重量份，木瓜蛋白酶1-3重量份，风味蛋白酶1-3重量份。
更优选的，其中步骤(2)中所述的复合酶为三种蛋白酶的混合物，三者比例为中性蛋白酶0.5-1.5重量份：木瓜蛋白酶1-3重量份：风味蛋白酶1-3重量份。
其中步骤(2)中所述的酸剂选自：枸橼酸、乳酸、磷酸、酒石酸、苹果酸；所述酶解温度为15～40℃。
优选的本发明所述的制备方法，步骤如下：
(1)水蛭原液的制备：将经过清洗处理的水蛭进行粗粉碎，加入4-6倍重量比例的生理盐水，静置8-12小时；
(2)酶解：将水蛭原液加入2-3％重量比例的复合酶(中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：风味蛋白酶配比为1:2:2)，加入酸剂调节PH值6-6.5，酶解2-4次，酶解液过滤，收集滤液；
(3)提取液纯化去腥：滤液加入1.2-1.6％重量比例的NaCl溶液，充分搅拌，静置，滤除沉淀，收集滤液；
(4)提取液浓缩：滤液放入真空罐中进行真空浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液。
最优选的，本发明所述的制备方法，步骤如下：
将水蛭原液加入2.5％重量比例的复合酶，所述复合酶为中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶和混合物，三者重量配比为1:2:2，再加入枸橼酸调节PH值到6.5，保持30℃下，水解3次，每次40min，收集滤液；加入1.5％重量比例的NaCl，充分搅拌，静置放冷，过滤析出的沉淀，收集滤液，放入真空罐中进行真空浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液。
本发明的水蛭提取浓缩液，可以直接和脑血疏口服液其他中药成分的提取液合并，进一步制备成脑血疏口服液。
本发明的优点：
1、基于低温酶解法提取，采用复合酶系酶解提取水蛭中抗凝血成分，该反应条件温和，有效保留抗凝血成分活性；
2、提取过程中添加可食用的枸橼酸等酸剂调节酸性环境，保证低温条件下酶解较高的提取率；
3、通过添加风味蛋白酶，并加入酸剂、氯化钠作为矫味剂，去除了水蛭原药材中的腥臭味，提高了产品口感。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1、酶的筛选
称取水蛭原液7份，各1000ml,分别加入酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶以及风味蛋白酶，添加量1％，在40℃下各酶最适宜p H环境(酸性蛋白酶5.5，碱性蛋白酶、胰蛋白酶8.5，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶以及风味蛋白酶7.0)下酶解两小时，然后冷却后静置，以2500r/min离心20min，取上清液，按《中国药典》(2015年版一部)中“水蛭”项下的凝血酶滴定法测定其凝血活性，并进行感官评定。结果如图1和图2，由图1，图2可看出：凝血活性由大到小的顺序为：木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞碱性蛋白酶＞风味蛋白酶＞胶原蛋白酶，木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶特异性较强，酶解效力高，所得凝血成分较多。
感官评定由大到小的顺序为：风味蛋白酶＞中性蛋白酶＞胶原蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞碱性蛋白酶＞胰蛋白酶＞酸性蛋白酶；风味蛋白酶的酶解液风味较好，腥味与臭味较小。
综合考虑上述两个方面的指标，决定选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶与风味蛋白酶3种单酶组成复合酶系，对水蛭药材进行水解。
复合酶系配比筛选
采用正交设计法确立3种酶的配比，以各酶占总复合酶量的比值为水平数，因素水平见表1
表1正交试验因素水平表
Figure GDA0001976018220000031
Figure GDA0001976018220000041
正交试验：选用L9(34)正交表安排试验，以水解液凝血活性与感官评定为考察指标，采用加权综合评分法(综合评分＝1*凝血活性+5*感官评分)，对正交试验结果进行方差分析，结果RB＞RA＞RC，3种酶的最佳配比为A1B2C2，即中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：风味蛋白酶最佳配比为1∶2∶2(表2)。
表2正交试验结果表
Figure GDA0001976018220000042
酶解工艺参数筛选
确定复合酶系后，对此酶解过程工艺参数进行单因素实验。以水解液凝血活性与感官评定为考察指标，采用加权综合评分法(综合评分＝1*凝血活性+5*感官评分)，进行单因素实验考察酶添加量、pH、酶解时间、酶解温度对酶解过程的影响。
单因素实验共分为四组，每组实验以其中一个因素为变量，控制其他变量不变。
第一组实验设置pH为7，酶解温度为40℃，酶解时间统一为2小时，酶添加量依次为0.5、1、1.5、2、2.5％。实验设置三组平行试验取平均值。
第二组实验酶添加量为1.5％，酶解时间2小时，酶解温度40℃，p H依次设置为5、6、7、8、9。实验设置三组平行试验取平均值。
第三组实验酶添加量设置为1.5％，pH为7，酶解温度40℃，酶解时间依次为0.5、1、2、3、4h。实验设置三组平行试验取平均值。
第四组实验酶添加量为1.5％，pH为7，酶解时间为2小时，酶解温度依次为20、30、40、50、60℃。实验设置三组平行试验取平均值。
结果：
1、酶添加量对酶解过程的影响
由图3可知，酶添加量对综合评分影响显著。综合评分随着酶添加量的增加而逐渐增大，酶添加量达到2％时基本达到最高，2.5％与2％相比水解度变化不显著。因此选取1.5、2、2.5％作为酶添加量的响应面水平。
2、pH对酶解过程的影响
结果如图4所示，在pH5-9范围之间，综合评分呈现先升高后下降的趋势，当pH＝6时，评分达到最大值。木瓜蛋白酶的标准酶解pH条件即为pH6-7，结合单因素实验结果选取6、7、8作为pH的响应面水平。
3、酶解时间对酶解过程的影响
结果如图5所示，随着酶解时间的延长，综合评分不断升高，但在水解2h以后增幅不断减小。分析原因可能是在2h以后，底物基本被分解完全，酶解过程基本结束。综合酶解效率及其他各方面影响因素，最终选取1、2、3h作为酶解时间的响应面水平。
4、酶解温度对酶解过程的影响
结果如图6所示，随着酶解温度的升高，综合评分呈先升高后下降的趋势，20℃到30℃之间升高幅度较大，在40℃时达到最高，超过这个温度后开始迅速减小，说明复合酶在40℃之后酶活性开始受到抑制甚至部分失活，综合分析最终选取20、30、40℃作为酶解温度的响应面水平。
响应面实验：
利用单因素实验确定的酶添加量、pH、酶解时间、酶解温度作为四因素，通过响应面法优化各个因素及水平，利用Design-Expert软件进行的响应面实验设计，结果见下表：
因素水平表
Figure GDA0001976018220000061
响应面实验设计与结果
Figure GDA0001976018220000062
Figure GDA0001976018220000071
以综合评分为响应值，根据上表的实验结果，利用Design-Expert 8.0.6.1软件对该表进行多元回归分析，得到回归方程：
综合评分＝-21112.82925+919.18325A+1451.30000B+669.36675C+516.33825D-14.25000AB-20.06250AC-0.93750AD+11.50000BC-2.85000BD-6.02500CD-80.22075A2-89.90825B2-49.37700C2-4.38000D2
通过Design-Expert 8.0.6.1软件分析，得到酶解的最佳工艺参数为：酶添加量为2.38％，PH为6.40，酶解时间为109min，酶解温度为32℃。
结合生产实际，最终确定酶解的工艺参数为：酶添加量为2.5％，PH为6.50，酶解时间为120min，酶解温度为30℃。
对比实验：
水蛭提取浓缩液的对比。
以下为本发明制备方法和现有技术的对比
Figure GDA0001976018220000072
Figure GDA0001976018220000081
1、凝血活性检测：
按《中国药典》(2015年版一部)中“水蛭”项下的凝血酶滴定法测定，结果如下：
测定值
现有技术方法 1259.0U
本发明方法 1524.0U
2、口感评价
由10人组成评议组,每人分别口服用现有技术方法的水蛭提取液和本发明实施例1的水蛭提取液，针对鱼腥味、色泽、澄清度、臭味、苦味等感官指标，进行打分(满分100)。评价结果如下：
不同方法冻干的水蛭口感比较
组别 分数
本发明方法 83
现有技术方法 51
3、配制成脑血疏口服液后的评价
感官评价：
由10人组成评议组,每人分别口服脑血疏口服液，针对口感、色泽、澄清度、等感官指标，进行打分(满分100)。评价结果如下：
附图说明：不同方法冻干的水蛭口感比较
Figure GDA0001976018220000082
客观评价：对使用本发明的方法配制的脑血疏口服液和现有技术配制的脑血疏口服液进行以下评价：
稳定性评价
取原工艺、新工艺的脑血疏口服液，分别置于温度25℃±2℃，相对湿度RH60％±10％条件下进行36个月的长期稳定性试验，在试验期间，分别于0、18、24、36个月取样，检测各项考察指标。
Figure GDA0001976018220000091
活性成分含量评价
Figure GDA0001976018220000092
疗效评价：
脑血疏口服液对犬脑血流量及脑血管阻力的影响
本实验将20只麻醉犬随机分为空白对照组(n＝5)，生理盐水10ml/kg(n＝5)，本发明脑血疏口服液组，生药10g/kg体重(n＝5)，现有技术方法脑血疏口服液组，生药10g/kg体重(n＝5)。各组均灌胃给药后，不同时间点分别记录和比较颈内动脉血流量的变化,并计算脑血管阻力的变化。
结果表明：
对照组给予生理盐水，脑血流量及脑血管阻力均无明显变化；现有技术方法脑血疏口服液组给药后，脑血流量明显增加，与药前及对照组比较差异显著(P<0.05，P<0.01)。本发明脑血疏口服液组用药后脑血流量明显增加，与药前及对照组比较差异非常显著(P<0.001)。
对犬脑血流量的影响：由表1可见，对照组给予生理盐水后脑血流量变化不明显，与给药前比较无显著性差异。本发明脑血疏口服液组动物给药后可见脑血流量明显增加，与生理盐水对照组及给药前比较差异有显著性，且明显强于现有技术方法脑血疏口服液组。
Figure GDA0001976018220000101
对犬脑血管阻力的影响：由表2可见，对照组给予生理盐水后脑血管阻力变化不明显，与给药前比较无显著性差异。本发明脑血疏口服液组动物给药后可见脑血管阻力降低，与生理盐水对照组及给药前比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01)，且明显强于现有技术方法脑血疏口服液组。
Figure GDA0001976018220000111
综上，新工艺脑血疏口服液增加脑血流量和降低血管阻力的作用优于现有技术方法脑血疏口服液。
附图说明
图1不同蛋白酶的凝血活性
图2不同蛋白酶的感官评定
图3酶添加量
图4 pH对酶解过程的影响
图5酶解时间对酶解过程的影响
图6酶解温度对酶解过程的影响
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
水蛭提取浓缩液的制备
将经过清洗处理的水蛭进行粗粉碎，加入5倍量生理盐水，静置10小时；将水蛭原液加入2.5％的复合酶(中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：风味蛋白酶配比为1∶2∶2)，加入适量枸橼酸调节PH值6.5，保持30℃下，酶解3次，每次40min,收集滤液；加入1.5％的NaCl，充分搅拌，静置放冷，过滤析出的沉淀，收集滤液，放入真空罐中进行真空浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液。
实施例2
脑血疏口服液的配制：
黄芪466g水蛭300g石菖蒲167g牛膝167g
牡丹皮167g大黄66g川芎167g
【制法】：以上七味，取石菖蒲、牡丹皮提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；黄芪、牛膝、川芎、大黄加水煎煮2次(第一次加水8倍量，第二次加水6倍量)，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与蒸馏后水溶液合并，浓缩至相对密度1.08-1.10(80-85℃)，加乙醇1.8倍，搅匀，静置24小时，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.20-1.25(70-80℃)；水蛭粗粉碎，加入5倍量生理盐水，静置10小时；将水蛭原液加入2.5％的复合酶(中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：风味蛋白酶配比为1∶2∶2)，加入适量枸橼酸调节PH值6.5，保持30℃下，酶解3次，每次40min,收集滤液；加入1.5％的NaCl，充分搅拌，静置放冷，过滤析出的沉淀，收集滤液，放入真空罐中进行真空浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液，与上述药液合并，加水适量，调pH值7.0-7.5，加热至沸，静置24小时，滤过，滤液加石菖蒲等挥发油(先与相当于挥发油一倍的吐温-80混合)，混匀，加水调整总量至1000ml，搅匀，灌封，灭菌，即得。

Claims (2)

1.一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法，所述方法步骤如下：
(1)水蛭原液的制备：将经过清洗处理的水蛭进行粗粉碎，加入4-6倍量生理盐水，静置8-12小时；
(2)酶解：将水蛭原液加入2-3％复合酶，所述复合酶为中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶的混合物，三者重量配比为1:2:2，加入酸剂调节PH值6-6.5，酶解2-4次，酶解液过滤，收集滤液；
(3)提取液纯化去腥：滤液加入1.2-1.6％的NaCl溶液，充分搅拌，静置，滤除沉淀，收集滤液；
(4)提取液浓缩：滤液放入真空罐中进行真空浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
将水蛭原液加入2.5％的复合酶，所述复合酶为中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶的混合物，三者重量配比为1:2:2，再加入枸橼酸调节PH值到6.5，保持30℃下，水解3次，每次40min，收集滤液；加入1.5％的NaCl，充分搅拌，静置放冷，过滤掉析出的沉淀，收集滤液，放入真空罐中进行真空浓缩至相对密度1.05-1.15，得到水蛭提取浓缩液。
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菲牛蛭抗凝血肽的酶法制备及其活性研究;钟超;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20130115;第35-36页，表1-2 *

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