CN103484483B - 香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段、编码蛋白及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种香菇C91-3菌株的 Latcripin-2 基因片段、编码蛋白及制备方法， Latcripin-2 基因片段，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。 Latcripin-2 基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。
Description
技术领域
本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-2基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有Pkinase结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、调节免疫及抗肿瘤、调节细胞周期等功能。
背景技术
真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，et a1．An Antitumor lectin from
edible Mushroom Agrocybe aegerita[J]．Biochem J，2003，374：321—327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等．香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J]．中国微生态学杂志，1996，8(3)：38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵,黄敏,宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26（9）；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-2基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有Pkinase结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、调节免疫及抗肿瘤、调节细胞周期等功能。
本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段，其特征在于如SEQ ID NO：1 所示的核苷酸序列。
一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：
a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；
b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；
c. PCR扩增目标基因：
以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ 和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：
上游引物BamHⅠ：
5'-GGCTGATATCGGATCCGAAAGCACTACAGCAGTTA-3'
下游引物XhoⅠ：
5'-GGTGGTGGTGCTCGAGCAGAGACTGTAGTAAGCCC-3'
d. 回收纯化DNA片段：
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化810bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C，12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min，再次4˚C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
所述c步骤的PCR反应体系50 µl：cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg2 ＋plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA
Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。
本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为Latcripin-2基因片段，所编码的蛋白具有Pkinase结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、调节免疫及抗肿瘤、调节细胞周期等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于pET-32a原核表达体系中进行高效表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
附图说明
图1是本发明实施例PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明实施例所用载体pET-32a（＋）双酶切后的电泳图。
图3是本发明实施例提取的Latcripin-2基因片段转化后的单克隆阳性菌落。
图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图5是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。
图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。
图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的生长抑制率示意图。
香菇C91-3菌株保藏日期：2013年3月15日；
分类命名：香菇（Lentinula edodes）；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏号：CGMCC No.7354。
具体实施方式
a. 提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA：
取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入1ml的Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入0.2 ml氯仿，温和振荡后，4˚C，12000 r/min离心，15 min；吸取上层水相溶液0.5 ml并转移至另一干净的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置15 min，再次4˚C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇1 ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；
紫外分光光度计验证纯度，OD260/280比值在1.8~2.0之间。
进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。
b. 将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；
使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set
Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。
反应体系：香菇菌丝体总RNA (1 µg/µl) 1 µl、3′ RACE Adaptor (5 µM) 1 µl、dNTP Mixture (10 mM each)
1 µl、RNase Free dH2O
4.5 µl；
反应条件：70℃，10 min立即冰上放置2分钟；
然后加入下列组分：5× M-MLV Buffer 2 µl、RNase Inhibitor (40 U/µl)
0.25 µl、Reverse Transcriptase M-MLV
(无RNA酶) (200 U/µl) 0.25 µl，体系总体积达到10 µl。
反应条件：42℃，60 min 70℃，15 min得到反转录反应液（cDNA）。
c. PCR扩增目标基因：
以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：
上游引物BamHⅠ：
5'-GGCTGATATCGGATCCGAAAGCACTACAGCAGTTA-3'
下游引物XhoⅠ：
5'-GGTGGTGGTGCTCGAGCAGAGACTGTAGTAAGCCC-3'
引物委托宝生物（大连）公司合成。
PCR反应体系50 µl：cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 µl、5×PrimeSTAR Buffer（Mg2 ＋plus） 10 µl、PrimeSTAR HS DNA
Polymerase（2.5 U/µl）0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M：DL2,000 DNA Marker；1：Latcripin-2目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。
d. 回收纯化DNA片段：
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化810bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，名命为Latcripin-2基因片段。
实验：
1. Latcripin-2基因片段序列测定：
测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-2基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1。Latcripin-2的基因片段序列长为810bp的cDNA，其含有270个密码子可读框（ORF）。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。
2. Latcripin-2基因片段的克隆表达
2.1 载体构建
2.1.1 将质粒pET-32a（＋），使用BamHⅠ/XhoⅠ进行酶切；
反应体系（37℃过夜）：
pET-32a（＋）（100 ng/µl） 10 µl
10×K
Buffer
5 µl
BamHⅠ（10 U/µl） 1 µl
XhoⅠ（10 U/µl）
1 µl
dH2O
Up to
50 µl
取5 µl进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，M：λ-Hind Ⅲ digest；1：pET-32a（＋）-plasmid；2：pET-32a（＋）-BamHⅠ/XhoⅠ；表明质粒切割完全，可进行后续实验。
2.1.2 载体回收
使用TaKaRa MiniBEST Agarose
Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收约5.9 kbp的DNA片段。
2.1.3 将pET-32a（＋）载体与本发明实施例的Latcripin-2基因片段进行重组
使用In-Fusion® HD Cloning Kit，分别将本发明实施例的Latcripin-2基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下：
Latcripin-2基因片段（100 ng/µl）
2 µl
酶切后回收载体（50 ng/µl）
1 µl
5xIn-Fusion HD
Enzyme Premix 2 µl
dH2O
Up to 10 µl
50℃ 15 min
取上述In-Fusion 产物2.5 µl热转化至E.coli Rosetta-gami(DE3)中，涂布于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB平板上，37℃过夜培养。培养结果如图3所示，表明阳性转化菌株已生长。
同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基于37℃培养14小时，采用宝生物公司Plasmid Miniprep Kit V3.l抽提质粒进行测序鉴定，结果如SEQ ID NO.1。
2.2Latcripin-2蛋白的诱导表达及鉴定
2.2.1Latcripin-2蛋白的自诱导表达
挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的LB液体培养基中，于37℃下，180 r/min振荡培养5小时，再接种于100 ml含四种抗生素（羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素）的自诱导培养基中，于37℃下，180 r/min振荡培养3小时。取菌液进行反复冻融破碎（4次），低温（4℃）离心5000 r/min，5 min，取上清，加入50 μl PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12% SDS-PAGE电泳，结果如图4所示，M：标准蛋白；1：Lp-2全菌蛋白；2：阴性对照。
表明重组蛋白已在阳性菌株中成功表达。
2.2.2 目标蛋白Western-blotting鉴定分析
将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭100分钟后，第一抗Mouse Anti-His Tag
Monoclonal Antibody，4℃孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育90分钟，显色试剂盒显色如图5所示，1：Lp-2全菌蛋白；2：阴性对照。
证明该诱导表达的重组蛋白确实为目的蛋白。
2.3 Latcripin-2蛋白的纯化及活性鉴定
2.3.1. Latcripin-2蛋白的纯化
将上述条件诱导的菌体低温5000 r/min，10 min~20 min离心，每50~100 mg菌体（湿重）加入1~2 ml细菌裂解液。10000×g，4℃离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀（包涵体）。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10,000×g离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12% SDS-PAGE电泳验证，如图6所示，M：标准蛋白；1：过柱前蛋白；2：流穿液；3-8分别为体积是1 ml的洗脱液。
表明：从洗脱液的第2 ml开始就成功分离出了目的蛋白。
采用现有方法纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该新型特异蛋白序列（Latcripin-2蛋白，简称Lp-2），经NCBI数据库氨基酸相似性检索和Pfam数据库检索分析，结果表明Latcripin-2蛋白具有Pkinase结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡和自噬、调节免疫及抗肿瘤、调节细胞周期等功能。
Pkinase是一组酶，在蛋白质的磷酸基团上移动，使蛋白质在细胞内发生磷酸化。该功能作为一个开/关开关，用于许多细胞过程，包括代谢，转录，细胞周期进展，细胞骨架重排，细胞运动，细胞凋亡，分化。它们也存在于胚胎发育，生理反应，神经系统和免疫系统中。异常磷酸化导致许多人类疾病，包括癌症，影响磷酸化的药物可以治疗这些疾病。[G. Manning, D. B. Whyte,
R. Martinez, T. Hunter, S. Sudarsanam, The Protein Kinase Complement of the
Human Genome, Science 6 December 2002, 298:1912-1934]。
2.3.2. Latcripin-2蛋白的除盐和复性
将纯化后的Latcripin-2蛋白进行梯度透析，将Latcripin-2蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5 L~2 L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24 h~72 h，每6 h~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至0。将透析袋中的溶液离心10000 r/min，4℃离心，20~30 min上清即为复性的重组蛋白。
2.3.3 Latcripin-2蛋白的活性鉴定（MTT法）
将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白分别稀释至浓度3.125 µg/ml、6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、25 µg/ml、50 µg/ml备用，以PBS作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人肺癌A549细胞进行MTT实验。用0.25%并含有EDTA的胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。每孔加入100 µl，边缘孔用无菌PBS填充，5% CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）加入上述药物每孔100 µl，每个浓度设6个复孔，5% CO2，37℃孵育24小时，48小时。并倒置显微镜下观察。然后每孔加入20 µl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 µl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪562 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630 nm，按照下面公式计算抑瘤率（细胞生长抑制率）=（对照组平均OD值－实验组平均OD值）/对照组平均OD值。目标蛋白在蛋白浓度为3.125 µg/ml、6.25 µg/ml、12.5 µg/ml、25 µg/ml、50 µg/ml时，24 h、48 h的抑瘤率如图7，说明本发明基因表达的蛋白对人肺癌A549细胞株有明显地抑制作用。
序列表
<110> 大连医科大学
<120>香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段、编码蛋白及制备方法
<160> 4
<210> 1
<211> 810
<212> DNA
<22>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）
<400> 1
1
GAAAGCACTA CAGCAGTTAA TGGAGGAGGA TTCGCGGACA TTTGGATTGG CCGTTGGGAG
61
AATCAATGTG TTTGCGTTAA AGTCTTGCGA TTTTTCCAGC GTGGATCAGA CCGAGATAAA
121
TTGCGGAAGG ATTTGAGTAA GGAGGTGCTC TTATGGAGAC AGCTCAAGCA TCCGAACATA
181
CTCCCCTTCC TTGGTGTCAA CGCTGACTTA TTTTCACCAA GTTTCTGTAT CATCTCGCCT
241
TGGATGTCGA ACGGCGATGT CATGTCCTAT TCCCGTCGTC TATCACTGGA TATCCGTACC
301
AGACTGGAAC ATACTATACA AATTGCCGAA GGTATCGCCT ACCTGCATGG ACTTGATCCA
361
CCTGTCGTGC ACGGCGACAT CAAAGGGGCC AATATCTTGA TATCTGACGA CTGCCGTTGC
421
TGCCTGGCGG ACTTTGGGCT CTCCGTCTTG GACACCCAGT CAATCAATGC AACGCACACA
481
GCTACTGTCC AGGGATCTCT TCGCTGGCTG GCCCCGGAAT TCATAAATCC CACACCGACT
541
CCCCAGGATA ATCAGGGGAA ATTGACTTCA AGAGACATCT ACGCGTTCGG ATGTACCGTG
601
TTCGAGCTCT TAACCGGGCA ACCCCCGTTT TATCATCACA ACCTGGACAT TAAGGTTGCT
661
ATTGATGTTC TGAACGGTGT TCGACCGGTA CTCTCGACGG ATGTCGTTCC AAATGAAACC
721
ATTTACAAGG CAATATGCCG GATGCTGGAT ACGTGTTGGT CAGAACAGAT CATGGAGAGG
781 CCGGACGCAG
AGGGCTTACT ACAGTCTCTG 810
<210> 2
<211> 270
<212> PRT
<22>香菇C91-3菌株（Lentinula edodes）表达产物
<400> 2
1
ESTTAVNGGG FADIWIGRWE
21
NQCVCVKVLR FFQRGSDRDK
41
LRKDLSKEVL LWRQLKHPNI
61
LPFLGVNADL FSPSFCIISP
81
WMSNGDVMSY SRRLSLDIRT
101
RLEHTIQIAE GIAYLHGLDP
121
PVVHGDIKGA NILISDDCRC
141
CLADFGLSVL DTQSINATHT
161
ATVQGSLRWL APEFINPTPT
181
PQDNQGKLTS RDIYAFGCTV
201
FELLTGQPPF YHHNLDIKVA
221
IDVLNGVRPV LSTDVVPNET
241
IYKAICRMLD TCWSEQIMER
261
PDAEGLLQSL
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<22>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
GGCTGATATCGGATCCGAAAGCACTACAGCAGTTA 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<22>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
GGTGGTGGTGCTCGAGCAGAGACTGTAGTAAGCCC 35
Claims (5)
1.一种香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段，其特征在于所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段编码的蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：
a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；
b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；
c. PCR扩增目标基因：
以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ 和 XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下：
上游引物：
5'-GGCTGATATCGGATCCGAAAGCACTACAGCAGTTA-3'
下游引物：
5'-GGTGGTGGTGCTCGAGCAGAGACTGTAGTAAGCCC-3'
回收纯化DNA片段：
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化810bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min，样品融化后继续研磨至裂解液透明状，室温静置5min后，12000r/min离心5min，将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿，温和振荡后，4˚C，12000 r/min离心15 min；吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min，再次4˚C，12000 r/min离心10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的Latcripin-2基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50 µl：cDNA模板1 µl，上游引物0.5 µl，下游引物0.5 µl，dNTP Mixture 4 µl、5×PrimeSTAR Buffer 10 µl、2.5 U/µl 的PrimeSTAR HS DNA
Polymerase0.5 µl、灭菌蒸馏水33.5 µl；反应条件：98℃变性10 s，55℃复性10 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；4℃冷却10 min。
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2013
- 2013-09-11 CN CN201310411828.1A patent/CN103484483B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343651A (zh) * | 2008-09-08 | 2009-01-14 | 大连医科大学 | 具有抗肿瘤活性的香菇发酵纯蛋白、提取方法及其制剂 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "香菇C91-3 cDNA文库的构建及鉴定";王晓丽 等;《时珍国医国药》;20091231;第20卷(第12期);第3162-3163页 * |
| Ben Liu等."A Novel Apoptosis Correlated Molecule:Expression and Characterization of Protein Latcripin-1 from Lentinula edodes C91–3".《International Journal of Molecular Sciences》.2012,第13卷(第5期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103484483A (zh) | 2014-01-01 |
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