CN105154423B - 赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及赤芝萜类合酶GL‑TS2编码基因cDNA序列及其应用，所述赤芝萜类合酶GL‑TS2编码基因的cDNA序列如Seq ID No.2所示，编码346个氨基酸。本发明通过赤芝萜类合酶基因GL‑TS2转化大肠杆菌，以内源性FPP为底物，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列及其应用。
背景技术
灵芝为担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyproraceae)灵芝属(Ganoderma)真菌赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G.sinense)的总称。灵芝作为我国传统的药用真菌，几千年来一直被用于疾病治疗和养生保健，具有悠久的药用历史。对于灵芝的药用记载最早出现在两千多年前的《神农本草经》中，目前灵芝已被《美国草药药典与治疗纲要》(American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium)收录，其药用价值已得到世界各国的广泛认可。灵芝中含有多种生物活性物质，截止目前，已有400多种不同的化合物被鉴定出来，包括150余种萜类化合物、灵芝多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸等，因此灵芝又被称为“生物活性成分细胞工厂”。现代药理学研究已经证明，灵芝具有多种重要的医学价值，例如抗肿瘤、降血压、抗病毒以及增强免疫能力等，其在疾病治疗、新药研发等领域中具有广阔的应用前景。
灵芝萜类与灵芝多糖是灵芝药用活性成分的主要组成部分。灵芝萜类中主要活性成分是灵芝三萜，其他萜类如单萜、倍半萜以及二萜也具有较强的药理活性。这三类萜在灵芝中的含量极少，并且提取分离困难，化学合成亦面临着巨大挑战。同位素标记实验显示：灵芝萜类通过甲羟戊酸途径(Mevalonic Acid Pathway，MVP)合成，羊毛甾醇是萜类化合物和麦角甾醇(真菌细胞膜的重要组分)的共同环状前体，但是目前对于灵芝萜类下游特异性合成途径的研究还是空白，对于从单一前体羊毛甾醇形成种类繁多的灵芝萜类的分子机制还不清楚。灵芝萜类生物合成途径相当复杂，参与其中的关键酶、限速酶亦数目繁多。
近年来，研究人员已经展开了对灵芝萜类合成的MVP途径中关键酶基因的克隆及特征描述等相关研究，并取得了显著的进展。Hongmei Luo等构建了灵芝子实体cDNA文库，并对其做表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)分析。研究人员从文库中随机抽取了1023个克隆，最终获得879条高质量的ESTs，经序列比对后发现这些ESTs与多种已知功能的基因具有极高的相似度，其中包括编码鲨烯环氧酶(SE)以及法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)的基因。Changhua Shang等从灵芝中分离得到了编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶(HMGR)的基因，并获得了其cDNA全长以及基因组序列全长。HMGR编码基因的cDNA序列(GenBank编号：EU263989)中开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)全长为3681bp，编码一条包含1226个氨基酸的多肽链；HMGR编码基因的DNA序列(GenBank编号：EU263990)全长为4262bp，包含7个外显子和6个内含子。此外，Ding YX等以及Zhao MW等则分别从灵芝中克隆得到了法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)编码基因的cDNA序列全长以及鲨烯合成酶(SQS)编码基因的cDNA序列全长和基因序列全长。这些基因的获得对后续进行灵芝萜类生物合成途径的异源构建及表达等相关研究提供了极其宝贵的数据和资料。
发明内容
本发明的目的是提供赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的赤芝萜类合酶GL-TS2，其为由Seq ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白，赤芝萜类合酶GL-TS2催化合成的产物为倍半萜，所述倍半萜的结构式如式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K所示：
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL-TS2的编码基因。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列，其为Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供含所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因或所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列的载体。
本发明还提供含所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因或所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列的宿主细胞、工程菌及转基因细胞系。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因或所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列在调控真菌及植物萜类化合物合成中的应用。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因或所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列在调控萜类化合物体外合成中的应用。
所述在调控萜类化合物体外合成中的应用是以大肠杆菌内源性FPP(法尼基焦磷酸)为底物，通过转化赤芝萜类合酶GL-TS2的编码基因或其cDNA序列，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物(倍半萜)。
本发明还提供用于PCR扩增所述赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列的特异性引物对，包括：
正向引物：5′-GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3′
反向引物：5′-GCGAGGACCACCTAAACCC-3′
本发明利用同源序列搜索和结构域搜索的方法，根据灵芝基因组(GenBank编号：AGAX00000000.1)公开的序列信息，，获得候选萜类合酶基因cDNA序列，使用引物设计软件Lasergene PrimerSelect对该基因序列进行分析，在其开放阅读框(ORF)前后100bp的范围内寻找最适引物对，最终确定引物序列为：
正向引物：5′-GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3′
反向引物：5′-GCGAGGACCACCTAAACCC-3′
所述萜类合酶编码基因cDNA克隆方法为：提取赤芝菌丝总RNA，反转录合成cDNA，利用上述引物对，以赤芝菌丝cDNA为模板进行PCR反应，回收PCR扩增产物与载体链接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆并测序。
本发明提供的赤芝萜类合酶GL-TS2的开放阅读框(ORF)长度为1041bp(Seq IDNo.2)，编码346个氨基酸(Seq ID No.1)。将GL-TS2全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝GL-TS2基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能验证的Dichomitussqualens LYAD-421 SS1(污叉丝孔菌)相似度最高，达92％。
萜类合酶基因是一类以GPP(牻牛儿基焦磷酸)、FPP(法尼基焦磷酸)和GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)为底物，分别催化单萜、倍半萜及二萜生物合成的一类酶家族成员。本发明的赤芝萜类合酶GL-TS2能够催化上述萜类物质的合成，通过以大肠杆菌内源性FPP为底物，转化赤芝萜类合酶基因GL-TS2，从而实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。
附图说明
图1为本发明实施例2中GL-TS2基因在赤芝不同组织部位(菌丝mycelia、原基primordia、子实体fruiting bodies)的表达情况。
图2为本发明实施例3中重组质粒pET28a-GL-TS2的PCR鉴定结果；其中，M为DL2000DNA Maker，1为pET28a-GL-TS2重组质粒。
图3为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果(色谱图)。
图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13和图14为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果(质谱图)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列的获得
1、根据已经测得的灵芝全基因组(GenBank编号：AGAX00000000.1)数据，通过拼接、注释等操作，获得候选萜类合酶基因cDNA序列。
2、取生长旺盛的灵芝菌丝，使用QiaGenMini试剂盒进行RNA的提取，利用逆转录试剂盒(PROMEGA)进行逆转录，对获取的cDNA为模板，使用引物设计软件LasergenePrimerSelect对该候选基因cDNA序列进行分析，在其开放阅读框(ORF)前后100bp的范围内寻找最适引物对，最终确定引物序列为：
正向引物：5′-GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3′
反向引物：5′-GCGAGGACCACCTAAACCC-3′
引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
3、琼脂糖凝胶电泳表明约在1000bp处出现特异片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收目标片段，克隆至pGEM-Teasy载体(Promega)中，鉴定阳性克隆并进行测序验证(北京农业科学院测序中心)，用于表达载体的构建。
实施例2 GL-TS2基因cDNA序列的生物信息学分析及组织表达分析
1、本发明的赤芝萜类合酶GL-TS2的开放阅读框(ORF)长度为1041bp(Seq IDNo.2)，编码346个氨基酸(Seq ID No.1)。将GL-TS2全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝GL-TS2基因编码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能验证的Dichomitussqualens LYAD-421 SS1(污叉丝孔菌)相似度最高，达92％。
2、提取赤芝三个不同生长时期菌丝、原基和子实体的总RNA，利用逆转录试剂盒(PROMEGA)进行逆转录，以蛋白磷酸酶2A(PP2A)基因为内参基因，进行荧光定量PCR分析，正向引物为：5′-ATGTCCAGGAGCGTCAAGTAT-3′，反向引物为：5′-GCGTTGAGCGTGAGGAAC-3′，结果表明该基因在子实体期的表达明显高于其在菌丝期和原基期的表达(图1)。
实施例3 GL-TS2基因cDNA序列的原核表达及功能分析
1、根据赤芝萜类合酶的全长cDNA序列，设计PCR扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上加入限制性酶切位点Nde I和HindIII。所设计的引物为：
正向引物：5′-CGCCATATGATGCCTGCA-3′
反向引物：5′-CCCAAGCTTCTAGGCATG-3′
以全长cDNA片段为模板，经PCR扩增后，保证赤芝萜类合酶基因的阅读框完全正确，并用Nde I和HindIII内切酶进行酶切反应，回收目的片段1041bp；大肠杆菌表达载体pET28a用Nde I和HindIII内切酶进行酶切反应，回收目的片段5kb。将经过酶切的赤芝萜类合酶基因的目的片段克隆至酶切的pET28a表达载体上，转化大肠杆菌BL21，提取重组子的质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。图2为重组质粒pET28a-GL-TS2的PCR鉴定结果。
2、蛋白表达的诱导及产物分析
挑取单克隆接种于3mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃振荡培养至摇床培养过夜，次日按照1∶100稀释加入到50mL液体培养基中，继续37℃培养，待OD600为0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mM，28℃诱导目的蛋白表达6-8小时后，50℃水浴，固相微萃取15min后，手动进样，GC-MS分析催化产物(图3和图4)。所得萜类化合物(根据化合物出峰时间依次编号A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K，分别对应质谱图的图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13和图14)--倍半萜的结构如下所示：
在大肠杆菌内异源合成倍半萜的过程如下：
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)
1.一种赤芝萜类合酶GL-TS2，其特征是，其为由Seq ID No.1所示的氨基酸序列构成的蛋白，所述赤芝萜类合酶GL-TS2催化合成的产物为倍半萜，所述倍半萜的结构式如式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K所示：
2.如权利要求1所述赤芝萜类合酶GL-TS2的编码基因。
3.一种赤芝萜类合酶GL-TS2编码基因cDNA序列，其特征是其为Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的载体。
5.含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的宿主细胞。
6.含有权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列的工程菌。
7.权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列在调控真菌及植物萜类化合物合成中的应用。
8.权利要求2所述编码基因或权利要求3所述编码基因cDNA序列在调控萜类化合物体外合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的在调控萜类化合物体外合成中的应用，其特征在于，以大肠杆菌内源性FPP为底物，通过转化赤芝萜类合酶GL-TS2的编码基因或其cDNA序列，实现在大肠杆菌内异源合成萜类化合物。
10.用于PCR扩增权利要求3所述编码基因cDNA序列的特异性引物对，包括：
正向引物：5′-GCCTCCCTCACCCACTCCAT-3′
反向引物：5′-GCGAGGACCACCTAAACCC-3′。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |