CN116004553A - 参与绞股蓝皂苷合成的基因及其编码产物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了参与绞股蓝皂苷合成的基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程技术领域；该基因全长开放阅读框核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。该基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。该基因不仅可应用于通过合成生物学或代谢工程技术异源合成和生产原人参二醇类绞股蓝皂苷的基本骨架，也可用于通过合成生物学的手段提高人参皂苷的含量。同时，该基因为药用植物绞股蓝的优良品种选育提供了依据与支持。

Description

参与绞股蓝皂苷合成的基因及其编码产物与应用

技术领域

本发明涉及药用植物基因工程技术领域，更具体的说是涉及参与绞股蓝皂苷合成的基因及其编码产物与应用。

背景技术

药用植物绞股蓝Gpnostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino隶属于葫芦科绞股蓝属，又名天堂草、福音草、七胆草、小苦药、遍地生根、五叶参和七叶参，为多年生攀援草本。其干燥全草入药，具有清热解毒、止咳化痰、补气生津、健脾安神之功效。

研究人员先后从绞股蓝中分离出130余种皂苷类化合物和多种糖类、黄酮类化合物。其中，在皂苷类化合物中，83种为具有类似人参皂苷骨架的达玛烷型绞股蓝皂苷，这就意味着绞股蓝是除五加科植物以外存在的含有人参皂苷的植物，具有与人参作用相似的免疫增强剂。

然而，绞股蓝皂苷在植物中含量低、不易化学合成，随着中药产业化对中药活性成分的需求增大，仅靠从天然绞股蓝中提取绞股蓝皂苷无法满足临床需求量。因此，需要通过克隆鉴定活性成分关键酶基因，解析其生源代谢途径，进而有利于利用合成生物学策略生产药用活性成分，调节相关次生代谢产物的生物合成。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了参与绞股蓝皂苷合成的基因及其编码产物，该基因是参与绞股蓝皂苷合成的关键酶基因，在该基因编码酶的催化作用下，绞股蓝皂苷合成路径中的达玛烯二醇(Dammarenediol)可产生原人参二醇(Protopanaxadiol)，实现在底物C12位上进行单加氧的功能。该基因的鉴定成功，对原人参二醇型绞股蓝皂苷的生物合成、代谢调控，以及药用植物绞股蓝的遗传育种具有重要价值。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

参与绞股蓝皂苷合成的基因，基因全长开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

参与绞股蓝皂苷合成的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有上述参与绞股蓝皂苷合成的基因的表达载体。

含有上述参与绞股蓝皂苷合成的基因的工程菌。

优选地，上述工程菌为酿酒酵母。

上述参与绞股蓝皂苷合成的基因或上述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白可应用于调节达玛烷型皂苷生物合成。

上述参与绞股蓝皂苷合成的基因或上述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白可应用于异源合成达玛烷型皂苷。

上述参与绞股蓝皂苷合成的基因或上述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白可应用于催化达玛烯二醇C12位羟基化生成原人参二醇。

进一步地，构建表达SEQ ID NO.1所示基因以及SEQ ID NO.3所示基因的表达载体，转入能够内源积累2,3-氧化鲨烯的宿主，诱导原人参二醇的表达。

上述参与绞股蓝皂苷合成的基因或上述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白可用于绞股蓝皂苷生物合成及绞股蓝遗传育种。

由上述技术方案可知，本发明公开了参与绞股蓝皂苷合成途径的关键酶基因，该基因不仅可应用于通过合成生物学或代谢工程技术异源合成和生产原人参二醇型三萜皂苷的基本骨架，而且也为绞股蓝皂苷的代谢调控以及绞股蓝的分子育种提供了理论支撑。

附图说明

图1所示为细胞色素P450基因GpCYP716A2在根、茎、叶中的表达量分析。

图2所示为WAT11/pESC-GpOSC1-GpCYP716A2样品色谱图。

图3所示为GpCYP716A2基因特异性产物对应的质谱图(保留时间44.68min)。

图4所示为原人参二醇(Protopanaxadiol)标准品色谱图。

图5所示为原人参二醇(Protopanaxadiol)标准品质谱图(保留时间44.66min)。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行操作。

实施例1 GpCYP716A2基因功能初步分析

GpCYP716A2基因全长开放读码框ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGAACCTAATTCATCTGTTCCGATACCTACCTGTTCTTGAAGTTATGGATTTGTTTTGGTACAATGTTTTATTAGTCACCTTCACTTCACTTCTTTTTTTCCTCGTATTTCTCTTGTTTAAAAAATCCAATGTTTCTAATGATCAACACATTAATCTTCCTCCTGGAAAGATGGGGTTTCCATTCATTGGTGAAAACCTGAAATTCTTCAAAACATTACGAAATGGTCATCCTGAAAACTTCATATTTGAAAGAATGTCCAAATTTTGTCCTCAAGTTTTCAAAACATCCATAGTTGCTGAGCCAGTAGCTGTTTTTTGTGGAATCCCAGGAAACAAATTCTTGTTTTCTAATGAGAACAAGTGTCTCACAGCTTGGTGGCCAAACTCAGTAAGCAAGATCTTCCAACACAAAGCAGATCAAAATGAAAACACTTCCGTTGAAGAGTCAAAGAAAACGAGAAAGTTACTTCCAGATTACTTAAACCCAGAATCTCTCAAGAGATATATAAGCATTATGGATTCAATGGCAGAAAATCACTTCAAAGAATGCTGGGAAGGAAGAGAACAAGTCTGTGTTCATCAACTTTCAAAAAAATTCACCTTCCATTTAGCTTGCAATCTTTTCTTGAGCATGGAAGATAGTGAGAAAGTGAAGAAATTTGGAGCTCCTTTCAAAATCTTGACAATGGGGCTCTTCTCTCTCCCAATAAACTTACCAGGAACAGCTTTTAACAAAGCAATCAAGGCCTCTAAATTGCTAAGAGAGGAAATCACAAGTATTATAAAGCAGAGAAATATTGATCTTATGGAGAAGAAGGCGTCTCCTGTTCAAGATATTTTGTCTCATATGCTTCTGACTGTAGATGAGGATGGAAATCACATGAGTGAATCAGAAATAGCAAGCAAGGTTTTAGGTTTGCTAATTGCTGGTTATGATAATGCAAGCTCTGTCATCAAGACTATGGTTTACTATCTTGCTGACAATCCTCAATTGTACAACCAACTTTACTTGGAGCAAATGGAGATTGCAAAATCAAAAAAACCTGGAGAGTCACTGAATTGGGATGACCTTCAGAAGATGAGATATGCATGGAATGTTGCATGTGAAGCAATGCGACTTCTTCCTCCCGTCGCTGGTACTTTTAGGATGGCCACTACTGACTTTACCTTTGCTGGTTTTCTCATTCCAAAGGGTTGGAAGCTATATTGGAGCACAGATGCATCACACAAGAACCCAGAGTATTTTCCACAACCAGAAAAGTTTGATCCATCAAGATTTGAAGGGGATGGACCGATCCCATTTAGTTTCGTACCATTTGGAGGAGGCCCAAGAATGTGTCCTGGAAAAGAGTATGCACGTTTAGAAATGCTTGTTTTTATGCATCATTTGGTGAAGAGATACAAATGGGAGAAGATACTTTCTCATAATAAGACTTCTATCGATCCATTGCCAACTGCAAATCGAAGCTTACCCATTCGCCTTTTTCCACATCTTCCATAG。

采集绞股蓝植株无菌苗的根、茎、叶三个组织样品于液氮速冻。另外，用200μM茉莉酸甲酯(MeJA)溶液喷洒于绞股蓝无菌苗上，分别采集MeJA喷洒处理后0h，6h，12h，18h，24h的叶片于液氮速冻。以上样品用于RNA提取。

使用QIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用PROMEGAGoScript^TMReverse Transcription System反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。使用Takara Premix Ex Taq^TM和Bio-RAD CFX96 real time system实时荧光定量PCR仪进行定量PCR扩增。

实时荧光定量扩增GpCYP716A2的引物根据ORF上下游及附近的UTR区域设计，具体的引物序列为：

GpCYP716A2-F：CTTCCGCTGTGCATGTTCTA，SEQ ID NO.4；

GpCYP716A2-R：GCCTTTTTCCACATCTTCCA，SEQ ID NO.5；

引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；

实时荧光定量PCR分析结果如图1所示，GpCYP716A2在不同器官组织中的表达情况为叶＞茎＞根；并且受MeJA诱导后在6h表达量最低、18h表达量最高，与绞股蓝皂苷合成过程中上游基因表达情况一致。由此推测GpCYP716A2可能参与绞股蓝皂苷的生物合成。

实施例2绞股蓝中GpCYP716A2基因的克隆

取生长旺盛的绞股蓝植株的幼嫩叶片，使用QIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用PROMEGA GoScript^TMReverse Transcription System反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。

根据GpCYP716A2基因ORF上下游及附近的UTR区设计如下引物对：

正向引物：GGCTATCTATATAATGAACCTAAT，SEQ ID NO.6；

反向引物：GTTATTTATTTAGTAGTCTTCCG，SEQ ID NO.7；

引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；

以得到的cDNA为模板使用上述正向引物和反向引物进行扩增。扩增产物琼脂糖凝胶电泳在1.5kb处出现特异性条带，对目标条带进行切胶回收，胶回收产物连接到北京聚合美生物科技有限公司的M5 HiPer pTOPO-Blunt vector，随后转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行测序(苏州金唯智生物科技有限公司-一代测序)，选择和保存序列正确(参考转录组测序结果)的GpCYP716A2基因克隆用于后续表达载体的构建。

一代测序结果显示，扩增得到的绞股蓝皂苷合成代谢途径中的细胞色素P450酶基因GpCYP716A2全长开放读码框(ORF)的长度为1503bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1；编码500个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2：MNLIHLFRYLPVLEVMDLFWYNVLLVTFTSLLFFLVFLLFKKSNVSNDQHINLPPGKMGFPFIGENLKFFKTLRNGHPENFIFERMSKFCPQVFKTSIVAEPVAVFCGIPGNKFLFSNENKCLTAWWPNSVSKIFQHKADQNENTSVEESKKTRKLLPDYLNPESLKRYISIMDSMAENHFKECWEGREQVCVHQLSKKFTFHLACNLFLSMEDSEKVKKFGAPFKILTMGLFSLPINLPGTAFNKAIKASKLLREEITSIIKQRNIDLMEKKASPVQDILSHMLLTVDEDGNHMSESEIASKVLGLLIAGYDNASSVIKTMVYYLADNPQLYNQLYLEQMEIAKSKKPGESLNWDDLQKMRYAWNVACEAMRLLPPVAGTFRMATTDFTFAGFLIPKGWKLYWSTDASHKNPEYFPQPEKFDPSRFEGDGPIPFSFVPFGGGPRMCPGKEYARLEMLVFMHHLVKRYKWEKILSHNKTSIDPLPTANRSLPIRLFPHLP。

实施例3绞股蓝中GpCYP716A2基因的功能鉴定

将SEQ ID NO.3所示OSC1基因(ATGTGGAAGATAAAGATAGCAGAAGGAGGGAATAATCCATATATATTCAGCAGTAATAATTTCATAGGAAGACAGATATGGGAATTCGATCCTGAAGCAGGTACTCAAGAAGAGAGAGACCAAGTTGAAAAGGCTCGCTTTCATTTCTATCAAAATCGTCGTAAAGTCAAGCCTGCTTCTGATCTCCTTTGGAGAATGCAGATGCTGAGAGAGAAAAAGTTCAAACAAGAAATCCCAGCAGTAAAGATAGAGGAGGGTGAAGAAATAACAGTAGAGAAGGCGAGTATTGCATTGAAGCGAGCAGCACACTTCTACTCGGCATTGCAGACAAGAGATGGGCATTGGCCAGCTGAAAATGCAGGTCCTGCTTTCTTCCTTCCACCATTGGTAATGTGCCTTTACTCGACAGGATATCTCGACCAGTTTTTCACCAAAGAACATAAGAAAGAAATATTAAGATACATATATTGTCATCAAAATGAAGATGGAGGTTGGGGAATGTATATTGGAGGCCAAAGCTCTATGTTAGGAAGCATCTCCAGTTATGTTTGTATGCGTTTAATTGGTGAAGGACCGGATGGTGGTCTTAACGATGCTTGTTCCAGAGGCCGTAAATGGATTCTTGATCACGGTGGTGCTACTCATGTACCCGCCTGGGGAAAGACCGCTCTTACTTTGTTAGGTGCTTATGAGTGGGCTGGAAACAACCCAGTGCCTCCAGAGTGTTGGCTACTCCCTTCATATATTCCGTTTCACCCAGCAAATGTTTGGTGCTATTTTCGAACGGTATATCTACCCATGTCCTACTTATATGGTAAAAGATTTGTTGGGCCAATCACGCCTCTTATACTTGAATTGAGACAAGAAATTTACACTCAACCTTATGATAAAATCGACTGGAAAAAGGCACGTCACCAGTGTGCTAAGGAGGATCTATATTTTCCCCATCCTTTTTACCAAGATGCAATATGGGATGGGCTATACCTTTGCACGGAACCCCTTCTTACTCGTTGGCCTCTCAACAAATTGGTTAGAGAGAGGGCTCTTAAAGTCACCATGGATCATATTCGTTACGAAGATGAGAATAGTCATTATATTACTATGGGTTGTGCTGAAAAGGTATTGTGTATGCTAGCATGTTTTGCTGAAGATCCAAATGGAGAAGCGTTCAAAAAGCATTTGGCAAGACTACCAGATTTCATATGGATAGGTGAAGATGGTATGAAAATGCAGAGTTTTGGAAGTCAAGAATGGGATGCTGGTTTTGCAATTCAAGCTTTACTTGCTGCTGATATGGTCGACGAAATCGGACCTACTTTAGCGAAAGGACATGATTTCATTAAGAATTCTCAAGTCAGGGATAACCCTTCTGGTGATTTTAGGAAAATGCATCGTCATATTTCTAAGGGAGCTTGGACTTTCTCGGACCGTGATCACGGTTGGCAAGTTTCTGATTGTACTGCTGAAGCTTTGAAGTGTTGCCTCCTTTTTTCATTGATGCCACCAGAGATTGTGGGTGAGAAAATGGAAGCTGAAAGGTTATACGATGCAGTCGATCTCTTACTTTATCTACAGAGTGAAAATGGAGGTTTGACAGCTTGGGAAAAAGGAGGAAAGTACCCTTGGCTAGAAAAACTAAATCCGACAGACATATTCGGAGACGTAATGATTGAGCACGAGTACGTAGAATGCACGTCTTCAGCAATTCAAGCATTTAAAATGTTCAAGAAACTATACCCAGGATACAGAACAAAGGATGTTGATAATTTCATTACAAATGGAATTTCATATATTCTGAAATCACAATTCCCAGATGGTTCTTGGTATGGGAATTGGGGTATTTGTTTTACTTATGGTACTTGGTTTGCTCTTGCTGCTCTTTTCACTGTCGGCAAATCTTTTACCAATTCTTTAGCCATTCGTAAAGCTACCCATTTCCTTCTTCAAACTCAAAAGCCAGATGGTGGTTGGGGTGAAAGCTACCTTTCCTGCCCTAATATGAAATACATACCTCTGGAAGGAGATGAATCGAATTTGGTTCAGACAGCTTGGGCAATGATGGGTCTGATTCTTGCTGGGCAGGCGGAAAGAGATCCCACACCTATTCACCGAGCCGCTAAGCTCATCATCAATTCACAATTGGAAAACGGAGACTTTCCCCAACAAGAAATAACAGGCGTTTTTATGAAGAACTGTATGTTACATTATTCAAATTACAGAAACATCTTCCCACTCTGGGCTCTGGCTGAATATCGTAAACTCGTCAAATTCCCTTCCACTTGA，经鉴定，此基因编码产物可催化2,3-氧化鲨烯环化成达玛烯二醇)连入pESC-ura表达载体的GAL1启动子区域，具体连接位点为XhoⅠ和KpnⅠ，双酶切使用T4连接酶连接得到表达载体pESC-GpOSC1-ura，以保证在转入WAT11酿酒酵母菌株后，在酵母菌株能够内源产生2,3-氧化鲨烯的前提下，OSC1基因能够催化产生GpCYP716A2基因表达所需要的底物达玛烯二醇。

通过对GpCYP716A2基因以及表达载体pESC-GpOSC1-ura酶切位点的分析，选择NotⅠ和SpeⅠ酶切位点进行连接，根据基因的ORF区及载体酶切位点的具体序列，引物对设计如下：

F：CGGAATTCATGAACCTAATTCATCTG，SEQ ID NO.8；

R：GGACTAGTCTATGGAAGATGTGGAAA，SEQ ID NO.9；

cDNA按照实施例2方法获得，使用上述引物F、R扩增得到的带有酶切位点的目的片段，连接到M5 HiPer pTOPO-Blunt vector进行测序验证；最后使用NotⅠ和SpeⅠ双酶切，使用T4连接酶将目的片段连接到pESC-GpOSC1-ura表达载体上；经测序验证，获得的pESC-GpOSC1-GpCYP716A2-ura载体上连接有包含SEQ ID NO.1所示序列的目的片段。

采用醋酸锂转化法将构建好的pESC-GpOSC1-GpCYP716A2-ura载体转入酿酒酵母WAT11菌株(市售，能够内源积累2,3-氧化鲨烯)中，转化出来的菌落测序验证其阳性。

挑取阳性的酵母单克隆WAT11/pESC-GpOSC1-GpCYP716A2-ura于50mL SD-ura液体培养基中(8g/L Ura Minus Media+2％葡萄糖+50mg/mL吐温-80+13mg/mL氯化血红素)培养，培养条件为30℃，220rpm。48h后，3000rpm集菌，无菌水洗涤三次，转接至添加有半乳糖的50mL SC-ura液体诱导培养基(2％半乳糖+8g/L Ura Minus Media+1％棉子糖+50mg/mL吐温-80+13mg/mL氯化血红素)中进行诱导表达，诱导时间48h，条件为30℃，220rpm。

诱导培养48h后收集菌体，加入5mL碱裂解液(20％KOH+50％EtOH)，95℃高温裂解15min，而后加入等体积的正己烷对催化产物进行涡旋萃取。采用旋转蒸发仪使催化产物浓缩，氮吹仪挥干，甲醇溶解待检测。

提取完成的酵母表达产物进行GC-MS检测，GC-MS检测结果显示(图2、图3)，WAT11/pESC-GpOSC1-GpCYP716A2-ura表达产物在保留时间44.68min时有特异产物峰出现，即有原人参二醇(Protopanaxadiol)产生。经过查看比对原人参二醇标准品色谱图(图4)保留时间以及44.66min相应质谱图(图5)，鉴定特异性产物为原人参二醇。

上述实验表明，GpCYP716A2基因参与绞股蓝皂苷的生物合成，此基因所表达的酶能够催化达玛烯二醇产生原人参二醇，可调节绞股蓝中达玛烷型皂苷的代谢合成，为原人参二醇型绞股蓝皂苷的代谢调控提供有力前提，并为绞股蓝遗传育种奠定基础。

本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.参与绞股蓝皂苷合成的基因，其特征在于，基因全长开放阅读框核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.参与绞股蓝皂苷合成的蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述参与绞股蓝皂苷合成的基因的表达载体。

4.含有权利要求1所述参与绞股蓝皂苷合成的基因的工程菌。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为酿酒酵母。

6.权利要求1所述参与绞股蓝皂苷合成的基因或权利要求2所述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白在调节达玛烷型皂苷生物合成中的应用。

7.权利要求1所述参与绞股蓝皂苷合成的基因或权利要求2所述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白在异源合成达玛烷型皂苷中的应用。

8.权利要求1所述参与绞股蓝皂苷合成的基因或权利要求2所述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白在催化达玛烯二醇C12位羟基化生成原人参二醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，

构建表达SEQ ID NO.1所示基因以及SEQ ID NO.3所示基因的表达载体，转入能够内源积累2,3-氧化鲨烯的宿主，诱导原人参二醇的表达。

10.权利要求1所述参与绞股蓝皂苷合成的基因或权利要求2所述参与绞股蓝皂苷合成的蛋白在绞股蓝皂苷生物合成及绞股蓝遗传育种中的应用。

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