CN103571892B

CN103571892B - 二氢查耳酮的生物技术生产方法

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Publication number: CN103571892B
Application number: CN201310325521.XA
Authority: CN
Inventors: 延斯-迈克尔·希尔默; 埃贡·格罗斯; 格哈德·克拉默尔; 雅各布·彼得·莱伊; 梅希特希尔德·高尔; 乌韦·博恩朔伊尔; 马伦·汤姆森; 克里斯廷·彼得斯; 帕特里克·约恩齐克; 萨沙·博伊特尔; 托马斯·舍佩尔
Original assignee: Symrise AG
Current assignee: Symrise AG
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2033-07-30
Also published as: EP2692729A1; US20140045233A1; ES2617133T3; DE102012213492A1; US9359622B2; CN103571892A; EP2692729B1

Abstract

给出了关于以下的描述：使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素的方法，所述转基因微生物包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶(enoate reductase)的基因或由其组成；相应的转基因微生物，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)和/或核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成；以及宿主细胞，其包含一种或更多种相同或不同的这样的载体。

Description

二氢查耳酮的生物技术生产方法

本发明主要涉及使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素(phloretin)的方法，或者还原黄烷酮(flavanones)的方法，所述转基因微生物包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶(enoate reductase)的基因或由其组成。

本发明还涉及这样的转基因微生物，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。

本发明还涉及这样的载体，尤其是质粒载体，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)和/或核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。

此外，本发明涉及这样的宿主细胞，其包含一种或更多种相同或不同的根据本发明的载体。

根据下面的描述、实施例，尤其是所附权利要求，本发明的其他方面是显而易见的。

二氢查耳酮(尤其是根皮素)通常通过查耳酮的化学还原或通过用二氢肉桂酸使酚发生傅-克酰基化(Friedel-Crafts acylation)来生产。该方法的缺点在于以该方式生产的食品添加剂、调味剂或芳香物质不能被描述为天然的。此外，可通过提取例如相应的糖苷(例如从苹果属(Malus spp.)原材料)随后生成糖苷配基(aglycone)来得到二氢查耳酮，尤其是根皮素。然而，该工艺耗时且成本高，并且还依赖于季节。

具有二氢查耳酮结构的重要调味剂和芳香物质是例如根皮素(例如，根据EP1,998,636-B1)、根皮苷(phloridzin)、三叶苷(trilobatin)(参见Tanaka，T.；Yamasaki，K.；Kohda，H.；Tanaka，O.；Mahato，S.B.，Dihydrochalcone-glucosides as sweet principlesof Symplocos ssp.Planta Medica1980，(Suppl.)，81-83)、柚皮苷二氢查耳酮(naringindihydrochalcone)和新橙皮苷二氢查耳酮(neohesperidine dihydrochalcone)(Crosby，G.A.，New Sweeteners.Critical Reviews in Food Science and Nutrition1976，(June)，297-323)。

由于现在需要并且未来也需要有利的二氢查耳酮，尤其是根皮素，所以本发明的主要问题是提供可以以工业规模用于生产二氢查耳酮尤其是根皮素的有效且优选节约成本的方法。

另一个问题是提供用于实施这种方法的合适的或必需的手段。

根据下面的描述，尤其是所附权利要求，本发明的其他问题是显而易见的。

本发明的主要问题通过使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素的创新性生物技术方法来解决，所述方法包括以下步骤：

(i)提供转基因微生物，其包含(作为转基因)

-核酸区段(a)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，

和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，

以及

-核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。

(ii)将一种或更多种黄烷酮(尤其是柚皮苷)和/或其一种或更多种前体或一种或更多种衍生物(尤其是柚皮苷的前体或衍生物)添加到转基因微生物中，并在允许所述黄烷酮和/或其前体或衍生物(尤其是柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物)转化为二氢查耳酮(尤其是根皮素)的条件下培养所述转基因微生物。

(iii)任选地：分离并且如果需要则纯化所述二氢查耳酮(尤其是根皮素)。

根据本发明使用的所述或一种、更多种或所有黄烷酮或其前体或衍生物优选选自：

柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)、柚皮芸香苷(narirutin)、或其他柚皮素糖苷、橙皮素(hesperetin)、橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、或其他橙皮素糖苷、圣草酚(eriodictyol)、圣草枸橼苷(eriocitrin)或其他圣草酚糖苷、sterubin、sterubin糖苷、樱花素(sakuranetin)、樱花素糖苷、异樱花素(isosakuranetin)、异樱花素糖苷、4’，7-二羟基-黄烷酮或其糖苷、4’，7-二羟基-3’-甲氧基-黄烷酮或其糖苷、3’，7-二羟基-4’-甲氧基-黄烷酮或其糖苷、3’，4’，7-三羟基-黄烷酮或其糖苷，其中黄烷酮就黄烷酮结构的2位而言可呈现为(S)-对映体、(R)-对映体、外消旋体或两种对映体的任意混合物。

在以下实例中提供了优先使用的多种黄烷酮：

根据本发明生产的二氢查耳酮优选选自：

根皮素、柚皮苷二氢查耳酮、根皮苷(phloridzin)或其他根皮素-糖苷、橙皮素二氢查耳酮、橙皮苷二氢查耳酮、新橙皮苷二氢查耳酮、或其他橙皮素二氢查耳酮糖苷、圣草酚二氢查耳酮(3-羟基根皮素)、或其他圣草酚二氢查耳酮糖苷、sterubin二氢查耳酮、sterubin二氢查耳酮糖苷、樱花素二氢查耳酮、樱花素二氢查耳酮糖苷、异樱花素二氢查耳酮、异樱花素二氢查耳酮糖苷、2’，4’，4-三羟基二氢查耳酮(达维荚蒾苷元，davidigenin)或其糖苷、3-甲氧基-2’，4’，4-三羟基二氢查耳酮或其糖苷、4-甲氧基-2’，3，4’-三羟基二氢查耳酮或其糖苷、或2’，4，4’，3-四羟基二氢查耳酮或其糖苷。

以下实例中提供了优选的二氢查耳酮：

特别优选的黄烷酮和由这些形成相应的二氢查耳酮是：柚皮素和根皮素、柚皮苷和柚皮苷二氢查耳酮、柚皮芸香苷和根皮苷、橙皮素和橙皮素二氢查耳酮、橙皮苷和橙皮苷二氢查耳酮、新橙皮苷和新橙皮苷二氢查耳酮、以及圣草酚和3-羟基根皮素。

因此本发明的第一方面涉及生产(天然)二氢查耳酮尤其是(天然)根皮素的生物技术方法，其由一种或更多种相应的黄烷酮和/或其前体或衍生物、尤其是柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物、尤其是柚皮苷或柚皮素开始，使用转基因微生物中的细菌查耳酮异构酶(尤其优选来自以下进一步所描述的微生物)和/或植物查耳酮异构酶(尤其优选来自以下进一步所描述的植物)与细菌烯醇还原酶(优选来自以下所描述的微生物)的组合。

一个优选实施方案涉及生产(天然)根皮素的生物技术方法，其由柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物、尤其是柚皮苷、柚皮芸香苷或柚皮素开始，使用转基因微生物(如本文类似描述的)用一种或更多种查耳酮异构酶(如本文所述)与烯醇还原酶(如本文所述)的组合。

一个特别优选的实施方案涉及生产(天然)根皮素的生物技术方法，其由柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物、尤其是柚皮苷、柚皮芸香苷或柚皮素开始，使用转基因微生物(如本文所述)用细菌查耳酮异构酶(优选来自厌氧生物细枝真杆菌(Eubacteriumramulus)，如以下进一步所述)与植物查耳酮异构酶(优选来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)或紫花苜蓿(Medicago sativa)，如以下进一步所述)和细菌烯醇还原酶(类似地优选来自厌氧生物细枝真杆菌，如以下进一步所述)的组合。

现有技术已知厌氧微生物细枝真杆菌能够降解柚皮素，其中形成了中间体根皮素。但是，这不应理解为是本发明意义内的用于生产根皮素的(生物技术)方法，尤其不是适用于根皮素工业生产(例如以工业规模生产根皮素)的方法(如上所述)。因为所形成的中间体根皮素在细枝真杆菌中立即进一步代谢(参见Schneider等，Anaerobic degradation offlavonoids by Eubacterium ramulus，Arch Microbiol(2000)173：71-75)，如以下反应图所示(尤其参见由根皮素水解酶(PhH)引起的反应)：

在关于本发明的研究的上下文中，为了本文所述方法的目的，可阐明并表征所述生物转化的关键分子生物学和生物化学原理，从而以工业规模生产根皮素(所形成根皮素不立即降解)。

现有技术的确描述了使用微生物生物转化的酶系统和方法的多种不同可能性；例如，已知可借助酵母(例如，酵母属(saccharomyces))简单地还原双键。但是迄今为止，针对酶促醚裂(ether splitting)的研究很少。

关于本发明，主要参照以下公开：Schoefer等，Anaerobic Degradation ofFlavonoids by Clostridium orbiscindens，Appl.Environ.Microbiol.，2003年10月，第5849-5854页；和Herles等，First bacterial chalcone isomerase isolated fromEubacterium ramulus，Arch Microbiol(2004)181：428-434。例如Masia等描述了与木质素降解有关的发现(Masai等，1993；Otsuka et al.，2003；也参见JP2002034557)。

在Koffas等的WO2006010117和Schmidt-Dannert等的WO2005084305中，描述了异源表达用于形成类黄酮的应用。在这些中(仅)描述了植物基因，其可用于异源表达多种物质(由L-苯丙氨酸、酪氨酸和肉桂酸开始)。

出乎意料地，借助细枝真杆菌的基因组序列，可鉴定编码查耳酮异构酶的基因(a)和烯醇还原酶的基因(b)(用于将柚皮苷或柚皮苷的前体或衍生物转化为根皮素；在这一点上参见以上所示的反应图)，进而在转基因微生物中表达。该酶在转基因微生物中的异源表达能够有利地避免或绕开通常在细枝真杆菌中发生的、根皮素通过根皮素水解酶产生间苯三酚和3-(4-羟苯基)丙酸(HPP)的次级反应(在这点上参见以上所示的反应图)，从而最终允许以工业规模生产根皮素或者使产品产量显著增加。

应理解关于本发明的“转基因微生物”为遗传改造或修饰的微生物，其中特别地通过生物技术方法将核酸区段(参见如本文所述的核酸区段(a)和(b))或基因引入另一种生物中(所谓的转基因)。

在本发明意义内的“查耳酮异构酶”(CHI)是催化反应的酶。CHI尤其催化柚皮素至柚皮素查耳酮/柚皮素查耳酮至柚皮素的反应(参见以上所示的反应图)，出于本发明的目的，尤其是柚皮素至柚皮素查耳酮的反应。

在本发明意义内的“烯醇还原酶”(ERED)是催化某些化合物脱水的酶，尤其是柚皮素查耳酮至根皮素的反应(参见以上所示的反应图)的酶。

鉴于以上所解释的关系，与根据本发明的方法有关的转基因微生物特别地不是细枝真杆菌，特别地不是梭菌目(Clostridiales)的微生物，更优选不是梭菌(Clostridia)纲的微生物，尤其优选不是厚壁菌(Firmicutes)门(节(section))的微生物。相反地，所述微生物优选地选自：兼性厌氧微生物，尤其是兼性需氧细菌，优选变形菌(proteobacteria)，尤其是肠细菌，例如埃希氏杆菌属(genus Escherichia)，优选大肠杆菌(E.coli)，尤其是大肠杆菌BL21、大肠杆菌Rosetta(大肠杆菌BL21的衍生菌)和大肠杆菌SE1；和酵母，例如酿酒酵母(S.cerevesiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。根据出于本发明目的的本文所述的一个优选方面，主要优选在需氧条件下并且(也)在排除氧气下的条件下生长并且能够表达引入基因(转基因；见上)的那些微生物。

根据本发明优选的是在步骤(ii)中添加柚皮苷和/或其糖苷配基的方法(如上所述)。

特别地，编码如下进行

编码细菌查耳酮异构酶的基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的查耳酮异构酶，尤其优选来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶，

和/或

编码植物查耳酮异构酶的基因编码来自十字花(Brassicales)目，特别是十字花(Brassicaceae)科，优选亚麻荠族(tribe Camelineae)，尤其是拟南芥(Arabidopsis)属，尤其是拟南芥(Arabidopsis thaliana)型的植物的查耳酮异构酶；或者编码来自豆(Fabales)目，特别是豆(Fabaceae)科，优选豆(Faboidae)亚科，尤其是苜蓿(Medicago)属，尤其是紫花苜蓿(Medicago sativa)型的植物的查耳酮异构酶，因此尤其优选编码来自拟南芥或紫花苜蓿的查耳酮异构酶(在这点上参见WO2005084305A2(Schmidt-Dannert)和WO2006010117A2(Koffas))，

和/或

编码细菌烯醇还原酶的基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的烯醇还原酶，尤其优选来自细枝真杆菌的烯醇还原酶。

尤其优选的是这样的根据本发明的方法(如本文所述)，其中

核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO：1(编码细枝真杆菌DSM16296之细菌CHI的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：1有40％或更多，特别地50％或更多，60％或更多或80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，

和/或

核酸区段(a’)包含根据SEQ ID NO：6(来自紫花苜蓿(易洛魁栽培变种(cultivarIroquois))(MsCHI-1)mRNA的CHI的核苷酸序列，完整cds)或SEQ ID NO：7(来自拟南芥的查耳酮黄烷酮异构酶1(TT5)mRNA的核苷酸序列，完整cds)的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7有40％或更多，特别地50％或更多，60％或更多或80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，

和/或

核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO：2(编码细枝真杆菌DSM16296之细菌ERED的基因的核苷酸序列)或SEQ ID NO：5(编码细枝真杆菌DSM16296之细菌ERED的基因的密码子优化核苷酸序列(尤其是用于在大肠杆菌BL21中表达)整合到pET22b(借助Nde1和BamH1克隆))的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5有40％或更多，特别地50％或更多，60％或更多或80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成。

根据本发明还优选的是这样的方法(如上所述)，其中

细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：3(细枝真杆菌DSM16296之细菌CHI的氨基酸序列)的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：3有40％或更多，特别地50％或更多，60％或更多或80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，

和/或

植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：8(紫花苜蓿的查耳酮异构酶的氨基酸序列)或SEQ ID NO：9(拟南芥的查耳酮黄烷酮异构酶1的氨基酸序列)的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9有40％或更多，特别地50％或更多，60％或更多或80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，

和/或

细菌烯醇还原酶包含根据SEQ ID NO：4(细枝真杆菌DSM16296的细菌ERED的氨基酸序列)的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：4有40％或更多，特别地50％或更多，60％或更多或80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。

在本发明的上下文中，“氨基酸序列同一性”优选使用Waterman-Smith算法来确定，其中缺口开放罚分(gap open penalty)为10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)为0.5，以及使用BLOSUM62矩阵(关于Waterman-Smith算法，参见例如Smith，T.F.和Waterman，M.S.，Identification of common molecular subsequences，Journal ofMolecular biology(1981)，147：195-197；通过EMBL相应的工具页面在线执行)。

为了本发明的目的，尤其优选的是使用这样的查耳酮异构酶，其具有根据图8A和图9的一个、数个或所有的以下特征和/或温度稳定性和pH稳定性：

K<sub>M</sub>[μmol/l]	V<sub>max</sub>[U/mg]	k<sub>cat</sub>[s<sup>-1</sup>]	k<sub>cat</sub>/K<sub>M</sub>[l<sup>＊</sup>mol<sup>-1＊</sup>s<sup>-1</sup>]
				36.83	107.3	416.7	1.13<sup>＊</sup>107

为了本发明的目的，优选的是使用这样的烯醇还原酶，其具有一个、更多个或所有的以下特征：

-蛋白质大小74.455kDa

-在多种温度下在缺氧条件下多至20小时后，在可溶性蛋和不溶性蛋白质级分中均表达。

以下描述了用于生产根皮素的本发明方法的根据本发明优选的进一步细节。

关于转基因微生物(如本文所述)的提供，应声明基本上可使用本领域技术人员所熟知的任何方法以将本文所述的核酸区段(a)、(a’)和(b)或本文所述的转基因引入到微生物中，例如主要是缀合(conjugation)、转导或转化，特别是通过热休克处理、电穿孔、缀合、基因枪、醋酸锂法或转导。然而，在本发明的上下文中，一般优选借助如本文所述(见下)的载体(尤其是质粒载体，特别是根据本发明的载体)引入所述的核酸区段(a)、(a’)和(b)或转基因。用于其的方法对于本领域技术人员是充分已知的。

在本发明意义内的转基因微生物可包含所引入的本文所述核酸区段或转基因的一个或更多个拷贝。

允许基于所引入的核酸区段或转基因表达期望氨基酸序列或期望酶的方法对于本领域技术人员类似地是充分已知的，例如使用调控元件，尤其是启动子(在这点上也参见所附实施例)。

如上所述，在根据本发明的方法的步骤(ii)中，将一种或更多种黄烷酮和/或其一种或更多种前体或衍生物添加到转基因微生物中，其中在允许黄烷酮和/或其前体或衍生物或衍生物(尤其是柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物)转化为二氢查耳酮(尤其是根皮素)的条件下培养所述转基因微生物。

如上所述，在根据本发明的方法的步骤(ii)中，特别优选地，将柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物添加到转基因微生物中，其中在允许柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物转化为根皮素的条件下培养所述转基因微生物。

根据本发明方法(如本文所述)的一种优选执行方式，特别是为了实现最大生物质浓度，起初(也就是说在步骤(ii)之前)在需氧条件下培养(转基因)微生物。这样做时，OD₆₀₀应优选至少在8至15或以上的范围中，特别是在5至190的范围中，尤其是在10至180的范围中，优选在15至170的范围中。然后优选在厌氧条件下培养步骤(ii)中的微生物，其中基于所引入的核酸区段或所引入的转基因发生期望氨基酸序列或期望酶的表达，例如借助IPTG和/或乳糖的诱导来刺激(当使用相应的合适启动子或相应的合适表达系统时)。

基本上，根据本发明优选的是，步骤(ii)中的孵育至少部分地或完全地在厌氧条件下发生。

根据微生物，为了本发明的目的，本领域技术人员在步骤(ii)中可创造合适的环境条件并且尤其是提供合适(培养)。培养优选在LB或TB培养基中进行。或者，可使用包含植物原材料(尤其是来自柑橘、葡萄柚和橙子植物)或由其组成的(更复杂的)培养基。培养在例如高于20℃，优选高于25℃，尤其是高于30℃(优选在30至40℃的范围中)的温度下进行，这可尤其有助于根皮素形成或增加产量。此外，低于40℃，尤其低于35℃(优选在20至30℃的范围中)的诱导温度(见上)可有助于根皮素形成或增加产量。

在步骤(ii)中，将柚皮苷或其前体或衍生物尤其以0.1mM至100mM(mMol/L)，优选0.5至95mM，尤其优选1至90mM的量添加到转基因微生物中(与包含转基因微生物之(培养)培养基相关)。在这里可使用合适的(共)溶剂。

如果使用一种或更多种合适的诱导剂(例如IPTG或乳糖)来诱导(例如，乳糖操纵子)(见上)，则优选在步骤(ii)中使用量为0.001至1mM，优选0.005至0.9mM，尤其优选0.01至0.8mM的诱导剂(与包含转基因微生物之(培养)培养基相关)，因为这样做可实现特别好的产量。

关于根皮素的任选分离和可能的纯化：在这里，例如可使用有机溶剂(优选选自以下列表：异丁烷、2-丙醇、甲苯、乙酸甲酯、环己烷、2-丁醇、己烷、1-丙醇、轻质石油(lightpetroleum)、1，1，1，2-四氟乙烷、甲醇、丙烷、1-丁醇、丁烷、乙基甲基酮、乙酸乙酯、乙醚、乙醇、二丁醚、CO₂、叔丁基甲基醚、丙酮、二氯甲烷和N₂O)、尤其优选与水形成视觉可辨别的相界面的那些进行提取。然后可除去溶剂中残余的水并且除去溶剂自身，然后接着将(例如)根皮素重新溶解于(可能其他的)溶剂中，所述溶剂适用于可能的产物后续结晶和干燥。作为替代地或另外地，可进行通过吸附、蒸馏和/或色谱的纯化。

根据所附实施例，本发明方法的其他细节是显而易见的。

本发明的另一方面涉及转基因微生物，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因(作为转基因)或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因(作为转基因)或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因(作为另一个转基因)或由其组成。

对于这里采用的术语，对于这些相同术语类推使用以上所述内容。根据以上关于根据本发明之方法的上下文中的优选微生物的相应声明，根据本发明的优选微生物是显而易见的。

为了本发明的目的，根据本发明的微生物优选具有至少一种查耳酮异构酶和一种烯醇还原酶活性，但是没有根皮素水解酶活性。上述也适用于在根据本发明之方法的上下文中优选使用的微生物(如上所述)。

特别优选地，所述微生物不是细枝真杆菌，优选地不是梭菌目的微生物，更优选也不是梭菌纲的微生物，尤其优选不是厚壁菌门的微生物，并且特别优选地选自：兼性厌氧微生物，尤其是兼性需氧细菌，优选变形菌，尤其是肠细菌，例如埃希氏杆菌属，优选大肠杆菌，尤其是大肠杆菌Rosetta、大肠杆菌BL21和大肠杆菌SE1；和酵母，例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。类推使用对于在根据本发明之方法的上下文中优选使用的微生物的其他以上所述内容。

因此，尤其优选这样的根据本发明的微生物，其中

和/或

编码植物查耳酮异构酶的基因编码来自拟南芥或紫花苜蓿的查耳酮异构酶(对于其他的优选来源见上)，

和/或

还优选

核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成；

和/或

核酸区段(a’)包含根据SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的核苷酸序列或与SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成；

和/或

核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成。

还优选

细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，

和/或

植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：8或SEQ ID NO：9有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，

和/或

细菌烯醇还原酶包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。

为了测定核苷酸序列同一性和氨基酸序列同一性，以上所述内容在这里类推使用。

本发明的另一个方面涉及允许克隆一个或更多个核酸区段的将外来核酸转移到受体细胞的载体，例如运输小泡(“基因穿梭载体(gene shuttle)”)，特别是质粒载体，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)和/或核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。这里优选的是所述载体包含核酸区段(a)和/或(a’)以及核酸区段(b)二者。

除核酸区段(a)、(a’)和/或(b)之外，为了本发明的目的，根据本发明的载体可包含另外的正常组分，尤其是改善或可实际上允许本文所述转基因在微生物中(特别是在本文所述的那些中)表达的正常组分。基本上，根据本发明的载体优选还包含选自以下的一种或更多种另外的组分或元件：启动子、序列起点、用于亲和色谱纯化的序列、选择标记、操纵子序列、终止子、核糖体结合位点、蛋白酶切割序列、重组结合位点、融合蛋白序列和分子伴侣序列。

对于根据本发明的载体(如上所述)，还优选

和/或

特别优选地

核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，

和/或

核酸区段(a’)包含根据SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的核苷酸序列或与SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，

和/或

还优选

细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：3有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成；

和/或

植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列或与SEQID NO：8或SEQ ID NO：9有40％或更多，特别是50％或更多，60％或更多或者80％或更多，尤其优选95％或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成；

和/或

另外，在这里，为了测定核苷酸序列同一性和氨基酸序列同一性，类推使用以上所述内容。

根据所附实施例和附图(图1：用于异源表达和表征来自细枝真杆菌DSM16296的ERED的质粒pET52b_EREDstrep；图2：用于异源表达和表征来自细枝真杆菌DSM16296的CHI的质粒pET28b_CHI；图3：用于异源表达和表征来自细枝真杆菌DSM16296的ERED的质粒pET22b_ERED)，特别优选的并且出于本发明的目的特别合适的载体及其组分或元件是显而易见的。

本发明还涉及宿主细胞，其包含一种或更多种相同或不同的如本文所述的根据本发明的载体。根据本发明优选的是这样的宿主细胞，其包含具有核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)的一种或更多种载体以及具有核酸区段(b)的一种或更多种载体二者，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。特别优选的是这样的宿主细胞，其包含具有核酸区段(a)和/或(a’)以及核酸区段(b)二者的一种或更多种载体。

对于根据本发明的宿主细胞，特别是根据本发明的微生物或根据本发明使用的微生物(如上所述)的情况。本文所述的根据本发明的宿主细胞或微生物或根据本发明使用的宿主细胞或微生物是或者特别是充当用于生物技术生产本文所述二氢查耳酮(尤其是根皮素)(如上所述)的(生产)菌株。

以下使用实施例更详细地解释了本发明，其中这些实施例不限制所附权利要求的主题。

实施例1：转基因微生物的制备(参见步骤(i))

1.1CHI：

使用已鉴定的来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶基因序列制备两种引物，其借助PCR用于复制基因组DNA。在这里，在引物的帮助下，在基因前面将用于Kpn1和BamH1的限制界面连接到靶序列并且在基因后面将用于Not1的界面(interface)连接到靶序列，它们用于在靶载体中连接基因区段。

使用的引物(直接结合到所述基因的序列区段以斜体示出)：

正向：CTAATCGGATCCGGTACC

反向：TCAGTAGCGGCCGC

借助TOPO TA(来自Invitrogen，Carlsbad，California，USA)将所得的查耳酮异构酶基因的DNA片段插入到载体中。在成功转化该构建体之后，通过Nco1和Not1将查耳酮异构酶基因从该载体中切割出来，并将其插入到同样用Nco1和Not1切割的靶载体pET28b中。将质粒引入大肠杆菌Rosetta中并在此处成功表达。

在成功转化后，借助测序确定序列同一性。

1.2ERED：

用来自基因组DNA的以下特定引物(直接结合到基因的序列区段以斜体示出)扩增烯醇还原酶：

正向：GATCCTCGAG

反向：GATCAAGCTTAGAT

在这里，在基因前面插入用于SacI的界面，并且在基因后面插入用于HindIII的界面，从而允许后续的克隆。

该片段还使用TOPO TA进行进一步加工。借助测序确定所得克隆(与载体和其中所含烯醇还原酶的基因)的序列同一性。

用引物扩增来自该质粒的基因，其在所述基因前面插入KpnI界面(直接结合到所述基因的序列区段以斜体示出)；在正向引物中插入的KpnI界面(不包含直接结合到基因的序列区段)标记为粗体)：

正向：AGTGTGATGTGCAGAATTCGCC

反向：GATCAAGCTTAGAT(见上)

载体类似地包含SacI界面，其用于进一步的克隆。

在PCR之后，用Sac1和Kpn1消化该PCR产物，然后连接到类似地用Sac1和Kpn1消化的质粒pET52b中。在大肠杆菌Rosetta中表达基因构建体。

使用测序以确定烯醇还原酶的基因被成功连接到质粒pET52b中，其中插入的N端strep标签仍然可用，允许高度特异性的蛋白质纯化。

在另一种方法的上下文中，将具有界面Nde1和BamH1的密码子优化序列连接到载体pET-22b中并在大肠杆菌BL21中表达。

1.3不含抗生素的表达

此外，可通过界面BamHI和XHO1将CHI的基因区段整合到含有合成的ERED基因的质粒pET22b中。

为此，使用正向引物GTCTAGGATCCAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA和pET-rP-引物CTAGTTATTGCTCAGCGG通过PCR扩增CHI基因，其中CHI基因之前的Xba1界面通过正向引物突变为BamHI界面。然后两种基因的构建体通过界面Xba1和Xho1从质粒中切割出来并连接到用Xba1和Xho1制备的质粒pStaby1.2中。

然后可借助StabyExpress系统进行不含抗生素的表达。

实施例2：根皮素的生物技术生产(参见步骤(ii))

将包含24g酵母提取物、12g胰蛋白胨和4g甘油的TB培养基制成900ml并在121℃下进行高压灭菌15分钟。在相同条件下对分开制备的盐水溶液(0.72M的K₂HPO₄和0.17M的KH₂PO₄)进行高压灭菌。然后将100ml盐水溶液添加到900ml无菌TB培养基中。用蒸馏水将包含5g酵母提取物、10g胰蛋白胨和10g NaCl的LB培养基补足至1000ml并在121℃下高压灭菌15分钟。

将根据例如实施例1转化的大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌BL21(见上)首先在装有50ml LB培养基的250ml锥形瓶(带有挡板)中在37℃和180rpm下培养约8小时。然后从该培养物中取出7ml并用于接种到包含700ml TB培养基(如上所述)的小型发酵罐中。使培养物在25℃和150-200rpm下在40％氧饱和度下生长过夜以实现最大生物质浓度。

在所引入核酸区段或所引入转基因(过)表达之前，终止空气供给并通过氮气排除存在的氧气。

为了诱导(过)表达，首先将培养基中的IPTG浓度设定为1mM，然后添加7ml柚皮素溶液(在DMSO中100mM)。

然后在缺氧条件下在表达阶段进行进一步的培养至少8至20小时。

实施例3：表达的CHI的表征

在大肠杆菌中表达例如pET28b_CHI(见上)之后，可在可溶性和不溶性级分两者中建立CHI。

在用例如阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱和/或Resource Q纯化进行纯化之后，可分离CHI用于表征(图7提供了载体pET28b_CHI在大肠杆菌中表达后单个纯化步骤之结果的实例)。

我们自己的研究产生了表1所示结果：

表1：载体pET28b_CHI在大肠杆菌中表达后CHI酶活性的表征

实施例4：表达的酶CHI和ERED的(进一步)表征

图4和5中的表格示出所表达酶CHI和ERED(来自厌氧转化期间的细枝真杆菌DSM16296(见上))表征的(进一步)结果。

分开放置酶CHI和ERED(来自细枝真杆菌DSM16296)以在适用于大肠杆菌的载体系统(见上)中表达。然后在确定的培养基中添加柚皮素之后，可借助HPLC测定这些酶的活性。

表4中的值示出根皮素随时间的形成(有柚皮素浓度的减小)，指明了酶CHI和ERED的活性。

图5表格中的值示出所表达的CHI的查耳酮异构酶活性的(进一步)结果，所述结果通过关于柚皮素查耳酮降解(以形成根皮素)的光度测定(在368nm下)得到。

为了进一步研究CHI活性，光学测定允许观察不含细胞的蛋白质粗提取物中柚皮素查耳酮浓度随时间的减少。对照实验(不含CHI的质粒)示出用作标志物底物的柚皮苷查耳酮减少。

实施例5：使用细枝真杆菌的(比较)表达实验结果

根据Herles等(Arch Microbiol(2004)181：428-434)在ST培养基中厌氧培养细枝真杆菌(DSMZ16296)。为了其制备，将9g经胰蛋白酶处理的肉蛋白胨、1g蛋白胨、3g肉提取物、4g酵母提取物、6g葡萄糖、3g氯化钠、2g磷酸氢二钠、0.5ml吐温80、0.25g胱氨酸、0.25g半胱氨酸-HCl、0.1g七水硫酸镁、5mg七水硫酸铁和3.4mg无水硫酸镁调整为pH7.0，用蒸馏水补足至1l，然后在121℃下进行高压灭菌15分钟。

在缺氧条件下在带有搅拌器的常规钢制反应器和带有Wipp系统的袋式反应器二者中进行培养，其中温度维持在37℃并且pH用酸和碱溶液(HCl或NaOH)维持在7.0。

在一种示例性发酵中，在培养开始时将275μM柚皮素添加到培养基中并测定生长及底物的转化(结果参见图10)。

SEQ ID NO：1

ATGGCAGATTTCAAATTCGAACCAATGAGAAGTCTTATCTACGTTGACTGCGTAAGCGAAGACTACAGACCAAAACTTCAGAGATGGATTTATAAAGTACATATTCCGGACAGCATCTCTCAGTTTGAGCCGTATGTTACCAAATATGCATTTTATCCGTCCTTCCCGATTCCACCACAGGGTGATCGTTTCGGATACGCAAGAATGCAGCTGACAGAGCATCACTGGTTAGTAAGCGACCTTGATCCTCGTCTTGAGATCAAAGCAATCGCTGAGACATTCCCGATGGACGTACTTGTATGGCAGGGACAGATCCCGGCAGCAGCTCATACAGACGCTCAGATCGATTCTGACGGAGATGCAGGAAATGCAGCCCGTAAATCCAACAATGCAGAAGGAAATCCATTTATCTTTGCATTCCTTCCGATGTGGTGGGAGAAAGACCTGAAAGGAAAAGGACGTACGATCGAGGACGGCGCAAACTATCGTTTCAATATGACTATCGGTTTCCCAGAAGGCGTAGACAAAGCAGAGGGAGAGAAATGGTTATTTGAGAAAGTAGTTCCGATTCTTCAGGCAGCTCCGGAGTGTACACGTGTACTTGCAAGTGCCGTAAAGAAAGACATCAACGGATGCGTAATGGATTGGGTACTTGAAATCTGGTTTGAGAATCAGTCCGGATGGTACAAAGTAATGGTAGATGACATGAAAGCACTTGAAAAACCGTCATGGGCTCAGCAGGATGCTTTCCCGTTCCTGAAACCATACCACAATGTTTGCAGTGCAGCAGTTGCTGATTATACACCAAGCAACAACCTTGCAAATTATCGTGGATACATCACCATGAGATAA

SEQ ID NO：2

ATGGCAGAAAAAAATCAGTATTTTCCACATTTGTTTGAGCCGTTAAAAGTTGGTTCAAAGACAATTAAGAACCGTATTGAGGCAGCACCGGCTTTATTTGCATTCGAGCATTATATCGAACTGAATCCGGATCCGTTTGGCTATACCACACCGGTTCCGGAGCGTGCGTTCCGTATGCTGGAGGCAAAGGCAAAAGGAGGGGCAGGAATTGTATGTCTGGGTGAGTTAAGCCCGAATCATGAGTATGACAAACGGTTTCCGTTTGAACCGTATCTTGATTTTACATCCAGATCAGATAAGCAGTTTGAAATTATGAAGGAAACTGCGGAGATGATCAAAAGCTATGGGGCATTTCCGATGGGCGAGCTGCTTTCCTGCGGTGAAATCAAGACAAATATCGGAGATGGTATCAATCCGAAGGGACCATCTGAGAAAGATCTTCCGGATGGCTCTCATGTGGAGGCGTTTACAAAAGAAGAGATTTTAAGCTGCTATCAGGATTATGTAACTGCATGTAAATGGTTTCAGGCAGCAGGCTGGGAAGGCATTATGATCCACTGCGGACATGGCTGGCTTCCGGCACAGTTCCTGTCTCCGCAATACAATAAACGTACCGATGAGTATGGTGGATCTTTTGAAAACAGAGCAAGATTTACTGTTGATCTGTTAAAAACTGTTCGTGAAGCTATGGGACCGGACTTCGTGATCGAGATCCGTGTCAGCAGCTCTGAGCATTTACCGGGCGGATTAGAGCTGGAAGATGCTGTAAATTATTGTAAACTGTGTGAGCCATACATTGATATGATCCATGTCTCCTGTGGTCATTACCTGAGTTCTTCCAGAAGTTGGGAGTTCACAACTGCTTATGCACCGCATGGTCCGAATATTGAACCGGCAGCTGTTATCAAACAGAACGTATCCATTCCGGTTGCGGCAGTCGGCGGCATCAATTCTCCGGAACAGGCGGAAGAGGCAATCGCGTCAGGAAAAATCGATATGGTATCCATGGGACGTCAGTTCTTTGCAGATCCGGCATTTCCAAACAAGGCAAAAGAAGGGCATGCAGATGAGATCCGTCGCTGTCTGCGCTGCGGAAGATGCTATCCGGGTCCGTCCGGCGAGCATGAAACAGAGATCTGGACGGTGAAATTCCCACCACTGGATTCCTGTACCATCAATCCATATGATGTATGGCCGGCATCTCATCATAAAGTCCTTCCGGACCGCATGCCGAAACCGGAAGCAAGCCGTAAGGTATTGGTAGTAGGCGGCGGCTGTGGCGGTCTGCAGACAGCGATCACAGCATCAGACAGAGGTCATCAGGTAATCCTGTGCGAAAAATCCGGAGTATTAGGCGGTCTGATCAATTTTACGGATCATACGGATCATAAAGTAGATATCAGAAACTTCAAAGATCTGCTGATCCGCGATGTGGAGAAACGTCCGATCGAAGTAAGATTAAACTGTGAAGTAACACCGGAACTCATCAGAGAAATTGCTCCGGAAGCAGTTGTACTGGCCGTCGGATCCGATGATCTGATCCTTCCAATCGAGGGAATTGAAAATGCGGTAACAGCAATGGACGTATACAGCAATGACTTTGCAGGTCTTGGAAAGAGCACCATCGTACTCGGTGGCGGTCTGGTTGGCTGTGAGGCAGCCGCAGATTATATTGATCACGGTGTAGAGACAACGATTGTTGAAATGAAAGGTGCGCTGATGCCGGAGACAACCGGTCTGTACCGTACAGCTGTACATGATTTCATCGACAAAAACGGCGGCAAATACGAAGTAAATGCAAAAGTTGTCAAAGTTGGCAAAGATTTTGTGGTAGCGGAACAAGATGGGAAAGAGATTACCATCAAAGCAGATTCTGTTGTCAATGCAATGGGACGCCGTGCGCATGCGACAGAAGCACTTGAGACAGCTATCAAAGAAGCTGGTATTCCGGTATGGAAGATCGGTGACTGTGTCCGTGCGCGTCAGATCGGTGATGCGGTAAGAGAAGGCTGGACCGCAGCAATGGAAATTATCTAA

SEQ ID NO：3

MAEKNQYFPHLFEPLKVGSKTIKNRIEAAPALFAFEHYIELNPDPFGYTTPVPERAFRMLEAKAKGGAGIVCLGELSPNHEYDKRFPFEPYLDFTSRSDKQFEIMKETAEMIKSYGAFPMGELLSCGEIKTNIGDGINPKGPSEKDLPDGSHVEAFTKEEILSCYQDYVTACKWFQAAGWEGIMIHCGHGWLPAQFLSPQYNKRTDEYGGSFENRARFTVDLLKTVREAMGPDFVIEIRVSSSEHLPGGLELEDAVNYCKLCEPYIDMIHVSCGHYLSSSRSWEFTTAYAPHGPNIEPAAVIKQNVSIPVAAVGGINSPEQAEEAIASGKIDMVSMGRQFFADPAFPNKAKEGHADEIRRCLRCGRCYPGPSGEHETEIWTVKFPPLDSCTINPYDVWPASHHKVLPDRMPKPEASRKVLVVGGGCGGLQTAITASDRGHQVILCEKSGVLGGLINFTDHTDHKVDIRNFKDLLIRDVEKRPIEVRLNCEVTPELIREIAPEAVVLAVGSDDLILPIEGIENAVTAMDVYSNDFAGLGKSTIVLGGGLVGCEAAADYIDHGVETTIVEMKGALMPETTGLYRTAVHDFIDKNGGKYEVNAKVVKVGKDFVVAEQDGKEITIKADSVVNAMGRRAHATEALETAIKEAGIPVWKIGDCVRARQIGDAVREGWTAAMEII

SEQ ID NO：4

MADFKFEPMRSLIYVDCVSEDYRPKLQRWIYKVHIPDSISQFEPYVTKYAFYPSFPIPPQGDRFGYARMQLTEHHWLVSDLDPRLEIKAIAETFPMDVLVWQGQIPAAAHTDAQIDSDGDAGNAARKSNNAEGNPFIFAFLPMWWEKDLKGKGRTIEDGANYRFNMTIGFPEGVDKAEGEKWLFEKVVPILQAAPECTRVLASAVKKDINGCVMDWVLEIWFENQSGWYKVMVDDMKALEKPSWAQQDAFPFLKPYHNVCSAAVADYTPSNNLANYRGYITMR

SEQ ID NO：5

用Nde1和BamH1克隆，整合到pET22b中的用于在大肠杆菌BL21中表达ERED的密码子优化核苷酸序列：

ATGGCAGAAAAGAACCAATACTTCCCGCACCTGTTTGAACCGCTGAAAGTCGGCTCTAAAACCATTAAAAATCGCATCGAAGCAGCACCGGCCCTGTTTGCATTCGAACATTATATCGAACTGAACCCGGACCCGTTTGGTTACACCACGCCGGTGCCGGAACGTGCATTCCGTATGCTGGAAGCCAAAGCAAAAGGCGGTGCCGGCATTGTTTGTCTGGGTGAACTGAGCCCGAATCACGAATATGATAAACGCTTTCCGTTCGAACCGTACCTGGATTTTACCAGCCGTTCTGACAAACAGTTCGAAATTATGAAAGAAACGGCAGAAATGATCAAAAGCTATGGCGCTTTTCCGATGGGTGAACTGCTGTCGTGCGGTGAAATCAAAACCAACATTGGCGATGGTATCAATCCGAAAGGCCCGTCAGAAAAAGATCTGCCGGACGGTTCGCATGTGGAAGCCTTCACCAAAGAAGAAATCCTGTCATGTTACCAGGATTACGTTACGGCATGCAAATGGTTCCAAGCGGCCGGCTGGGAAGGTATTATGATCCATTGTGGCCACGGTTGGCTGCCGGCGCAGTTTCTGAGCCCGCAATATAACAAACGCACCGATGAATACGGCGGTTCTTTTGAAAATCGTGCGCGCTTCACCGTCGATCTGCTGAAAACGGTGCGTGAAGCGATGGGCCCGGACTTCGTGATTGAAATCCGTGTTAGCTCTAGTGAACATCTGCCGGGCGGTCTGGAACTGGAAGATGCGGTGAACTATTGCAAACTGTGTGAACCGTACATTGACATGATCCATGTTAGTTGCGGCCACTATCTGTCCTCATCGCGCTCCTGGGAATTTACCACGGCTTACGCGCCGCACGGTCCGAACATCGAACCGGCAGCTGTCATTAAACAGAATGTGAGCATCCCGGTTGCAGCAGTCGGCGGTATCAACTCTCCGGAACAAGCGGAAGAAGCCATTGCAAGTGGCAAAATCGATATGGTTAGCATGGGCCGTCAGTTTTTCGCTGACCCGGCGTTTCCGAATAAAGCAAAAGAAGGCCATGCTGATGAAATTCGTCGCTGCCTGCGTTGTGGTCGCTGCTATCCGGGCCCGAGTGGTGAACACGAAACCGAAATCTGGACGGTGAAATTCCCGCCGCTGGATAGTTGTACCATTAACCCGTACGACGTGTGGCCGGCATCCCATCACAAAGTTCTGCCGGATCGCATGCCGAAACCGGAAGCGTCCCGTAAAGTTCTGGTGGTTGGCGGTGGCTGTGGTGGTCTGCAGACCGCAATCACGGCATCAGACCGCGGCCATCAAGTCATTCTGTGCGAAAAATCGGGTGTGCTGGGTGGCCTGATTAACTTTACCGATCATACGGACCACAAAGTTGATATTCGCAATTTCAAAGATCTGCTGATCCGTGACGTCGAAAAACGCCCGATTGAAGTTCGTCTGAATTGTGAAGTCACCCCGGAACTGATTCGTGAAATCGCTCCGGAAGCAGTCGTGCTGGCAGTGGGCAGTGATGACCTGATTCTGCCGATCGAAGGTATTGAAAACGCCGTTACCGCAATGGATGTCTATAGCAATGACTTTGCCGGCCTGGGTAAATCTACGATCGTGCTGGGTGGCGGTCTGGTTGGCTGCGAAGCAGCTGCGGATTATATCGATCATGGCGTGGAAACCACGATTGTTGAAATGAAAGGCGCACTGATGCCGGAAACCACGGGTCTGTATCGTACCGCTGTGCACGATTTTATTGACAAAAACGGCGGTAAATACGAAGTCAATGCCAAAGTTGTCAAAGTGGGCAAAGATTTCGTGGTTGCAGAACAGGACGGTAAAGAAATTACCATCAAAGCGGATTCTGTCGTGAATGCGATGGGCCGTCGCGCTCACGCAACCGAAGCTCTGGAAACGGCGATTAAAGAAGCCGGCATCCCGGTTTGGAAAATTGGTGATTGCGTCCGTGCCCGCCAAATCGGTGACGCAGTTCGTGAAGGCTGGACGGCTGCAATGGAAATCATCTAA

SEQ ID NO：6

ATGGCTGCATCAATCACCGCAATCACTGTGGAGAACCTTGAATACCCAGCGGTGGTTACCTCTCCGGTCACCGGCAAATCATATTTCCTCGGTGGCGCTGGGGAGAGAGGATTGACCATTGAAGGAAACTTCATCAAGTTCACTGCCATAGGTGTTTATTTGGAAGATATAGCAGTGGCTTCACTAGCTGCCAAATGGAAGGGTAAATCATCTGAAGAGTTACTTGAGACCCTTGACTTTTACAGAGACATCATCTCAGGTCCCTTTGAAAAGTTAATTAGAGGGTCAAAGATTAGGGAATTGAGTGGTCCTGAGTACTCAAGGAAGGTTATGGAGAACTGTGTGGCACACTTGAAATCAGTTGGAACTTATGGAGATGCAGAAGCTGAAGCTATGCAAAAATTTGCTGAAGCTTTCAAGCCTGTTAATTTTCCACCTGGTGCCTCTGTTTTCTACAGGCAATCACCTGATGGAATATTAGGGCTTAGTTTCTCTCCGGATACAAGTATACCAGAAAAGGAGGCTGCACTCATAGAGAACAAGGCAGTTTCATCAGCAGTGTTGGAGACTATGATCGGCGAGCACGCTGTTTCCCCTGATCTTAAGCGCTGTTTAGCTGCAAGATTACCTGCGTTGTTGAACGAGGGTGCTTTCAAGATTGGAAACTGATGATGATTATACTCCTATATCACTGCATTTCCAAAAGCGTTGCAGCACAAGAATGAGACCATGAACTTTTTTAAGTCTACACGTTTAATTTTTTGTATATCTATTTACCTTCTTATTAGTATCAATAATATGAAATGAAAGATCTTGCTTTCTACTCTTGTACTATTTCTGTGATAGATAATGTTAATGAGTATCTTCATCAATAAAAGTGATTTGTTTTGTTTGTTC

SEQ ID NO：7

ATGTCTTCATCCAACGCCTGCGCCTCTCCGTCACCGTTCCCCGCCGTCACGAAGCTTCATGTAGACTCCGTCACGTTTGTACCGTCCGTCAAGTCACCGGCCTCCTCCAATCCATTATTCCTCGGCGGCGCCGGTGTCCGAGGCCTTGATATCCAAGGTAAATTCGTGATCTTCACCGTCATTGGAGTATACCTAGAGGGTAACGCCGTTCCTTCTCTATCTGTCAAGTGGAAGGGAAAAACTACGGAGGAGCTAACAGAATCTATCCCGTTCTTCCGTGAAATAGTCACCGGTGCGTTTGAGAAGTTTATCAAGGTGACAATGAAACTGCCGTTAACGGGACAACAATATTCGGAGAAAGTGACGGAGAATTGTGTGGCTATATGGAAACAATTAGGGCTTTATACGGACTGTGAAGCTAAAGCTGTGGAGAAGTTCTTGGAGATCTTCAAGGAAGAAACATTCCCTCCCGGTTCATCGATCCTCTTCGCTCTCTCCCCTACCGGCTCTCTTACGGTTGCGTTTTCGAAAGATGATAGTATCCCTGAAACCGGGATCGCTGTGATCGAGAACAAATTGTTGGCGGAGGCGGTTCTGGAATCTATCATCGGGAAGAACGGTGTGTCACCTGGCACTAGGTTAAGTGTTGCAGAAAGATTATCTCAGCTAATGATGAAGAACAAGGACGAAAAGGAAGTTAGTGATCACTCTGTTGAGGAAAAACTAGCCAAAGAGAACTGAGAATGATAGATTTTTCTTGTGTTT

SEQ ID NO：8

MAASITAITVENLEYPAVVTSPVTGKSYFLGGAGERGLTIEGNFIKFTAIGVYLEDIAVASLAAKWKGKSSEELLETLDFYRDIISGPFEKLIRGSKIRELSGPEYSRKVMENCVAHLKSVGTYGDAEAEAMQKFAEAFKPVNFPPGASVFYRQSPDGILGLSFSPDTSIPEKEAALIENKAVSSAVLETMIGEHAVSPDLKRCLAARLPALLNEGAFKIGN

SEQ ID NO：9

MSSSNACASPSPFPAVTKLHVDSVTFVPSVKSPASSNPLFLGGAGVRGLDIQGKFVIFTVIGVYLEGNAVPSLSVKWKGKTTEELTESIPFFREIVTGAFEKFIKVTMKLPLTGQQYSEKVTENCVAIWKQLGLYTDCEAKAVEKFLEIFKEETFPPGSSILFALSPTGSLTVAFSKDDSIPETGIAVIENKLLAEAVLESIIGKNGVSPGTRLSVAERLSQLMMKNKDEKEVSDHSVEEKLAKEN

Claims

1.一种使用不是细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)的转基因微生物生产二氢查耳酮的方法，其包括以下步骤：

(i)提供转基因微生物，其包含

和

-核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成；

(ii)将一种或更多种黄烷酮和/或所述黄烷酮的一种或更多种前体添加到所述转基因微生物中，以及在允许所述黄烷酮和/或其前体转化为二氢查耳酮的条件下培养所述转基因微生物；

(iii)任选地：分离并且可能地纯化所述二氢查耳酮，

其中所述二氢查耳酮是根皮素，和/或其中所述黄烷酮是柚皮素。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因微生物是兼性厌氧微生物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因微生物是酵母。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因微生物不是梭菌(Clostridiales)目的微生物。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因微生物不是梭菌(Clostridia)纲的微生物。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因微生物不是厚壁菌(Firmicutes)门的微生物。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因微生物是兼性需氧细菌。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因微生物是变形菌。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因微生物是肠细菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肠细菌是埃希氏杆菌属。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述埃希氏杆菌属选自大肠杆菌(E.coli)。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述大肠杆菌是大肠杆菌Rosetta、大肠杆菌BL21和大肠杆菌SE1。

13.根据权利要求3所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(S.cerevesiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中添加柚皮苷和/或其糖苷配基。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中

编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自厚壁菌门的微生物的查耳酮异构酶，

和/或

编码植物查耳酮异构酶的所述基因编码来自拟南芥(A.thaliana)或紫花苜蓿(M.sativa)的查耳酮异构酶，

和/或

编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自厚壁菌门的微生物的烯醇还原酶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自梭菌纲的微生物的查耳酮异构酶。

17.根据权利要求15所述的方法，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自梭菌目的微生物的查耳酮异构酶。

18.根据权利要求15所述的方法，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶。

19.根据权利要求15所述的方法，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自梭菌纲的微生物的烯醇还原酶。

20.根据权利要求15所述的方法，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自梭菌目的微生物的烯醇还原酶。

21.根据权利要求15所述的方法，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自细枝真杆菌的烯醇还原酶。

22.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中

所述核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，

和/或

所述核酸区段(a’)包含根据SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，

和/或

所述核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成。

23.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中

所述细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，

和/或

所述植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，

和/或

所述细菌烯醇还原酶包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。

24.不是细枝真杆菌的转基因微生物，其包含

核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，以及

核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。

25.根据权利要求24所述的微生物，其中所述微生物具有查耳酮异构酶和烯醇还原酶活性，但是不具有根皮素水解酶活性。

26.根据权利要求24或25所述的微生物，其中所述微生物是兼性厌氧微生物。

27.根据权利要求24或25所述的微生物，其中所述微生物是酵母。

28.根据权利要求26所述的微生物，其中所述微生物不是梭菌目的微生物。

29.根据权利要求26所述的微生物，其中所述微生物不是梭菌纲的微生物。

30.根据权利要求26所述的微生物，其中所述微生物不是厚壁菌门的微生物。

31.根据权利要求26所述的微生物，其中所述微生物是兼性需氧细菌。

32.根据权利要求26所述的微生物，其中所述微生物是变形菌。

33.根据权利要求26所述的微生物，其中所述微生物是肠细菌。

34.根据权利要求33所述的微生物，其中所述肠细菌是埃希氏杆菌属。

35.根据权利要求34所述的微生物，其中所述埃希氏杆菌属选自大肠杆菌。

36.根据权利要求35所述的微生物，其中所述大肠杆菌是大肠杆菌Rosetta、大肠杆菌BL21和大肠杆菌SE1。

37.根据权利要求27所述的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。

38.根据权利要求24或25所述的微生物，其中

和/或

编码植物查耳酮异构酶的所述基因编码来自拟南芥或紫花苜蓿的查耳酮异构酶，

和/或

编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自厚壁菌门的微生物的烯醇还原酶；

其中

和/或

所述核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成；

和/或

39.根据权利要求38所述的微生物，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自梭菌纲的微生物的查耳酮异构酶。

40.根据权利要求38所述的微生物，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自梭菌目的微生物的查耳酮异构酶。

41.根据权利要求38所述的微生物，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶。

42.根据权利要求38所述的微生物，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自梭菌纲的微生物的烯醇还原酶。

43.根据权利要求38所述的微生物，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自梭菌目的微生物的烯醇还原酶。

44.根据权利要求38所述的微生物，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自细枝真杆菌的烯醇还原酶。

45.载体，其包含

-核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，

和/或

46.根据权利要求45所述的载体，其中所述载体是质粒载体。

47.根据权利要求45或46所述的载体，其中

和/或

其中

和/或

48.根据权利要求47所述的载体，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自梭菌纲的微生物的查耳酮异构酶。

49.根据权利要求47所述的载体，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自梭菌目的微生物的查耳酮异构酶。

50.根据权利要求47所述的载体，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶。

51.根据权利要求47所述的载体，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自梭菌纲的微生物的烯醇还原酶。

52.根据权利要求47所述的载体，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自梭菌目的微生物的烯醇还原酶。

53.根据权利要求47所述的载体，其中编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自细枝真杆菌的烯醇还原酶。

54.宿主细胞，其包含一种或更多种相同或不同的根据权利要求45至53中任一项所述的载体，其中所述宿主细胞不是细枝真杆菌。

55.根据权利要求54所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是根据权利要求24至44中任一项所述的微生物。

56.根据权利要求54或55所述的宿主细胞，其包含

具有核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)的一种或更多种载体以及具有核酸区段(b)的一种或更多种载体二者，

所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。

57.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述微生物是根据权利要求54至56中任一项所述的宿主细胞。