CN101343651A - 具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂 - Google Patents

Abstract

具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂，是以香菇C91－3的菌丝体经发酵、盐析、透析、干燥、柱层析而得；为淡褐色或土黄色的粉末，可溶于水，有特定的香味，水溶液pH5.0～8.0，分子量为1KD～90KD，含有18种氨基酸和多种蛋白质。实验证明：在体外抗肿瘤试验中，香菇发酵纯蛋白LFP91－3－A对H22及S180在72小时的抑瘤率可达59.93％和80.13％；对H22细胞端粒酶活性明显受到抑制和其凋亡具有诱导作用。香菇发酵纯蛋白LFP91－3－B对S180的抑瘤率可达76.7％；表明该菌株发酵纯蛋白具有较强直接杀伤肿瘤细胞的作用。动物急性毒性实验和长期毒性实验证明无毒副作用。

Description

具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂

技术领域：

本发明涉及一种医药技术领域的产品，具体涉及具抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂。

背景技术：

以活性蛋白质作为药物具有高活性、特异性强、生物功能明确和有利于临床应用的特点。七十年代以来，蛋白质微量分析技术的不断更新和各种生物活性测定方法的建立，极大地推动了活性蛋白质的研究。近年，多肽蛋白质的研究进展迅速，随着工作的深入，越来越令人关注的是某种生理和药物活性的天然蛋白质。蛋白质类药物的研究一直是药物研究中的一个活跃领域，如何从天然动物、植物、微生物中发现活性多肽蛋白质类物质，使之成为新药研究中的先导化合物一直是蛋白质类研究中的一个方向。近几年随着分子生物学的发展、基因工程技术、蛋白质合成技术的兴起，出现了一些合成或表达出各种蛋白、多肽物质，但其中真正成为药的还是那些首先在天然产物中发现的活性成分，经上述技术重新合成或表达的产物。因此，不断从大自然的天然宝库中去寻找新的活性多肽蛋白质类物质显得尤为重要。

真菌作为药物来源已有多年历史，以真菌为材料所生产的药剂在我国很早就应用于临床。香菇是世界名贵的食用兼药用真菌之一，具有很高的营养及药用价值。香菇化学成分复杂、药理活性强、临床应用范围广，其抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能引起国内外学者广泛关注。现代医学研究认为，多糖类作为生物应答调节剂(BRM)在香菇的抗肿瘤活性中起到间接的抗肿瘤作用，香菇多糖的分离纯化，结构及药理作用都得到了深入的研究，并用于临床肿瘤的治疗，其疗效得到广泛的肯定。

除多糖外，香菇中含有大量蛋白质、氨基酸和多种微量元素。对香菇中蛋白质生物学活性的研究以及从蛋白质水平去发掘其抗肿瘤活性的本质却鲜有报道。本实验室在研究香菇C91-3菌株抗肿瘤活性中发现并证实了香菇的菌丝体发酵液提取的粗蛋白具有体内抑制肿瘤生长作用还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用(戴兵，黄敏等.浙江医学.2004年：26(9)：656-658)，提示蛋白质是香菇中除多糖外的另一种重要的抗肿瘤活性物质。但粗蛋白成分复杂，造成药源物质成分不能更好发挥作用，因而从中寻找特定的药理活性蛋白质单体显得尤为重要。本实验室采用与现有技术截然不同的工艺路线，用少量菌种在发酵罐中深层发酵取得香菇发酵液，从中分离纯化香菇发酵粗蛋白和纯蛋白。香菇菌丝体发酵液可通过发酵和工业生产或通过改进和控制发酵工艺及菌种选育等途径提高所需化合物的含量，大规模培养并且其生长条件可完全人工控制，其提取物的原材料可被源源不断的提供并不受季节和外部环境影响且不存在大量破坏生物资源等问题，这是其他从子实体中提取的真菌来源药物不具备的优点。而且香菇发酵提取蛋白是菌丝体通过生物发酵直接分泌到培养基中的细胞外蛋白产物，由于不需要破坏微生物细胞以释放蛋白质，大大简化了后续的下游加工。

发明内容

本发明的目的是提供具抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其在抗肿瘤中的应用的制剂。

本发明公开的具抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白及其制剂是以香菇C91-3菌株为发酵原料，采用深层发酵的技术，通过蛋白分离纯化技术提取后加工而成。

本发明的香菇发酵纯蛋白是采用下述技术方案获得的：

1.香菇发酵液的制备

(1)香菇发酵液培养基的制备：由如下重量份原料构成的培养基

葡萄糖	0.5～15	新鲜啤酒酵母	1～16
				蔗糖	0.5～15	全脂奶粉	0.5～10
蛋白胨	0.5～10	磷酸二氢钾	0.1～5
				维生素B1	0.001～1	维生素B2	0.001～1

将上述物品加到1000重量份蒸馏水中，混合后放入20～60℃水浴中，使其完全溶解，调节pH5.0～8.0，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌15～20分钟，冷却后备用。

(2)取7～10天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体0.5～15g。

(3)置室温摇床上培养，前两天50～100转/分，第三天开始逐渐加转速至100～150转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到10⁵～10¹⁰/ml时停止培养，即可收集发酵液备用。

(4)将发酵液在0～8℃、3,000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸过滤上清液(0～8℃)除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液放入0～8℃的环境中保存。该上清液为不透明的淡褐色或土黄色的液体，pH5.0～8.0，其中主要含有18种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸，其中天门冬氨酸ASP＞40mg/ml，苏氨酸THR＞20mg/ml，丝氨酸SER＞20mg/ml，谷氨酸GLU＞100mg/ml，甘氨酸GLY＞50mg/ml，丙氨酸ALA＞30mg/ml，胱氨酸CYS＞1mg/ml，缬氨酸VAL＞30mg/ml，蛋氨酸MET＞5mg/ml，异亮氨酸ILE＞20mg/ml，亮氨酸LEU＞40mg/ml，酪氨酸TYR＞40mg/ml，苯丙氨酸PHE＞20mg/ml，赖氨酸LYS＞30mg/ml，氨NH3＞3mg/ml，组氨酸HIS＞9mg/ml，精氨酸ARG＞20mg/ml，脯氨酸PRO＞40mg/ml，色氨酸TRP＞1mg/ml；多糖＞50mg/ml。

2.香菇发酵粗蛋白的制备：

(1)在0～8℃发酵液缓慢盐析，同时以磁力搅拌器搅拌，直到过饱和时停止。静置20min后，低温离心机(2,000～6,000g/min，0～8℃)离心30min。弃去上清液，收集沉淀。

(2)将上述所得的沉淀置于透析袋中，以去离子水作为透析缓冲液，0～8℃下透析。每30min更换一次缓冲液，直至除去全部的盐，即得到粗蛋白溶液。

(3)将脱盐后的粗蛋白质溶液于-20℃冰箱保存，或将脱盐后的粗蛋白质溶液经过真空冷冻干燥机浓缩、冻干即得香菇C91-3发酵液粗蛋白的冻干原粉，并于-20℃冰箱保存。

3.香菇发酵纯蛋白的制备：

(1)称取粗蛋白质冻干粉，利用蛋白分离纯化技术收集后得到多种单一的纯蛋白：如粗蛋白质冻干粉的溶液用DEAE-Cellulose柱、以Sephadex G-100凝胶为分子筛层析的填料层析柱以及其它层析分离柱对提取的粗蛋白进行层析分离，分段截取洗脱液，含有单一香菇发酵纯蛋白的洗脱液再经浓缩冻干得到纯化的香菇发酵纯蛋白粉末，此多种单一的纯蛋白冻干原粉均为淡褐色或土黄色的粉末，可溶于水，有特定的香味，分子量为1KD～90KD。

4.香菇发酵纯蛋白制剂的制备：

香菇发酵纯蛋白冻干原粉与赋形剂按比例做成各种口服剂型：如速溶颗粒剂、片剂、胶囊及口服液等。

①香菇发酵纯蛋白胶囊的制备：

取香菇纯蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖400～600g，硬脂酸钙或硬脂酸镁10～30g，经充分混捏、混合均匀后分装口服用胶囊，每胶囊含香菇纯蛋白冻干原粉0.1～0.5mg.。

②香菇发酵纯蛋白速溶颗粒的制备：

取香菇纯蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖100～300g，糊精300～1000g，混合均匀后造粒、装袋，每袋含香菇纯蛋白冻干原粉0.1～0.5mg

③香菇发酵纯蛋白片剂的制备：

取香菇纯蛋白冻干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸钙或硬脂酸镁10～30g，低聚糖或乳糖400～600g，混合均匀后压片，每片含香菇纯蛋白冻干原粉0.1～0.5mg。

④香菇发酵纯蛋白口服液的制备：

由原料香菇纯蛋白冻干原粉100g，吐温-802～5g，甘露醇5～10g，加无菌水搅拌稀释至香菇纯蛋白含量为0.1～0.5mg/ml。

本发明的实验证明：在体外抗肿瘤试验中，其中香菇发酵纯蛋白LFP91-3-A对H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)72小时的抑瘤率可达59.93％和80.13％，对H22细胞端粒酶活性明显受到抑制，对H22细胞的凋亡具有诱导作用；其中香菇发酵纯蛋白LFP91-3-B对S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)的抑瘤率可达76.7％；表明该菌株发酵纯蛋白具有较强的直接杀伤肿瘤细胞的作用。动物毒性实验：急性毒性实验和长期毒性实验证明无毒副作用，安全可靠。

附图说明

图1为香菇发酵纯蛋白的SDS-PAGE电泳图，左侧为蛋白质分子量marker(分子量自上而下依次为66、45、35、27、20kD)，右侧为香菇发酵液提取蛋白LFP91-3-A。

图2香菇发酵纯蛋白的SDS-PAGE电泳图，左侧为蛋白质分子量marker，右侧为香菇发酵纯蛋白LFP91-3-B

图3所示为正常肿瘤

图4细胞核质浓缩，细胞表面微绒毛减少或消失(箭头所示)

图5细胞皱缩，核染色质明显积聚(箭头所示)

图-6其中1为未用LFP91-3-A作用H₂₂细胞端粒酶活性，2、3、4分别为LFP91-3-A作用H₂₂细胞24h、48h、72h后H₂₂细胞端粒酶活性。

具体实施方式

下面结合实施例来对本发明进一步说明。

实施例1：香菇发酵液的制备

(1)香菇发酵液培养基的制备

葡萄糖	1g	新鲜啤酒酵母	8g
				蔗糖	6g	全脂奶粉	1g
蛋白胨	1g	磷酸二氢钾	0.3g
				维生素B1	0.01g	维生素B2	0.01g

将上述物品加到1000ml蒸馏水中，混合后放入50℃水中水浴，使其完全溶解，调节PH7.5，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌15分钟，冷却后备用。

(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体1g。

(3)置室温摇床上培养，前两天75转/分，第三天开始逐渐加转速至100转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到10⁷/ml时停止培养，收集发酵液备用。

(4)将发酵液在4℃、3,000g/min离心10min，收集上清液，然后以单层滤纸过滤上清液(4℃)除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液放入4℃的环境中保存。

实施例2：香菇发酵粗蛋白的制备

(1)在4℃向发酵液中缓慢加入硫酸铵粉末，同时以磁力搅拌器搅拌，直到硫酸铵过饱和时停止加入。静置20min后，低温离心机(5,000g/min，4℃)离心30min。弃去上清液，收集沉淀。

(2)将上述所得的沉淀置于透析袋中，以去离子水作为透析缓冲液，4℃下透析除去残留的硫酸铵。纳氏试剂检验是否有NH4+残留，加入纳氏试剂后溶液呈黄色则有NH4+残留，反之无色。每30min更换一次缓冲液，直至除去全部NH4+。

(3)将脱盐后的蛋白质(即粗蛋白)溶液于-20℃冰箱保存；或将脱盐后的粗蛋白质溶液经过真空冷冻干燥机浓缩、冻干即得香菇C91-3发酵液的冻干粗蛋白原粉，并于-20℃冰箱保存。

实施例3：香菇发酵纯蛋白A及冻干粉的制备

(1)取400mg香菇发酵粗蛋白冻干粉，4℃于pH 8.0的0.01M Tris-HCl缓冲液中透析直至达到透析膜内外离子平衡，透析液4℃、3,000g/min离心10min，过滤除去杂质，考马斯亮蓝测定透析液的蛋白质浓度。

(2)将样品转入DEAE-Cellulose柱(5×20cm)，上样量为100mg。先用3个柱体积的0.01MTris-HCl缓冲液洗脱未吸附的蛋白质，至流出的洗脱液经考马斯亮蓝检测不含蛋白质，调整洗脱液流出速度为1ml/min，然后用0-0.5MNaCl(2×100ml)梯度洗脱被结合的蛋白质，自动馏分收集仪收集洗脱液。层析完毕后，每管取50μl洗脱液于96孔板，每孔再加入考马斯亮蓝G-250 200μl，混匀，5min内用酶标仪测定595nm处的OD值，根据OD值绘制洗脱曲线收集得到香菇发酵纯蛋白，浓缩冻干得到香菇发酵纯蛋白干粉，并于-20℃冰箱保存。其中收集洗脱曲线第一峰得到香菇发酵纯蛋白A(LFP91-3-A)，经过SDS-PAGE电泳分析后，其分子量约为35KD(见图-1)。

实施例4：香菇发酵纯蛋白B及干粉制剂的制备

称取粗蛋白，并用洗脱缓冲液(tris-HCl ph＝8.0，0.02mol/L，NaCl 0.09mol/L)调整浓度至所需上样浓度2.85mg/ml，并上样8ml。以Sephadex G-100凝胶为分子筛层析的填料，对提取的粗蛋白进行层析分离，以2ml/管，流速15s/滴，自动馏分收集仪收集洗脱液。层析完毕后，每管取50μl洗脱液于96孔板，每孔再加入考马斯亮蓝G-250 200μl，混匀，5min内用酶标仪测定595nm处的OD值，根据OD值绘制洗脱曲线收集得到香菇发酵纯蛋白，浓缩冻干得到香菇发酵纯蛋白干粉，并于-20℃冰箱保存。其中收集洗脱曲线第二峰得到香菇发酵纯蛋白B(L FP91-3-B)，经过SDS-PAGE电泳分析后，其分子量约为21KD(见图-2)

实施例5：香菇发酵纯蛋白体外抑制肿瘤细胞活性的测定

采用MTT比色法测定肿瘤细胞H₂₂(小鼠腹水型肝癌细胞)和S₁₈₀(小鼠腹水型肉瘤细胞株)，具体操作如下：

(1)细胞培养

肿瘤细胞在含有10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，37℃，5％CO₂条件下培养1-2天达到细胞对数生长期，调整细胞数供试验使用。

(2)MTT溶液的配制

四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶于pH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为50μg/ml，过滤除菌后，于4℃避光保存，使用前用含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液稀释至50μg/ml。

(3)样品的处理

将收集的冷冻干燥浓缩的香菇发酵纯蛋白LFP91-3-A有生理盐水溶解并调整pH7.0，然后用直径为18μm的微孔滤过膜滤过除菌，考马斯亮蓝测定无菌LFP91-3-A浓缩液的浓度，用无菌生理盐水分别调整香菇发酵提取蛋白浓缩液至浓度为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml。

(4)肿瘤细胞抑制率的测定

肿瘤细胞(1×10⁵/ml)加到96孔板，每孔100μl，加入100μl无菌生理盐水100μl作为对照组，分别加入不同浓度的香菇发酵纯蛋白A各100μl作为实验组。每组设3个复孔，置于37℃，5％CO₂孵箱中培养72小时后，加入MTT100μl，再继续培养4小时，离心弃上清，然后每孔加100μl DMSO，震荡混匀，使结晶充分溶解，用酶标仪测定各孔吸光度值，(测定波长595nm，参考波长655nm)，并按下面公式计算抑瘤率：

其结果见表-1和表-2

表1香菇发酵纯蛋白对H₂₂细胞的生长抑制率(X±SD)

表2香菇发酵纯蛋白对S₁₈₀细胞的生长抑制率(X±SD)

由表1和表2可以看出5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml的香菇发酵纯蛋白作用24小时，对H22细胞的抑瘤率分别为15.88％±1.09％，22.63％±0.56％，27.52％±0.61％，对S180细胞的抑瘤率，分别为28.37％±0.68％，36.45％±0.61％，43.69％±0.54％，作用24h对S180的抑瘤率接近于50％；5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml的香菇发酵纯蛋白作用72小时，对H22细胞的抑瘤率增高，分别为30.54％±1.55％，40.86％±2.59％，59.93％±1.76％，对S180细胞的抑瘤率显著增高，分别为71.82％±0.81％，76.60％±0.31％，80.13％±0.68％。香菇发酵纯蛋白对肿瘤细胞H22、S180细胞的生长具有明显的直接抑制作用，其作用强度在一定范围内呈现出对浓度和时间的依赖性，抑瘤率随着作用时间的延长和LFP91-3-A浓度的升高而增加(P＜0.05)。香菇发酵纯蛋白对S180细胞的生长抑制作用更为显著。

实施例8香菇发酵纯蛋白LFP91-3-A诱导肿瘤细胞凋亡率的测定

对数生长期的H22细胞(1×10⁵/ml)加入培养瓶，每瓶3ml。向细胞悬液中加入无菌香菇发酵纯蛋白LFP91-3-A，使其终浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml，混匀后37℃，5％CO2孵育24小时；同时以相同细胞数而不加香菇发酵纯蛋白的H22细胞悬液作为阴性对照。依照前面描述方法处理，以流式细胞仪检测细胞凋亡率。以Cell Quest软件分析检测肿瘤细胞凋亡结果(见表3)。

表3香菇发酵纯蛋白诱导H₂₂细胞凋亡率

结果表明香菇发酵纯蛋白LFP91-3-A对H22细胞的凋亡具有诱导作用，肿瘤细胞对理化作用的耐受性降低，细胞碎片增多，凋亡数目亦明显增多。而且随着香菇发酵纯蛋白剂量的增加作用更强烈，表现出剂量-效应关系。作用24小时后，香菇发酵纯蛋白的浓度为5μg/ml时，早期凋亡率和晚期凋亡率分别为0.88％和2.06％；浓度为10μg/ml时，早期凋亡率和晚期凋亡率分别达到1.83％和40.60％，两期凋亡率均增加，晚期凋亡率显著增加，细胞凋亡以晚期凋亡为主。浓度为15μg/ml时，早期凋亡率明显升高而晚期凋亡率增高不多，分别为8.68％和56.31％，但仍以晚期凋亡为主。

实施例9：香菇发酵纯蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的形态学观察

H22细胞(1×10⁵/ml)加入香菇发酵纯蛋白，使其终浓度为5μg/ml，混匀后37℃孵育24小时。按前面描述方法处理制成电镜切片，用透射电镜观察。透射电镜下可见正常细胞的形态为细胞呈圆形，外型完整；细胞膜境界清晰，细胞核大，核/质比增高，核膜境界清晰，可见核膜孔，染色质均匀分布于核质中(图3)。而经香菇发酵液提取蛋白作用的细胞皱缩，体积变小，胞质浓缩，细胞核呈多形核或畸形核，核膜出现高度皱褶，呈现核染色质明显积聚、靠边，电子密度增高，边集于核膜下，在核膜下形成结节或半月状团块，出现“核边集”现象(图4)，细胞浆浓缩，细胞表面微绒毛减少或消失，有的出现小泡或形成凋亡小体(图5)。

实施例10香菇发酵纯蛋白LFP91-3-A对H22肿瘤细胞端粒酶活性影响

(1)取对数生长期的H22细胞，调整细胞数为1.5×106个/ml，加入培养瓶，每瓶2ml。向细胞悬液中加入无菌LFP91-3-A浓缩液，使其终浓度为10ug/ml；同时以相同细胞数而只加入相同体积无菌生理盐水的H22细胞悬液作为阴性对照。混匀后松旋瓶帽，37℃、5％CO2孵育箱内培养。分别孵育24、48及72小时后收集细胞，用0.4％台酚兰染色，细胞存活率大于95％时可继续进行下列实验。

(2)细胞端粒酶的提取：将收集的细胞用无菌PBS洗二次(离心2000rpm，5min)。在离心后收集的细胞中加入1ml冰冷的Wash buffer，悬浮上述样品，置冰上5min。4℃离心(3000rpm，5min)，弃上清。在沉淀中加入40ul冰冷的Lysis buffer，悬浮沉淀，涡旋振荡10s，置冰上30min，每5分钟涡旋振荡一次。4℃离心(25,000rpm，30min)。把离心上清转移至新的EP管中(不能吸取中间层物质)，放置冰上并测定其蛋白浓度，最后用DEPC水调浓度至1μg/μl，于-20℃保存备用。端粒酶PCR扩增，端粒酶PCR反应体系如下

将上述PCR反应体系轻弹混匀，于PCR扩增仪上23℃保温30min进行反转录。30min后在反应体系中加入1μl CX primer混匀，进入PCR循环。

PCR反应条件：94℃(预变性)5min；94℃(变性)30s；50℃(退火)30s；72℃(延伸)90s；共35个循环；72℃，5min。然后在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑1h；取9μl PCR产物加上1μl 10×上样缓冲液，在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1.5h；银染后结果见图-6

本研究表明H₂₂细胞有非常高的端粒酶活性，10μg/ml LFP91-3-A作用H₂₂细胞48h、72h后H₂₂细胞端粒酶活性明显受到抑制。

实施例11.对H22肿瘤细胞用药后的Caspase-3活性测定

(1)取对数生长期的H22细胞，调整细胞数为4×106个/ml，加入培养瓶，每瓶2ml。向细胞悬液中加入无菌LFP91-3-A浓缩液，使其终浓度为10μg/ml；同时以相同细胞数而只加入相同体积无菌生理盐水的H22细胞悬液作为阴性对照。混匀后松旋瓶帽，37℃、5％CO2孵育箱内培养。分别孵育24、48及72小时后收集细胞，用0.4％台酚兰染色，细胞存活率大于95％时可继续进行下列实验。

(2)Caspase-3活性测定：将收集细胞用PBS洗涤二次(离心2000rpm，5min)收集细胞，尽量去除上清。在冰浴条件下加入50μl冰冷Lysis Buffer(使用前每50μl Lysis Buffer中加入0.5μl DTT)，吹打均匀。将细胞置-20℃快速冻存10min，然后置37℃快速融解5min，反复冻融4次，每次融解后涡旋振荡10s。把裂解后的悬液于4℃，10000rpm离心1min，离心上清转移至新的EP管中并放置冰上。用考马斯亮蓝G-250法测定离心上清蛋白浓度。吸取50μl含100μg蛋白的细胞裂解上清，加入50μl的2×Reaction Buffer(使用前每50μl 2×Reaction Buffer中加入0.5μl DTT)混匀后在37℃孵育10min。向混合液中加入5μl Caspase-3Substrate并于37℃避光孵育4h。用酶标仪在λ＝405nm处测定其吸光值。用无细胞的50μl Lysis Buffer+50μl 2×Reaction Buffer作为空白对照。使用SPSS11.5统计软件进行实验数据分析。组内比较采用t检验，组间比较采用方差分析，实验数据以平均值±标准差(X±S)形式表达，P＜0.05表示有统计学意义。实验结果见表4。LFP91-3-A作用H22细胞24h后阳性组与对照组相比Caspase-3活性有显著差异(0.159vs 0.043P＜0.05)，48h(0.237vs 0.044P＜0.05)，72h也有相似的结果(0.423vs 0.046P＜0.05)；且LFP91-3-A作用H22细胞各个时间段的Caspase-3活性相比也有显著差异(P＜0.05)，说明随着LFP91-3-A作用时间的延长Caspase-3活性逐渐增加。

表4两组细胞Caspase-3的活性(X±S)

＊即P＜0.05vs other 3groups.

实施例12：动物毒性实验

(1)急性毒性实验：取昆明小鼠40只(雌雄各半)，体重20～22g，于24小时内灌胃3次，使累计的服用量为上述用药的225倍，连续观察小鼠14天，无死亡现象及不良反应，说明此制剂无毒副作用。

(2)长期毒性实验：取体重适宜的大鼠40只(雌雄各半)，随机分为两组，一组为香菇发酵纯蛋白实验组，以上述实验剂量的100倍连续灌胃60天；另一组为加等量蒸馏水对照组，结果发现，在此期间两组动物均无死亡及不良反应，两组动物食欲、大小便及体重在统计学上均无显著性差异(p＞0.05)；血液白细胞、红细胞及血小板等血常规指标两组间无显著性差异(p＞0.05)；两组动物脏器解剖病理观察均无异常病理现象，说明此制剂长期服用安全可靠。

Claims (9)

1.具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白，是以香菇C91-3的菌丝体经发酵、盐析、透析、干燥、柱层析而得；为淡褐色或土黄色的粉末，可溶于水，有特定的香味，水溶液pH5.0～8.0，分子量为1KD～90KD，含有18种氨基酸和多种蛋白质。

2.具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白的提取方法，其特征在于工艺步骤为：

I.香菇发酵液的制备

(1)将含有以下重量分的原料：葡萄糖0.5～15、蔗糖0.5～15、蛋白胨0.5～10、VB1 0.001～1、新鲜啤酒酵母1～16、全脂奶粉0.5～10、磷酸二氢钾0.1～5、VB20.001～1和1000重量份蒸馏水中混合在20～60℃水浴中，使其完全溶解，调节pH5.0～8.0，分装至300ml三角烧瓶中，每瓶250ml，用4层纱布外盖一层牛皮纸封口，消毒灭菌15～20min，冷却后备用；

(2)取7～10天生长良好的香菇C91-3的菌丝体，接种到上述的培养基中，每瓶接种菌丝体0.5～15g；

(3)置室温摇床上培养，前两天50～100转/分，第三天开始逐渐加转速至100～150转/分。每天观察生长情况，无菌取少量培养物观察孢子数，如果孢子数达到10⁵～10¹⁰/ml时停止培养，收集发酵液备用；

(4)将发酵液在0～8℃、3,000g/min离心10min，收集上清液，然后在0～8℃下以单层滤纸过滤上清液除去其中悬浮的杂质，并将所得的上清液为不透明的淡褐色或土黄色，在0～8℃的下保存；

II.香菇发酵粗蛋白的制备：

(1)在0～8℃缓慢盐析发酵液，搅拌下直到过饱和时为止，静置20min后，0～8℃下离心30min，收集沉淀；

(2)将沉淀置于透析袋中，以去离子水作为透析缓冲液，0～8℃下透析，每30min更换一次缓冲液，直至除去全部的盐，于-20℃冰箱保存；

(3)将脱盐后的蛋白质溶液经过真空冷冻干燥机浓缩冻干得香菇发酵粗蛋白固体原粉；

III香菇发酵纯蛋白的制备：

利用蛋白分离纯化技术收集后得到多种单一的纯蛋白：粗蛋白质冻干粉的溶液用柱层析分离技术方法分段截取洗脱液，含有单一香菇发酵纯蛋白的洗脱液再经浓缩冻干得到多个单一纯化的香菇发酵纯蛋白粉末，此多种单一的纯蛋白冻干原粉均为淡褐色或土黄色的粉末，可溶于水，有特定的香味，分子量为1KD～90KD。

3.根据权利要求2所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白的提取方法，其特征在于工艺步骤III香菇发酵纯蛋白的制备的步骤为：

(1)取400mg香菇发酵粗蛋白冻干粉，4℃于pH 8.0的0.01M Tris-HCl缓冲液中透析直至达到透析膜内外离子平衡，透析液4℃、3,000g/min离心10min，过滤除去杂质，考马斯亮蓝测定透析液的蛋白质浓度。

(2)将样品转入5×20cm的DEAE-Cellulose柱，上样量为100mg。先用3个柱体积的0.01MTris-HCl缓冲液洗脱未吸附的蛋白质，至流出的洗脱液经考马斯亮蓝检测不含蛋白质，调整洗脱液流出速度为1ml/min，然后用2×100ml的0-0.5MNaCl梯度洗脱被结合的蛋白质，自动馏分收集仪收集洗脱液，层析完毕后，每管取50μl洗脱液于96孔板，每孔再加入考马斯亮蓝G-250200μl，混匀，5min内用酶标仪测定595nm处的OD值，根据OD值绘制洗脱曲线收集洗脱曲线第一峰得到香菇发酵纯蛋白，浓缩冻干得到香菇发酵纯蛋白干粉LFP91-3-A，经过SDS-PAGE电泳分析后，其分子量约为35KD。

4.根据权利要求2所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白的提取方法，其特征在于工艺步骤III香菇发酵纯蛋白的制备的步骤为：

称取粗蛋白并用洗脱缓冲液tris-HCl ph＝8.00.02mol/L，NaCl 0.09mol/L调整上样浓度2.85mg/ml，并上样8ml；以Sephadex G-100凝胶为分子筛层析的填料，以2ml/管，流速15s/滴，自动馏分收集仪收集洗脱液，层析完毕后，每管取50μl洗脱液于96孔板，每孔再加入考马斯亮蓝G-250200μl，混匀，5min内用酶标仪测定595nm处的OD值，根据OD值绘制洗脱曲线收集洗脱曲线第二峰得到香菇发酵纯蛋白，浓缩冻干得到香菇发酵纯蛋白干粉L FP91-3-B，经过SDS-PAGE电泳分析后，其分子量约为21KD。

5.具有抗肿瘤活性的香菇发酵粗蛋白制剂，其特征在于将香菇发酵粗蛋白冻干原粉与赋形剂按比例制成成各种口服剂型。

6.根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白制剂，其特征在于是口服胶囊，由香菇发酵纯蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖400～600g，硬脂酸钙或硬脂酸镁10～30g，经充分混捏、混合均匀后分装口服用胶囊，每胶囊含香菇粗蛋白冻干原粉0.1～0.5mg。

7.根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白制剂，其特征在于是速溶颗粒，由香菇发酵纯蛋白冻干原粉100g，低聚糖或乳糖100～300g，糊精300～1000g，混合均匀后造粒、装袋，每袋含菇粗蛋白冻干原粉0.1～0.5mg。

8.根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白制剂，其特征在于是片剂，由香菇发酵纯蛋白冻干原粉100g，淀粉10000g，硬脂酸钙或硬脂酸镁10～30g，低聚糖或乳糖400～600g，混合均匀后压片，每片含菇粗蛋白冻干原粉0.1～0.5mg。

9.根据权利要求3所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白制剂，其特征在于是口服液，由香菇发酵纯蛋白冻干原粉100g，吐温-802～5g，甘露醇5～10g，加无菌水搅拌稀释至香菇粗蛋白含量为0.1～0.5mg/ml。

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