CN103251926B - 一种中药水蛭提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药水蛭提取物及其用途，属中药领域。其特征是水蛭以双酶连续酶解法酶解(水蛭先在酸性条件下以胃蛋白酶酶解，酶解混悬液再在碱性条件下以胰蛋白酶酶解)，再经过超滤、纳滤、阳离子交换凝胶等精制、纯化，得到水蛭提取物，其纯度90％以上，可加制剂辅料按常规方法制成冻干粉针剂。本发明具有良好的活血作用，用于治疗心脑血管疾病，特别是用于治疗缺血性中风效果较好。

Description

一种中药水蛭提取物及其用途

技术领域

本发明公开了一种中药水蛭提取物及其用途，属中药领域。

背景技术

水蛭为中国药典收载的药材品种，功能破血，逐瘀，通经，用于癥瘕痞块，血瘀经闭，跌扑损伤。水蛭始载于《神农本草经》，“主逐恶血，瘀血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道”。由于近年来对活血化瘀治疗各种疑难病的不断深入研究，水蛭的药用也倍受青睐。

水蛭作为传统中药，在心脑血管临床应用很广泛，在入药的方式上通常采用原药材粉碎后直接服用，或水提或醇提或水提醇沉后服用，其所采取的提取方法比较传统。在中医临床上用单味水蛭或配伍复方，口服给药，治疗心脑血管疾病疗效显著，然而临床疗效确切的水蛭制剂多为干燥药材原粉制成的中成药，或经水煎煮提取制得的粗提物，水蛭药材利用率较低，活性物质没有获得充分的利用。现代研究较多的是水蛭中的水蛭素类成分，其作用较强，研究较为透彻，但水蛭素类成分只存在于吸血类水蛭中，在蚂蟥、柳叶蚂蟥等非吸血水蛭中不含水蛭素类成分，而且水蛭素在口服后易破坏失活。在临床应用中，蚂蟥、柳叶蚂蟥等非吸血水蛭及水蛭等吸血水蛭口服后的作用疗效确切，说明水蛭等动物药还有另一些活性成分或部位。人体经口服水蛭后，经胃肠道的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收入血发挥疗效。水提、水提醇沉或醇提的提取工艺使大分子量的蛋白变性，不溶入水、醇，未被溶出，被滤过除去，造成大量的药材浪费，疗效同样大大降低。

本专利以蚂蟥(中药水蛭的来源品种)为原料，应用酶法酶解水蛭中的蛋白质，获得具有生理活性的生物活性肽。由于不同的酶水解的部位不一样，得到的酶解产物也大不相同，比如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键。本专利为保证所酶解的水蛭小肽的疗效，并能保证不引起人体的排异反应，采用模仿人体经口服水蛭经胃肠道的酶解、消化，以小分子肽类成分吸收入血发挥疗效的过程，将水蛭采用胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶连续酶解法进行酶解，并进一步纯化制备成冻干粉针剂直接注入血管治疗疾病，如此则与口服水蛭所吸收入血的成分组成相同，而且药材利用率更高，保证了水蛭药材的有效成分充分被利用。

经查阅已有专利，申请号为“200810138936.5”的专利，其权利要求为取水蛭加水匀浆后加入胰蛋白酶或/和胰酶酶解，加乙醇或/和丙酮冷藏沉淀，上清液通过分子截留量为5000Da的超滤膜，超滤液再通过阴离子交换树脂，脱盐，浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥得到水蛭提取物。此专利中为采用胰蛋白酶或/和胰酶对水蛭进行酶解得到的分子量小于5000Da的肽部分，肽的末端为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基(胰蛋白酶或/和胰酶酶切部位)，其余精制方法如醇沉或/和丙酮冷藏、超滤、阴离子交换树脂纯化等技术为医药领域内的常用手段，本专业的人员都已掌握并使用；而本专利根据人体消化吸收过程，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶连续酶解法进行酶解所得的小肽片段，小肽的末端一侧为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸等脂肪族氨基酸残基(胃蛋白酶酶切部位)，另一侧为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸残基(胰蛋白酶酶切部位)，其组成成分的分子量相对更小，组成小肽的物质群是与上述专利不一致的，即是另一类新物质。故本专利与上述专利是针对水蛭中的不同物质的提取、纯化手段，不影响本专利的申请。

申请号为“CN200510080314.8”的专利，为将水蛭采用匀浆法提取出活性物质并进一步纯化制成冻干粉针剂，其为分子量更大的蛋白质或稍偏小一些的多肽，其相对分子质量一般在10KDa以上，而本专利所针对的是连续酶解所得的相对分子质量在3KDa以下的偏酸性的小肽，故此专利与本专利的物质基础是不一致的，不影响本专利的申请。

申请号为“CN200810226320.3”的专利，为本项目组申请的关于水蛭仿生酶解法制备水蛭小肽的专利，其总小肽含量为不得低于50％，纯度较低(除了小肽以外，核苷类成分、脂肪酸、氨基酸、氯化钠等成分含量也较多)，含有仿生酶解所得的所有相对分子质量小于3KDa的小肽(包括偏酸性小肽、中性小肽、偏碱性小肽)，对所得的小肽也没有进行精制纯化分离出有活性的部位，而且也不宜制备成注射剂直接应用。本专利是在原技术的基础上，将水蛭双酶酶解所得的小肽进一步纯化，取其中的偏酸性的水蛭小肽基团，此偏酸性的水蛭小肽基团为本方法酶解水蛭的主要有效部位，检测其总小肽含量不低于90％，对其余的杂质类成分的含量如氯化钠量、相对分子质量大于3kD的总肽量、游离氨基酸量加以控制，本专利进一步将此水蛭提取物有效部位制备成冻干粉针剂，可以直接注射于血管给药，其药效作用力更强，并排除了异常发热、身体不适等直接注射于血管的大分子肽类引起的不良反应，具有极好的应用前景。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种更有效的，副作用小的，无污染的中药水蛭提取物；本发明的第二目的是提供该中药在治疗心脑血管疾病中的应用。

本发明目的第一目的是这样实现的：

发明人提供一种中药水蛭提取物冻干粉针剂，该药物以下述方法制备的：

(1)取水蛭，粉碎成细粉，加入10～15倍量水，煮沸，待冷至35～45℃，以双酶连续酶解，即先在pH1.5～2.5条件下加入0.5％～1.5％胃蛋白酶保温酶解1～3小时，再在pH8.0～9.0条件下加入0.5％～1.5％胰蛋白酶保温酶解3～5小时，煮沸，离心，收集上清液；(本工艺步骤的目的是将水蛭中的蛋白质类成分酶解成小分子的肽类成分，便于被人体直接吸收利用发挥疗效。)

(2)上清液调节pH6.5～7.0，加入1％～3％的活性炭，搅拌均匀，滤过；(本工艺步骤的目的是以活性炭吸附酶解液中的色素等杂质，并起到助滤的作用，使溶液澄清，便于超滤。)

(3)滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液；(本工艺步骤的目的是通过超滤截取相对分子质量3kD以下的小肽活性部位，去除大分子的蛋白质、多肽等杂质，并通过纳滤去除小分子的游离氨基酸、氯化钠等杂质。)

(4)未透过液加于阳离子交换树脂柱上，以水洗脱，收集洗脱液；(本工艺步骤的目的是将初步精制所得的小分子肽类成分进一步纯化，去除吸附在树脂柱上的偏碱性的小肽片段，富集直接洗脱下来的偏酸性的小肽活性部位。)

本步骤发明人曾采用阴离子交换机制的凝胶柱(Q-Sepharose FF和甲基丙烯酸酯凝胶)纯化所得的活性小肽部位，方法为以pH8.0～9.0、0.01～0.05M的Tris-盐酸溶液平衡阴离子交换凝胶柱，将未透过液加于凝胶柱上，先以pH8.0～9.0、0.01～0.05M的Tris-盐酸溶液洗脱，弃去洗脱液，再以0.1～1M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液。结果表明，本步骤以阴离子交换凝胶柱和阳离子交换树脂柱结果相当，均能在一定程度上纯化偏酸性的小肽活性部位，且以阴离子交换凝胶纯化所得的部位得量更低(以阳离子交换树脂纯化为收集未被树脂吸附的部分，会带入少量的不带电荷的杂质)；但从生产实际考虑，阴离子交换凝胶只能用于少量制备的实验室工艺，在大量生产时不适用，而阳离子交换树脂则在大量生产中普遍应用，故虽然阴离子交换凝胶的纯化效果更好，本专利为保证大量生产的需要，最终选择此步骤以阳离子交换树脂纯化。

(5)以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤浓缩脱盐，干燥，得水蛭提取物。(本工艺步骤的目的是去除富集的水蛭小分子肽类溶液中的氯化钠，并起到浓缩的作用，制备出水蛭小分子肽类有效部位。)

按上述方法制备的水蛭提取物中，其总小肽含量不得低于90％，氯化钠含量不得高于2％，相对分子质量大于3kD的总肽量不得高于2％，游离氨基酸含量不得高于4％。总小肽含量、氯化钠含量、相对分子质量大于3kD的总肽含量、游离氨基酸含量的测定方法如下：

①总小肽含量

照紫外-可见分光光度法测定。

对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.25mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品内容物，研细，称取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，以水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞试管中，各加入水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液[取福林试液储备液(1→16)]4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中反应5分钟，取出，置冷水浴中冷却10分钟，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版一部附录V A)，以0号管为空白，在650nm波长处迅速测定吸光度。以吸光度为纵坐标，牛血清白蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程。

测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下自“加入碱性铜试液1.0ml”起，依法测定吸光度，从回归方程中计算总肽含量。

②氯化钠含量

照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验以Waters Spherisorb5μm SCX阳离子交换树脂柱(4.6×250mm)为固定相；以15mmol/L醋酸铵溶液(含有0.04％三乙胺和0.15％醋酸)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按钠氯化钠计算应不低于4000。

对照品溶液的制备取氯化钠对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含1.0mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加流动相50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，以流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

③相对分子质量大于3kD的总肽含量

照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验以TSK-gel G2000SWXL(7.8×300mm)凝胶柱为固定相；以0.2％的醋酸铵溶液为流动相；柱温25℃；流速0.6mL/min；蒸发光散射检测器检测。

对照品溶液的制备取相对分子质量约为3kD的对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含1.0mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，以水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算大于3kD的部分吸收峰面积占总吸收峰面积的比例，即得。(蒸发光散射检测器检测的是检测物质的质量，吸收峰面积的比例与重量比的比例是一致的)

④游离氨基酸含量

采用氨基酸分析仪法测定，将本专利制得的样品以水溶解，不水解直接进氨基酸分析仪测定。

以上所述的水蛭品种为蚂蝗Whitmania pigra Whitman；胃蛋白酶的酶活力为3000～4000U/g，胰蛋白酶酶活力为2000～3000U/mg；在pH2.0～3.0、pH6.5～7.0条件下为以稀盐酸调节，在pH8.0～9.0条件下为以20％氢氧化钠溶液调节；阳离子交换树脂型号为001×7。

发明人所制备的水蛭提取物，可加入乳糖、甘露醇，再加入注射用水溶解，混合均匀，分装，冷冻干燥，制备成冻干粉针剂。本领域技术人员可以方便地将本发明水蛭提取物有效部位配合适当的辅料，制备成中药制剂，故本专利不限于冻干粉针剂，还可以制成胶囊剂、片剂、滴丸剂等剂型。

本发明的第二目的是提供上述中药水蛭提取物冻干粉针剂在治疗心脑血管疾病中的应用，特别是在治疗缺血性脑中风疾病中的应用。

有益效果

1.提高了药材生物利用度。本专利的水蛭提取方法突破了传统的提取方法(如原粉直接给药、水提给药、醇提给药等)，对水蛭采用可控的胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶连续酶解法酶解，将水蛭中的蛋白质肽链打开，释放出具有生物活性的肽段，而且在体外将水蛭酶解成小肽片段，传统的提取方法比较，大大的增强了水蛭药材的利用率(传统提取方法一般为口服给药，服用后绝大多数不能被人体吸收，直接派出体外，造成药材浪费)，水蛭中的活性肽段基本都能提取出来，利用率较高。

2.降低了不良反应发生率。人体对非本身的蛋白质类成分很容易引起排异反应，特别是当直接注射进入血管时，大分子的蛋白质和多肽基本都会带来异常发热、过敏反应、变态反应、身体不适等不良反应。本专利从口服水蛭经胃肠道吸收入血的成分角度出发，在体外先以与人体过程一致的胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶连续酶解法酶解成相对分子质量小于3kD的小分子肽，如此则与口服吸收入血的物质成分相同，不会引起人体的排异反应，使用更安全。

3.增强了药物的活性。本专利将水蛭酶解后，又采用超滤、纳滤、离子交换层析等技术将所得的小分子肽类成分进行精制纯化，只保留活性最强的偏酸性小分子肽类成分有效部位，活性大大增强，并将其制备成冻干粉针剂，直接注射入血迅速发挥疗效，即大大的增强了疗效，显效迅速，又能一定程度的降低不良反应的发生，对心脑血管疾病患者急性期与恢复期均具有重要意义，为临床提供一种高效、低毒的纯中药精制制剂。

4.水蛭活性小肽部位的阳离子交换树脂柱纯化

本品采用双酶连续酶解、活性炭滤过、超滤、纳滤所得的水蛭小肽提取物，其得量较高，还包含一些无活力的杂质，按照小肽的pH划分，可将小肽进一步分为偏酸性的小肽、偏碱性的小肽，根据阳离子交换树脂的性质，在酸性条件下上柱，偏碱性的小肽呈离子态，带阳电荷，能被树脂吸附，而偏酸性的小肽呈分子态或带阴电荷，不被树脂吸附，故可将偏酸性小肽和偏碱性小肽分开，经考察此两部分的抗凝血酶活性，保留具有活性的部位。

取处理好的阳离子交换树脂柱，将提取液加于树脂柱上，以水洗脱，收集至洗脱液无氨基酸反应或电导率较低时，结束洗脱，得洗脱液I；再以0.5M的氯化钠洗脱，收集至洗脱液无氨基酸反应或电导率较低时，结束洗脱，得洗脱液II。将洗脱液I和洗脱液II浓缩至一定量，测定其抗凝血酶活力，结果见表1及附图。

表1阳离子交换树脂分离部位抗凝血酶活力

以上结果表明，洗脱液I为主要活性部位，活力较强，故选择洗脱液I作为水蛭的活性部位。

5.本发明水蛭提取物曾做分离后质谱测定小肽肽链结构确证，小肽质谱(ESI-MS)测定方法及结果如下：

ESI-MS参数雾化气为氮气，碰撞气体为氩气；源温80℃，锥孔电压50V；TOF加速电压9.1kV；MCP检测器电压为2150V；毛细管电压800V。

首先进行分析，质量扫描范围为100～1000D。根据本品的测定结果显示，大部分肽段二重质子化(即带两个单位正电荷)，通过选择信号强的母离子进入MS/MS分析，得到8种肽的MS/MS图谱，对得到的MS/MS碎片信息进行分析，获得的它们的氨基酸序列组成结果见表2。

表2水蛭提取物部分分子的相对分子质量及序列组成表

6.水蛭酶解方法比较

应用蛋白酶酶解动物药中的蛋白质制备活性小分子肽，不仅增强了疗效，而且消除了服用动物原粉及其他常规提取方法引入异蛋白引起的免疫原反应，减小了不良反应发生率，安全性高。

由于不同的酶水解的部位不一样，得到的酶解产物也大不相同，如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键。

本研究以同一批次的水蛭药材，以体外法抗凝血酶活性及总肽量为指标，考察了水蛭采用不同蛋白酶酶解工艺的提取液的活性，即考察了水蛭胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解及双酶连续酶解所得的酶解液的活性。

取水蛭药材，粉碎成细粉，称取四份，每份20g，加10倍量水煮沸15分钟，待冷至40℃，一份以稀盐酸溶液调节pH值1.5～2.0，加入2％量的胃蛋白酶，40℃保温酶解2小时；一份以20％氢氧化钠溶液调节pH值8.0～8.5，加入2％量的胰蛋白酶，40℃保温酶解4小时；一份以20％氢氧化钠溶液调节pH值6.0～7.0加入2％量的木瓜蛋白酶，40℃保温酶解4小时；最后一份以稀盐酸溶液调节pH值1.5～2.0，加入1％量的胃蛋白酶，40℃保温酶解2小时，20％氢氧化钠溶液调节pH值8.0～8.5，加入1％量的胰蛋白酶，40℃保温酶解4小时；以上酶解液均加热煮沸使酶灭活，离心(5000r/min)，上清液减压浓缩(70～80℃，-0.07～-0.08MPa)并调整总量至100mL，即得水蛭不同酶提取液。分别测定各提取液的总肽量和抗凝血酶活性，测定结果见表3。

表3水蛭不同蛋白酶酶解提取方法各部分的生物活性

实验结果表明，用单一的胃蛋白酶、胰蛋白酶来酶解，均不能使水蛭中的蛋白被有效的利用，酶解产物的活性和总肽含量不高，显示药材未充分利用，造成了一定的药材浪费；双酶连续酶解与木瓜蛋白酶酶解产物活性和总肽含量均较高，且双酶连续酶解高于木瓜蛋白酶，但由于木瓜蛋白酶酶解在体外强制酶解，与人体自身酶解所得的活性物质不尽相同，必会引起人体的排异反应。所以本课题选择以双酶连续酶解的方法制备水蛭生物活性肽。

7.为进一步验证本发明产物的治疗作用，发明人进行了动物药效学实验，实验中所用的水蛭提取物为按本发明技术方案实施例1制得的水蛭提取物。

(1)对脑缺血模型大鼠脑梗塞范围的影响

①材料

动物Wister大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g。购自北京大学实验动物科学部。

阳性对照药血塞通注射液，规格250mg/5ml，中国昆明兴中制药有限责任公司。

试剂肝素注射液

仪器聚乙烯管，动脉夹，4^#尼龙线，手术器械，电子分析天平。

②方法与结果

分组及给药取Wister大鼠，每组10只，雌雄各半，各组动物于缺血后，即刻舌静脉给药，6小时后再给药一次。假手术组与模型组给予等体积的生理盐水。

造模方法大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，分离右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA和CCA，用静脉夹夹闭ICA远心端，迅速于距ECA与ICA分叉处约0.5cm的颈总动脉处作一切口，插入一端涂有石蜡的尼龙线，插入至大脑中动脉，实现大脑中动脉阻塞，导致脑缺血。结扎入口处，尼龙线外留线头至略有阻力以实现大脑中动脉再灌注。在缺血3小时和再灌注0.5小时内用电灯维持大鼠肛温在35～36℃。假手术组与其他模型组一样分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，但只结扎右侧颈总动脉CCA。

脑梗塞范围的测定大鼠于缺血3小时再灌注21小时后断头，迅速置于冰盘上取脑，去掉嗅球、小脑、低位脑干，将大脑均匀切成5片放入盛有TTC的瓶中，并放入37℃孵育30分钟，再转入10％福尔马林溶液固定。非缺血区域染成玫红色，缺血区域呈白色，将缺血区域分开并称重，按下式计算脑梗塞范围：

脑梗塞范围(％)＝梗塞区域重量/全脑重量×100％

实验结果对缺血再灌注大鼠脑梗塞范围的实验结果采用组间t检验统计学比较，结果见表4。

表4水蛭提取物对缺血再灌注大鼠脑梗塞范围的影响

与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

以上试验结果表明，水蛭酶解小分子肽提取物的高剂量组、中剂量组、低剂量组均可明显降低脑梗塞范围，高剂量组、中剂量组与模型组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)，低剂量组与阳性药组相当，与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。说明本品对脑缺血疾病具有较好的治疗作用。

(2)对大鼠凝血时间的影响

①材料

动物Wister大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g。购自北京大学实验动物科学部。

阳性对照药血塞通注射液，规格250mg/5ml，中国昆明兴中制药有限责任公司。

仪器玻璃毛细管。

②方法与结果

试验方法取Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为5组，每组10只：空白对照组、阳性药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，注射给药2天，每天1次，空白对照组注射给予同体积生理盐水，末次给药后1h，用内径为1mm的玻璃毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细管血柱达5mm，每隔30s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝，计算毛细管采血到出现血凝丝时间，即为凝血时间。

试验结果结果见表5。

表5对大鼠凝血时间的影响

与空白对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

以上试验结果表明，水蛭酶解小肽提取物的高剂量组、中剂量组、低剂量组均可明显降低脑梗塞范围，高剂量组、中剂量组与模型组比较，具有极显著性差异(P＜0.001)，低剂量组与阳性药组相当，与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.01)。说明本品具有较好的活血作用。

(3)小鼠常压耐缺氧试验

剂量设置与分组ICR小鼠50只，雌雄各半，体重18-22g，随机分为5组，每组10只，分别为：空白对照组(无菌蒸馏水)，阳性药组40mg/kg，高剂量60mg/kg，中剂量30mg/kg，低剂量15mg/kg。各组连续腹腔注射给药3天。

缺氧试验方法给药第3天，取125ml广口玻璃瓶，每瓶内加入50g医用钠石灰，瓶口涂抹凡士林保证密封。末次给药1h后，将动物迅速分别放入玻璃瓶中，密封瓶口，秒表计时，观察记录各只动物的死亡时间。

结果实验结果见表6。

表6水蛭提取物对常压缺氧小鼠存活时间的影响(N＝10，)

^#P＜0.05，^##P＜0.01，与对照组比较。

以上试验结果表明，与对照组相比，高、中剂量组均能明显延长常压缺氧小鼠存活时间(P＜0.01，P＜0.05)。

附图说明

附图是阳离子交换树脂分离水蛭提取物经洗脱后得到的洗脱液I和洗脱液II的分离示意图，横坐标表示自动收集器收集洗脱液的管数，纵坐标表示220nm下的吸收度。第1-35管表示为洗脱液I部分，第36-65管表示为洗脱液II部分。

具体实施方式

下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：

实施例1

取水蛭500g，粉碎成细粉，加入10倍量水，煮沸，待冷至40℃，以双酶连续酶解，即先在pH2.0～2.5条件下加入1.0％胃蛋白酶保温酶解1小时，再在pH8.0～8.5条件下加入1.0％胰蛋白酶保温酶解3小时，煮沸，高速离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1％的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，加于阳离子交换树脂柱上，以水洗脱，收集洗脱液，以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤浓缩脱盐，干燥，得水蛭提取物(总小肽含量93.7％，氯化钠含量0.6％，相对分子质量大于3kD的总肽量1.6％，游离氨基酸含量2.8％)。

实施例2

取水蛭500g，粉碎成细粉，加入15倍量水，煮沸，待冷至45℃，以双酶连续酶解，即先在pH1.5～2.0条件下加入1.5％胃蛋白酶保温酶解2小时，再在pH8.5～9.0条件下加入1.5％胰蛋白酶保温酶解4小时，煮沸，离心，收集上清液，加入3％的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，调节pH9.0～10.0，加于阴离子交换凝胶柱上，先以pH8.0～9.0、0.01～0.05M的Tris-盐酸溶液洗脱，弃去洗脱液，再以1M氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液，以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤浓缩脱盐，干燥，得水蛭提取物(总小肽含量91.1％，氯化钠含量1.0％，相对分子质量大于3kD的总肽量1.1％，游离氨基酸含量3.4％)。

实施例3

取水蛭500g，粉碎成细粉，加入12倍量水，煮沸，待冷至35℃，以双酶连续酶解，即先在pH1.5～2.0条件下加入0.5％胃蛋白酶保温酶解1小时，再在pH8.5～9.0条件下加入0.5％胰蛋白酶保温酶解4小时，煮沸，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入2％的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，加于阳离子交换树脂柱上，以水洗脱，收集洗脱液，以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤浓缩脱盐，干燥，得水蛭提取物(总小肽含量91.6％，氯化钠含量0.6％，相对分子质量大于3kD的总肽量0.9％，游离氨基酸含量2.5％)，再加入乳糖、甘露醇，加入注射用水溶解，混合均匀，分装，冷冻干燥，制备成冻干粉针剂。

实施例4

取水蛭500g，粉碎成细粉，加入10倍量水，煮沸，待冷至40℃，以双酶连续酶解，即先在pH2.0～2.5条件下加入1.0％胃蛋白酶保温酶解3小时，再在pH8.0～8.5条件下加入1.0％胰蛋白酶保温酶解5小时，煮沸，放冷，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1.5％的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，加于阳离子交换树脂柱上，以水洗脱，收集洗脱液，以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤浓缩脱盐，干燥，得水蛭提取物(总小肽含量92.3％，氯化钠含量1.3％，相对分子质量大于3kD的总肽量0.7％，游离氨基酸含量3.0％)，再加入乳糖、甘露醇，加入注射用水溶解，混合均匀，分装，冷冻干燥，制备成冻干粉针剂。

Claims (4)

1.一种中药水蛭提取物，其特征在于：

(1)该中药水蛭提取物中总小肽含量大于等于90％，氯化钠含量小于等于2％，相对分子质量大于3kD的总肽量小于等于2％，游离氨基酸含量小于等于4％；

(2)该中药水蛭提取物含有如下氨基酸序列：①VDHEEPGNH，相对分子质量1033.0；②VDHERLLEH，相对分子质量1147.2；③KLYPAPYMTVT，相对分子质量1283.5；④CCGFVAWCPK，相对分子质量1113.3；

(3)该中药水蛭提取物是以下述方法制备的：取水蛭，粉碎成细粉，加入10～15倍量水，煮沸，待冷至35～45℃，以双酶连续酶解，即先在pH1.5～2.5条件下加入0.5％～1.5％胃蛋白酶保温酶解1～3小时，再在pH8.0～9.0条件下加入0.5％～1.5％胰蛋白酶保温酶解3～5小时，煮沸，离心，收集上清液，调节pH6.5～7.0，加入1％～3％的活性炭，搅拌均匀，滤过，滤液用截留相对分子质量为3kD的中空纤维膜进行超滤，收集透过液，再以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤，收集未透过液，加于阳离子交换树脂柱上，以水洗脱，收集洗脱液，以截留相对分子质量为150D～300D的陶瓷膜进行纳滤浓缩，干燥，得水蛭提取物。

2.根据权利要求1所述的中药水蛭提取物，其特征在于所述的水蛭品种为蚂蝗Whitmaniapigra Whitman；胃蛋白酶的酶活力为3000～4000U/g，胰蛋白酶酶活力为2000～3000U/mg；在pH2.0～3.0、pH6.5～7.0条件下为以稀盐酸调节，在pH8.0～9.0条件下为以20％氢氧化钠溶液调节；阳离子交换树脂型号为001×7。

3.根据权利要求1所述的中药水蛭提取物，其特征在于所述的水蛭提取物中加入乳糖、甘露醇，再加入注射用水溶解，混合均匀，分装，冷冻干燥，制备成冻干粉针剂。

4.权利要求1所述的中药水蛭提取物在制备用于治疗缺血性脑中风疾病的药物中的应用。