CN101167759B - 具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂,是以香菇C91-3菌株为发酵原料,经深层发酵、过滤后冻干而成,为淡褐色或土黄色的固体原粉,水溶液的pH5.0~8.0。由冻干原粉与赋形剂可制成速溶颗粒剂、片剂、胶囊及口服液等口服剂型。实验证明:在体外抗肿瘤试验中,发酵制剂对H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)的72小时后的抑瘤率分别为71.11%、72.85%、76.81%;在体内抗肿瘤试验中具有治疗肿瘤作用。对H22荷瘤鼠治愈率35%,对S180荷瘤鼠治愈率为40%,并具有明显抑制肿瘤的作用。动物毒性实验证明无毒副作用,安全可靠。
Description
技术领域:
本发明属于抗肿瘤药物领域,涉及来源于高级真菌经发酵后产物的制剂。
背景技术:
真菌作为药物来源已有多年历史,以真菌为材料所生产的药剂在我国很早就应用于临床。香菇是世界名贵的食用兼药用真菌之一,具有很高的营养及药用价值。香菇化学成分复杂、药理活性强、临床应用范围广,其抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能引起国内外学者广泛关注(景军,等.中国食品卫生杂志.2001:13(2):46-47;Chihara G.et al.CancerRes.1970:30:2776)。现代医学研究认为,多糖类作为生物应答调节剂(BRM)在香菇的抗肿瘤活性中起主要作用,香菇多糖的分离纯化,结构及药理作用都得到了深入的研究,并用于临床肿瘤的治疗,其疗效得到广泛的肯定。香菇多糖是通过刺激免疫细胞成熟、分化和增殖,改善宿主机体平衡从而使免疫状态由低下恢复到接近于正常能力,使肿瘤受抑制来实现其抗肿瘤的功能,但其无直接的抗肿瘤作用[Ruan Zheng,et al.International Immunopharmacology 5(2005)811-820]。
除多糖外,香菇中含有大量蛋白质、氨基酸和多种微量元素。对香菇中其他生物学活性物质的研究水平去发掘其抗肿瘤活性的本质却鲜有报道。黄敏等在研究香菇C91-3菌株发酵液的抗肿瘤活性中,首次发现并证实了香菇的菌丝体发酵液具有体内抑制肿瘤生长作用,同时还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用,提示除了香菇多糖外还有其他重要的直接抗肿瘤活性物质,国内外还未见报道(黄敏,等.中国微生态学杂志.1996年:8(3):38-40)。香菇菌株发酵液的抗肿瘤的制剂亦未见报道。
发明内容:
本发明的目的是提供一种新的具抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂的制备方法及其在抗肿瘤中的应用。
本发明公开的具抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂是以香菇C91-3菌株为发酵原料,采用深层发酵的技术,过滤后冻干加工而成。
本发明的香菇发酵制剂的制备方法包括以下述步骤:
1.香菇发酵液的制备
(1)香菇发酵液培养基的制备:由如下重量份原料构成的培养基
将上述物品加到1000重量份蒸馏水中,混合后放入20~60℃水浴中,使其完全溶解,调节PH5.0~8.0,分装至300ml三角烧瓶中,每瓶250ml,用4层纱布外盖一层牛皮纸封口,消毒灭菌15~20分钟,冷却后备用。
(2)取7~10天生长良好的香菇C91-3的菌丝体,接种到上述的培养基中,每瓶接种菌丝体0.5~15g。
(3)置室温摇床上培养,前两天50~100转/分,第三天开始逐渐加转速至100~150转/分。每天观察生长情况,无菌取少量培养物观察孢子数,如果孢子数达到105~1010/ml时停止培养,即可收集发酵液备用。
(4)将发酵液在0~8℃、3,000g/min离心10min,收集上清液,然后以单层滤纸过滤上清液(0~8℃)除去其中悬浮的杂质,并将所得的上清液放入0~8℃的环境中保存。该上清液为不透明的淡褐色或土黄色的液体,pH5.0~8.0,其中主要含有18种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸,其中天门冬氨酸ASP>40mg/ml,苏氨酸THR>20mg/ml,丝氨酸SER>20mg/ml,谷氨酸GLU>100mg/ml,甘氨酸GLY>50mg/ml,丙氨酸ALA>30mg/ml,胱氨酸CYS>1mg/ml,缬氨酸VAL>30mg/ml,蛋氨酸MET>5mg/ml,异亮氨酸ILE>20mg/ml,亮氨酸LEU>40mg/ml,酪氨酸TYR>40mg/ml,苯丙氨酸PHE>20mg/ml,赖氨酸LYS>30mg/ml,氨NH3>3mg/ml,组氨酸HIS>9mg/ml,精氨酸ARG>20mg/ml,脯氨酸PRO>40mg/ml,色氨酸TRP>1mg/ml;多糖>50mg/ml。
2.香菇发酵干粉制剂的制备
(1)将此上清液经过真空冷冻干燥机浓缩冻干得香菇C91-3发酵液的固体冻干原粉,并于-20~8℃冰箱保存。此冻干原粉为淡褐色或土黄色的粉末,可溶于水,有特定的香味,含有18种氨基酸,其中有8种人体所必需的氨基酸及多糖,氨基酸占82~91%,多糖占8~15%,其他成分占1~3%。
(2)称取冻干原粉(0.1~10mg)加上赋形剂(0~500mg)等,利用现有的技术做成各种口服剂型:如速溶颗粒剂、片剂、胶囊及口服液等。该干粉制剂的各种剂型均为淡褐色或土黄色的不透明的固体制剂,含冻干原粉0.5~5mg及赋形剂0~500mg。
本发明的实验证明:在体外抗肿瘤试验中,香菇C91-3发酵制剂对H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)的72小时后的抑瘤率分别为71.11%、72.85%、76.81%,表明该菌株发酵液具有有较强的直接杀伤肿瘤细胞的作用。在体内抗肿瘤试验中,香菇C91-3发酵制剂具有治疗肿瘤作用。对H22荷瘤鼠治愈率35%,对S180荷瘤鼠治愈率为40%。实验组即使死亡鼠的存活期也比对照组延长,具有明显抑制肿瘤的作用。另外发现该发酵液对革兰氏阴性菌和呼吸道病毒有明显抑制作用,但对革兰氏阳性菌无效。动物毒性实验:急性毒性实验和长期毒性实验证明无毒副作用,安全可靠。
具体实施方式:
下面结合实施例来对本发明进一步说明。
实施例1:香菇发酵液的制备
(1)香菇发酵液培养基的制备
将上述物品加到1000ml蒸馏水中,混合后放入50℃水中水浴,使其完全溶解,调节PH7.5,分装至300ml三角烧瓶中,每瓶250ml,用4层纱布外盖一层牛皮纸封口,消毒灭菌15分钟,冷却后备用。
(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体,接种到上述的培养基中,每瓶接种菌丝体1g。
(3)置室温摇床上培养,前两天75转/分,第三天开始逐渐加转速至100转/分。每天观察生长情况,无菌取少量培养物观察孢子数,如果孢子数达到107/ml时停止培养,收集发酵液备用。
(4)将发酵液在4℃、3,000g/min离心10min,收集上清液,然后以单层滤纸过滤上清液(4℃)除去其中悬浮的杂质,并将所得的上清液放入4℃的环境中保存。
实施例2:香菇发酵液冻干原粉的制备
(1)将上清液经过真空冷冻干燥机浓缩、冻干即得香菇C91-3发酵液的冻干原粉,并于-20℃冰箱保存。
实施例3:香菇发酵干粉胶囊的制备
称取冻干原粉1mg,利用现有的技术将冻干粉装入胶囊中即成。
实施例4:香菇发酵干粉速溶颗粒的制备
按照1∶300(冻干原粉∶硅胶粉)的比例,称取冻干粉lmg,硅胶粉300mg,将其混合后利用现有的技术制成速溶颗粒,再包装成袋。
实施例5:香菇发酵干粉片剂的制备
称取冻干原粉1mg,加上淀粉100mg及10mg的硬脂酸镁等附型剂混合均匀后,利用现有的技术制粒、压片即得。
实施例6:香菇发酵干粉口服液的制备
将冻干原粉与三蒸水混合制成浓度为1mg/ml的口服液,然后利用现有的技术分装成瓶。
实施例7:香菇发酵制剂体外抗肿瘤活性试验
(1)细胞株的选用:H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)、S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)。
(2)MTT法测定香菇发酵制剂体外抗肿瘤的抑瘤率:将香菇发酵后做成速溶颗粒剂、片剂、胶囊或口服液用生理盐水溶解,并稀释至浓度1mg/ml(含香菇冻干粉)备用。选各种瘤细胞对数生长期的细胞调整浓度至1×105个/ml,并接种于96孔培养板内,每孔100μl。对照组没孔加入100μl无菌生理盐水,实验组加入上述的制剂100μl。每组设3个复孔,置于37℃,5%CO2孵箱中培养24、48和72小时后,加入MTT(1μg/ml)100μl,再继续培养4小时,离心弃上清,然后每孔加100μl DMSO,震荡混匀,使结晶充分溶解,用酶标仪测定各孔吸光度值,(测定波长595nm,参考波长655nm),并按下面公式计算抑瘤率。
香菇发酵液体外抗肿瘤活性试验数据如表-1所示。
实施例8:香菇发酵制剂体内抗肿瘤活性试验
(1)细胞株的选用:本试验H22(小鼠腹水型肝癌细胞株)、U14(小鼠腹水型宫颈癌细胞株)、S180(小鼠腹水型肉瘤细胞株)。
(2)模型动物的选用:t纯系615小鼠、Bal b/c小鼠、昆明系小鼠若干只,体重20~22g,由本校实验动物中心提供。
(3)细胞系的动物模型的制备:将瘤细胞配制成1×106细胞悬液,取该细胞悬液以0.5ml/只注入小鼠腹腔。次日随机分成对照组、试验组。对照组每只小鼠灌胃1ml生理盐水,试验组每只小鼠灌胃上述发酵制剂1ml。连续灌胃5天,观察小鼠存活期,计算存活率和生命延长率。
香菇发酵液体外抗肿瘤活性试验数据如表-2所示。
实施例9:动物毒性实验
(1)急性毒性实验:取昆明小鼠40只(雌雄各半),体重20~22g,于24小时内灌胃3次,使累计的服用量为上述用药的225倍,连续观察小鼠14天,无死亡现象及不良反应,说明此制剂无毒副作用。
(2)长期毒性实验:取体重适宜的大鼠40只(雌雄各半),随机分为两组,一组为香菇制剂实验组,以上述实验剂量的100倍连续灌胃60天;另一组为加等量蒸馏水对照组,结果发现,在此期间两组动物均无死亡及不良反应,两组动物食欲、大小便及体重在统计学上均无显著性差异(p>0.05);血液白细胞、红细胞及血小板等血常规指标两组间无显著性差异(p>0.05);两组动物脏器解剖病理观察均无异常病理现象,说明此制剂长期服用安全可靠。
整个实验结果表明,香菇发酵制剂对肿瘤有直接的杀伤作用(也是国内外首次发现),并具有明显的治疗肿瘤作用;并且无毒副作用,安全可靠。
表1 香菇发酵制剂体外抗各种瘤细胞结果
表2香菇C91-3菌发酵液体内抗肿瘤试验结果
存活率观察60天以上未长肿瘤。
Claims (6)
1.一种具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂,其特征在于以香菇发酵冻干粉和赋形剂制成的口服剂型,每剂含香菇发酵冻干粉0.5~5mg及赋形剂0~500mg;香菇发酵冻干粉是以香菇C91-3菌株为发酵原料,经深层发酵、过滤后冻干加工而成,为淡褐色或土黄色的粉末,可溶于水,有特定的香味,含有18种氨基酸,其中有8种人体所必需的氨基酸及多糖,氨基酸占82~91%,多糖占8~15%,其他成分占1~3%;香菇发酵冻干粉用以下方法制成:
(1)香菇发酵液培养基的制备:由如下重量份原料构成的培养基:
将上述物品加到1000重量份蒸馏水中,混合后放入50℃水中水浴,使其完全溶解,调节pH7.5,分装至300ml三角烧瓶中,每瓶250ml,用4层纱布外盖一层牛皮纸封口,消毒灭菌15分钟,冷却后备用;
(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体,接种到上述的培养基中,每瓶接种菌丝体1g;
(3)置室温摇床上培养,前两天75转/分,第三天开始逐渐加转速至100转/分,每天观察生长情况,无菌取少量培养物观察孢子数,孢子数达到107/ml时停止培养,收集发酵液备用;
(4)将发酵液在4℃、3,000g/min离心10min,收集上清液,然后以单层滤纸4℃下过滤上清液除去其中悬浮的杂质,并将所得的上清液放入4℃的环境中保存;
(5)将上清液经过真空冷冻干燥机浓缩、干燥即得香菇发酵冻干粉,于-20℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂,其特征在于所述的口服剂型为香菇发酵干粉胶囊,每个胶囊含香菇发酵冻干粉1mg。
3.根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂,其特征在于所述的口服剂型为香菇发酵干粉速溶颗粒剂,香菇发酵冻干粉与赋形剂硅胶粉的重量比为1∶300。
4.根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂,其特征在于所述的口服剂型为香菇发酵干粉片剂,香菇发酵冻干粉与赋形剂淀粉、硬脂酸镁的重量比为1∶100∶10。
5.根据权利要求1所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂,其特征在于所述的口服剂型为香菇发酵干粉口服液,香菇发酵冻干粉与赋形剂三蒸水混合制成口服液的浓度为1mg/ml的。
6.如权利要求1所述具有抗肿瘤活性的香菇发酵干粉制剂中的香菇发酵冻干粉的制备方法,其特征在于工艺步骤为:
(1)香菇发酵液培养基的制备:由如下重量份原料构成的培养基:
将上述物品加到1000重量份蒸馏水中,混合后放入50℃水中水浴,使其完全溶解,调节pH7.5,分装至300ml三角烧瓶中,每瓶250ml,用4层纱布外盖一层牛皮纸封口,消毒灭菌15分钟,冷却后备用;
(2)取第7天生长良好的香菇C91-3的菌丝体,接种到上述的培养基中,每瓶接种菌丝体1g;
(3)置室温摇床上培养,前两天75转/分,第三天开始逐渐加转速至100转/分,每天观察生长情况,无菌取少量培养物观察孢子数,孢子数达到107/ml时停止培养,收集发酵液备用;
(4)将发酵液在4℃、3,000g/min离心10min,收集上清液,然后以单层滤纸4℃下过滤上清液除去其中悬浮的杂质,并将所得的上清液放入4℃的环境中保存;
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