CN105154420B

CN105154420B - 赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列及其应用

Info

Publication number: CN105154420B
Application number: CN201510516037.4A
Authority: CN
Inventors: 孙超; 陈士林; 曾欣宜; 王丽芝
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: CN105154420A

Abstract

本发明涉及赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列及其应用，所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因的cDNA序列如Seq ID No.2所示，编码419个氨基酸。本发明通过赤芝萜类合酶基因GL22395转化大肠杆菌，以内源性FPP为底物，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。

Description

赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列及其应用。

背景技术

灵芝为担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G.sinense)的总称。灵芝作为我国传统的药用真菌，几千年来一直被用于疾病治疗和养生保健，具有悠久的药用历史。对于灵芝的药用记载最早出现在两千多年前的《神农本草经》中，目前灵芝已被《美国草药药典与治疗纲要》(American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium)收录，其药用价值已得到世界各国的广泛认可。灵芝中含有多种生物活性物质，截止目前，已有400多种不同的化合物被鉴定出来，包括150余种萜类化合物、灵芝多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸等，因此灵芝又被称为“生物活性成分细胞工厂”。现代药理学研究已经证明，灵芝具有多种重要的医学价值，例如抗肿瘤、降血压、抗病毒以及增强免疫能力等，其在疾病治疗、新药研发等领域中具有广阔的应用前景。

灵芝萜类与灵芝多糖是灵芝药用活性成分的主要组成部分。灵芝萜类中主要活性成分是灵芝三萜，其他萜类如单萜、倍半萜以及二萜也具有较强的药理活性。这三类萜在灵芝中的含量极少，并且提取分离困难，化学合成亦面临着巨大挑战。同位素标记实验显示：灵芝萜类通过甲羟戊酸途径(Mevalonic Acid Pathway，MVP)合成，羊毛甾醇是萜类化合物和麦角甾醇(真菌细胞膜的重要组分)的共同环状前体，但是目前对于灵芝萜类下游特异性合成途径的研究还是空白，对于从单一前体羊毛甾醇形成种类繁多的灵芝萜类的分子机制还不清楚。灵芝萜类生物合成途径相当复杂，参与其中的关键酶、限速酶亦数目繁多。

近年来，研究人员已经展开了对灵芝萜类合成的MVP途径中关键酶基因的克隆及特征描述等相关研究，并取得了显著的进展。Hongmei Luo等构建了灵芝子实体cDNA文库，并对其做表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)分析。研究人员从文库中随机抽取了1023个克隆，最终获得879条高质量的ESTs，经序列比对后发现这些ESTs与多种已知功能的基因具有极高的相似度，其中包括编码鲨烯环氧酶(SE)以及法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)的基因。Changhua Shang等从灵芝中分离得到了编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶(HMGR)的基因，并获得了其cDNA全长以及基因组序列全长。HMGR编码基因的cDNA序列(GenBank编号：EU263989)中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)全长为3681bp，编码一条包含1226个氨基酸的多肽链；HMGR编码基因的DNA序列(GenBank编号：EU263990)全长为4262bp，包含7个外显子和6个内含子。此外，Ding YX等以及Zhao MW等则分别从灵芝中克隆得到了法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)编码基因的cDNA序列全长以及鲨烯合成酶(SQS)编码基因的cDNA序列全长和基因序列全长。这些基因的获得对后续进行灵芝萜类生物合成途径的异源构建及表达等相关研究提供了极其宝贵的数据和资料。

发明内容

本发明的目的是提供赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的赤芝萜类合酶GL22395，其为：

1)由Seq ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

2)Seq ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。

本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395的编码基因。

本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列，其为：

i)Seq ID No.2所示的核苷酸序列；或

ii)Seq ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与Seq ID No.2所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明还提供含所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的载体。

本发明还提供含所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的宿主细胞、工程菌及转基因细胞系。

本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列在调控真菌及植物萜类化合物合成中的应用。

本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列在调控萜类化合物体外合成中的应用。

所述应用是以大肠杆菌内源性FPP(法尼基焦磷酸)为底物，通过转化赤芝萜类合酶GL22395的编码基因或其cDNA序列，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物(倍半萜)。

本发明还提供用于PCR扩增所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的特异性引物对，包括：

正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′

反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′

本发明利用同源序列搜索和结构域搜索的方法，根据灵芝基因组(GenBank编号：AGAX00000000.1)公开的序列信息，获得候选萜类合酶基因cDNA序列，使用引物设计软件Lasergene PrimerSelect对该基因序列进行分析，在其开放阅读框(ORF)前后100bp的范围内寻找最适引物对，最终确定引物序列为：

正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′

反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′

所述萜类合酶编码基因cDNA克隆方法为：提取赤芝菌丝总RNA，反转录合成cDNA，利用上述引物对，以赤芝菌丝cDNA为模板进行PCR反应，回收PCR扩增产物与载体链接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆并测序。

本发明提供的赤芝萜类合酶GL22395的开放阅读框(ORF)长度为1260bp(Seq IDNo.2)，编码419个氨基酸(Seq ID No.1)。将GL22395全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝GL22395基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能验证的Dichomitus squalens LYAD-421SS1(污叉丝孔菌)相似度最高，达85％。

萜类合酶基因是一类以GPP(牻牛儿基焦磷酸)、FPP(法尼基焦磷酸)和GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)为底物，分别催化单萜、倍半萜及二萜生物合成的一类酶家族成员。本发明的赤芝萜类合酶GL22395能够催化上述萜类物质的合成，通过以大肠杆菌内源性FPP为底物，转化赤芝萜类合酶基因GL22395，从而实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。

附图说明

图1为本发明实施例2中GL22395基因在赤芝不同组织部位(菌丝mycelia、原基primordia、子实体fruiting bodies)的表达情况。

图2为本发明实施例3中重组质粒pET28a-GL22395的PCR鉴定结果；其中，M为DL2000DNA Maker，1为pET28a-GL22395重组质粒。

图3为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果(色谱图)。

图4为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果(质谱图)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的获得

1、材料及试剂

1.1实验材料

所用灵芝菌种--赤芝购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，以组织培养获得的灵芝单倍体菌丝为材料提取总RNA。

1.2酶及化学试剂

DNA聚合酶、dNTP Mixture、重组DNase I(RNase-free)、DL5000DNAMaker、DL2000DNA Maker购自TaKaRa公司；2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京TransGen生物技术有限公司；Trgptone(OXOID,England)、酵母提取物(OXOID,England)、维生素B1(Sigma)、X-gal(Sigma)、IPTG(Merck)；其他所需药品均为国产分析纯。

1.3试剂盒

总RNA提取试剂盒、PCR纯化及凝胶提取试剂盒购自QiaGen公司；1st Strand cDNA合成试剂盒、DNA A-Tailing试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒(离心柱型)购自TianGen生物技术有限公司。

1.4菌株及质粒

E.coli转化所用菌株为DH5α型，感受态细胞购自TianGen生物技术有限公司；所用质粒为pGEM-T Easy型克隆载体，购自Promega公司。

2、实验方法

2.1培养基及试剂配制

(1)PDA液体培养基(1L)

配方：马铃薯浸取液1.0L(取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L)、葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄·7H₂O 1.5g、维生素B1微量。

调节pH至6.0；将培养基分装至100mL玻璃三角瓶，每瓶40mL；121℃高压蒸汽灭菌15min。

(2)PDA固体培养基

在PDA液体培养基的基础上，每升培养基加琼脂15.0g；121℃高压蒸汽灭菌15min。在超净工作台内将培养基分装至玻璃平皿中，封口后倒置于4℃保存备用。

(3)LB液体培养基(1L)

配方：胰酪蛋白胨(Trgptone)10g、酵母提取物5g、NaCl 10g。

将pH调节至7.2～7.5，121℃高压蒸汽灭菌灭菌15min。置于4℃保存备用。

(4)LB固体培养基(+Amp)

在LB液体培养基的基础上，加入1.5％的琼脂，即每升培养基加琼脂15g；121℃高压蒸汽灭菌15min。

待培养基冷却至50℃左右时，在超净工作台内加入.氨苄青霉素(Amp)母液使终浓度为100μg/ml，充分混匀后将培养基分装至玻璃平皿中，封口后倒置于4℃保存备用。

2.2菌种培养

1)取含有灵芝单倍体菌丝的固体培养基2-3块接于液体培养基中，28℃、160rpm摇床培养3-4天，转移至250ml培养瓶(含有100ml液体培养基)继续培养7天，收取菌丝。

2)使用四层纱布过滤，真空抽滤器抽滤灵芝菌丝培养液，并用灭菌超纯水清洗3次，然后将水分挤干，铝箔纸包好后立即置于液氮中速冻。放置在-80℃冰箱中保存备用。

2.3灵芝菌丝RNA提取

使用QiaGenMini试剂盒，操作步骤如下：

(1)液氮研磨，取50-100mg粉末放入2ml预冷的EP管中。

(2)加入450μl RLT缓冲液(加1％的β-巯基乙醇，56℃预热1-3min)。

(3)将样品转移至Qiashredder Spin Column上，最大转速离心2min，取上清转移至新的EP管中。

(4)加入0.5倍体积的无水乙醇，并混匀。

(5)将样品转移至RNeasy Spin Column上(每次650μl)，≥8000g(≥10000rpm)离心15s，弃掉废液。

(6)加入700μl RW1缓冲液，离心15s，弃废液。

(7)加入500μl RPE缓冲液，≥8000g离心15s，弃掉废液。

(8)加入500μl RPE缓冲液，≥8000g离心2min，弃掉废液。

(9)将RNeasy Spin Column放到新的收集管中，最大转速离心1min。

(10)将RNeasy Spin Column到新的1.5ml的EP管中，加入30μl RNase-freeddH₂O，室温放置2min，12000rpm离心1min。

(11)取2μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测定浓度。

2.4除去RNA中的基因组DNA

(1)在微量离心管中配制下列反应液，总体积50μl。

(2)37℃反应20～30分钟。

(3)重组DNase I失活(热处理)：

i.加入0.5M EDTA液2.5μl，混匀，80℃加热处理2min。

ii.用RNase-free ddH₂O定容至100μl。

(4)加入10μl 3M醋酸钠和250μl冷乙醇，-80℃放置20min。

(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

(6)加入70％冷乙醇洗净，4℃，12000rpm离心5min，弃上清。

(7)沉淀干燥。

(8)用10μl RNase-free ddH₂O溶解后，进行Agarose电泳检验RNA提取质量，同时使用Nano Drop测定A260/A280及RNA的浓度。

2.5第一链cDNA合成

使用TaKaRa1st Strand cDNA合成试剂盒，操作步骤如下：

(1)在微量离心管中配制下列混合液。

(2)在PCR仪上进行变性反应：65℃5min，冰上预冷。

(3)在上述微量离心管中配制下列反转录反应液：

(4)在PCR仪上进行反转录反应：

30℃10min→42℃60min→95℃5min(酶失活)，然后于-20℃保存备用。

2.6目的基因的PCR扩增

2.6.1引物序列的设计

根据已经测得的灵芝全基因组(GenBank编号：AGAX00000000.1)数据，通过拼接、注释等操作，获得候选萜类合酶基因cDNA序列，使用引物设计软件LasergenePrimerSelect对该基因序列进行分析，在其开放阅读框(ORF)前后100bp的范围内寻找最适引物对，最终确定引物序列为：

正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′

反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′

引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。将引物配制成100μM母液，使用时稀释10倍，终浓度10μM。

2.6.2PCR反应

以灵芝菌丝cDNA为模板进行PCR反应，反应体系(50μl)如下：

PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃10min。于4℃保存。

PCR反应结束后，取2μl样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.7PCR产物回收

使用QiaGen QIAquick PCR纯化试剂盒，操作步骤如下：

(1)向PCR产物中加入5倍体积的PB缓冲液，混匀。

(2)将混合液转移到吸附柱中，吸附柱置于收集管中，离心30-60s。

(3)倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入0.75ml PE缓冲液，离心30-60s。

(4)倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中，离心1min。

(5)将吸附柱放入一个新的1.5ml EP管中，向柱子中部加入30μl无菌超纯水，静置2min后，离心收集。

(6)取2μl样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.8PCR产物末端加碱基A

在微量离心管中配制下列加A反应体系(10μl)：

于72℃反应30min。

2.9目的基因与克隆载体连接

在微量离心管中配制下列连接反应体系(10μl)：

于16℃连接过夜。

2.10E.coli转化及蓝白斑筛选

(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞并使其在冰上融化后，每100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30min。

(2)42℃水浴热激90s，然后快速将离心管转移到冰上，冰浴5min。

(3)在超净工作台内，每100μl感受态细胞加入600μl LB液体培养基(不含Amp)，37℃、110rpm震荡培养1h。

(4)在LB固体平板(+Amp)上，加入X-gal 40μl、IPTG 4μl，混匀涂板，37℃黑暗放置1h。

(5)向上述处理过的平板上加入150μl感受态菌液，涂板并做好标记。

(6)倒置平板，于37℃温箱中培养过夜，12-16h出现菌落。

(7)菌落平板倒置于4℃保存。

2.11菌落PCR检测阳性克隆

在微量离心管中配制下列PCR反应体系(10μl)：

在超净工作台内，使用灭菌牙签挑取白色单菌落在LB固体平板(+Amp)上划线，同时在上述PCR反应体系中搅动2-3次，将微量离心管置于PCR仪中反应。反应条件与2.6.2中的PCR反应条件一致。

PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。划线平板倒置于37℃温箱中培养，菌落长成后于4℃保存。

2.12挑选阳性克隆摇菌并测序

根据菌落PCR结果，挑选4个阳性克隆，使用灭菌玻璃管摇菌，每管加LB液体培养基(+Amp)2ml，37℃、220rpm震荡培养12h后送测序。测序单位为北京农业科学院测序中心。

3、GL22395基因cDNA序列的生物信息学分析以及组织表达分析

本发明的赤芝萜类合酶GL22395的开放阅读框(ORF)长度为1260bp(Seq IDNo.2)，编码419个氨基酸(Seq ID No.1)。将GL22395全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝GL22395基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能验证的Dichomitus squalens LYAD-421SS1(污叉丝孔菌)相似度最高，达85％。

实施例2 GL22395基因cDNA序列的组织表达分析

提取赤芝三个不同生长时期菌丝、原基和子实体的总RNA，利用逆转录试剂盒(PROMEGA)进行逆转录，以蛋白磷酸酶2A(PP2A)基因为内参基因，进行荧光定量PCR分析，正向引物为：5′-CTCGCACGCTACAACAAAG-3′，反向引物为：5′-AGTCGGAAGTGGGTGGG-3′，结果表明该基因在菌丝中的表达明显高于其在原基和子实体期的表达(图1)。

实施例3 GL22395基因cDNA序列的原核表达

1、根据赤芝萜类合酶的全长cDNA序列，设计PCR扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上加入限制性酶切位点BamHⅠ和XholⅠ。所设计的引物为：

正向引物：5′-CGCGGATCCATGAGCGTC-3′

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCAGATCGA-3′

以全长cDNA片段为模板，经PCR扩增后，保证赤芝萜类合酶基因的阅读框完全正确，并用BamHⅠ和XholⅠ内切酶进行酶切反应，回收目的片段1260bp；大肠杆菌表达载体pET28a用BamHⅠ和XholⅠ内切酶进行酶切反应，回收目的片段5kb。将经过酶切的赤芝萜类合酶基因的目的片段克隆至酶切的pET28a表达载体上，转化大肠杆菌BL21，提取重组子的质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。图2为重组质粒pET28a-GL22395的PCR鉴定结果。

2、蛋白表达的诱导及产物分析

挑取单克隆接种于3mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃振荡培养至摇床培养过夜，次日按照1:100稀释加入到50mL液体培养基中，继续37℃培养，待OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mM，28℃诱导目的蛋白表达6-8小时后，50℃水浴，固相微萃取15min后，手动进样，GC-MS分析催化产物(图3和图4)。所得萜类化合物--倍半萜的结构如式(I)所示：

在大肠杆菌内异源合成倍半萜的过程如下：

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

[1]Wachtel-Galor S,Tomlinson B,Benzie IFF.Ganoderma lucidum("Lingzhi”),a Chinese medicinal mushroom:biomarker responses in a controlledhuman supplementation study.Br J Nutr,2004,91:263-269

[2]Paterson MRR.Ganoderma-A therapeutic fungalbiofactory.Phytochemistry,2006,67:1985-2001

[3]Sanodiya B.S.,Thakur G.S.,Baghel R.K.,Prasad G.B.&BisenP.S.Ganoderma lucidum:a potent pharmacologicalmacrofungus.Curr.Pharm.Biotechnol.,2009,10:717-742

[4]Shiao M.S.Natural products of the medicinal fungus Ganodermalucidum:occurrence,biological activities,and pharmacologicalfunctions.Chem.Rec.,2003,3:172-180

[5]Boh B.,Berovic M.,Zhang J.&Zhi-Bin L.Ganoderma lucidum and itspharmaceutically active compounds.Biotechnology annual review2007,13:265-301

[6]Yun TK.Update from Asia:Asian studies on cancerchemoprevention.Ann NY Acad Sci,1999,889:157-192

[7]Sliva D.Cellular and physiological effects of Ganoderma lucidum(Reishi).Mini-Rev Med Chem,2004,4:873-879

[8]Wang SY,Hsu ML,Hsu HC,Tzeng CH,Lee SS,Shiao MS,Ho CK.The antitumoreffect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from activatedmarophages and tlymphocytes.Int J Cancer,1997,70:699-705

[9]Lin ZB,Zhang HN.Anti-tumor and immunoregulatory activities ofGanoderma lucidum and its possible mechanisms.Acta Pharmacol Sin,2004,25:1387-1395

[10]Lee SS,Wei YH,Chen CF,Wang SY,Chen KY.Anti-tumor effects ofGanoderma lucidum.J Chin Med,1995,6:1-12

[11]Shi L.,Ren A.,Mu D.&Zhao M.Current progress in the study onbiosynthesis and regulation of ganoderic acids.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,88:1243-1251.

[12]Hirotani M,Asaka I,Furuya T.Investigation of the biosynthesis of3α-hydroxy triterpenoids,ganoderic acids T and S,by application of a feedingexperiment using[1,2–13C2]acetate.J Chem Soc Perkin Trans,1990,1:2751–2754.

[13]Wu Q,Song J,Sun Y,et al.Transcript profiles of Panaxquinquefolius from flower,leaf and root bring new insights into genes relatedto ginsenosides biosynthesis and transcriptional regulation.Physiol Plant,2010,138(2):134-149.

[14]Ding YX,Ou-Yang X,Shang CH,Ren A,Shi L,Li YX,Zhao MW.Molecularcloning,characterization,and differential expression of a farnesyl-diphosphate synthase gene from the basidiomycetous fungus Ganodermalucidum.Biosci Biotechnol Biochem,2008,72:1571–1579.

[15]Ren A.,Qin L.,Shi L.,Dong X.,Mu D.S.,Li Y.X.&Zhao M.W.Methyljasmonate induces ganoderic acid biosynthesis in the basidiomycetous fungusGanoderma lucidum.2010,Bioresource technology,101:6785-6790.

[16]Lee MH,Jeong JH,Seo JK,et al.Enhanced triterpene and phytosterolbiosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalene synthase gene.PlantCell Physiol,2004,45(8):976-984.

[17]Han JY,In JG,Kwon YS,et al.Regulation of ginsenoside andphytosterol biosynthesis by RNA interferences of squalene epoxidase gene inPanax ginseng.Phytochenmistry,2010,71(1):36-46.

[18]Hongmei Luo,Chao Sun,Jingyuan Song,et al.Generation and analysisof expressed sequence tags from a cDNA library of the fruiting body ofGanoderma lucidum.2010,5:9

[19]Shang CH,Zhu F,Li N,Ou-Yang X,Shi L,Zhao MW,Li YX.Cloning andcharacterization of a gene encoding HMG-CoA reductase from Ganoderma lucidumand its functional identification in yeast.Biosci Biotechnol Biochem,2008,72:1333–1339.

[20]Zhao MW,Liang WQ,Zhang DB,Wang N,Wang CG,Pan YJ.Cloning andcharacterization of squalene synthase(SQS)gene from Ganoderma lucidum.JMicrobiol Biotechnol,2007,17:1106–1112.

Claims

1.赤芝萜类合酶GL22395，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

2.权利要求1所述赤芝萜类合酶GL22395的编码基因。

3.赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如Seq IDNo.2所示。

4.含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的载体。

5.含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的宿主细胞。

6.含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的工程菌。

7.权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列在调控真菌及植物萜类化合物合成中的应用。

8.权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列在调控萜类化合物体外合成中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以大肠杆菌内源性FPP为底物，通过转化赤芝萜类合酶GL22395的编码基因或其cDNA序列，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。

10.用于PCR扩增权利要求3所述编码基因cDNA序列的特异性引物对，包括：

正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′

反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′。