CN103387610B

CN103387610B - 双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂

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Publication number: CN103387610B
Application number: CN201310320887.8A
Authority: CN
Inventors: 吕秋敏; 石聪博
Original assignee: Mercedes Benz Biotechnology (yunnan) Co Ltd
Current assignee: Mercedes Benz Biotechnology (yunnan) Co Ltd
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2033-07-29
Also published as: CN103387610A

Abstract

双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，步骤如下：（1）第一次离子交换层析分离纯化：a）眼镜蛇粗毒的溶解：b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化。（2）第二次离子交换层析分离纯化：a）SourceS(XK5030)柱：柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;b）SourceS(XK5030)柱纯化，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。本发明工艺科学合理，在生产中不使用有机试剂，不使用高浓度盐，不使用任何蛋白修饰方法，最大限度地保存科博肽的生物学活性。本发明的工艺先进，操作简单，可大大缩短生产周期，节约生产时间，降低生产成本，完全适合工业化生产线的应用。

Description

双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂

技术领域

本发明属于生物医药的分离纯化领域，涉及一种双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂。

背景技术

科博肽是从中华眼镜蛇蛇毒中分离纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。本发明中提及的科博肽就是眼镜蛇神经毒蛋白的通用名。

科博肽可以通过抑制神经肌肉接头突触后乙酰胆碱与受体的结合而起到镇痛作用。其生物学活性直接影响到镇痛效果，包括镇痛的强度和镇痛的持续时间。

临床运用证明：科博肽制剂具有良好的镇痛效果，而且镇痛持续时间长；副作用小，安全系数高；特别是没有药物耐受性和依赖性的特点，越来越被广大疼痛患者接受和使用。

科博肽作为天然来源的生化药物，已经在科技文献、药学研究刊物、杂志上公开和发表了多种多样的分离纯化方法，包含不同程序的组合。但是，对于科博肽的分离纯化，还存在着进一步提高科博肽纯度及实现工业化生产线分离纯化科博肽的问题。

发明内容

本发明的目的在于为进一步提高眼镜蛇神经毒蛋白纯度，最大限度地保存科博肽的生物学活性，且实现工业化生产线分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白而提供一种双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂的新的技术方案。

本发明的技术方案: 双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，其特征在于，对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，步骤如下：

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液为A液，

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒，用A液溶解，离心取上清液为蛇毒液，备用；

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将SP-Sephodex-C25凝胶用0.3N NaOH浸泡，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液抽气，取出装于XK-5030柱中，用A液平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为8-12ml/分，用A液进行洗脱，再用15-35%梯度进行梯度洗脱，然后用100% B液(含NaC1的A液)洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用；

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱：柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;

b）Source S(XK5030)柱纯化：将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S(XK5030)柱中，再用10-35%梯度的A液, B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。

或采用下述方法对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，具体步骤如下：

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液，并调pH 5.6—pH 6.8为A液；

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒20-30克，用A液50-100毫升溶解，3000转/分转速，离心8-12分钟，取上清液为蛇毒液，备用；

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将600毫升SP-Sephodex-C25凝胶用500毫升0.3N NaOH浸泡10分钟，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液600毫升抽气10分钟，取出装于XK-5030柱中，用A液2000ml平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为10ml/分，

用A液600ml进行洗脱，再用15-35%梯度 A液, B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用；

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱：柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;

b）Source S(XK5030)柱纯化：将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S(XK5030)柱中，再用10-35%梯度A液, B液 3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。

用上述方法得到的二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白与药学上可接受的辅料，通过现有的常规制剂方法制备的单方制剂或复方制剂。

所述的单方制剂为：包括片剂、胶囊剂、溶液剂或颗粒剂的口服制剂、缓控释剂、靶向制剂、乳膏剂、外用溶液剂、冻干粉注射剂或水针注射剂。

所述的复方制剂为：包括片剂、胶囊剂、溶液剂或颗粒剂的口服制剂、缓控释剂、靶向制剂、乳膏剂、外用溶液剂、冻干粉注射剂或水针注射剂。

本发明是发明人历经超过20年时间，通过大量的研究和试验，验证数十种方法组合，把已经公开和发表的其他分离纯化方法逐一进行实验、比较，进行200多次的实验室实物组合试验、验证，自主创新，优选出的最佳工艺程序和最佳方法组合。

本发明的重要目的是实现工业化生产线分离纯化科博肽，为此本发明第一次离子交换层析用 SP-Sephodex-C25凝胶柱（XK-5030柱）分离纯化，搭配pH 5.6—pH 6.8 的磷酸盐缓冲液，可以分离大部分大分子量蛋白、酸性蛋白和强碱性蛋白；第二次离子交换层析选择高强度离子交换介质预装柱Source S(XK5030)，可以分离科博肽类似物，得到高纯度的科博肽；高强度离子交换介质预装柱Source S(XK5030)其最大流速可以达到2000 cm/h；运用其耐压4 MPa的刚性介质，可以在线清洗，提高了洗脱的流速，节省程序操作时间，实现工业化生产线分离纯化科博肽。本发明两次离子交换层析都是使用相同的缓冲液系统，第一次离子交换层析产物可以直接进入第二次离子交换层析，避免了多次的缓冲液切换、浓缩、脱盐等步骤，节省生产成本和程序操作时间。

本发明由于具备科学合理的工艺程序，16小时可以高效完成一个批次的科博肽分离纯化程序，比已经公开和发表的其他分离纯化方法完成一个批次的科博肽分离纯化程序需要时间最少的96小时减少80小时，生产周期缩短83%，节省时间和成本，完全适合工业化生产线的应用。

本发明的第二个目的是最大限度地保存科博肽的生物学活性。本发明是通过以下优化的方法实现的：

1、优化选择的Source S(XK5030)柱作为第二次离子交换层析进行纯化科博肽，是整个方法组合的核心，由于Source S(XK5030) 柱体材料具备的特性，可以对于性质相近的科博肽与科博肽类似物进行高效分离。

2、选择Source S(XK5030)柱填料载量大，每毫升载量可以达到80 mg 溶菌酶。

3、选择Source S(XK5030)柱颗粒小（30 μm），每米理论塔板数可以超过30000，对于性质相近的科博肽与科博肽类似物进行分离，效果最好，达到最大限度地保存科博肽的生物学活性。

4、本发明的分离纯化方法，仅在最后程序才进行浓缩和脱盐，避免了整个分离纯化过程中多次的缓冲液切换、浓缩、脱盐等步骤，减少神经毒蛋白的损失。

本发明的分离纯化程序中不使用有机试剂，避免了有机试剂对神经毒蛋白生物学活性的损害；分离纯化程序中不使用高浓度盐，避免了高浓度盐条件下部分蛋白变性沉淀；分离纯化程序中不使用任何蛋白修饰方法，避免其天然结构的改变而导致的神经毒蛋白生物学活性降低或者丧失。

本发明工艺科学合理，在生产中不使用有机试剂，不使用高浓度盐，不使用任何蛋白修饰方法，最大限度地保存科博肽的生物学活性。本发明的工艺先进，操作简单，可大大缩短生产周期，节约生产时间，降低生产成本，完全适合工业化生产线的应用。

对本发明方法分离纯化的科博肽样品进行的鉴定检测：

为了验证本发明方法分离纯化的科博肽样品的纯度、神经毒蛋白含量和生物学活性，我们进行了多种实验验证。

一、纯度检测验证

1、常规的C₈柱HPLC检测条件依照中国药品标准（WS₁—XG—009—2000）进行。

在常规的C₈柱HPLC检测条件下，科博肽国家对照品纯度为100%，见附图1；本法科博肽样品纯度为100%，见附图2，由于检测条件限制，两者纯度一样。

2、优化的C₁₈柱HPLC检测条件依照中国药品生物制品检定所对首批科博肽国家对照品的研制检测的条件进行。

色谱柱：Waters sunfire C₁₈(4.6mm×150mm，5μm )

流动相A液：0.1%三氟乙酸，流动相B液：三氟乙酸－50% 乙晴溶液(1:100)；

流速：1.5ml· min^-1 ，洗脱梯度为0→4 min, B: 8%；4→34 min, B:8%～40%； 34→38min,

B: 40%；38→45 min, B: 8%；上样量20μl；柱温45℃；检测波长214 nm。用HPLC系统工作站对结果进行数据处理，用面积归一化法计算出其纯度。

在优化的C₁₈柱HPLC检测条件下，科博肽国家对照品纯度为76%，见附图3；本法科博肽样品纯度为93%，见附图4。本法科博肽样品的纯度比科博肽国家对照品的纯度提高了22%。

二、神经毒蛋白含量检测验证

按照国家药品标准的检测要求，以牛血清白蛋白为对照品，以“福林酚测定法”检测，从回归曲线中测定科博肽的神经毒蛋白含量。

检测结果显示：科博肽国家对照品的神经毒蛋白含量为63%，本法科博肽样品的神经毒蛋白含量为75%，本法科博肽样品神经毒蛋白含量比科博肽国家对照品的神经毒蛋白含量提高了19%。

三、生物学活性检测

1、对小鼠皮下注射科博肽的半数致死量LD₅₀测定试验

1．1、试验目的：

根据国家药品标准中检查异常毒性规定的要求，观察小鼠皮下注射科博肽48 小时后所产生的急性毒性反应和死亡情况，测定LD50。

1．2、试验材料：

A、动物：选用17－20g 健康昆明种小鼠，雌雄各半，由中科院昆明动物研究所动物中心提供;

B、药品：科博肽国家对照品（批号200501），采购自中国药品生物制品检定所，在C₁₈柱的HPLC 检测条件下测定纯度为76%；本法科博肽样品（批号120701），由本公司新药实验室提供，在C₁₈柱的HPLC 检测条件下测定纯度为93%。

1．3、试验方法：

将科博肽溶于氯化钠注射液中，按表中所列剂量随机给动物进行皮下注射，给药后观察48小时，记录动物毒性反应情况和死亡情况；对死亡动物及时进行尸验，记录病变情况，并按Bliss方法用SPSS软件计算LD₅₀结果见表1和表2。

表1、小鼠皮下注射科博肽国家对照品LD ₅₀ 测定

按Bliss方法用SPSS软件计算小鼠皮下注射科博肽国家对照品的半数致死量LD₅₀为0.175mg / kg。（其95％可信限为0.167－0.184mg/kg）。

表2 、小鼠皮下注射本法科博肽样品LD ₅₀ 测定

按Bliss方法，用SPSS软件计算小鼠皮下注射本法科博肽样品的半数致死量LD₅₀

为0.115 mg / kg。（其95%可信限为0.105－0.124 mg/kg）。

小鼠皮下注射科博肽后，连续观察48小时，轻者仅表现为嗜睡作用等，以后逐渐恢复正常；重者出现呼吸困难，腹式呼吸明显，随后呼吸变浅，唇周及尾部明显紫绀，发作时间短，以后停止呼吸。

小鼠停止呼吸后，立即剖开胸腔，仍可见心脏跳动，表明呼吸停止先于心脏停止。对死亡动物作病理检查，未见脏器有异常情况。

目前市场上的科博肽原料药纯度不高，含有较多的杂质，这必然会导致其生物学活性的不足。采用羧甲基纤维素柱层析法分离眼镜蛇神经毒，得到聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一带的神经毒，对小白鼠皮下注射的半数致死量LD₅₀为0.13mg/kg，检测广西产眼镜蛇神经毒对小白鼠皮下注射的半数致死量LD₅₀为0.35mg/kg。

表1和表2的测定结果表明：本发明方法分离纯化的科博肽样品皮下注射LD₅₀为0.115mg/kg，LD₅₀数据明显小于市场上其他科博肽原料药，同时也小于科博肽国家对照品的皮下注射LD₅₀数据0.175mg/kg，显示本法科博肽样品的生物学活性高于科博肽国家对照品52%，最大限度保存了科博肽的生物学活性。

、科博肽对大鼠膈肌-隔神经标本的作用测定实验

分离大鼠（180-200g）的膈肌-膈神经标本置于50ml恒温水浴管中。膈肌和膈神经分别连接不同的电极，肌肉连接张力传感器。在通气（95%氧气，5%二氧化碳）的克氏液中平衡60 min。分别加入本发明方法分离纯化的科博肽样品和科博肽国家对照品，分别对肌肉和神经进行刺激。依照不同浓度药物的抑制率计算IC₅₀，见附图7。

结果表明，科博肽国家对照品的IC₅₀为0.20 μg/ml，本发明方法纯化的科博肽样品IC₅₀为0.12 μg/ml，显示本发明方法分离纯化的科博肽样品生物学活性远远高于科博肽国家对照品。

附图说明

图1是在常规的C₈柱HPLC检测条件下，科博肽国家对照品的纯度是100%的检测报告;

图2是在常规的C₈柱HPLC检测条件下，采用本发明得到的科博肽样品的纯度是100%的检测报告;

图3是在优化的C₁₈柱 HPLC检测条件下，科博肽国家对照品纯度为76.18%的检测报告;

图4是在优化的C₁₈柱 HPLC检测条件下，采用本发明得到的科博肽样品纯度为93.84%的检测报告;

图5是本发明第一次离子交换层析分离科博肽分离纯化图谱;

图6是本发明第二次离子交换层析纯化科博肽分离纯化图谱;

图7是是本发明科博肽样品对大鼠膈肌-隔神经标本的作用检测实验记录。

具体实施方式

1、制备眼镜蛇神经毒蛋白，实施方式1-5的技术参数见表3，具体步骤如下：

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

制0.02M, 调pH 5.6—pH 6.8的磷酸盐缓冲液为A液；

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

称取眼镜蛇粗毒20-30克，用A液50-100毫升溶解，3000转/分转速，离心8-12分钟，取上清液为蛇毒液，备用。

表3 各具体实施方式的技术参数

b）SP-Sephodex-C25凝胶柱分离纯化：

将600毫升SP-Sephodex-C25凝胶用500毫升0.3N NaOH浸泡10分钟，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液600毫升抽气10分钟，取出装于XK-5030柱中，用A液2000ml平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephodex-C25凝胶柱中，流速为10ml/分，用A液600ml进行洗脱，再用15-35%梯度的A液, B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用。

第一次分离纯化程序需要时间6小时，得率为粗毒的6%。

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S(XK5030)柱：柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用；

b）Source S(XK5030)柱纯化：将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S(XK5030)柱中，再用10-35%梯度的A液, B液 3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。

第二次分离纯化程序需要时间10小时，得率为粗毒的4%。

2、眼镜蛇神经毒蛋白产品的冻干和储存

（1）将二次纯化的科博肽脱盐液体放入洁净不锈钢盘中，置冰箱-20℃冷冻10小时，取出置冻干机中真空冷冻干燥。

（2）真空冷冻干燥后，取出眼镜蛇神经毒蛋白冻干粉，过60目筛。从25克粗度中分离纯化得到纯度为93%、神经毒蛋白含量为75%的眼镜蛇神经毒蛋白冻干粉1.03克。

（3）经质量检测合格，按重量要求分装入玻璃瓶，即为合格的眼镜蛇神经毒蛋白原料药，在冰箱-10℃储存。

3、用本法分离纯化的眼镜蛇神经毒蛋白与药学上可接受的辅料，通过现有的常规制剂方法制备的单方制剂。所述的单方制剂为：包括片剂、胶囊剂、溶液剂或颗粒剂的口服制剂、缓控释剂、靶向制剂、乳膏剂、外用溶液剂、冻干粉注射剂或水针注射剂。

4、用本法分离纯化的眼镜蛇神经毒蛋白与药学上可接受的辅料，通过现有的常规制剂方法制备的复方制剂。所述的复方制剂为：包括片剂、胶囊剂、溶液剂或颗粒剂的口服制剂、缓控释剂、靶向制剂、乳膏剂、外用溶液剂、冻干粉注射剂或水针注射剂。

Claims

1.双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，其特征在于，对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，步骤如下：

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液为A液，

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

b）SP-Sephadex-C25凝胶柱分离纯化：

将SP-Sephadex-C25凝胶用0.3N NaOH浸泡，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液抽气，取出装于XK-5030柱中，用A液平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephadex-C25凝胶柱中，流速为8-12ml/分，用A液进行洗脱，再用15-35%梯度进行梯度洗脱，然后用100% B液洗脱，最后用A液600ml平衡柱子，按标准分离纯化图谱收集一次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白，备用；

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S-XK5030柱：柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用;

b）Source S-XK5030柱纯化：将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S-XK5030柱中，再用10-35%梯度的A液 B液3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。

2. 根据权利要求1所述的双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法，其特征在于，对蛇毒进行两次离子交换层析纯化，具体步骤如下：

（1）第一次离子交换层析分离纯化：

a）眼镜蛇粗毒的溶解：

配制0.02M的磷酸盐缓冲液，并调pH 5.6—pH 6.8为A液；

配制含0.8M NaCl的A液为B液；

b）SP-Sephadex-C25凝胶柱分离纯化：

将600毫升SP-Sephadex-C25凝胶用500毫升0.3N NaOH浸泡10分钟，用纯水洗至中性，抽干取出置烧杯中加A液600毫升抽气10分钟，取出装于XK-5030柱中，用A液2000ml平衡，将上述离心好的蛇毒液加入SP-Sephadex-C25凝胶柱中，流速为10ml/分，

（2）第二次离子交换层析分离纯化：

a）Source S-XK5030柱：柱体积500ml,用A液1000毫升平衡柱子备用；

b）Source S-XK5030柱纯化：将步骤（1）得到的神经毒蛋白用A液稀释三倍，流速为10ml/分，直接加入Source S-XK5030柱中，再用10-35%梯度A液, B液 3000ml进行梯度洗脱，然后用100% B液200ml洗脱，最后用A液600ml清洗柱子，按标准纯化图谱收集二次纯化的眼镜蛇神经毒蛋白。