CN114908067B - 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用 - Google Patents

氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114908067B
CN114908067B CN202210132042.5A CN202210132042A CN114908067B CN 114908067 B CN114908067 B CN 114908067B CN 202210132042 A CN202210132042 A CN 202210132042A CN 114908067 B CN114908067 B CN 114908067B
Authority
CN
China
Prior art keywords
kaempferol
methyltransferase
oxymethyl
fsr2
transferase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210132042.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114908067A (zh
Inventor
张礼文
徐玉泉
王辰
岳群
刘洋
顿宝庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Research Institute of CAAS
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Research Institute of CAAS filed Critical Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority to CN202210132042.5A priority Critical patent/CN114908067B/zh
Publication of CN114908067A publication Critical patent/CN114908067A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114908067B publication Critical patent/CN114908067B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开甲基转移酶及其在催化山奈酚4’位羟基氧甲基化反应中的应用，该反应是从山奈酚出发合成淫羊藿苷的关键步骤，本发明提供的生物催化方法，可以实现细胞工厂发酵合成淫羊藿苷，具有巨大的应用价值。

Description

氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4'羟基氧甲基化中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及可将山奈酚4'羟基氧甲基化的氧甲基转移酶及其相关应用。
背景技术
真菌生物转化是利用细胞内特定的酶对底物进行结构修饰与改造，从而获得更有价值的化合物的代谢反应。山奈酚（kaempferol）（式1）是一种常见的天然黄酮类植物次生代谢产物，其广泛存在于多种植物的根、叶和果实中。山奈酚具有抗氧化、抗炎症、抑制肿瘤生长及保护肝细胞、抑制血小板聚集和黏附作用等活性，因此受到人们的广泛关注。此外，它还是合成多种黄酮类活性物质的重要中间产物，如淫羊藿苷。
淫羊藿苷（Icariin）（式2）是淫羊藿的主要活性成分，为8-异戊烯基黄酮苷类化合物。淫羊藿苷能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，还具有补肾壮阳、抗衰老等功效。目前获得淫羊藿苷主要是从箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿巫、朝鲜淫羊藿等干燥茎叶中提取得到，然而，植物生长周期长、产物含量低，导致这种生产方式对野生植物资源造成严重破坏。如何以一种可持续、绿色清洁的方式生产这些高附加值的天然产物，对于保障社会经济可持续发展至关重要。生物质是一种可再生的清洁资源。通过生物制造技术，生物质可以被转化为燃料、大宗化学品和天然产物，从而替代石油化工炼制和植物资源提取。生物制造的核心技术是构建高效的微生物细胞工厂，将生物质原材料转化为各种终端产品。如何拓展微生物细胞生产化学品的种类和如何提高细胞的生产效率是限制细胞工厂产业化的两个关键技术问题。
4’位羟基的氧甲基化是从山奈酚出发合成淫羊藿苷的关键步骤之一；构建利用生物质高效合成淫羊藿苷的关键技术之一是能够高效专一地进行山奈酚4’位羟基甲基化反应，实现途径之一就是挖掘具有该生物学功能的氧甲基转移酶。
发明内容
本发明的目的是获得能够高效专一地进行山奈酚4’位羟基甲基化反应的甲基转移酶基因，实现4’氧甲基山奈酚的高效合成。
本发明通过基因组挖掘，从水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)中挖掘到了一个氧甲基转移酶fsr2（Uniprot S0DQQ0），其编码基因属于镰刀菌素生物合成基因簇的一部分，镰刀菌素是负责子实体着色的高色素萘醌。通过cDNA扩增氧甲基转移酶基因fsr2，构建了可在酵母菌中表达的重组质粒，并在酵母中进行异源表达转化。通过外源添加山奈酚，从发酵产物中提取得到了4’氧甲基山奈酚（即山奈素）,且无其他转化产物。经与已知黄酮类4’羟基甲基化的甲基转移酶进行比较，发现fsr2转化产生山奈素的产量较高，产物谱专一程度较高。
进一步通过同源性挖掘和文献检索还得到具有上述酶活性的酶，即PaOMT、CrOMT、KAF 。
因此，本发明提供一种甲基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1、3、5或7所示，或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有甲基转移酶活性。
具体地，其中一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个，5个，3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。在一个更具体的实施方式中，在氨基末端或羧基末端连接有标签序列，优选地是Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc，更具体是RRRRR、HHHHHH、DYKDDDDK、WSHPQFEK、EQKLISEEDL。为了使（a）中的蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
本发明进一步提供所述的甲基转移酶的编码基因，优选地，其核苷酸序列如SEQID NO. 2、4、6、8所示。
更进一步提供所述的编码基因的重组载体、重组菌株、重组细胞，优选是酵母，更优选为酿酒酵母。
本发明尤其提供一种制备4’氧甲基山奈酚的方法，其特征在于，以山奈酚为底通过所述的甲基转移酶催化实现。具体地，其是通过含有所述的编码基因的重组菌株发酵制备，更优选地，在培养所述重组菌株时添加底物山奈酚；任选地，还包括纯化产物4’氧甲基山奈酚的步骤。更优选地，所述重组菌株是酿酒酵母。
本发明还提供所述的甲基转移酶、及其编码基因，或含有所述的编码基因的重组菌株在制备4’氧甲基山奈酚中的应用，具体地以山奈酚为底物，通过山奈酚4’位羟基氧甲基化而实现。
同时还提供所述的甲基转移酶、及其编码基因，或含有所述的编码基因的重组菌株在制备淫羊藿苷中的应用，具体地通过以山奈酚为底物，通过山奈酚4’位羟基氧甲基化而得到4’氧甲基山奈酚，再进一步转化为淫羊藿苷。
本发明挖掘的甲基转移酶可以催化山奈酚4’位羟基氧甲基化反应，该反应是从山奈酚出发合成淫羊藿苷的关键步骤，因此本发明提供的生物催化方法，可以实现细胞工厂发酵合成淫羊藿苷，具有巨大的应用价值。
附图说明
图1为fsr2基因片段的扩增结果；其中，1为pXW425M酶切，2为Fsr2扩增。
图2为重组载体PXW425m-fsr2的物理图谱；
图3为山奈酚修饰前的液相色谱图；
图4为山奈酚修饰前的质谱图；
图5为山奈素标准样品的液相色谱图；
图6为山奈素标准样品的质谱图；
图7为山奈酚经fsr2修饰后，产生的HPLC液相色谱图（注：化合物1的[M+H]+为287，符合山奈酚分子量；化合物2的[M+H]+为301，符合山奈素分子量）；
图8为山奈酚经fsr2修饰后，产生的一个甲基化化合物的质谱图；
图9为木犀草素经fsr2修饰后，产生的HPLC液相色谱图,从上至下依次为：含有空载体的酵母，底物木樨草素，产物香叶木素，底物饲喂含有fsr2载体的酵母（注：1为底物木樨草素）；
图10为圣草酚经fsr2修饰后，产生的HPLC液相色谱图,从上至下依次为：含有空载体的酵母，底物圣草酚，产物橙皮素，底物饲喂含有fsr2载体的酵母（注：1为底物圣草酚）；
图11为山奈酚经KAF修饰后，产生的HPLC液相色谱图（注：化合物1的[M+H]+为287，符合山奈酚分子量；化合物2的[M+H]+为301，符合山奈素分子量）；
图12为山奈酚经PaOMT修饰后，产生的HPLC液相色谱图（注：化合物1的[M+H]+为287，符合山奈酚分子量；化合物2的[M+H]+为301，符合山奈素分子量；3的[M+H]+为315，符合双氧甲基化的山奈酚分子量）；
图13为山奈酚经CrOMT修饰后，产生的HPLC液相色谱图（注：化合物1的[M+H]+为287，符合山奈酚分子量；化合物2的[M+H]+为301，符合山奈素分子量）。
具体实施方式
以下实验中所用的实验材料说明及来源如下：
菌株和载体：
水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)和酵母菌S. cerevisiaeBJ5464-NpgA、酵母表达载体PRS425m，均来源于中国农业科学院生物技术研究所。
酶与试剂盒：
限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；
RNA反转录试剂盒购自TAKARA公司；
Quick-Fusion Cloning Kit购自Biotool公司；
热启动高保真DNA扩增试剂盒购自Biotool公司；
DNA聚合酶和DNA marker购自北京全式金生物公司；
质粒小提试剂盒、通用型DNA纯化胶回收试剂盒购自天根公司；
冷冻酵母转化试剂盒购自YMO RESEARCH生物公司；
大肠杆菌DH5α感受态购自康维世纪公司；其它试剂均为国产分析纯产品。
培养基：
大肠杆菌培养基为LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）。SC--Leu缺陷培养基（1%葡萄糖、6.7%DifcoTMYeast Nitrogen Base w/o Amino Acids、-Leu/-TrpDO Supplement）。YPD培养基（1%酵母膏，2% Peptone蛋白胨，2% 葡萄糖）。YPD低糖培养基（1%酵母膏，2% Peptone蛋白胨，1% 葡萄糖.）若制固体培养基，加入2%琼脂粉。
实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，分子克隆按(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) 实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 克隆氧甲基转移酶基因fsr2，并构建酵母表达载体获得酵母转化子
通过相关生物信息学软件分析水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)基因组中的氧甲基转移酶，通过比对发现了一个氧甲基转移酶基因fsr2（其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸酸序列如SEQ ID NO.5所示）。将fsr2的核苷酸序列通过多种软件预测分析去除掉内含子拼接得到fsr2的编码区序列。提取水稻恶苗病菌的RNA通过反转录获得cDNA，利用设计的引物扩增fsr2的编码基因，回收目的片段交给测序公司测序比对，获得SEQ IDNO. 1所示的氧甲基转移酶fsr2。
合成时引入酶切位点。在启动子前加入NdeI酶切位点，在终止子后加入PmeI酶切位点，片段长度为0.75Kb。fsr2扩增片段见图1。
用NdeI和PmeⅠ双酶切穿梭载体PXW06F并回收6114bp大小的片段。利用无缝连接克隆试剂盒将两片段连接。
热激法转化入大肠杆菌感受态DH5α。Ampr抗性筛选，提取质粒，ScaI和NdeⅠ酶切鉴定。重组质粒PRS425M-fsr2图谱见图2。
将酿酒酵母S. cerevisiaeBJ5464-NpgA接种至YPD培养基中，30℃、200 r/min培养至O.D.值0.8-1.0，按照ZYMO公司提供的说明书制备酿酒酵母感受态细胞并进行重组质粒的转化。将含有fsr2基因的PRS425M-fsr2重组质粒转化入酿酒酵母中，涂布于亮氨酸缺失的SC固体缺陷培养基，30℃培养3天左右。获得的酵母转化子，划线培养至新的SC--Leu缺陷培养基上，于30℃培养箱中培养2天左右。
实施例2 应用氧甲基转移酶重组载体PRS425M-fsr2实现山奈酚到山奈素的转化
通过HPLC高效液相分离得到经氧甲基转移酶fsr2修饰后的代谢产物并分析其分子结构。实验方法如下：
1）发酵培养
采取二步法发酵技术，首先将适量的酿酒酵母转化子菌体接种至相应的25-mL-Leu液体缺陷培养基中（1%葡萄糖、6.7%DifcoTMYeast Nitrogen Base w/o Amino Acids、-Trp/-uraDO Supplement），30℃、200 r⋅min-1培养16 h左右，再加入YPD低糖培养基25 ml（1%酵母膏、2% Peptone蛋白胨、1%葡萄糖），同时加入5mg 山奈酚纯品继续培养48h；用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50 ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1 ml甲醇复溶萃取物。
2）高效液相（HPLC）色谱检测
将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。
HPLC检测条件如下：色谱柱RRHD Eclipse Plus C18, 4.6 x100mm，采用乙腈-H2O为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件: 0～5min,乙腈10%;5～8.5min,乙腈从50%→95%;8.5～9.5min, 乙腈为95%;9.5～10min, 乙腈从95%→10%。流速3. mL⋅min−1，检测波长为280 nm。
通过HPLC分析发现，山奈酚经转化得到了另外一个峰，无其他明显产物峰，其保留时间与山奈素标准样品一致（见图3、图5和图7）。经高分辨质谱检测，该产物峰的[M+H]+质荷比为301.0690，预测分子式为C16H13O6（误差为5.55 ppm）,与山奈素一致。经分析二级质谱，该产物与山奈素的谱图高度相似（见图4、图6和图8）。综合上述结果，判断该产物为山奈素。
以上结果证明，本发明涉及的氧甲基转移酶可专一地将山奈酚转化为山奈素，用于淫羊藿苷等山奈酚衍生化合物的制备。
实施例3 测试氧甲基转移酶重组载体PRS425M-fsr2对其他多酚类化合物的转化能力
通过HPLC高效液相分离得到经fsr2修饰后的代谢产物并分析其分子结构，检验fsr2对其它黄酮类多酚化合物的催化效果。实验方法如下：
1）发酵培养：
采取二步法发酵技术，首先将适量的酵母转化子菌体接种至相应的25 ml-Leu液体缺陷培养基中，30℃、200 r⋅min-1培养16 h左右，再加入YPD低糖培养基25 ml，同时分别加入5mg圣草酚或木樨草素的纯品继续培养48h；用乙酸乙酯提取发酵产物，乙酸乙酯与发酵液的比例为1:1，即用50 ml的乙酸乙酯提取发酵产物；旋转蒸发仪回收乙酸乙酯干燥萃取物，1 ml甲醇复溶萃取物。
2）高效液相（HPLC）色谱检测：
将上述所得发酵产物经高速离心后用高效液相色谱检测。
HPLC检测条件如下：色谱柱RRHD Eclipse Plus C18, 4.6 x100mm，采用乙腈-H2O为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱条件: 0～5min,乙腈10%;5～8.5min,乙腈从50%→95%;8.5～9.5min, 乙腈为95%;9.5～10min, 乙腈从95%→10%。流速3. mL⋅min−1，检测波长为280 nm。
通过HPLC分析发现，添加的2种底物均不能被fsr2转化，未检测到与底物相关的产物峰。重组菌株发酵产物色谱图见图9和图10。
实施例4 应用其它真菌源或植物源氧甲基转移酶转化山奈酚
比较不同来源的氧甲基转移酶将山奈酚转化为山奈素的能力。实验方法如下：
经过序列比对，发现一种来源于真菌F. buxicola的氧甲基转移酶KAF（AccessionID：JAAVUK010000131）与fsr2序列相似度较高。使用实施例一中的方法分别构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒，转入酿酒酵母；使用实施例二中的方法培养发酵并检测其产物。
经过文献检索，得到6种可能将山奈酚转化为山奈素的植物源氧甲基转移酶（表2）。使用实施例一中的方法分别构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒，转入酿酒酵母；使用实施例二中的方法培养发酵并检测其产物。
经分析，上述7种氧甲基转移酶中，有3种可以转化山奈酚，即PaOMT（其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸酸序列如SEQ ID NO.6所示）、CrOMT（其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，核苷酸酸序列如SEQ ID NO.7所示）、KAF（其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸酸序列如SEQ ID NO.8所示）。KAF、PaOMT和CrOMT转化山奈酚的液相色谱图如图11至图13，其中数字1标明 [M+H]+为287的化合物，符合山奈酚分子量，且保留时间与山奈酚标准品一致，表明该化合物为山奈酚；数字2标明[M+H]+为301的化合物，符合山奈素分子量，且保留时间与山奈素标准品一致，表明该化合物为山奈素；数字3标明[M+H]+为315的化合物，符合双氧甲基化的山奈酚分子量。
表2 能将山奈酚转化为山奈素的植物源氧甲基转移酶
然而，与fsr2相比，KAF与CrOMT的催化专一性虽然与fsr2相当，但转化率显著降低；PaOMT的催化率虽然较高，但专一性较差，增加分离提纯的难度。因此，综合考虑，fsr2在上述氧甲基转移酶中最适合应用于山奈酚到山奈素的生物转化。
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4'羟基氧甲基化中的应用
<160> 8
<210> 1
<211> 387
<212> PRT
<213> 水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 1
1 MDKADRDAVI EHATQVKRLV HDPHSFLTEL VAQQQQYHCI AWLCHFNILS NIPQPPESIA
61 YSDVATKAQV PLSKLQSVAR MAMTTGLLSE TKDGKLSHNT LSAQFITNVH MKTQLLHIVN
121 QTVPLMTGLI QATWKWGETS ATNETAYNII HGTELSFFEH LKTRPDLNEG FQAYMKSRAV
181 SHTGSNVEHL LNAFDWKALG QAQVVDIGGS SGSTSIMLAT AFPLLNLVIE DLPEPIENAK
241 ARLSELPSDI KSRIEIMAYD FFTPQPVKNA DVYLLRTILH DWPDADAIKI IQGIVAAMGP
301 SSRLLIMDMV LPKPGSGSVT FEAALRQKDL TMIQCFNAQE REVEEWKALL TKADPRLKIQ
361 AIERPAGSEL SVIEAMLDES PEQAAWF
<210> 2
<211> 391
<212> PRT
<213> 钝鳞紫背苔（Plagiochasma appendiculatum）
<400> 2
1 MAVSTNGKTS EGVSDVSRTK NITNGNGMDM SVSANVASIG SVSATPLSPE DKRDHVVAIN
61 FLLGWVQTWA LKAVVTMRIP DIISKAPMDA LTAREIISQI QCKNPSNAVP LLERLMRFMV
121 CKGFFSESVN GENEIAYELN GVSKMYVTDH EMSVVEWVNV AFHRSGIPAL TRMHEAITED
181 VCPWDQAHGM PIYAHNPKFP ELGDFFHKAM IVHSNFLTKI LAEEYEGFKD FKVLVDVGGS
241 LGNNLALILR FHPHLRGINF DMPSVIAGAP SFPGVEHVGG NFYESVPSGD AIMLMAILHN
301 NSDENCVKIL RSVHAALPED GKLIVAEYIM TNEADHNGER IRLLDMLMLV QFRGGEERTF
361 EHHKTLYEAA GFRHYKLIKT SGPMDIIEVR K
<210> 3
<211> 359
<212> PRT
<213> 长春花（Catharanthus roseus）
<400> 3
1 MDLQTAEFRE AQAKIWSQAF SFANCAALKC AVKLGIADAI DNHDKKALTL SELTEELSIK
61 PSKSPFLQRL MRQLVNAGFF TEAKQLRDDN KDGRTTTAYA LTPVSRLLLK NEQWNLRGIV
121 LTMLDPAELK AWSVLNDWFK NDDPTAFQTA HEKNYWDYTA ENTQHCQIFE DAMANDSVLV
181 SKLLVTEYKF LFEGLTSLID LGGSTGTIAK ALAKSFPNLK CTVFDLPHVV ANLESTKNLE
241 FVGGDMFEKL PPSNAILLKW ILHDWNDEDC VKILKNCKKA IQEKGNGGKV IIIDTVVYSQ
301 KNEKELVDLQ ISMDMAMVIN FAAKERTEEE WEHLIREAGF SGHKIFPMYD FRSIIEVYP
<210> 4
<211> 395
<212> PRT
<213> 布氏镰刀菌（Fusarium buxicola）
<400> 4
1 MNKTERDAVI EHATQVKHLV HDPNSFLTEL VVQQQQYHCI GWLCHFDVLS AIPLPPDSLP
61 YADVATKAKV PVSTLRSVAR MAMTAGILCE TKDGNLSHNP LSASFVENPL MRVQLLHMFN
121 QTVPLMAQLA NATEKWGETT APNETAYNLV HNTDLPFFQH LKSRPDLGKG FEDFMKSRAV
181 SHTGSNVEHL LEAFDWKSLG ESTVVDVGGS SGSTATMLAT TYPKLKLVVE DLPDPIKNAR
241 ARVAELAEDV RSRIEIVEYD FFTPQPVKNA DVYLLRTILH DWPDADAIKI IRGIVEAMGP
301 SSRLLIMDMV LPKPGSGSRT FEAALRQKDL TMIQAFNAKE RETEEWRALL TKADPRFSIR
361 AIERPAGSEL SVIEATLGIY EVEPVNGTNG VNGHA
<210> 5
<211> 1161
<212> DNA
<213> 水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)
<400> 5
1 ATGGATAAAG CTGATAGAGA TGCTGTTATT GAACATGCTA CTCAAGTTAA AAGATTAGTT
61 CATGATCCAC ATTCATTTTT AACTGAATTA GTTGCTCAAC AACAACAATA CCATTGTATT
121 GCTTGGTTAT GTCATTTTAA TATTTTATCT AATATTCCAC AACCACCAGA ATCTATTGCA
181 TACTCTGATG TTGCTACAAA AGCTCAAGTT CCATTATCTA AATTACAATC AGTTGCAAGA
241 ATGGCAATGA CTACTGGATT ATTGTCTGAA ACTAAAGATG GTAAATTATC TCATAATACT
301 TTATCTGCAC AATTCATTAC TAACGTTCAT ATGAAAACTC AATTGTTACA TATTGTTAAT
361 CAAACTGTTC CTTTAATGAC AGGTTTGATT CAAGCTACTT GGAAATGGGG TGAAACTTCA
421 GCAACTAATG AAACTGCTTA TAATATTATT CATGGTACTG AATTAAGTTT CTTTGAACAC
481 TTAAAAACAA GACCAGATTT GAATGAAGGT TTTCAAGCTT ACATGAAATC TAGAGCTGTT
541 TCTCATACAG GTTCAAATGT TGAACATTTG TTAAATGCTT TTGATTGGAA GGCATTAGGT
601 CAAGCTCAAG TAGTTGATAT TGGTGGTTCT TCTGGTTCAA CTTCTATTAT GTTAGCTACT
661 GCTTTTCCAT TATTGAATTT GGTTATTGAA GATTTGCCAG AACCTATTGA AAATGCTAAA
721 GCTAGATTAT CTGAATTACC ATCTGATATA AAATCTAGAA TTGAAATTAT GGCTTATGAC
781 TTTTTCACTC CACAACCAGT TAAGAATGCT GATGTTTATC TATTGAGAAC TATTTTACAT
841 GATTGGCCAG ATGCTGATGC TATTAAGATA ATTCAAGGTA TTGTTGCAGC TATGGGTCCA
901 TCTAGTAGAT TGTTGATTAT GGATATGGTT TTACCTAAAC CAGGTTCTGG TTCTGTTACA
961 TTTGAAGCTG CTTTGAGACA AAAAGATTTG ACTATGATAC AATGTTTTAA TGCACAAGAA
1021 AGAGAAGTTG AAGAATGGAA AGCTTTGTTA ACTAAAGCTG ATCCAAGATT GAAAATTCAA
1081 GCTATTGAAA GACCAGCTGG TTCTGAATTA AGTGTTATTG AAGCTATGTT AGATGAATCA
1141 CCTGAACAAG CTGCTTGGTT T
<210> 6
<211> 1176
<212> DNA
<213> 钝鳞紫背苔（Plagiochasma appendiculatum）
<400> 6
1 ATGGCTGTTT CTACTAACGG CAAGACTTCT GAAGGTGTTT CTGACGTTTC TAGAACTAAG
61 AACATTACTA ACGGTAACGG TATGGATATG TCTGTTTCTG CTAATGTTGC TTCCATCGGT
121 TCCGTTTCCG CTACTCCATT GTCTCCAGAA GATAAGAGAG ATCACGTCGT TGCCATTAAC
181TTCTTGTTGG GTTGGGTTCA AACTTGGGCT TTGAAAGCCG TTGTGACTAT GAGAATCCCT
241 GATATTATTT CCAAGGCTCC TATGGATGCT TTAACTGCTA GAGAAATCAT TTCTCAAATT
301 CAATGTAAGA ACCCATCTAA TGCTGTTCCT TTGTTGGAAA GATTGATGAG ATTCATGGTT
361 TGTAAGGGTT TCTTCTCTGA ATCAGTTAAT GGTGAAAATG AAATTGCTTA TGAATTGAAT
421 GGTGTTTCTA AGATGTACGT TACTGATCAT GAAATGTCTG TTGTCGAATG GGTCAATGTT
481 GCTTTCCATA GATCTGGTAT CCCAGCTTTA ACTAGAATGC ATGAAGCAAT TACTGAAGAT
541 GTTTGTCCAT GGGATCAAGC CCATGGTATG CCAATCTATG CTCATAACCC TAAGTTCCCT
601 GAATTGGGTG ACTTCTTTCA TAAGGCTATG ATTGTCCATT CTAACTTCTT GACTAAGATT
661 TTGGCTGAAG AATACGAAGG TTTCAAGGAT TTTAAGGTTT TAGTTGATGT TGGTGGTTCA
721 TTGGGTAATA ACTTAGCTTT GATTTTGAGA TTTCATCCAC ATTTGAGAGG TATTAATTTC
781 GATATGCCAT CCGTTATTGC TGGTGCACCA TCATTCCCTG GTGTGGAACA CGTCGGTGGT
841 AACTTCTATG AATCTGTTCC ATCTGGTGAC GCTATTATGT TGATGGCTAT TTTGCATAAT
901 AACTCTGATG AAAACTGTGT TAAGATTTTG AGATCTGTTC ATGCTGCTTT GCCAGAGGAC
961 GGTAAATTGA TTGTCGCTGA ATACATTATG ACTAATGAAG CTGATCATAA CGGTGAAAGA
1021 ATTAGATTGT TGGACATGTT AATGTTGGTT CAATTCAGAG GTGGTGAAGA AAGAACTTTT
1081 GAACATCATA AGACTTTGTA TGAAGCTGCT GGTTTCAGAC ATTACAAGTT GATTAAGACC
1141 TCTGGTCCAA TGGACATTAT TGAAGTTAGA AAGTAA
<210> 7
<211> 1080
<212> DNA
<213> 长春花（Catharanthus roseus）
<400> 7
1 ATGGATTTGC AAACTGCTGA ATTCCGTGAA GCTCAAGCTA AGATTTGGTC TCAAGCTTTC
61 TCTTTCGCTA ATTGTGCTGC TTTGAAGTGT GCTGTTAAGT TGGGTATTGC TGATGCTATT
121 GATAACCATG ATAAGAAGGC TTTGACTTTA TCTGAATTAA CTGAAGAATT GTCTATTAAG
181 CCTTCTAAGT CTCCATTCTT GCAACGTTTG ATGAGACAAT TGGTTAACGC TGGTTTCTTT
241 ACTGAAGCTA AACAATTGAG AGATGATAAC AAGGATGGTA GAACTACCAC TGCTTACGCT
301 TTAACCCCAG TTTCTAGATT GTTGTTGAAA AACGAACAAT GGAACTTAAG AGGTATTGTT
361 TTAACTATGT TGGATCCTGC TGAATTGAAG GCTTGGTCCG TTTTGAACGA TTGGTTCAAG
421 AACGATGACC CAACCGCTTT TCAAACTGCT CACGAAAAGA ACTACTGGGA TTACACTGCT
481 GAAAACACTC AACATTGTCA AATTTTCGAA GATGCTATGG CTAACGATTC TGTTTTGGTT
541 TCTAAATTGT TGGTTACTGA ATACAAGTTC TTATTTGAAG GTTTGACTTC ATTGATTGAT
601 CTAGGTGGAT CTACCGGTAC TATTGCTAAG GCTTTGGCTA AGTCTTTTCC AAATTTGAAG
661 TGTACTGTCT TTGATTTGCC ACACGTTGTT GCCAATTTGG AATCTACTAA GAATTTGGAA
721 TTCGTTGGTG GCGATATGTT CGAAAAGTTA CCACCATCCA ACGCTATTTT GTTGAAGTGG
781 ATTTTGCATG ATTGGAACGA TGAAGATTGT GTTAAGATCT TGAAAAATTG TAAGAAGGCT
841 ATTCAAGAAA AAGGTAATGG TGGTAAAGTT ATCATCATTG ATACTGTTGT TTATTCTCAA
901 AAGAACGAAA AGGAATTGGT CGATTTGCAA ATTTCTATGG ATATGGCTAT GGTTATTAAC
961 TTTGCTGCTA AGGAAAGAAC TGAAGAAGAA TGGGAACACT TGATTAGAGA AGCTGGTTTC
1021 TCTGGTCATA AGATTTTTCC AATGTATGAT TTCAGATCTA TTATTGAAGT TTACCCATAA
<210> 8
<211> 1185
<212> DNA
<213> 布氏镰刀菌（Fusarium buxicola）
<400> 8
1 ATGAACAAGA CTGAAAGAGA TGCTGTTATT GAACACGCTA CTCAAGTTAA GCATTTGGTT
61 CATGATCCAA ACTCTTTCTT AACTGAATTA GTTGTCCAAC AACAACAATA CCACTGTATT
121 GGTTGGTTAT GCCATTTCGA TGTCTTGTCT GCTATTCCAT TGCCACCAGA TTCTTTGCCA
181 TACGCTGATG TCGCTACTAA GGCTAAGGTT CCAGTTTCCA CTTTGAGATC TGTTGCTAGA
241 ATGGCTATGA CTGCTGGTAT TTTATGTGAA ACTAAGGATG GTAACTTGTC TCATAACCCA
301 TTGTCCGCTT CTTTCGTTGA AAACCCATTG ATGAGAGTTC AATTGTTACA TATGTTCAAC
361 CAAACTGTTC CATTGATGGC TCAATTAGCT AATGCTACTG AAAAATGGGG TGAAACTACT
421 GCTCCAAATG AAACTGCTTA CAATTTGGTT CATAACACTG ACTTGCCATT CTTCCAACAT
481 CTTAAATCTA GACCAGATTT GGGTAAAGGT TTTGAAGATT TCATGAAATC TAGAGCTGTT
541 TCTCATACCG GTTCTAACGT TGAACATCTG TTGGAAGCTT TTGATTGGAA GTCTTTAGGT
601 GAATCTACTG TTGTTGATGT TGGTGGTTCT TCCGGTTCTA CTGCTACCAT GTTAGCTACT
661 ACTTATCCAA AGTTGAAGTT AGTTGTTGAA GATTTGCCAG ATCCAATCAA AAATGCCAGA
721 GCTAGAGTTG CTGAATTGGC CGAAGATGTT AGATCTAGAA TCGAAATTGT TGAATATGAT
781 TTCTTTACTC CACAACCAGT TAAGAATGCT GATGTTTACT TATTGAGAAC TATTTTGCAT
841 GATTGGCCAG ATGCTGATGC TATTAAGATC ATTAGAGGTA TTGTTGAAGC TATGGGTCCA
901 TCTTCTAGAT TATTGATTAT GGATATGGTT CTACCTAAGC CAGGTTCTGG TTCTAGAACC
961 TTTGAAGCTG CTTTAAGACA AAAGGATTTG ACTATGATCC AAGCTTTTAA TGCTAAAGAA
1021 AGAGAAACTG AAGAATGGAG AGCTTTGTTG ACTAAAGCTG ATCCAAGATT CTCTATTAGA
1081 GCTATTGAAA GACCAGCTGG TTCTGAATTA TCTGTTATTG AAGCTACTTT GGGTATCTAT
1141 GAAGTTGAAC CAGTTAACGG TACTAACGGT GTTAATGGTC ATGCT

Claims (7)

1.一种制备4’氧甲基山奈酚的方法，其特征在于，以山奈酚为底物通过甲基转移酶催化实现，所述的甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其是通过含有所述的甲基转移酶的编码基因的重组菌株发酵制备，所述的甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在培养所述重组菌株时添加底物山奈酚。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括纯化产物4’氧甲基山奈酚的步骤。
5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述重组菌株是酿酒酵母。
6.一种甲基转移酶、甲基转移酶的编码基因，或含有甲基转移酶的编码基因的重组菌株在制备4’氧甲基山奈酚中的应用，其特征在于，以山奈酚为底物，通过山奈酚4’位羟基氧甲基化而实现；所述的甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的甲基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
7.一种甲基转移酶、甲基转移酶的编码基因，或含有甲基转移酶的编码基因的重组菌株在制备淫羊藿苷中的应用，其特征在于，通过以山奈酚为底物，通过山奈酚4’位羟基氧甲基化而得到4’氧甲基山奈酚，再进一步转化为淫羊藿苷。
CN202210132042.5A 2022-02-14 2022-02-14 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用 Active CN114908067B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210132042.5A CN114908067B (zh) 2022-02-14 2022-02-14 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210132042.5A CN114908067B (zh) 2022-02-14 2022-02-14 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114908067A CN114908067A (zh) 2022-08-16
CN114908067B true CN114908067B (zh) 2023-09-08

Family

ID=82763834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210132042.5A Active CN114908067B (zh) 2022-02-14 2022-02-14 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114908067B (zh)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
植物类黄酮O-甲基转移酶研究进展;张传丽等;西北植物学报;第32卷(第6期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114908067A (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113322288B (zh) 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用
CN110106209B (zh) 一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法
CN103571892B (zh) 二氢查耳酮的生物技术生产方法
CN113136373B (zh) 碳苷糖基转移酶及其应用
WO2021164673A1 (zh) 双功能碳苷糖基转移酶及其应用
CN111424020B (zh) 淫羊藿来源半乳糖基转移酶及其在制备金丝桃苷中的应用
CN111032875A (zh) Iii型聚酮合酶作为间苯三酚合酶的用途
KR20120085364A (ko) 3,6-안하이드로-ｌ-갈락토오스에 작용하는 신규한 3,6-안하이드로-ｌ-갈락토오스 데히드로게나제와 이 효소를 이용한 3,6-안하이드로 갈락토닉산의 생산
CN117844793A (zh) 氧化鲨烯环化基因NiOSC2在生物合成中的应用
CN108624572A (zh) 糖苷类化合物的甲基化转移酶基因
CN114908067B (zh) 氧甲基转移酶fsr2在催化山奈酚4`羟基氧甲基化中的应用
CN114525215B (zh) 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用
CN116731886A (zh) 产糖基化虾青素的工程菌及其构建方法与应用
CN107345232B (zh) 可参与生物合成转化后修饰的葡糖基转移酶基因
CN114277024B (zh) 一种新型三萜合酶及其应用
CN115927152A (zh) 香兰素在基因工程菌大肠杆菌中的合成与积累
CN113444737B (zh) 细胞色素p450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用
CN110878288B (zh) 多肽、核酸及其在合成橙花叔醇糖苷上的应用
CN116656641A (zh) 咖啡酸o-甲基转移酶突变体及其应用
US9340809B2 (en) Microbial conversion of sugar acids and means therein
CN102277327B (zh) 过表达RimL的大肠杆菌及其在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
CN111647589A (zh) 大戟二烯醇合酶及其编码基因与应用
CN113801861B (zh) 一种来源于朝鲜淫羊藿的黄酮4′-o-甲基转移酶及其应用
CN108866142A (zh) 细胞色素p450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant