ES2590221B1 - Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles - Google Patents

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Abstract

Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles.#La presente invención se refiere a un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 1 y una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 4. Además dicha secuencia puede comprender las secuencias de otros genes para la síntesis de polifenoles. En la presente invención se demuestra la utilidad de dichas construcciones génicas en la síntesis de polifenoles, en concreto de estilbenos, chalconas, flavanonas, isoflavonas, flavonas, flavonoles, dihidroflavonoles, dihidroflavanoles, antocianidinas y sus derivados.

Description

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Acido nucleico recombinante para su uso en la produccion de polifenoles
DESCRIPCION
La presente invencion se refiere a un acido nucleico recombinante que comprende una subunidad que comprende una secuencia que codifica para una protema con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 1 y una subunidad que comprende una secuencia que codifica para una protema con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 4 para la generacion de polifenoles. Por lo tanto, la presente invencion se puede encuadrar en el campo de la medicina.
ESTADO DE LA TECNICA
Los polifenoles constituyen uno de los grupos mas numeroso y ampliamente distribuido del reino vegetal. Son metabolitos secundarios de las plantas, esenciales para la morfologia y fisiologia de las mismas. Participan en la pigmentacion de flores y otros organos vegetales, y ademas, estan involucrados en el crecimiento y reproduction (atraen a agentes polinizadores) y protegen a las plantas frente a infecciones microbianas y radiation ultravioleta (Harborne y Williams, 2000). Quimicamente, se caracterizan por tener al menos un anillo aromatico con uno o mas grupos hidroxilo unidos y dos de sus familias principales son los estilbenos y los flavonoides (Manach et al., 2004). Los flavonoides se subdividen a su vez en varios subgrupos en funcion del grado de sustitucion: flavanonas, flavonas, isoflavonas, flavanoles, flavan-3-oles y antocianidinas. Los flavonoides constituyen el grupo mas numeroso de los polifenoles de la dieta, con mas de 4.000 moleculas. (Kumar y Pandey, 2013). Ver figura 1 (Manach et al., 2004).
Hasta ahora se han identificado mas de 8.000 polifenoles distintos que forman parte de nuestra dieta, siendo de ellos mas de 4.000 flavonoides. Aunque no son nutrientes necesarios para el bienestar a corto plazo, hay evidencias de que una ingesta moderada a largo plazo tiene efectos beneficiosos para la salud. Estos compuestos, al igual que los estilbenos, son potentes antioxidantes que previenen la aparicion de tumores, enfermedades cardiovasculares y osteoporosis, mejoran las funciones cognitivas y la diabetes; o poseen action fitoestrogenica, antiinflamatoria, antibacteriana o antiviral, teniendo por lo tanto un fuerte impacto sobre la salud humana (Kumar y Pandey, 2013).
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La principal ruta involucrada en la bioslntesis de polifenoles en las plantas es la fenilpropanoide, siendo la L-fenilalanina el precursor principal. La fenilalanina amonio liasa (PAL) cataliza la transformation de L-fenilalanina en acido cinamico, que es hidroxilado por la 4-cinamato hidroxilasa (C4H) para generar acido p-cumarico. El acido p-cumarico (o 4-hidroxi-cumarico) es el sustrato de la p-cumaroil-CoA ligasa (4CL), responsable de la production de p-cumaroil-CoA (o 4-hidroxi-cumaroil-CoA) (Vogt, 2010).
Partiendo de este p-cumaroil-CoA y de tres moleculas de malonil-CoA, se originan estas dos importantes familias de polifenoles: los estilbenos y los flavonoides. Los estilbenos se originan gracias a la action de la estilbeno sintasa (STS). Por el contrario, los flavonoides comienzan su slntesis con la formation de dos chalconas, la de naringenina y la de liquiritigenina. Para la formacion de ambas se requiere la actividad de la chalcona sintasa (CHS) y adicionalmente la de la chalcona reductasa (CHR) para la formacion de la chalcona de liquiritigenina. Ambas chalconas son sustrato de la chalcona isomerasa (CHI) encargada de cerrar el anillo B, y que genera naringenina y liquiritigenina respectivamente (Crozier et al., 2009). A partir de la liquiritigenina se forma la isoflavona daidzelna, gracias a la accion de la isoflavona sintasa (IFS). Esta enzima tambien es capaz de usar como sustrato la naringenina para formar otra isoflavona, la genistelna (Winkel-Shirley, 2001). De la naringenina derivan otras subfamilias de flavonoides debido a la actividad de diversas enzimas:
• Flavona sintasa (FNS): responsable de la formacion de flavonas, como por ejemplo la apigenina.
• Flavanona-3-hidroxilasa (F3H): origina dihidroflavonoles como el dihidrokampferol (aromadendrina). Este compuesto es sustrato de otras enzimas responsables de la formacion de dihidroflavonoles como la dihidroquercetina y la dihidromiricetina. Estas enzimas son la flavonoide-3’-hidroxilasa (F3’H) y la flavonoide- 3’,5’- hidroxilasa (F3’5’H) respectivamente.
• Flavonol sintasa (FLS): genera flavonoles como el kaempferol y la quercetina. Sus sustratos son los dihidroflavonoles.
• Dihidroflavonol reductasa (DFR) y antocianidina sintasa (ANS): ambas enzimas originan las antocianidinas, como la pelargonidina.
• Antocianidina reductasa (ANR): actua sobre las leucoantocianidinas originadas por la DFR para formar los flavan-3-oles, como la epicatequina (Winkel-Shirley, 2001).
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La importancia de los flavonoides como protectores de la salud humana ha estimulado la investigation y el desarrollo de nuevas plataformas para su production a gran escala. En las plantas se encuentran en bajas concentraciones y la slntesis qulmica implica procesos complejos, asl que la bioslntesis de estos compuestos en microorganismos podrla ser una solution eficaz a estos problemas.
E. coli se ha empleado para la produccion de algunos flavonoides en bajas concentraciones, gracias a la utilization de la enzima 4-cumaroil-CoA-ligasa (4CL) de la bacteria Streptomyces coelicolor, que permite formar 4-cumaroil-CoA a partir de acido 4-hidroxi-cumarico (un derivado de L-tirosina) (Kaneko et al., 2003). Asl se pudieron producir pinocembrina y naringenina (dos flavonoides muy simples e iniciales en esta familia de compuestos) en E. coli, a partir de fenilalanina y tirosina respectivamente, expresando el gen codificador de la enzima fenil-amonio-liasa (PAL) de la levadura Rhodotorula rubra, la 4CL de S. coelicolor y la CHS de la planta Glychyrrhiza echinata (Hwang et al., 2003). El paso de estas chalconas hasta flavanonas se logro mediante la adicion del gen CHI de la planta Pueraria lobata (Miyahisa et al., 2005). Posteriormente, se lograron sintetizar los flavonoles galangina y kaempferol y las flavonas crisina y apigenina a partir de fenilalanina y tirosina respectivamente, gracias a la incorporation de nuevos plasmidos portadores de los genes codificadores de las FNS1, F3H y FLS (Miyahisa et al., 2006). Mediante adicion al medio de cultivo de distintos precursores (acido cumarico, acido cafeico, naringenina y eriodictiol) otros investigadores utilizaron la enzima F3H y tambien la flavonoide-3’,5’-hidroxilasa (F3’5’H) para producir en E. coli los flavonoides eriodictiol, dihidrokampferol, kaempferol, dihidroquercetina y quercetina (Leonard et al., 2006a). Se logro tambien sintetizar apigenina y luteolina utilizando la FNS1, a partir de la adicion al medio de cultivo de naringenina y eriodictiol, o de acido cumarico y cafeico respectivamente (Leonard et al., 2006b). Recientemente se ha sintetizado en E. coli eriodictiol a partir de L-tirosina, utilizando la flavonoide-3’-hidroxilasa (F3’H) fusionada con una reductasa P450 truncada (Zhu et al., 2014).
Hasta ahora se ha conseguido sintetizar las isoflavonas genistelna y daidzelna en E. coli a partir de los flavonoides naringenina y liquiritigenina anadidos como precursores en el caldo de cultivo, gracias a una citocromo P450 derivada de una enzima de Bacillus megaterium, fusionada con la IFS (Leonard y Koffas, 2007) (Kim, 2009).
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Hasta hace pocos anos, todos los flavonoides sintetizados en E. coli necesitaban la adicion al medio de cultivo de precursores como aminoacidos u otros flavonoides, pero desde entonces se ha logrado obtener naringenina en E. coli sin anadir precursores (Santos et al., 2011).
Se han publicado estudios realizados en Streptomyces venezuelae, donde se ha logrado sintetizar naringenina y pinocembrina a partir de la adicion al medio de cultivo de los precursores acido cumarico y cinamico respectivamente, y el estilbeno resveratrol a partir de acido cumarico (Park et al., 2009). Con adicion al medio de cultivo de naringenina y pinocembrina se ha logrado tambien producir apigenina, crisina, kampferol y galangina en S. venezuelae (Park et al., 2010b). En esta especie no se ha logrado sintetizar polifenoles hasta ahora sin recurrir a la adicion de precursores en el medio de cultivo.
En 2005 se sintetizaron flavonoides en la levadura S. cerevisiae, utilizando los genes PAL, 4CL y CHS para sintetizar naringenina y pinocembrina a partir de L-fenilalanina (Jiang et al., 2005). Tambien se utilizo acido cumarico anadido en el medio de cultivo, mas los genes codificadores de las enzimas C4H, 4CL, CHS, CHI para sintetizar naringenina en esta levadura (Yan et al., 2005). A partir de fenilalanina, o de acido cumarico o naringenina (estos dos ultimos anadidos al medio de cultivo), mediante el uso de la IFS y de una citocromo reductasa P450, se obtuvo la isoflavona genistelna en levadura y tambien kaempferol y quercetina (Kim et al., 2005) (Trantas et al., 2009).
Sin embargo, es necesaria una nueva plataforma que permita la produccion de polifenoles, por ejemplo en actinomicetos, a gran escala y sin necesidad de anadir al medio de cultivo precursores de los mismos, lo que permita su produccion industrial ilimitada y a bajo coste.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
En la presente invencion se demuestra la utilidad de varias construcciones genicas en la slntesis de polifenoles, en concreto de estilbenos, chalconas, flavanonas, isoflavonas, flavonas, flavonoles, dihidroflavonoles, dihidroflavanoles, antocianidinas y sus derivados.
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En la presente invencion se han sintetizado polifenoles en Streptomyces, como modelo de slntesis en actinomicetos, por lo que para poder expresar correctamente los genes en la presente invencion, los mismos se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un acido nucleico recombinante que comprende:
a. una subunidad (a) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 (protelna TAL), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2 (gen TAL), y
b. una subunidad (b) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4 (protelna 4CL), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 5 (gen 4CL).
En adelante "el acido nucleico de la invencion” o ”acido nucleico recombinante de la invencion”.
En la presente invencion se entiende por "subunidad” a una secuencia de nucleotidos. Dicha subunidad puede ser una acido desoxirribonucleico (ADN) o acido ribonucleico (ARN).
El acido nucleico recombinante tambien se denomina "construction genica”.
Se entiende como "recombinante” aquel acido nucleico no natural que ha sido producido artificialmente in vitro o in vivo por tecnicas conocidas por el experto en la materia y que no ocurre en la naturaleza.
El termino "identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proportion de aminoacidos identicos entre dos peptidos que se comparan o a la proportion de nucleotidos identicos entre dos acidos nucleicos que se comparan. Los metodos de comparacion de secuencias son conocidos en el estado de la tecnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Podemos considerar, que peptidos o acidos nucleicos con porcentajes de
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identidad de, al menos, un 70% mantendran las mismas propiedades de dicha secuencia.
Cuando nos referimos a al menos un 70% de identidad quedan incluidos el 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % y 100% de identidad. Cuando nos referimos a al menos un 65% de identidad quedan incluidos el 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % y 100% de identidad.
En la presente invencion los terminos "secuencia nucleotldica”, "polinucleotido”, "secuencia de nucleotidos”, "acido nucleico” y "oligonucleotido” se utilizan indistintamente.
El acido nucleico de la presente invencion puede presentar sustituciones conservativas, conocidas por el experto en la materia. Las sustituciones conservativas en el polinucleotido conllevan a que se codifique el mismo peptido.
El termino acido nucleico incluye ADN genomico o ADN codificante de cadena doble o sencilla, acido ribonucleico (ARN), cualquier polinucleotido sintetico y manipulado geneticamente y tanto la cadena codificante como la antisentido. Esto incluye moleculas de cadena sencilla y de doble cadena, como por ejemplo, hlbridos de ADN- ADN, ADN-ARN y ARN-ARN.
La secuencia nucleotldica de la invencion puede obtenerse de manera artificial mediante metodos de clonacion y seleccion convencional ampliamente conocidos en el estado de la tecnica.
La tirosina-amonio liasa (TAL, histidine ammonia-lyase) utilizada en la presente invencion es de Rhodobactercapsulatus, numero de acceso WP_013066811 (SEQ ID NO: 1 es la protelna, SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 3 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
La 4CL de S. coelicolor es una enzima capaz de producir cumaroil-CoA a partir de tirosina (Kaneko et al., 2003).
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La 4-cumaroil ligasa (4CL, 4-coumarate-CoA ligase) utilizada en la presente invencion es de Streptomyces coelicolor, numero de acceso NP_628552 (SEQ ID NO: 4 es la protelna, SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 6 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Una realizacion preferida del primer aspecto de la invencion se refiere al acido nucleico recombinante donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada) y la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada).
Otra realizacion preferida del primer aspecto de la invencion se refiere al acido nucleico recombinante que ademas comprende una subunidad (c) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 7 (protelna STS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 8 (gen STS). Preferiblemente, la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 (STS optimizada). Mas preferiblemente se refiere al acido nucleico recombinante donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada) y la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 (STS optimizada).
En una realizacion mas particular, el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 10.
El uso de la secuencia SEQ ID NO: 10 demuestra que se sintetiza resveratrol. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pSTS6W que comprende dicha secuencia.
La estilbeno sintasa (STS) es la unica que posee la capacidad de sintetizar estilbenos y en la naturaleza se sintetiza principalmente en diversas especies de la familia elegida.
La STS (stilbene synthase) utilizada en la presente invencion es de Vitis vinifera, numero de acceso AAB32488 (SEQ ID NO: 7 es la protelna, SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 9 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
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Otra realization preferida del primer aspecto de la invention se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (d) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 11 (protelna CHS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 12 (gen CHS). Preferiblemente, en el acido nucleico la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada). Aun mas preferiblemente, la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada) y donde la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada).
La chalcona sintasa (CHS, chalcone synthase 5) utilizada en la presente invention es de Glycine max, numero de acceso L07647.1 (SEQ ID NO: 11 es la protelna, SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 13 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Una realization mas preferida del primer aspecto de la invention se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (e) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 14 (protelna ALKR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 15 (gen ALKR). Preferiblemente, el acido nucleico donde la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16 (ALKR optimizada). Mas preferiblemente, el acido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada) y la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16 (ALKR optimizada).
En una realization particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en la secuencia SEQ ID NO: 17.
El uso de la secuencia SEQ ID NO: 17 demuestra que se sintetiza floretina. La presente invention tambien se refiere al plasmido pJFF-PHLO que comprende dicha secuencia.
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La alkenal reductasa (ALKR, phloretin alkenal-reductase) utilizada en la presente invencion es de Malus domestica, numero de acceso XP_008367739 (SEQ ID NO: 14 es la protelna, SEQ ID NO: 15 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 16 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realizacion mas preferida del primer aspecto de la invencion se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (f) que comprende una secuencia que codifica para la protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 18 (protelna PRTase), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 19 (gen PRTase). Mas preferiblemente al acido nucleico donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 (PRTase optimizada). Aun mas preferiblemente al acido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada) y donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 (PRTase optimizada).
La aromatic preniltransferasa (PRTasa o PRTase, Xanthohumol prenyl-transferase) utilizada en la presente invencion es de Humulus lupulus, numero de acceso XP_008367739 (SEQ ID NO: 18 es la protelna, SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 20 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Una realizacion aun mas preferida del primer aspecto de la invencion se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (g) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 21 (protelna OMTase), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 22 (gen OMTase). Preferiblemente la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23 (OMTase optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 (PRTase optimizada) y donde la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23 (OMTase optimizada).
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Una realization particular se refiere al acido nucleico donde el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 24 (inserto en el plasmido pJFF-XAN).
Con la secuencia SEQ ID NO: 24 se puede sintetizar xanthohumol. La presente invention tambien se refiere al plasmido pJFF-XAN que comprende dicha secuencia.
La O-metiltransferasa 1 (OMTasa, OMTase o OMT1, Xanthohumol-O-methyl- transferase) utilizada en la presente invention es de Humulus lupulus, numero de acceso FM164641.1 (SEQ ID NO: 21 es la protelna, SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 23 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realization mas preferida del primer aspecto de la invention se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (h) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 25 (protelna CHI), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 26 (CHI gen). Preferiblemente en el acido nucleico la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada). Mas preferiblemente en el acido nucleico la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada) y donde la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada).
Una realizacion mas particular se refiere al acido nucleico donde el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 28.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 28 se puede sintetizar naringenina. La presente invention tambien se refiere al plasmido pNGM-NAR que comprende dicha secuencia.
La chalcona isomerasa (CHI, chalcone flavonone isomerase 1A) utilizada en la presente invention es de Glycine max, numero de acceso AY595413.1 (SEQ ID NO: 25 es la protelna, SEQ ID NO: 26 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 27 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
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Una realization aun mas preferida del primer aspecto de la invention se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (i) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 29 (protelna CHR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 30 (gen CHR). Preferiblemente en el acido nucleico la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada). Mas preferiblemente en el acido nucleico segun la revindication 26 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL
optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL
optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS
optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI
optimizada) y donde la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada).
Una realization mas particular se refiere al acido nucleico que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 32.
Mediante el uso de la SEQ ID NO: 32 se puede sintetizar liquiritigenina. La presente invention tambien se refiere al plasmido pLMF-LQ que comprende dicha secuencia.
La chalcona reductasa (CHR, NAD(P)H-dependent 6'-deoxychalcone synthase) utilizada en la presente invention es de Glycine max, numero de acceso X55730.1 (SEQ ID NO: 29 es la protelna, SEQ ID NO: 30 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 31 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realization mas particular se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33 (protelna N3DOX), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34 (gen N3DOX). Preferiblemente la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada),la subunidad (i) consiste en la secuencia
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SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada).
Una realizacion aun mas particular se refiere al acido nucleico que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 36.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 36 se demuestra que se sintetiza garbanzol. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pGR que comprende dicha secuencia.
La naringenina 3-dioxigenasa (N3DOX, Flavanone 3-hydroxylase, Flavanone 3- dioxygenase, Naringenin 3-dioxygenase) utilizada en la presente invencion es de Petroselinum crispum, numero de acceso AY230248 (SEQ ID NO: 33 es la protelna, SEQ ID NO: 34 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 35 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realizacion mas particular se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (protelna F3’H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (gen F3’H). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada) y donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada).
Una realizacion particular se refiere al acido nucleico que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 40.
Mediante el uso de secuencia SEQ ID NO: 40 se demuestra que se genera dihidrofisetina. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pDF que comprende dicha secuencia.
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La flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H, flavonoid 3’-hydroxylase) utilizada en la presente invencion es de Arabidopsis thaliana, numero de acceso Q9SD85 (SEQ ID NO: 37 es la protelna, SEQ ID NO: 38 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 39 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realizacion mas particular se refiere al acido nucleico que ademas comprende una subunidad (l) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41 (protelna IFS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42 (gen IFS) y una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43 (protelna reductasa de G. max), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44 (gen de la reductasa). Preferiblemente la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS optimizada+reductasa optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada),la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y donde la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS+reductasa optimizada).
En una realizacion mas particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 47 (inserto en el plasmido pLMF55W). Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 47 se genera daidzelna.
La isoflavona sintasa (IFS, isoflavone synthase 1,) utilizada en la presente invencion es de Glycine max, numero de acceso AF195818 (SEQ ID NO: 41 es la protelna, SEQ ID NO: 42 es la secuencia de nucleotidos).
La NAPH:P450 reductasa (CPR) utilizada en la presente invencion es de Glycine max, numero de acceso AY170374.1 (SEQ ID NO: 43 es la protelna, SEQ ID NO: 44 es la secuencia de nucleotidos).
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La quimera IFS-CPR tiene como secuencia de protelnas la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46 es la secuencia optimizada para Streptomyces.
En una realization mas particular el acido nucleico ademas comprende una subunidad
(m) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 50 (protelna DZNR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 51 (gen DZNR). Preferiblemente la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS- reductasa optimizada) y donde la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada).
La reductasa de daidzelna (DZNR, daidzein reductase) utilizada en la presente invention es de Lactococcus garvieae, numero de acceso AB558141 (SEQ ID NO: 50 es la protelna, SEQ ID NO: 51 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 52 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otras reductasas que tambien pueden utilizarse son las siguientes (se identifican con su numero de acceso): XP_006472452, XP_008338958, XP_006338052,
AAZ39648.1, P38038, AEE85738.1, BAD05639, XP_002270732, 1408205A,
AFW57103, CBG67789, CAM03474, AAB97736, XP_003610109, WP_010982013, WP_011027201, EFE84508.
En una realizacion mas particular el acido nucleico ademas comprende una subunidad
(n) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 53 (protelna DHDR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 54 (gen DHDR). Preferiblemente en el acido nucleico la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55 (DHDR optimizada). Mas preferiblemente el acido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL
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optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS
optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI
optimizada),la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS-reductasa optimizada), la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR
optimizada) y la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55 (DHDR
optimizada).
La reductasa de dihidrodaidzelna (DHDR, dihydrodaidzein reductase) utilizada en la presente invencion es de Lactococcus garvieae, numero de acceso AB592970 (SEQ ID NO: 53 es la protelna, SEQ ID NO: 54 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 55 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En una realizacion mas particular el acido nucleico ademas comprende una subunidad
(o) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 56 (protelna THDR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 57 (gen THDR), y una subunidad (s) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 59 (prot RAC), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 65% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 60 (gen RAC). Preferiblemente la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 (THDR optimizada) y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61 (RAC optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada),la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS-reductasa optimizada), la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada), la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55 (DHDR optimizada), la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 (THDR RAC optimizada) y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61 (RAC optimizada).
En una realizacion particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 62.
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El uso de la secuencia SEQ ID NO: 62 demuestra que se genera (S)-equol. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pLMF56 que comprende dicha secuencia.
La reductasa de tetrahidrodaidzelna (THDR, tetradrodaidzein reductase) utilizada en la presente invencion es de Lactococcus garvieae, numero de acceso AB592969 (SEQ ID NO: 56 es la protelna, SEQ ID NO: 57 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 58 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
La racemasa (RAC, dihydrodaidzein racemase) utilizada en la presente invencion es de Lactococcus garvieae, numero de acceso AB592969 (SEQ ID NO: 59 es la protelna, SEQ ID NO: 60 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 61 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En otra realizacion mas particular el acido nucleico ademas comprende la subunidad (l) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41 (protelna IFS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42 (IFS gen) y una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43 (protelna reductasa de G. max), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44 (gen de la reductasa). Preferiblemente la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS+ reductasa optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL

optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS

optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI

optimizada) y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS+
reductasa optimizada).
En una realizacion mas particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 63.
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Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 63 se demuestra que se sintetiza genistelna. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pNGM-GEN que comprende dicha secuencia.
En otra realizacion mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (protelna F3’H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (F3’H gen). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada).
En una realizacion particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 64.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 64 se demuestra que se genera erodictiol. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pNGM-ERY que comprende dicha secuencia.
En otra realizacion mas particular el acido nucleico ademas comprende una subunidad
(p) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 65 (protelna FNS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 66 (FNS gen). Preferiblemente la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 (FNS optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 (FNS optimizada).
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En otra realization particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 68.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 68 se genera apigenina. La presente invention tambien se refiere al plasmido plMG-API que comprende dicha secuencia.
La flavona sintasa (FNS, flavone synthase I) utilizada en la presente invention es de Petroselinum crispum, numero de acceso AY230247.1 (SEQ ID NO: 65 es la protelna, SEQ ID NO: 66 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 67 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En una realization aun mas particular el acido nucleico ademas comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al
menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (protelna F3’H),
preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (F3’H gen).Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la
secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la
secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 (FNS optimizada) y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada).
En una realization particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 69.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 69 se demuestra que se sintetiza luteolina. La presente invention tambien se refiere al plasmido pLT que comprende dicha secuencia.
En una realization aun mas particular el acido nucleico ademas comprende la subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33 (protelna N3DOX), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34 (N3DOX gen). Preferiblemente la subunidad (j) consiste en
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la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada).
En otra realizacion aun mas particular el acido nucleico ademas comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70 (protelna FLS1), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71 (FLS1 gen).Preferiblemente la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada) y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada).
En una realizacion aun mas particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 73.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 73 se demuestra que se genera kaempferol. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pKF que comprende dicha secuencia.
La flavonol sintasa (FLS1, flavonol synthase, flavanone 3-hydroxylase ) utilizada en la presente invencion es de Arabidopsis thaliana, numero de acceso Q96330 (SEQ ID NO: 70 es la protelna, SEQ ID NO: 71 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 72 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En otra realizacion aun mas particular el acido nucleico ademas comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74 (protelna F3’5’H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la
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secuencia SEQ ID NO: 75 (F3’5’H gen). Preferiblemente la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 (F3’5’H optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada), la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada) y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 (F3’5’H optimizada).
En una realizacion aun mas preferida el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 77.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 77 se demuestra que se genera miricetina. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pMIR que comprende dicha secuencia.
La flavonoide 3’-5’-hidroxilasa (F3’5’H, flavonoid 3’-5’-hydroxylase) utilizada en la presente invencion es de Petunia x hybrida, numero de acceso Z22544.1 (SEQ ID NO: 74 es la protelna, SEQ ID NO: 75 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 76 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En una realizacion aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al
menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (protelna F3’H),
preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (F3’H gen). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la
secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la
secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada) y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada).
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En otra realization aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una protema con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70 (protema FLS1), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71 (FLS1 gen). Preferiblemente la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada), la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3’H optimizada) y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada).
En una realization aun mas preferida el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 78.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 78 se demuestra que se genera quercetina. La presente invention tambien se refiere al plasmido pQR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 78.
En otra realization aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protema con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90 (protema DFR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91 (DFR gen). Preferiblemente la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 (DFR optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
La dihidroflavonol reductasa (DFR, dihydroflavonol 4-reductase) utilizada en la presente invention es de Punica granatum, numero de acceso KF841618 (SEQ ID NO: 90 es la protema, SEQ ID NO: 91 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 92 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
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En una realization aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una protema con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93 (protema ANS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94 (ANS gen). Preferiblemente la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 (ANS optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
En una realization particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 96 (inserto del pPEL).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 96 se demuestra que se genera pelargonidina. La presente invention tambien se refiere al plasmido pPEL que comprende la secuencia SEQ ID NO: 96.
La antocianidin sintasa (ANS, anthocyanidin synthase) utilizada en la presente invention es de Punica granatum, numero de acceso KF841619 (SEQ ID NO: 93 es la protema, SEQ ID NO: 94 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 95 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En otra realization aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una protema con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74 (protema F3’5’H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75 (F3’5’H gen). Preferiblemente la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 (F3’5’H optimizada). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76. Mas preferiblemente ademas comprende la subunidad (t) que comprende una
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secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90 (protelna DFR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91 (DFR gen). Mas preferiblemente la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 (DFR optimizada). Por lo que la presente invencion tambien se refiere a un acido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92. Aun mas preferiblemente ademas comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93 (protelna ANS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94 (ANS gen). Mas preferiblemente la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 (ANS optimizada). Por lo que tambien se refiere al acido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
En otra realizacion particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 97 (inserto del pDEL).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 97 se demuestra que se genera delfinidina. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pDEL que comprende la secuencia SEQ ID NO: 97.
En otra realizacion aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90 (protelna DFR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91 (gen DFR). Preferiblemente donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 (DFR optimizado). Mas preferiblemente donde la
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subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92. En una realizacion particular ademas comprende la subunidad (v) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 98 (protelna LAR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 99 (gen LAR). Preferiblemente la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100 (LAR optimizado). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100.
En otra realizacion particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 101 (inserto del pCTC).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 101 se demuestra que se genera catequina. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pCTC que comprende la secuencia SEQ ID NO: 101.
La leucoantocianidin reductasa (LAR, leucoanthocyanidin reductase) utilizada en la presente invencion es de Fragaria x ananassa, numero de acceso AAZ78662 (SEQ ID NO: 98 es la protelna, SEQ ID NO: 99 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 100 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En otra realizacion aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93 (protelna ANS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94 (gen ANS). Preferiblemente la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 (ANS optimizado). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia
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SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
En otra realizacion particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 102 (inserto del pCYN).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 102 se demuestra que se genera cianidina. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pCYN que comprende la secuencia SEQ ID NO: 102.
En otra realizacion aun mas preferida el acido nucleico comprende la subunidad (w) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 103 (protelna ANR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 104 (gen ANR). Preferiblemente la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105 (ANR optimizado). Mas preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92, la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 y la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105.
En otra realizacion particular el acido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 106 (inserto del pECTC).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 106 se demuestra que se genera epicatequina. La presente invencion tambien se refiere al plasmido pECTC que comprende la secuencia SEQ ID NO: 106.
La antocianidin reductasa (ANR, anthocyanidin reductase) utilizada en la presente invencion es de Fragarai x ananassa, numero de acceso ABD95362 (SEQ ID NO: 103
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es la protelna, SEQ ID NO: 104 es la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 105 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En la presente invention los genes pueden tener al menos un sitio de union al ribosoma (rbs), preferiblemente todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma.
Por este motivo, en otra realization aun mas preferida el acido nucleico ademas comprende al menos un sitio de union a ribosomas (rbs) unido de forma operativa. Preferiblemente el rbs esta unido a la position 5’ de cada subunidad, preferiblemente entre el sitio de union a ribosomas y la subunidad puede haber o no un polinucleotido espaciador. Aun mas preferiblemente el rbs se selecciona de la lista que consiste en: rbs se Streptomyces (SEQ ID NO: 79), rbs LMF (SEQ ID NO: 80), rbs consenso para Streptomyces (SEQ ID NO: 81), rbs de genes operon gly (aaaggag), rbs mit (aggagg), rbs tipA (agaagggag), preferiblemente consiste en la secuencia SEQ ID NO: 79.
La secuencia nucleotldica de la invencion, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, promotores, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5’ o 3’, sitios de union a ribosomas, secuencias estabilizadoras, secuencias de deteccion celular, secuencias de reconocimiento para enzimas de restriction, etc. Estos polinucleotidos adicionalmente tambien pueden incluir secuencias codificantes para aminoacidos adicionales que pueden ser utiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del peptido generado a partir de el o para permitir una mejor purification del mismo.
Por este motivo, una realizacion aun mas preferida del primer aspecto de la invencion se refiere al acido nucleico que ademas comprende al menos un promotor constitutivo o inducible unido de forma operativa. Preferiblemente el promotor constitutivo o inducible esta unido de forma operativa delante de cada subunidad. Mas preferiblemente el promotor se selecciona de la lista que consiste en: promotor del gen ermE (SEQ ID NO: 82), rp1M (SEQ ID NO: 83), tipA (SEQ ID NO: 84), tsr (SEQ ID NO: 85), snpA (SEQ ID NO: 86), gy1ABx (SEQ ID NO: 87), mcrB (SEQ ID NO: 88), aac(2)IV (SEQ ID NO: 89), preferiblemente es el promotor del gen ermE (SEQ ID NO: 82).
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En la presente invention el termino "promotor” hace referenda a una region del acido desoxirribonucleico, generalmente "aguas arriba” o "upstream” del punto de inicio de la transcription, que es capaz de iniciar la transcription. Este termino incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores especlficos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles. Ejemplos de promotores procariotas incluyen tambien, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lac, lacI, tet, gal, trc, o tac. Segun la presente invencion, el termino promotor constitutivo se refiere a un promotor genetico que expresa continuamente el gen que regula. El termino promotor inducible en la presente invencion hace referencia a un promotor genetico que activa la expresion del acido nucleico de la invencion al que regula en respuesta a un factor externo (o agente inductor), como por ejemplo una sustancia qulmica o una condition ambiental, y que en este caso controla la transcripcion del mismo (por ejemplo, isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido, nisina o por temperatura). No obstante, es conocido por el experto en la materia que existen secuencias promotoras que se comportan como constitutivas o como inducibles dependiendo de la celula que los expresa. El promotor inducible en la presente invencion tambien puede ser cualquiera de los promotores inducibles conocidos por el experto en la materia, por ejemplo los promotores lacUV5, T7, P1, nisA o del fago T5.
La expresion "unido operativamente” (o "unido de forma operativa”), tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes asl descritos tienen una relation que les permite funcionar en la manera intencionada.
Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un cassette de expresion que comprende el acido nucleico del primer aspecto de la presente invencion. En adelante "el cassette de expresion de la invencion”.
El cassette de expresion comprende los elementos necesarios para la expresion del acido nucleico de la invencion, al estar unido operativamente a elementos de control de la transcripcion y/o de traduction, tales como, por ejemplo, senales de inicio y termination, sitios de corte, o senal de poliadenilacion.
Las secuencias de acidos nucleicos de la invencion o el cassette de expresion de la presente invencion pueden hallarse formando parte de vectores que permitan su multiplication o clonaje asl como su expresion. Dicho vector puede ser, por ejemplo
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un vector de clonacion o un vector de expresion o un vector recombinante. El clonaje de la secuencia nucleotidica de la invention se puede realizar empleando un vector de expresion o recombinante, o un plasmido. Estos vectores comprenden la secuencia nucleotidica de la invencion (o el cassette de expresion que la comprende) y tambien pueden comprender una serie de secuencias codificantes para aminoacidos que son dianas de corte de proteasas. La ventaja de esta estructura es que, una vez producida la protema o peptido de fusion, lisado el sistema de expresion y purificada esta mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cromatografia de afinidad, se puede escindir la protema portadora del peptido de la invencion mediante digestion con una proteasa y repurificar el peptido de la invencion mediante el mismo sistema cromatografico.
Utilizando tecnicas bien conocidas, un experto en la materia seria capaz de obtener un vector adecuado para la clonacion y/o expresion del acido nucleico del primer aspecto de la invencion en cualquier microorganismo.
El termino "vector", tal y como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molecula de acido nucleico que es capaz de transferir secuencias de acidos nucleicos contenidas en la misma a una celula. Algunos ejemplos de vectores recombinantes son ADN lineal, ADN plasmidico, virus modificados, adenovirus/virus adenoasociados, vectores retrovirales y virales, etc.; todos ellos ampliamente descritos en la literatura y que pueden ser empleados siguiendo tecnicas estandar de biologia molecular o comprados a proveedores. Entre los vectores virales mas usados para la introduction de genes en celulas de mamifero, se encuentran, vectores de poxvirus, de herpes simplex, adenovirus, vectores asociados a adenovirus, etc.
Los vectores pueden ser introducidos por cualquier metodo conocido por el experto en la materia, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante transfection, transduction, transformacion o infeccion de las celulas hospedadoras, como son, aunque sin limitarse a ellas, celulas vegetales, de mamifero, bacterias, arqueas, levaduras, hongos o celulas de insecto.
El termino "vector de clonacion", tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a una molecula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de replication. Ejemplos de vectores de expresion son,
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pero sin limitarse, plasmidos, cosmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura.
El termino "vector de expresion", tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a un vector de donation adecuado para expresar un acido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una celula, denominada celula huesped. Dicho acido nucleico se encuentra, por lo general, unido operativamente a secuencias de control.
El termino "expresion" se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipeptido a partir de un polinucleotido. Incluye la transcription del polinucleotido en un ARN mensajero (ARNm) y la traduction de dicho ARNm en una protelna o un polipeptido. La expresion puede tener lugar en una celula hospedadora.
El termino "vector recombinante", tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a un vector adecuado para expresar un acido nucleico que ha sido clonado en el mismo, de forma que la expresion del peptido de bioslntesis de polifenoles se realiza directamente en el tejido o celula diana. Generalmente dicho vector es un virus o un plasmido, y es producido por la union de diferentes fragmentos de acidos nucleicos a partir de diferentes fuentes y cuya expresion da lugar a un elemento genetico movil que permite la expresion en el tejido o celula diana de las secuencias nucleotldicas o peptldicas de interes. La expresion en un tejido o celula de interes se realiza mediante la union operativa del polinucleotido a secuencias de control, preferentemente secuencias de control especlficas del tejido o celula donde se quiere expresar; preferentemente dichas secuencias de control son promotores o enhancers. Un vector recombinante segun la invention puede, por tanto, emplearse tanto como herramienta biotecnologica para multiplicarlo como emplearse en composiciones farmaceuticas como tratamiento farmacologico per se. Un vector recombinante tlpico se selecciona del grupo que consiste en un vector lentiviral, un vector adenoviral, un vector de virus adenoasociados, un plasmido, un cosmido, o un cromosoma artificial.
Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a un vector que comprende el acido nucleico del primer aspecto de la presente invencion o el cassette de expresion del segundo aspecto de la presente invencion. Preferiblemente el vector es replicativo o integrativo. Mas preferiblemente dicho vector se selecciona de la lista que
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comprende: plasmido, cosmido, bacmido, vector viral o cromosoma artificial. En adelante "el vector de la invention”.
Una realization preferida de este aspecto de la invencion se refiere a un vector que comprende el acido nucleico de la invencion o el cassette de expresion de la invencion unido en fase de lectura a una secuencia nucleotldica que codifica para una etiqueta de purification.
La expresion "etiqueta de purificacion” o "etiqueta de afinidad”, tal y como se utiliza en la presente description se refiere a una secuencia de aminoacidos que ha sido incorporada (generalmente, por ingenierla genetica) a una protelna para facilitar su purificacion. La etiqueta, que puede ser otra protelna o una secuencia corta de aminoacidos, permite la purificacion de la protelna, por ejemplo, mediante cromatografla de afinidad. Algunos ejemplos de etiquetas de purificacion conocidos en el estado de la tecnica son, por ejemplo, pero sin limitarse a: el peptido de union a calmodulina (CBP), la enzima glutation-S-transferasa (GST) o una cola de residuos de histidina. Preferiblemente, la etiqueta de purificacion consiste en al menos 6 residuos de histidina.
Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a una protelna de fusion que se genera a partir de la traduction del acido nucleico del primer aspecto de la invencion, es decir la codificada por el acido nucleico de la invencion. En adelante "la protelna de la invencion”.
Los terminos "secuencia de aminoacidos” o "protelna” se usan aqul de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimerica de aminoacidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, qulmica o bioqulmicamente modificados. El termino "residuo” corresponde a un aminoacido.
Un quinto aspecto de la presente invencion se refiere a una celula que comprende el acido nucleico del primer aspecto de la invencion, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, el vector del tercer aspecto de la invencion y/o la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion. En adelante, la "celula hospedadora de la invencion” o "la celula de la invencion”.
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Preferiblemente dicha celula es una bacteria, una levadura, un hongo, una celula vegetal o una celula animal. Mas preferiblemente la celula es un actinomiceto, preferiblemente del genero que se selecciona de la lista que consiste en Streptomyces, Saccharopolyspora, Micromonospora, Bifidobacterium, Frankia, Streptoverticiiiium, Kitasatospora, Propionibacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium; y otros como Escherichia, Lactobacillus, Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces o Bacillus.
En una realization aun mas particular del quinto aspecto de la invention la celula es Streptomyces coelicolor, S. albus, S. venezuelae, S. avermitilis, S. lividans, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. clavuligerus, S. griseus, S. kanamyceticus, S. noursei, S. scabies, S. violaceoruber o Saccharopolyspora erythraea.
El termino "celula hospedadora" o "celula huesped" o “celula transformada” incluye cualquier celula cultivable que puede ser modificada mediante la introduction del acido nucleico de la invencion, el cassette de la invencion, del vector de la invencion, o la protelna de la presente invencion no contenidos de manera natural en la celula.
Preferiblemente, una celula hospedadora es aquella en la que el polinucleotido de la invencion puede ser expresado, dando lugar a un polipeptido estable, modificado post- traduccionalmente y localizado en el compartimento subcelular apropiado. La election de una celula hospedadora adecuada puede tambien estar influida por la eleccion de la senal de detection. Por ejemplo, el uso de construcciones con genes reporteros (por ejemplo, lacZ, luciferasa, timidina quinasa o la protelna verde fluorescente “GFP”) puede proporcionar una senal seleccionable mediante la activation o inhibition de la transcription del gen de interes en respuesta a una protelna reguladora de la transcription. De cara a conseguir una selection o “screening” optimo, el fenotipo de la celula hospedadora debera ser considerado.
La celula transformada de la invencion puede presentar el acido nucleico del primer aspecto de la invencion o la construction genica clonada en un vector genico capaz de replicarse establemente en dicha celula, como por ejemplo en un plasmido, o el vector del segundo aspecto de la invencion. En consecuencia, la etapa de transformacion celular puede llevarse a cabo clonando la construccion genetica en el vector (plasmido), que puede ser posteriormente introducido en la celula de destino por un metodo de conjugacion, transformacion o electroporacion, dependiendo de la
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celula de destino y del vector de clonacion elegido. Alternativamente, la celula transformada puede presentar la construction genetica integrada en el genoma de dicha celula. En ese caso, la etapa de transformation celular a puede llevarse a cabo por alguno de los metodos conocidos para recombination homologa o no homologa, por ejemplo mediante el uso de transposones u otros vectores moleculares que no son capaces de autorreplicarse en la celula de destino, pero que pueden mediar procesos de recombinacion entre acidos nucleicos.
En la presente memoria, la expresion "metodo de conjugation” se refiere a cualquiera de los metodos habitualmente empleados en biologla molecular que permiten transferir una molecula de ADN desde una bacteria donadora a una bacteria receptora tras ponerlas en contacto directo.
En la presente memoria, la expresion "metodo de transformacion” se refiere a cualquiera de los metodos habitualmente empleados en biologla molecular que permiten introducir una molecula de ADN en una cepa bacteriana tras poner en contacto directo dicha cepa bacteriana con la molecula de ADN.
En la presente memoria, la expresion "metodo de electroporation” se refiere a cualquiera de los metodos habitualmente empleados en biologla molecular que permiten introducir una molecula de ADN en una cepa bacteriana tras poner en contacto directo dicha cepa bacteriana con la molecula de ADN y aplicar una corriente electrica.
En una realization particular del quinto aspecto de la invention la celula hospedadora puede ser una celula no patogena que pueda ingerirse por un sujeto, por ejemplo bifidobaterias (B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. thermophilum, B. animalis, B. breve, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. adolescentes, B. pullorum o B. ruminantium). Tambien puede ser una celula que se selecciona de la lista que consiste en Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnnosus y Lactobacillus salivarium. En otra realizacion aun mas particular, la celula se refiere a L. casei BL23, L. casei ATCC 334, L. casei str. Zang. Dichas celulas pueden ser usadas como probiotico productor de polifenoles directamente en el tracto digestivo de una persona o de un animal.
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Por lo tanto la presente invention tambien se refiere al uso de la celula del quinto aspecto de la invencion (no patogena) para la production de un alimento, un producto lacteo fermentado, suplemento dietetico o un producto probiotico comestible. En una realization particular los productos lacteos fermentados son quesos o yogures.
Ademas, la presente invencion tambien se refiere a un alimento, un producto lacteo fermentado, suplemento dietetico o un producto probiotico comestible que comprende el acido nucleico del primer aspecto de la invencion, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, el vector del tercer aspecto de la invencion, la protelna del cuarto aspecto de la invencion y/o la celula del quinto aspecto de la invencion. En una realizacion particular los productos lacteos fermentados son quesos o yogures, u otros materiales fermentados que puedan servir de alimento a animales o humanos.
Ademas la invencion tambien se refiere a un producto vegetal fermentado con las celulas hospedadoras de la invencion. Dicho producto se puede administrar como alimento funcional en animales o humanos.
Un sexto aspecto de la presente invencion se refiere al uso del acido nucleico del primer aspecto de la invencion, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, el vector del tercer aspecto de la invencion, la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o de la celula del quinto aspecto de la invencion para la slntesis de polifenoles (produccion de polifenoles). Preferiblemente se sintetiza resveratrol, floretina, garbanzol, dihidrofisetina (fustina), liquiritigenina, daidzelna, (S)- equol, xanthohumol, naringenina, genistelna, apigenina, luteolina, erodictiol, kaempferol, dihidrokaempferol, miricetina, dihidroquercetina, quercetina, catequina, epicatequina, cianidina,pelargonidina y/o delfinidina. Dicha slntesis de polifenoles puede ser realizad in vitro o in vivo (por ejemplo en un humano o animal).
Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso del acido nucleico del primer aspecto de la invencion, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, el vector del tercer aspecto de la invencion, la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o de la celula del quinto aspecto de la invencion como medicamento, es decir, para la elaboration de un medicamento. Preferiblemente para el tratamiento o la prevention de (o para la elaboracion de un medicamento para el
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tratamiento y/o prevention o para su uso en el tratamiento o prevention) de enfermedades en las que los polifenoles descritos en la presente invention alivien los slntomas, curen o mitiguen la enfermedad; dichas enfermedades pueden ser cualquiera de las conocidas por el experto en la materia en las que la action de los polifenoles aqul descritos mejoren el estado de salud del individuo. Por ejemplo pueden ser usados para prevenir y tratar tumores, enfermedades cardiovasculares, osteoporosis, mejorar las funciones cognitivas y la diabetes; como fitoestrogenos, antiinflamatorios, antibacterianos o antivirales. Es decir, se refiere al acido nucleico del primer aspecto de la invencion, al cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, al vector del tercer aspecto de la invencion, a la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o a la celula del quinto aspecto de la invencion para su uso en el tratamiento y/o la prevention de dichas enfermedades.
Ademas, tambien se refiere al uso del acido nucleico del primer aspecto de la invencion, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, el vector del tercer aspecto de la invencion, la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o de la celula del quinto aspecto de la invencion para la disminucion de los signos de la edad y del envejecimiento, es decir para la elaboracion de un medicamento para dicho fin. Es decir, se refiere al acido nucleico del primer aspecto de la invencion, al cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, al vector del tercer aspecto de la invencion, a la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o a la celula del quinto aspecto de la invencion para su uso en la disminucion de los signos de la edad y del envejecimiento.
Por lo tanto otro aspecto de la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que comprende al acido nucleico del primer aspecto de la invencion, al cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, al vector del tercer aspecto de la invencion, a la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o a la celula del quinto aspecto de la invencion.
El termino "composition farmaceutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para prevention, diagnostico, alivio, tratamiento o curacion de una enfermedad en el ser humano o en los animales. La composition farmaceutica de la invencion puede utilizarse tanto sola como en combination con otras composiciones farmaceuticas. El termino composition farmaceutica y medicamento se utilizan en esa invencion de manera indistinta. En el contexto de la presente invencion se refiere a
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una composition farmaceutica o un medicamento caracterizado por comprender el acido nucleico de la invention o la protema o vector o celula que permita su expresion en el organismo a tratar, en una cantidad terapeuticamente activa, de forma que el acido nucleico ejerza su funcion en el tejido/celula diana.
En una realization preferida, la composition farmaceutica de la invention ademas comprende un vehiculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. En una realization mas preferida, la composition farmaceutica ademas comprende un adyuvante. En una realization aun mas preferida, ademas comprende otro principio activo (principio activo adicional).
En la presente invention la expresion "cantidad terapeuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del agente calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendra determinada, para el caso de una composition terapeutica, por las caracteristicas propias de los compuestos, la ruta, forma y frecuencia de administration de los mismos, y otros factores, incluyendo la edad, estado del paciente, asi como la severidad de la alteration o trastorno.
El termino "excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorcion de los elementos de la composicion de la invencion, estabiliza dichos elementos y activa o ayuda a la preparation de la composition en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan mas agradable. Asi pues, los excipientes podrian tener la funcion de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azucares o celulosas, la funcion de endulzar, la funcion como colorante, la funcion de protection de la composition, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la funcion de relleno de una pastilla, capsula o cualquier otra forma de presentation, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibasico, la funcion desintegradora para facilitar la disolucion de los componentes y su absorcion en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este parrafo.
El termino "vehiculo”, al igual que el excipiente, hace referencia a una sustancia que se emplea en la composition farmaceutica o medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la presente invencion comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. La funcion del vehiculo es facilitar la incorporation de otros elementos, permitir una mejor dosificacion y administration o dar consistencia y forma
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a la composition. Cuando la forma de presentation es llquida, el vehlculo farmacologicamente aceptable es el diluyente.
En esta memoria, el termino "adyuvante” se refiere a un agente que aumenta el efecto del acido nucleico o protelna de la invention cuando es suministrado de forma conjunta a este o bien formando parte de un mismo protocolo de tratamiento.
Los adyuvantes y vehlculos farmaceuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composition farmaceutica de la presente invention son los vehlculos conocidos por los expertos en la materia.
Como se emplea aqul, el termino "principio activo” ("sustancia activa”, "sustancia farmaceuticamente activa”, "ingrediente activo” o "ingrediente farmaceuticamente activo”) significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacologica u otro efecto diferente en el diagnostico, cura, mitigation, tratamiento, o prevention de una enfermedad, o que afecta a la estructura o funcion del cuerpo del hombre u otros animales.
En otra realization particular, dicha composition farmaceutica se prepara en forma solida o en suspension acuosa, en un diluyente farmaceuticamente aceptable.
La composition de esta invention puede ser administrada por cualquier via de administration apropiada, para lo cual dicha composition se formulara en la forma farmaceutica adecuada a la via de administration elegida. En una realization particular, la administracion de la composicion terapeutica proporcionada por esta invention se efectua por ejemplo por via parenteral, por via oral, por via intraperitoneal o subcutanea.
Un septimo aspecto de la presente invention se refiere a un metodo de production de polifenoles que comprende la utilization del acido nucleico del primer aspecto de la invention, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invention, el vector del tercer aspecto de la invention, la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invention y/o de la celula del quinto aspecto de la invention. Preferiblemente se produce resveratrol, floretina, garbanzol, dihidrofisetina (fustina), liquiritigenina, daidzelna, (S)- equol, xanthohumol, naringenina, genistelna, apigenina, luteolina, erodictiol,
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kaempferol, dihidrokaempferol, miricetina, dihidroquercetina, quercetina, catequina, epicatequina, cianidina, pelargonidina y/o delfinidina.
Un octavo aspecto de la presente invention se refiere a un kit (tambien puede ser un dispositivo) que comprende el acido nucleico del primer aspecto de la invencion, el cassette de expresion del segundo aspecto de la invencion, el vector del tercer aspecto de la invencion, la protelna de fusion del cuarto aspecto de la invencion y/o de la celula del quinto aspecto de la invencion.
Un noveno aspecto de la presente invencion se refiere al uso del kit (o del dispositivo) del octavo aspecto de la invencion para generar polifenoles. Preferiblemente para generar resveratrol, floretina, garbanzol, dihidrofisetina (fustina), liquiritigenina, daidzelna, (S)-equol, xanthohumol, naringenina, genistelna, apigenina, luteolina, erodictiol, kaempferol, dihidrokaempferol, miricetina, dihidroquercetina, quercetina, catequina, epicatequina, cianidina, pelargonidina y/o delfinidina.
A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Estructura general de los flavonoides
FIG. 2 Ruta biosintetica del resveratrol. Se muestra la masa molecular en daltons (Da).
FIG. 3 Plasmido final productor de resveratrol (pSTS6W) que contiene el promotor (permE*), y los genes TAL, 4CL y STS. tsr es el gen de resistencia a tioestreptona.
FIG. 4 Espectro de masas de un extracto de la cepa productora de resveratrol, S. coelicolor transformado con pSTS6W. El espectro muestra los picos de uno de los fragmentos (227,3000 > 143,0000) obtenidos tras realizar el analisis MRM. Los picos
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corresponden a los isomeros cis (4,5 min) y trans (5,3 min) de resveratrol. Se muestran los tiempos de retencion.
FIG. 5 Ruta bioslntesis de la liquiritigenina, daidzelna, naringenina y genistelna. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 6 Plasmido final pLMF-LQ conteniendo los genes de la ruta de bioslntesis de liquiritigenina (A). Plasmido final pNGM-NAR conteniendo los genes de la ruta de bioslntesis de naringenina (B). ApR es el gen de resistencia a ampicilina. tsr es el gen de resistencia a tioestreptona.
FIG. 7 Espectro de masas (EIC). Se muestra el patron de liquiritigenina superpuesto (pico mayor) a la liquiritigenina producida por S. coelicolor con el plasmido pLMF-LQ (pico menor).
FIG. 8 Plasmidos productores de daidzelna: pLMF55 (integrativo) (A) y pLMF55W (replicativo) (B). Plasmido productor de genistelna (pNGM-GEN).
FIG. 9 Produccion de daidzelna en S. coelicolor transformado con pLMF55W (arriba) y pLMF55 (abajo). Se muestra el tiempo de retencion de la daidzelna.
FIG. 10 Espectro de masas mostrando los flavonoides producidos por S. albus conteniendo el plasmido pLMF55 (arriba) y pLMF55W (abajo), tras analisis MRM. Se muestran la daidzelna (DZ), la liquiritigenina (LQ) y la naringenina (NAR).
FIG. 11 Ruta bioslntetica de (S)-equol. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 12 Plasmido productor de (S)-equol (pLMF56).
FIG. 13 Espectro de masas de produccion de (S)-equol (pico sombreado en gris) por la cepa S. coelicolor conteniendo el plasmido pLMF56.
FIG. 14 Posibles rutas de obtencion de las flavonas apigenina y luteolina, y de la flavanona eriodictiol, a partir de naringenina. Se muestran las masas moleculares en Da.
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FIG. 15 Construction plasmldica final productora de luteolina (pLT) (A), de apigenina (pNGM-AP) (B) y de erodictiol (pNGM-ERY) (C)
FIG. 16 Espectro de masas mostrando los flavonoides producidos por S. albus transformado con el plasmido pLT. Se muestra la luteolina (LT), la quercetina (QR) y la apigenina (API).
FIG. 17 Rutas biosinteticas para la obtencion de kaempferol, miricetina y quercetina a partir de naringenina. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 18 Plasmidos finales productores de kaempferol (pKF) (A), quercetina (pQR) (B) y miricetina (pMIR) (C).
FIG. 19 Especto de masas obtenido tras analisis MRM de pKF transformado en S. albus. Se muestra el dihidrokaempferol (DHK), la quercetina (QR), la apigenina (API) y el kaempferol (KF).
FIG. 20 Espectro de masas mostrando los flavonoides detectados por MRM de pQR transformado en S. albus. Se muestra el dihidrokaempferol (DHK), la quercetina (QR), la apigenina (API) y el kaempferol (KF).
FIG. 21 Espectro de masas de los resultados obtenidos tras transformar pMIR en S. albus. Se muestra la miricetina (MIR), el dihidrokaempferol (DHK), la quercetina (QR) y el kaempferol (KF).
FIG. 22 Ruta de bioslntesis de garbanzol y dihidrofisetina. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 23 Plasmidos productores de garbanzol (pGR) (A) y de dihidrofisetina (pDF) (B).
FIG. 24 Espectros de masas tras analisis SIM. Espectro correspondiente a un extracto de S. albus conteniendo el plasmido pGR (arriba) y el correspondiente a la cepa control (abajo). Se observan 3 picos nuevos en la cepa con pGR (minutos 3,8; 4,1 y 5,7), alguno de los cuales podrla ser garbanzol.
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FIG. 25 Superposicion de los espectros obtenidos tras analisis SIM de un extracto de S. albus conteniendo el plasmido pDF (color negro) y de la cepa control (color gris). Se observa un pico diferencial en el minuto 4,4 que podrla ser dihidrofisetina.
FIG. 26 Plasmidos productores de floretina (pJFF-PHLO) (A) y de xanthohumol (pJFF- XAN) (B).
FIG. 27 Espectro de HPLC-MS donde se muestran los tiempos de retencion de los iones correspondientes a cada uno de los patrones comerciales usados en este trabajo. Los patrones comerciales fueron adquiridos en Sigma Aldrich. Las masas moleculares y su tiempo de retencion vienen indicados en la tabla 1.
FIG. 28 Rutas biosinteticas para la obtencion de pelargonidina, delfinidina, catequina, cianidina y epicatequina a partir de dihidrokaempferol.
FIG. 29 Plasmidos productores de pelargonidina (pPEL) (A), delfinidina (pDEL) (B), catequina (pCTC) (C), cianidina (CYN) (D) y epicatequina (pECTC) (E).
EJEMPLOS
A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
EJEMPLO 1: sintesis de estilbenos
Para la sintesis de resveratrol se requieren tres enzimas: TAL, 4CL y STS (Figura 2). Muchas de las enzimas pertenecientes a la familia de las TAL son bifuncionales, tienen actividad tambien sobre la fenilalalina y puede que la preferencia sobre este aminoacido sea mayor, asl que para la election de nuestro enzima se reviso la bibliografla existente hasta el momento para asegurarnos de que tuviera mayor actividad sobre tirosina. La TAL elegida en la presente invencion es la procedente de Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NO: 1). Ademas otra TAL perteneciente a otra especie de Rhodobacter (R. sphaeroides) fue utilizada para sintetizar estilbenos y flavonoides y presenta una elevada homologla con la TAL de R. capsulatus (Watts et al, 2004).
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Los otros dos enzimas utilizados fueron la 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 4), y la STS de Vitis vinifera (SEQ ID NO: 7). Este enzima fue elegido ya que es el unico que posee la capacidad de sintetizar estilbenos y en la naturaleza se sintetiza principalmente en diversas especies de la familia elegida. Ademas esta ampliamente descrita en la biografla y fue utilizada en diversos estudios para sintetizar resveratrol (Donnez et al., 2009).
Para poder expresar correctamente estos tres genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 9). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El plasmido final (Figura 3, pSTS6W, SEQ ID NO: 10) productor de resveratrol es un plasmido replicativo (pWHM3) que contiene un promotor constitutivo (permE*) delante de los tres genes transformado en S. coelicolor y en S. albus.
La transformation se realizo en S. coelicolor M145 y en S. albus J1074. En ambos casos para la production de metabolitos se crecieron 3x107 esporas en 3 ml de R5A solido durante una semana a 30° C. La extraction se realizo con un volumen de acetato de etilo + 0,1% acido formico y se evaporo. El extracto seco se resuspendio en 200 pl de DMSO:Metanol (1:1). Este protocolo de produccion y extraccion se realizo tambien para comprobar la produccion del resto de flavonoides sintetizados en este trabajo. La detection se realizo por cromatografla de masas (Figura 4) mediante monitorizacion de multiples reacciones (MRM). Los iones obtenidos fueron de 185 y 143. El tiempo de retention fue de 4,63 para la forma cis y 5,14 para la forma trans. En S. coelicolor se detecto resveratrol, pero no en S. albus.
EJEMPLO 2: sintesis de flavanonas
El primer paso para la sintesis de isoflavonas es obtener la chalcona de naringenina. En plantas, ocurre de forma muy similar al resveratrol pero en lugar de una estilbeno sintasa se requiere una chalcona sintasa (CHS) (Wang et al., 2011). Gracias a la action de una chalcona isomerasa (CHI) se obtiene la flavanona naringenina, a partir de la cual se pueden obtener numerosos flavonoides (Falcone Ferreyra et al., 2012). Sin embargo, para la obtencion de daidzelna se necesita otra flavanona, la liquiritigenina. En la sintesis de liquiritigenina esta involucrada la chalcona reductasa (CHR) que actua sobre la chalcona de naringenina eliminando un grupo hidroxilo para formar isoliquiritigenina (chalcona de liquiritigenina). Sobre esta chalcona actua la CHI,
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que cierra el anillo central formando la liquiritigenina. Finalmente, actua una enzima clave para la smtesis de isoflavonas, la isoflavona sintasa (IFS). Esta enzima cataliza la formacion de isoflavonas a partir de flavanonas migrando el anillo aromatico del C2 al C3 (Falcone Ferreyra et al., 2012), dando lugar a la isoflavona daidzema a partir de la flavanona liquiritigenina (Figura 5) Este paso supone un reto para la smtesis de isoflavonas en microorganismos dado que es una citocromo P450 reductasa unida a la membrana del retmulo endoplasmatico. En ausencia de CHR, la accion de la IFS directamente sobre la flavanona naringenina da lugar a la isoflavona genistema (Figura 5).
En la presente invencion, para la obtencion de naringenina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la smtesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26) son de Glycine max. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 27). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construccion final con todos los genes se clono en el plasmido replicativo pWHM3 (Vara et al. 1989) (pNGM-GEN, SEQ ID NO: 63) (Figura 6). Este plasmido se transformo en S. coelicolory S. albus, detectandose naringenina por HPLC-MS.
En la presente invencion, para la obtencion de liquiritigenina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la smtesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26), CHR (SEQ ID NO: 30) son de Glycine max. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 31). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construccion final con todos los genes se clono en el plasmido replicativo pWHM3 (pLMF-LQ) (Figura 6). Este plasmido se transformo en S. coelicolor y S. albus, detectandose liquiritigenina por HPLC-MS (Figura 7).
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EJEMPLO 3: sintesis de isoflavonas
En la presente invention para la obtencion de daidzelna se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la sintesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHR (SEQ ID NO: 30) y CHI (SEQ ID NO: 26), son de Glycine max, ya que esta especie es una de las principales productoras de isoflavonas. Por el mismo motivo se selecciono tambien la IFS de la misma especie (SEQ ID NO: 42 el gen y SEQ ID NO: 41 la protelna). Para que este ultimo enzima fuera funcional se sintetizo una quimera IFS - NADPH:P450 reductasa (IFSR) (SEQ ID NO: 48 la protelna y SEQ ID NO: 49 la secuencia de nucleotidos), porque como se menciona anteriormente, la IFS es una enzima que necesita poder reductor, y este as! se lo proporcionarla la reductasa de la quimera construida (SEQ ID NO: 44 el gen y SEQ ID NO: 43 la protelna). Ademas, para el diseno de esta quimera IFSR se anadio un linker entre ambas enzimas, inventado con una secuencia aleatoria (que va desde la position 527 a la 536 de la secuencia SEQ ID NO: 48) que no forma ningun tipo de estructura secundaria. Ademas se anadieron en el extremo amino-terminal de la IFS varios aminoacidos despues de la metionina inicial (12 aminoacidos, posicion 2-13), con el fin de facilitar la union de esta IFS (y por tanto de su quimera) a la membrana celular de la bacteria (en la celula vegetal, aparece unida a membranas de organulos celulares). En la quimera, tambien se eliminaron la metionina inicial y los siguientes 64 aminoacidos de la NADPH:P450 reductasa, y se comprobo con el programa TMHMM server que no se mantenlan en la reductasa aminoacidos que la anclasen a la membrana en la celula bacteriana.
Para poder expresar correctamente estos genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 49). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construction final con todos los genes se clono en el plasmido integrativo pKC796 (Kuhstoss et al., 1991) (pLMF18). Este plasmido se transformo en S. coelicolor pero solo se observo liquiritigenina, lo que nos indica que esta primera quimera IFSR no es funcional, ya que la liquiritigenina es el precursor inmediatamente anterior.
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En un segundo experimento para la obtencion de daidzelna se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHR (SEQ ID NO: 30) y CHI (SEQ ID NO: 26), son de Glycine max, ya que esta especie es una de las principales productoras de isoflavonas. Por el mismo motivo se selecciono tambien la IFS de la misma especie (SEQ ID NO: 42). Para que este ultimo enzima fuera funcional se sintetizo una nueva quimera IFS - NADPH:P450 reductasa (IFSm) (SEQ ID NO: 46 la secuencia de nucleotidos y SEQ ID NO: 45 la secuencia de protelnas), porque como se menciona anteriormente, la IFS es una enzima que necesita poder reductor, y este asl se lo proporcionarla la reductasa de la quimera construida (SEQ ID NO: 44). Ademas, para el diseno de esta quimera se anadio el mismo linker entre ambas enzimas, inventado con una secuencia aleatoria (que va desde la posicion 502 a la 510 de la secuencia SEQ ID NO: 45) que no forma ningun tipo de estructura secundaria. Pero en esta ocasion se eliminaron del extremo amino-terminal de la IFS los primeros 19 aminoacidos despues de la metionina inicial, con el fin de evitar la union de esta IFS (y por tanto de su quimera) a la membrana celular de la bacteria, y que actuase libre en el citoplasma (en la celula vegetal, esos aminoacidos la mantienen unida a membranas de organulos celulares, inexistentes en bacterias). En la quimera, tambien se eliminaron la metionina inicial y los siguientes 64 aminoacidos de la NADPH:P450 reductasa, y se comprobo con el programa TMHMM server que no se mantenlan en la reductasa aminoacidos que la anclasen a la membrana en la celula bacteriana.
Para poder expresar correctamente estos genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 46). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
Se construyeron asl dos nuevos plasmidos, uno integrativo (pLMF55) y otro replicativo (pLMF55W) (Figura 8) y se transformaron en S. coelicolor y S. albus. En ambos casos se observo production de daidzelna, lo que nos indica la funcionalidad de la nueva quimera. En S. coelicolor solo se observa el producto final (Figura 9), la daidzelna. Sin embargo, en S. albus tambien se detecto naringenina y liquiritigenina (Figura 10). Los iones obtenidos por MRM fueron 151 y 119,1 para naringenina; 119 y 90,9 para
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liquiritigenina; 132 y 91 para daidzelna. Los tiempos de retencion fueron 5,64; 4,88 y 4,75 respectivamente.
En un experimento diferente, para la obtencion de genistelna, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26) y la quimera IFSm (SEQ ID NO: 46), son de Glycine max, ya que esta especie es una de las principales productoras de isoflavonas.
Para poder expresar correctamente estos genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 46). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
Se construyo as! un nuevo plasmido (pNGM-GEN) (Figura 8) (SEQ ID NO: 63) y se transformo en S. coelicolory S. albus. Los extractos se analizaron con HPLC-MS y en ambos casos se observo produccion de genistelna.
Recientemente se describio la ruta de bioslntesis del (S)-equol (Figura 11) en distintas bacterias anaerobias, encargadas de producir (S)-equol a partir de daidzelna en el intestino (Kim et al., 2009; Tsuji et al., 2012). Ademas se identificaron las enzimas implicadas en su slntesis en Lactococcus garviae y se comprobo su actividad (Shimada et al., 2010, 2011). Tambien se identifico posteriormente una racemasa necesaria para una slntesis de (S)-equol mas efectiva (Shimada et al., 2012).
Decidimos partir de los plasmidos productores de daidzelna para crear uno productor de (S)-equol. Para ello se clonaron los 4 genes implicados en su slntesis descritos en Lactococcus: reductasa de daidzelna (DZNR) (SEQ ID NO: 51), reductasa de dihidrodaidzelna (DHDR) (SEQ ID NO: 54), reductasa de tetrahidrodaidzelna (THDR) (SEQ ID NO: 57), y la racemasa de dihidrodaidzelna (RAC) (SEQ ID NO: 60). Estos genes se sintetizaron optimizando los codones (SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 61, respectivamente), se les anadio el rbs (SEQ ID NO: 79) y un promotor permE* (SEQ ID NO: 82) situado entre la IFSm y la DZNR (Figura 12).
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Este nuevo plasmido (pLMF56, SEQ ID NO: 62) (Figura 12), una vez transformado en S. coelicolor, produda (S)-equol, cuyo pico era observable en los extractos de esta cepa analizados por HPLC-MS (Figura 13).
EJEMPLO 4: sintesis de flavonas
Las flavonas se obtienen a partir de la naringenina gracias a la accion de dos enzimas: la flavona sintasa (FNS), que lleva a la sintesis de la apigenina (la primera de las flavonas de la ruta biosintetica) y la flavonoide-3-hidroxilasa (F3’H), que si actua sobre la naringenina produce una flavanona (eriodictiol) pero es capaz de anadir un grupo hidroxilo a la apigenina transformandola en luteolina (Figura 14).
Con el fin de sintetizar la flavona apigenina, se clonaron los genes que llevan a la sintesis de naringenina (TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5); CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26) de Glycine max) junto con la FNS de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 66) en el plasmido replicativo pWHM3 junto con el promotor permE* (SEQ ID NO: 82) (pNGM-API) (Figura 15) y este plasmido se transformo en S. coelicolor y S. albus. Todos los genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67) y contienen el rbs de las ocasiones anteriores (SEQ ID NO: 79).
Tras la extraccion de los compuestos, se realizo una cromatografia de masas mediante analisis MRM para identificar la presencia de apigenina. Los iones obtenidos fueron de 150,9 y 117 para apigenina y el tiempo de retencion fue 5,6 min. Se detectaron niveles elevados de apigenina.
Con el fin de sintetizar la flavanona eriodictiol, se clonaron los los genes que llevan a la sintesis de naringenina (TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5); CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26) de Glycine max) junto con la F3’H de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 38) en el plasmido replicativo pWHM3 junto con el promotor permE* (SEQ ID NO: 82) (pNGM-ERY) (Figura 15) y este plasmido se transformo en S. coelicolor y S. albus. Todos los genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 39) y contienen el rbs de las ocasiones anteriores (SEQ ID NO: 79).
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Tras la extraction de los compuestos, se realizo una cromatografla de masas mediante analisis MRM para identificar la presencia de eriodictiol. Se detecto el pico correspondiente a eriodictiol.
Con el fin de sintetizar luteolina se clonaron los genes que llevan a la slntesis de naringenina (TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5); CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26) de Glycine max) junto con la FNS de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 66) y la F3’H de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 38) en el plasmido replicativo pWHM3 junto con el promotor permE* (SEQ ID NO: 82) (pLT) (Figura 15) y este plasmido se transformo en S. coelicolor y S. albus. Todos los genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 39) y contienen el rbs de las ocasiones anteriores (SEQ ID NO: 79).
Tras la extraction de los compuestos, se realizo una cromatografla de masas mediante analisis MRM para identificar la presencia de apigenina, eriodictiol y luteolina. Los iones obtenidos fueron de 150,9 y 117 para apigenina; 150,9 y 135 para ediodictiol y 151,2 y 131,1 para luteolina. Los tiempos de retention fueron 5,6; 4,9 y 4,95 respectivamente.
Se detectaron niveles elevados de apigenina, pero tambien se detecto luteolina, eriodictiol y ademas niveles similares de quercetina (Figura 16).
EJEMPLO 5: slntesis de flavonoles
En la slntesis de flavonoles estan implicadas varias enzimas. La primera de ellas es la naringenina-3-dioxigenasa (N3DOX), que hidroxila la naringenina en el C3 para dar lugar al dihidrokaempferol. La flavonol sintasa (FLS1) cataliza la formation de kaempferol a partir de su forma dihidro. A partir de este flavonol se origina otro, la miricetina, gracias a la action de la flavonoide-3’,5’-hidroxilasa (F3’5’H). A partir del dihidrokaempferol, por la action de la flavonoide-3’-hidroxilasa (F3’H) se origina dihidroquercetina, y sobre esta actua la flavonol sintasa (FLS1) generando quercetina (Figura 17).
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Para producir estos flavonoides se sintetizaron los genes N3DOX de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 34), FLS1 (SEQ ID NO: 71) y F3’H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana, F3’5’H de Petunia x hybrid (SEQ ID NO: 75). Se optimizaron los genes para la slntesis en Streptomyces (SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 76). Se construyeron tres plasmidos: pKF para la slntesis de kaempferol (SEQ ID NO: 73), pQR para la slntesis de quercetina (SEQ ID NO: 78) y pMIR para la slntesis de miricetina (SEQ ID NO: 77). Todos ellos son plasmidos replicativos (pWHM3) y contienen el promotor permE*, el el rbs seleccionado (SEQ ID NO: 79), y los genes que generan naringenina (TAL, 4CL, CHS y CHI) ademas de la N3DOX y FLS1 en el caso de pKF; y adicionalmente F3’H (pQR) o F3’5’H (pMIR) (Figura 18).
Los plasmidos se transformaron en S. coelicolor y S. albus y se comprobo la produccion de flavonoides mediante cromatografla de masas. Se realizo un analisis MRM y los iones obtenidos fueron: 117 y 93 para el kaempferol; 179,1 y 151,1 para la quercetina; 179 y 151 para la miricetina. Los tiempos de retencion fueron 5,81; 5,02 y 4,33 respectivamente.
En los extractos de cepas que contenlan el plasmido pKF (Fig. 18A) se detectaron niveles elevados de kaempferol y residuos de su precursor, el dihidrokaempferol. Ademas se detecto quercetina y apigenina aunque en muy bajas cantidades (Figura 19).
En los extractos de cepas que contenlan el plasmido pQR (Fig. 18B) se detectaron niveles elevados de quercetina y kaempferol. Tambien se observo dihidrokaempferol y apigenina aunque en pequenas cantidades (Figura 20).
En los extractos de cepas que contenlan el plasmido pMIR (Fig. 18C) se detecto mayoritariamente quercetina, seguido de miricetina. En menor medida se detectaron intermediarios de la ruta biosintetica, el dihidrokaempferol y el kaempferol (Figura 21).
EJEMPLO 6: slntesis de dihidroflavonoles
Partiendo de la flavanona liquiritigenina y utilizando tan solo uno o dos de los genes empleados para sintetizar los demas flavonoides descritos anteriormente se pueden
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obtener de forma sencilla otros dos flavonoides: el garbanzol y la dihidrofisetina (Figura 22).
Para sintetizar garbanzol se construyo un plasmido replicativo que contiene los genes implicados en la slntesis de liquiritigenina, que incluyen los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5), y los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26), CHR (SEQ ID NO: 30) de Glycine max. Ademas se incluyo el gen N3DOX de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 34). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 35). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construction final con todos los genes se clono en el plasmido replicativo pWHM3 (pGR) (SEQ ID NO: 36) (Figura 23). Este plasmido se transformo en S. albus, detectandose por HPLC-MS tres picos nuevos con masa molecular identica al garbanzol (272,25 Da), que no existen en la cepa control (contiene solo el vector vaclo) y que son probablemente garbanzol e isomeros del mismo (Figura 24). No existe patron comercial para garbanzol.
Partiendo de este plasmido pGR se construyo el que lleva a la slntesis de dihidrofisetina (pDF, (SEQ ID NO: 40) anadiendo tan solo un gen mas, la F3’H (SEQ ID NO: 38; optimizado SEQ ID NO: 39) (Figura 23).
El plasmido pDF se transformo en S.albus, al igual que el plasmido control sin ningun gen. Con los extractos de estas cepas se realizo un analisis por masas de tipo SIM (masa del ion seleccionado) y se comparo la cepa con el plasmido pDF con la cepa control. Se observo la presencia de un pico diferencial no presente en el control y correspondiente a la masa molecular de la dihidrofisetina (288,25 Da). Esto nos indica que ese pico podrla ser dihidrofisetina (Figura 25). No existe patron comercial para este compuesto.
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EJEMPLO 7: sintesis de otras chalconas
En la presente invention, para la obtencion de la chalcona denominada floretina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la sintesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizo el gen CHS (SEQ ID NO: 12) de Glycine max, comun con la sintesis de la chalcona de naringenina. Y finalmente se anadio el gen de la alqueno reductasa ALKR (SEQ ID NO: 15) procedente de Malus domestica. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 16). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construction final con todos los genes se clono en el plasmido replicativo pWHM3 (pJFF-PHLO, SEQ ID NO: 17) (Figura 26). Este plasmido se transformo en S. coelicolory S. albus, detectandose floretina por HPLC-MS.
En otro experimento, para la obtencion de la chalcona denominada xanthohumol, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la sintesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizo el siguiente gen, CHS (SEQ ID NO: 12) de Glycine max, comun con la sintesis de la chalcona de naringenina. Y finalmente se anadieron los genes de la prenil-transferasa PRTase (SEQ ID NO: 19) y el de la O-metil-transferasa OMTase (SEQ ID NO: 22), ambos procedentes de Humulus lupulus. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 23). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construccion final con todos los genes se clono en el plasmido replicativo pWHM3 (pJFF-XAN, SEQ ID NO: 24) (Figura 26). Este plasmido se transformo en S. coelicolor y S. albus, detectandose xanthohumol por HPLC-MS.
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EJEMPLO 8: sintesis de antocianidinas
En la sintesis de antocianidinas estan implicadas varias enzimas. La primera de ellas es la dihidroflavonol reductasa (DFR), que reduce el grupo ceto situado en el C4 de un dihidroflavonol, para dar lugar a una leucoantocianidina. La antocianidin sintasa (ANS) cataliza la formacion de un heterociclo muy singular, donde el oxlgeno del anillo posee una carga neta positiva, al contrario que todo los demas flavonoides. Ejemplos tlpicos son la pelargonidina, la delfinidina y la cianidina. A partir de estas antocianidinas primarias se originan otras, como la catequina y la epicatequina, gracias a la accion de la leucoantocianidin reductasa (LAR), y de la antocianidin reductasa (Figura 28).
Para producir estos flavonoides se sintetizaron los genes DFR de Punica granatum (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94); y los genes de Fragaria x ananassa LAR (SEQ ID NO: 99) y ANR (SEQ ID NO: 104). Se optimizaron los genes para la sintesis en Streptomyces (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 105). Se construyeron cinco plasmidos: pPEL para la sintesis de pelargonidina (SEQ ID NO: 96), pDEL para la sintesis de delfinidina (SEQ ID NO: 97), pCYN para la sintesis de cianidina (SEQ ID NO: 102), pCTC para la sintesis de catequina (SEQ ID NO: 101), y pECTC para la sintesis de epicatequina (SEQ ID NO: 106). Todos ellos son plasmidos replicativos (pWHM3) y contienen el promotor permE*, el rbs seleccionado (SEQ ID NO: 79), y los genes que generan dihidrokaempferol (TAL, 4CL, CHS, CHI y N3DOX) ademas de la F3’5’H en el caso de pDEL, y F3’H en el caso de pCYN, pCTC y pECTC (Figura 29).
En un experimento de la presente invencion, para la obtencion de la antocianidina denominada pelargonidina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la sintesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la sintesis de dihidrokampferol. Ademas se anadieron los genes de Punica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 95). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
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La construction final se clono en el plasmido replicativo pWHM3, generando pPEL (SEQ ID NO: 96) (Figura 29A), que se transformo en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observo pelargonidina por HPLC-MS.
En otro experimento de la presente invention, para la obtencion de la antocianidina denominada delfinidina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la slntesis de dihidrokampferol. Se anadio ademas el gen F3’5’H (SEQ ID NO: 75) de Petunia x hybrida. Y finalmente se anadieron los genes de Punica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 95). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construction final se clono en el plasmido replicativo pWHM3, generando pDEL (SEQ ID NO: 97) (Figura 29B), que se transformo en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observo delfinidina por HPLC-MS.
En otro experimento de la presente invention, para la obtencion de la antocianidina denominada cianidina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la slntesis de dihidrokampferol. Se anadio ademas el gen F3’H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana. Y finalmente se anadieron los genes de Punica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 95). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
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La construction final se clono en el plasmido replicativo pWHM3, generando pCYN (SEQ ID NO: 102) (Figura 29D), que se transformo en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observo cianidina por HPLC-MS.
En otro experimento de la presente invention, para la obtencion de la antocianidina denominada catequina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la slntesis de dihidrokampferol. Se anadio ademas el gen F3’H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana. Y finalmente se anadio el gen de Punica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y el gen de Fragaria x ananassa LAR (SEQ ID NO: 99). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 100). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construction final se clono en el plasmido replicativo pWHM3, generando pCTC (SEQ ID NO: 101) (Figura 29C), que se transformo en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observo catequina por HPLC-MS.
Por ultimo, en otro experimento de la presente invention, para la obtencion de la antocianidina denominada epicatequina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la slntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Ademas se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la slntesis de dihidrokampferol. Se anadio ademas el gen F3’H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana. Y finalmente se anadieron los genes de Punica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94), junto con el gen de Fragaria x ananassa ANR (SEQ ID NO: 104). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresion en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID
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NO: 105). Ademas todos ellos contienen el sitio de union al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construction final se clono en el plasmido replicativo pWHM3, generando pECTC (SEQ ID NO: 106) (Figura 29E), que se transformo en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observo epicatequina por HPLC-MS.
EJEMPLO 9: deteccion de polifenoles
Con el fin de comparar los diversos polifenoles estudiados en la presente invention, se puso a punto un sistema para su separation e identification por medio de HPLC- MS utilizando patrones comerciales disponibles para la mayorla de ellos. El equipo utilizado fue 1290 Infinity de Agilent Technologies, 6460 Triple Quadrupole LC/MS con fuente de ionization por electrospray. La columna utilizada fue una Zorbax Eclipse Plus C18 de Agilent, de 1,8 p,m y 50 x 2,1 mm. La temperatura de la columna fue de 30 °C. Los solventes utilizados fueron agua con 0,1% de acido formico y acetonitrilo con 0,1% de acido formico. Las condiciones fueron 0-10% (porcentaje de acetonitrilo con 0,1% de acido formico) durante 1 min, 10-35% durante 3 min, 35% durante 1 min, 35-80% durante 3 min, 80% durante 2 min y 80-10% durante 1 min. El flujo se mantuvo constante a 0,3 ml/min. Estas condiciones fueron las mismas para todos los compuestos. La tabla 1 muestra la masa molecular detectada y el tiempo de retention para cada uno de ellos.
La figura 27 muestra un espectro de todos ellos analizados en un unico experimento de HPLC-MS.
Tabla 1: deteccion de polifenoles
Patrones
Masa molecular Tiempo de retencion
Dihidroquercetina (DHQ)
304,2 3,84
Miricetina (MIR)
318,3 4,33
Dihidrokaempferol (DHK)
288,2 4,38
Resveratrol (RES)
228,2 4,63 y 5,14
Daidzefna (DZ)
254,2 4,75
Liquiritigenina (LQ)
256 4,88
Eriodictiol (ER)
288 4,90
Luteolina (LT)
286,2 4,95
Quercetina (QR)
302,2 5,02
Apigenina (API)
270 5,60
Naringenina (NAR)
272,2 5,64
(S)-Equol (EQ)
242,2 5,71
Kaempferol (KF)
286,2 5,81
Como se ha indicado anteriormente, en los ejemplos proporcionados se optimizaron los genes para poder ser expresados en Streptomyces.
5 Tabla 2. Identidades de nucleotidos entre genes originales y los optimizados en la
presente invencion
Genes utilizados en la invencion
% identidad
TAL de Rhodobacter capsulatus
81,27
4CL de S. coelicolor
88,27
CHS de Glycine max
77,72
CHI de G. max
75,65
CHR de G. max
77
IFS + reductasa de G.max
77,91 + 73,11 (es una protefna quimera)
DZR de Lactococcus garvieae
89,92
DHZR de L. garvieae
90,36
THDR de L. garvieae
87,61
RAC de L. garvieae
67,5
FNS de Petroselinum crispum
74,13
FLS de Arabidopsis thaliana
74,68
F3’H de A. thaliana
75,78
F3’5’H de Petunia x hybrida
71,05
N3DOX de P. crispum
75,07
STS de Vitis vinifera
74,22
PRT de Humulus lupulus
71
OMT1 de Humulus lupulus
74
ALKR de Malus domestics
75
DFR Punica granatum
83
ANS Punica granatum
83
LAR Fragaria x ananassa
77
ANR Fragaria x ananassa
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MATERIAL Y METODOS:
1.1 CEPAS BACTERIANAS Y PLASMIDOS
5
Las cepas bacterianas y plasmidos utilizados en este trabajo se muestran en las tablas 3 y 4 respectivamente:
Tabla 3: cepas utilizadas en la presente invencion:
Cepa
Caracteristicas Procedencia
E. coli TOP10
F- mcrA A(mrr-hsdRMS- mcrBC) ^80lacZAM15 AlacX74 nupG recA1 araD139 A(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 A- Invitrogen
E. coli ET12567
F- dam-13::Tn9 dcm-6 hsdM hsdR zjj-202::Tn10 recF143 galK2 galT22 ara- 14 lacY1 xyl-5 leuB6 thi-1 tonA31 rpsL136 hisG4 tsx- 78 mtl-1 glnV44 (MacNeil et al., 1992)
Streptomyces coelicolor M145
wt (Hopwood et al. 1985)
Streptomyces albus J1074
Ilv-1, sal-2. (Chater y Wilde, 1980)
Tabla 4: plasmidos utilizados en la presente invencion:
Plasmido
Caracteristicas Procedencia
pUC57
Vector de seleccion positiva de E. coli; lacZ+, ApR (2,7 kb). Fermentas
pCR®-Blunt
Vector de clonacion de productos de PCR; lacZ+, KnR (3,5 kb) Invitrogen
pUK21
Vector de seleccion positiva de E. coli; lacZ+, KnR (3 kb). (Vieira y Messing, 1991)
pWHM3
Vector bifuncional multicopia para E. coli y Streptomyces. lacZ+, ApR, TioR (7,2 kb) (Vara et al, 1989)
pIAGO
pWHM3 con promotor permE* (Aguirrezabalaga, 2000)
pKC796
Vector bifuncional para E. coli y Streptomyces (integrativo), ApR, AmR (6,7 kb) (Kuhstoss et al., 1991)
pSTS6W
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL y STS Con inserto SEQ ID NO: 10
pNGM-NAR
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS y CHI Con inserto SEQ ID NO: 28
pLMF-LQ
pWHME3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHR y CHI Con inserto SEQ ID NO: 32
pNGM-GEN
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI y IFSm Con inserto SEQ ID NO: 63
pLMF55
pKC796 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI e IFSRm Con inserto SEQ ID NO: 47
pLMF55W
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI e IFSm Con inserto SEQ ID NO: 47
pLMF56
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI ,IFSm, permE*-DZNR, DHDR, THDR y RAC Con inserto SEQ ID NO: 62
pLMF58
pWHM3 con prplM y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI e IFSm Con inserto SEQ ID NO: 107
pLMF60
pWHM3 con permE* delante de cada gen y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI y IFSm Con inserto SEQ ID NO: 108
pNGM-API
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI y FNS Con inserto SEQ ID NO:68
pNGM-ERY
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI y F3’H Con inserto SEQ ID NO: 64
pJFF-PHLO
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS y ALKR Con inserto SEQ ID NO: 17
pJFF-XAN
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, PRTase y OMTase Con inserto SEQ ID NO: 24
pDF
pIAGO con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI, N3DOXy F3’H Con inserto SEQ ID NO: 40
pGR
pIAGO con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHR, CHI y N3DOX Con inserto SEQ ID NO: 36
pKF
plAGO con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, FLS1, CHI y N3DOX Con inserto SEQ ID NO: 73
pLT
plAGO con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, FNS, CHI y F3’H Con inserto SEQ ID NO: 69
pMIR
plAGO con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, FLS1, CHI, N3DOX y F3’5’H Con inserto SEQ ID NO: 77
pQR
pIAGO con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, FLS1, CHI, N3DOX y F3’H Con inserto SEQ ID NO: 78
pPEL
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI, N3DOX, DFR y ANS Con inserto SEQ ID NO: 96
pDEL
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI, N3DOX, F3’5’H, DFR y ANS Con inserto SEQ ID NO: 97
pCTC
pWHM3 con permE* y genes TAL,4CL, CHS, CHI, N3DOX, F3’H, DFR y LAR Con inserto SEQ ID NO: 101
pCYN
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI, N3DOX, F3’H, DFR y ANS Con inserto SEQ ID NO: 102
pECTC
pWHM3 con permE* y genes TAL, 4CL, CHS, CHI, N3DOX, F3’H, DFR, ANS y ANR Con inserto SEQ ID NO: 106
1.2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Las cepas de E. coli se crecieron a 37 °C en medio solido (TSA), o en agitacion (250 5 rpm) en el caso de medio liquido (TSB o LB). S. coelicolor se crecio a 30 °C en medio solido (SFM para esporulacion, o R5A agar para produccion), o a 250 rpm en medio liquido (R5A para produccion, o YEME 34% sacarosa para generar protoplastos). S. albus se crecio en las mismas condiciones que S. coelicolor, pero el medio de esporulacion en este caso fue Bennet y el YEME utilizado es al 17% sacarosa.
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Para la conservation de las cepas, se utilizo glicerol 25% (para E. coli y esporas de Streptomyces) o sacarosa 10,3% (para micelio de Streptomyces).
Todos los antibioticos fueron suministrados por Applichem y una vez preparados se 15 almacenaron a -20 °C.
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Para la selection de clones positivos en E. coli se utilizaron los siguientes antibioticos: ampicilina (100 mg/ml, Ap) a una concentration final de 100 pg/ml, apramicina (200 mg/ml, Am) a concentration final de 40 pg/ml, kanamicina (50 mg/ml, Kn) a concentration final de 50 pg/ml. Para la cepa de E. coli ET12567 ademas se anadio cloranfenicol (50 mg/ml) a una concentration final de 25 pg/ml. Para seleccionar los plasmidos lacZ+ se anadio X-Gal (40 mg/ml) a una concentration final de 20 pg/ml. Para la selection en Streptomyces se utilizaron los siguientes antibioticos: apramicina (200 mg/ml) a concentration final de 40 pg/ml y tiostreptona (50 mg/ml) a concentration final de 50 pg/ml.
1.3 PREPARACION DE PROTOPLASTOS DE S. coelicolor y S. albus.
El protocolo seguido para la preparation de protoplastos de ambas especies esta basado en el descrito en Practical Streptomyces Genetics (Kieser y Bibb, 2000).
Etapa 1 para S. albus:
- Se inoculan 100 pl de esporas (10106 UFCs) en un matraz de 150 ml esteril con 10 ml de TSB. Se incuba a 30 °C durante 24 h a 250 rpm.
- Tras la incubation se anaden (por matraz) 750 pl de este preinoculo de micelio crecido, en matraces invaginados de 250 ml con 25 ml de YEME 17%, mas 937 pl de glicina al 20% y 50 pl de MgCl2 2,5M. Se incuban durante 36 h a 30 °C en agitacion.
Etapa 1 para S. coelicolor:
- Se inoculan 100 pl de esporas (25 106 UFCs) en cada matraz invaginado de 250 ml con 25ml de YEME 34%, mas 625 pl de glicina al 20% y 50 pl de MgCl2 2,5M. Se incuban durante 36 h a 30 °C en agitacion.
Etapa 2 (igual para ambas especies):
- Transferir el contenido de los matraces a tubos Falcon de 50 ml y centrifugar a 8000 rpm durante 5 min a 4 °C.
- Eliminar sobrenadante y resuspender el pellet en sacarosa al 10,3%. Centrifugar igual que en paso anterior.
- Repetir el lavado con sacarosa y eliminar el sobrenadante.
- Anadir a cada pellet 10 ml de tampon P ya suplementado y con lisozima (1 mg/ml). Incubar entre 60 y 90 min a 30 °C en estatico.
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- Observar al microscopio para comprobar que se han generado protoplastos y filtrar con jeringas de algodon.
- Centrifugar a 3500 rpm durante 10 min a 4 °C, descartar sobrenadante, resuspender pellet y anadir 5 ml de tampon P suplementado.
- Repetir paso anterior 2 veces.
- Resuspender pellet de protoplastos en 400 pl de tampon P suplementado y hacer allcuotas de 200 pl.
- Almacenar a -80 °C.
1.4 TRANSFORMACION DE PROTOPLASTOS DE Streptomyces.
Para transformar se anaden 500 pl de PEG6000 y 20 pl de ADN plasmldico por cada allcuota descongelada de protoplastos (200 pl). En el caso de S. coelicolor, el ADN tiene que provenir de la cepa de E. coli ET12567. Las celulas se siembran en 4 placas de medio R5 y se incuban a 30 °C entre 16-24 h hasta observar la formacion de micelio sustrato bien desarrollado. Entonces se anaden 1,5 ml de agua filtrada con el antibiotico de seleccion por cada placa. Se incuban a 30 °C hasta observar la formacion de colonias, que se pican para esporular en el medio correspondiente para cada especie (medio Bennet para S. albus y SFM para S. coelicolor). Una vez esporuladas, se recogen las esporas con bisturl y se almacenan en glicerol 50% a -20 °C.
1.5 REACTIVOS PARA MANIPULACION DE ADN
Las soluciones empleadas para la obtencion de ADN plasmldico en las bacterias senaladas anteriormente se obtuvieron de casas comerciales (VWR, ThermoFisherScientific) y se siguio el protocolo descrito por el fabricante para la obtencion del mismo.
El protocolo seguido para extraer ADN genomico de Streptomyces esta basado en el metodo de salting out descrito en Practical Streptomyces Genetics (Kieser y Bibb, 2000).
Para la extraccion de ADN plasmldico de Streptomyces se utilizo el sistema de PrepMan® Ultra de Life Technologies siguiendo el protocolo de la casa comercial.
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1.6 MANIPULACION IN VITRO DEL ADN
Las enzimas utilizadas para realizar las digestiones de ADN fueron de Takara y EURx. Los tampones de digestion fueron de Roche y se utilizaron siguiendo los protocolos recomendados por las casas comerciales. La RNAsa fue de Roche y se preparo a una concentration de 5 mg/ml, que se almacena a -20 °C. Para preparar la RNAsa se utilizaron 50 mg de RNAsa, 9,9 ml de agua MilliQ y 100 pl de CH3COONa 3M pH=6, que se hirvieron durante 10 min y se alicuotaron a -20 °C.
Para las digestiones de comprobacion de minipreparaciones de ADN plasmldico o genomico se incubaron 7 pl de ADN, 1 pl de tampon, 1 pl de RNAsa y 1 pl de enzima/s a 37 °C (excepto Smal que se incubo a 30 °C) durante 1h. Las digestiones para la obtencion de bandas o plasmidos para realizar ligaciones se llevaron a cabo sobre un volumen final de 100 pl.
Para defosforilar extremos digeridos de ADN plasmldico se utilizo la fosfatasa alcalina (5 U/pl) de EURx con su correspondiente tampon. Se utilizaron 50 pl de ADN ya digerido y purificado, 6 pl de tampon y 4 pl de fosfatasa. Esta mezcla se incubo a 37 °C durante 7 min y se purifico (ver abajo).
1.7 ELECTROFORESIS DE ADN.
Los fragmentos de ADN obtenidos tras las digestiones o amplification por PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa en TBE 1x (10 mV/cm).
1.8 PURIFICACION DE ADN
Para purificar los fragmentos de ADN obtenidos a partir de geles de agarosa se utilizo el kit comercial "GeneJET Gel Extraction Kit” de Thermo Scientific, siguiendo el protocolo recomendado.
Para purificar el ADN obtenido tras amplificacion por PCR, digestion o tras una defosforilacion se uso el kit comercial "GeneJET PCR Purification Kit” de Thermo Scientific siguiendo el protocolo recomendado.
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Para la purification de ADN para ser usado en secuenciacion se uso el kit comercial "GeneJet Plasmid Miniprep Kit” de Thermo Scientific siguiendo el protocolo recomendado.
1.9 LIGACION DE BANDAS DE ADN
Para la realizar las ligaciones se evaluo previamente la cantidad de vector y banda mediante una electroforesis. La ligation se realizo sobre un volumen final de 10 pl. Se anadio 1 pl de ligasa, 1 pl de tampon ligasa y una proportion 3:1 de banda-vector. La ligasa utilizada fue la "T4 DNA ligase” de Fermentas. Para ligaciones con extremos cohesivos se uso la ligasa de 1U/pl y para romos la de 5U/pl y su correspondiente tampon. Las ligaciones se incubaron durante 1h a temperatura ambiente, o un mlnimo de 4h para las ligaciones de extremos romos.
1.10 SECUENCIACION DE ADN
Las muestras de ADN se secuenciaron en la Unidad de Secuenciacion de los Servicios Cientlfico-Tecnologicos (SCTs) de la Universidad de Oviedo, utilizando el equipo de analisis genetico ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems). Este equipo esta basado en el marcaje por fluorescencia de las moleculas de ADN y su posterior separation mediante electroforesis capilar.
1.11 anAlisis de secuencias de nucleotidos y aminoAcidos
Las secuencias obtenidas tras el analisis de secuenciacion se leyeron utilizando el programa BioEdit Sequence Alignment Editor y se utilizaron las herramientas web de comparacion de secuencias ClustalW del Instituto Bioinformatico Europeo EMBL-EBI y BLASTN del NCBI. Tambien se uso la herramienta web NEBcutter de New England Biolabs para analizar los sitios de corte.
Para el estudio de secuencias de aminoacidos se utilizo la herramienta BLASTP del NCBI.
El programa Clone Manager Basic 9 fue utilizado para la planificacion de estrategias de clonacion y diseno de nuevos plasmidos.
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1.12 CUANTIFICACION DE ESPORAS.
Para cuantificar las esporas se crecieron las cepas productoras en 10 placas de su medio correspondiente de esporulacion (SFM para S. coelicolor y Bennet para S. albus) hasta observar esporulacion. Las esporas se recogieron con bisturi raspando la superficie de la placa, utilizando por cada placa 5 ml de una solucion de glicerol 25% + 0,001% de triton X-100. Estas soluciones con las esporas recogidas se pasaron a tubos Falcon de 50 ml, que se agitaron con vortex durante 5 min, antes de filtrar las soluciones de esporas (y restos de micelio) a traves de jeringas con algodon esterilizadas. Las soluciones filtradas se centrifugaron 10 min a 8000 rpm y se lavaron los pellets dos veces con H20 MilliQ. El pellet de esporas final se resuspendio en H20 MilliQ en un volumen final entre 0,5 y 2 ml en funcion del tamano del pellet. Estas soluciones se almacenaron a 4 °C para su posterior uso.
Para realizar el contaje de esporas (en realidad UFCs) se hicieron diluciones seriadas partiendo de las esporas almacenadas en H20 MilliQ, que se sembraron por duplicado en placas de TSA. Las placas se incubaron durante 2 dias a 30 °C y se contaron las colonias.
1.13 EXTRACCION DE COMPUESTOS DESDE CEPAS RECOMBINANTES DE Streptomyces.
Para la production y extraction de compuestos se sembraron 107 esporas/ml en R5A solido y liquido, y se dejaron crecer durante 5 dias a 30 °C.
La extraccion se realizo anadiendo 1 volumen de una mezcla de acetato de etilo con 0,1% de acido formico, e incubando todo a temperatura ambiente y en agitation durante 1 h. Posteriormente, esta mezcla de cultivo y solvente se centrifugo a 8000 rpm durante 5 min. El acetato de etilo se paso a tubos eppendorf y se evaporo en speed-vac. El extracto seco se almaceno a -20 °C hasta su uso.
1.14 CROMATOGRAFIA hplc y hplc-ms.
Para el analisis de los compuestos extraidos de las cepas recombinantes se realizaron analisis por HPLC utilizando el equipo de Agilent Technologies, 1260 Infinity. La columna utilizada fue una columna de fase reversa de Teknokroma de 5p,m
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y 25 x 0,46 mm. Las fases moviles utilizadas fueron: agua/acido acetico (98:2), agua/acetonitrilo/acido acetico (73:25:2) y metanol. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: gradiente de flujo de 1ml/min 100-20% de agua/acetico y 0-80% de agua/acetonitrilo/acetico durante 55 min; flujo de 1,2 ml/min y 20-10% de agua/acetico y 80-90% de agua/acetonitrilo/acetico durante 2 min; mismo flujo y 10% de agua/acetico y 90% de agua/acetonitrilo/acetico durante 13 min ; mismo flujo y 10-5% de agua/acetico y 90-95% de agua/acetonitrilo/acetico durante 10 min; flujo de 1 ml/min y 5-0% de agua/acetico, 95-0% de agua/acetonitrilo/acetico 0-100% de metanol durante 20 min; mismo flujo y 0-100% de agua/acetico y 100-0% de metanol durante 5 min y finalmente mismo flujo y 100% de agua/acetico durante 15 min. La temperatura de la columna fue de 20 °C. Estas condiciones fueron las mismas para todos los compuestos sintetizados en este trabajo.
Para el analisis por cromatografla de masas se utilizo el equipo de Agilent Technologies 1290 Infinity, 6460 Triple Quadrupole LC/MS con fuente de ionizacion por electrospray. La columna utilizada fue una Zorbax Eclipse Plus C18 de Agilent, de 1,8 p,m y 50 x 2,1 mm. La temperatura de la columna fue de 30 °C. Los solventes utilizados fueron agua con 0,1% de acido formico y acetonitrilo con 0,1% de acido formico. Las condiciones fueron 0-10% (porcentaje de acetonitrilo con 0,1% de acido formico) durante 1 min, 10-35% durante 3 min, 35% durante 1 min, 35-80% durante 3 min, 80% durante 2 min y 80-10% durante 1 min. El flujo se mantuvo constante a 0,3 ml/min. Estas condiciones fueron las mismas para todos los compuestos.
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Shimada, Y., et al. (2012). Identification of a novel dihydrodaidzein racemase essential for biosynthesis of equol from daidzein in Lactococcus sp. strain 20-92. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4902-4907.
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Claims (135)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. Acido nucleico recombinante que comprende:
    a. una subunidad (a) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2, y
    b. una subunidad (b) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 5,
  2. 2. Acido nucleico recombinante segun la reivindicacion 1 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 y la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6.
  3. 3. Acido nucleico recombinante segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que ademas comprende una subunidad (c) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 7, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 8.
  4. 4. Acido nucleico recombinante segun la reivindicacion 3 donde la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9.
  5. 5. Acido nucleico recombinante segun la reivindicacion 4 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 y la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9.
  6. 6. Acido nucleico segun la reivindicacion 5 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 10.
  7. 7. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que ademas comprende una subunidad (d) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 11,
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    preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 12.
  8. 8. Acido nucleico segun la reivindicacion 7 donde la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13.
  9. 9. Acido nucleico segun la reivindicacion 8 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 y donde la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13.
  10. 10. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que ademas comprende una subunidad (e) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 14, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 15.
  11. 11. Acido nucleico segun la reivindicacion 10 donde la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16.
  12. 12. Acido nucleico segun la reivindicacion 11 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 y la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16.
  13. 13. Acido nucleico segun la reivindicacion 12 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 17.
  14. 14. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que ademas comprende una subunidad (f) que comprende una secuencia que codifica para la protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 18, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 19.
  15. 15. Acido nucleico segun la reivindicacion 14 donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20.
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  16. 16. Acido nucleico segun la reivindicacion 15 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 y donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20.
  17. 17. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que ademas comprende una subunidad (g) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 21, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 22.
  18. 18. Acido nucleico segun la reivindicacion 17 donde la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23.
  19. 19. Acido nucleico segun la reivindicacion 18 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 y donde la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23.
  20. 20. Acido nucleico segun la reivindicacion 19 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 24.
  21. 21. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que ademas comprende una subunidad (h) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 25, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 26.
  22. 22. Acido nucleico segun la reivindicacion 21 donde la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27.
  23. 23. Acido nucleico segun la reivindicacion 22 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 y donde la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27.
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  24. 24. Acido nucleico segun la reivindicacion 23 donde el acido nucleico comprende en la secuencia SEQ ID NO: 28.
  25. 25. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que ademas comprende una subunidad (i) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 29 , preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 30.
  26. 26. Acido nucleico segun la reivindicacion 25 donde la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31.
  27. 27. Acido nucleico segun la reivindicacion 26 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y donde la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31.
  28. 28. Acido nucleico segun la reivindicacion 27 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 32.
  29. 29. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 que ademas comprende una subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34.
  30. 30. Acido nucleico segun la reivindicacion 29 donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
  31. 31. Acido nucleico segun la reivindicacion 30 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
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  32. 32. Acido nucleico segun la revindication 31 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 36.
  33. 33. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 que ademas comprende una subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38.
  34. 34. Acido nucleico segun la revindication 33 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  35. 35. Acido nucleico segun la revindication 34 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 y donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  36. 36. Acido nucleico segun la revindication 35 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 40.
  37. 37. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 que ademas comprende una subunidad (l) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42 y una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44.
  38. 38. Acido nucleico segun la revindication 37 donde la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46.
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  39. 39. Acido nucleico segun la reivindicacion 38 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y donde la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46.
  40. 40. Acido nucleico segun la reivindicacion 39 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 47.
  41. 41. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40 que ademas comprende una subunidad (m) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 50, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 51.
  42. 42. Acido nucleico segun la reivindicacion 41 donde la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52.
  43. 43. Acido nucleico segun la reivindicacion 42 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 y donde la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52.
  44. 44. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43 que ademas comprende una subunidad (n) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 53 , preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 54.
  45. 45. Acido nucleico segun la reivindicacion 44 donde la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55.
  46. 46. Acido nucleico segun la reivindicacion 45 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6,
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    la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46, la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 y la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55.
  47. 47. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 que ademas comprende una subunidad (o) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 56, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 57;y una subunidad (s) que comprende una secuencia que codifica una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 59, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 65% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 60.
  48. 48. Acido nucleico segun la reivindicacion 47 donde la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61.
  49. 49. Acido nucleico segun la reivindicacion 48 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46, la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52, la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55, la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61.
  50. 50. Acido nucleico segun la reivindicacion 49 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 62.
  51. 51. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que ademas comprende la subunidad (l) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42; y una secuencia que codifica para una protelna con
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    al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44.
  52. 52. Acido nucleico segun la reivindicacion 51 donde la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46.
  53. 53. Acido nucleico segun la reivindicacion 52 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (l) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46.
  54. 54. Acido nucleico segun la reivindicacion 53 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 63.
  55. 55. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que ademas comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 .
  56. 56. Acido nucleico segun la reivindicacion 55 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  57. 57. Acido nucleico segun la reivindicacion 56 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  58. 58. Acido nucleico segun la reivindicacion 57 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 64.
  59. 59. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que ademas comprende una subunidad (p) que comprende una secuencia que codifica para
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    una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 65, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 66.
  60. 60. Acido nucleico segun la reivindicacion 59 donde la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67.
  61. 61. Acido nucleico segun la reivindicacion 60 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67.
  62. 62. Acido nucleico segun la reivindicacion 61 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 68.
  63. 63. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 59 a 62 que ademas comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38.
  64. 64. Acido nucleico segun la reivindicacion 63 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  65. 65. Acido nucleico segun la reivindicacion 63 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  66. 66. Acido nucleico segun la reivindicacion 65 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 69.
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  67. 67. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que ademas comprende la subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34.
  68. 68. Acido nucleico segun la reivindicacion 67 donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
  69. 69. Acido nucleico segun la reivindicacion 68 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
  70. 70. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que ademas comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71.
  71. 71. Acido nucleico segun la reivindicacion 70 donde la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72.
  72. 72. Acido nucleico segun la reivindicacion 71 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72.
  73. 73. Acido nucleico segun la reivindicacion 72 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 73.
  74. 74. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 70 a 73 que ademas comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74,
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75.
  75. 75. Acido nucleico segun la reivindicacion 74 donde la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
  76. 76. Acido nucleico segun la reivindicacion 75 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
  77. 77. Acido nucleico segun la reivindicacion 76 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 77.
  78. 78. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que ademas comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38.
  79. 79. Acido nucleico segun la reivindicacion 78 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  80. 80. Acido nucleico segun la reivindicacion 79 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
  81. 81. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 78 a 80 que ademas comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71.
    5
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  82. 82. Acido nucleico segun la reivindicacion 78 donde la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72).
  83. 83. Acido nucleico segun la reivindicacion 79 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72.
  84. 84. Acido nucleico segun la reivindicacion 83 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 78.
  85. 85. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que ademas comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91.
  86. 86. Acido nucleico segun la reivindicacion 85 donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
  87. 87. Acido nucleico segun la reivindicacion 86 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
  88. 88. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 85 a 87 que ademas comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94.
    5
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  89. 89. Acido nucleico segun la reivindicacion 88 donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
  90. 90. Acido nucleico segun la reivindicacion 89 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
  91. 91. Acido nucleico segun la reivindicacion 90 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 96.
  92. 92. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que ademas comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75.
  93. 93. Acido nucleico segun la reivindicacion 92 donde la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
  94. 94. Acido nucleico segun la reivindicacion 93 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
  95. 95. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 92 a 94 que ademas comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91.
  96. 96. Acido nucleico segun la reivindicacion 95 donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
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  97. 97. Acido nucleico segun la reivindicacion 93 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
  98. 98. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 95 a 97 que ademas comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94.
  99. 99. Acido nucleico segun la reivindicacion 98 donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
  100. 100. Acido nucleico segun la reivindicacion 99 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
  101. 101. Acido nucleico segun la reivindicacion 100 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 97.
  102. 102. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 78 a 80 que ademas comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91.
  103. 103. Acido nucleico segun la reivindicacion 102 donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
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  104. 104. Acido nucleico segun la reivindicacion 103 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
  105. 105. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104 que ademas comprende la subunidad (v) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 98, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 99.
  106. 106. Acido nucleico segun la reivindicacion 105 donde la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100.
  107. 107. Acido nucleico segun la reivindicacion 106 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100.
  108. 108. Acido nucleico segun la reivindicacion 107 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 101.
  109. 109. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104 que ademas comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94.
  110. 110. Acido nucleico segun la reivindicacion 109 donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
    5
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  111. 111. Acido nucleico segun la reivindicacion 110 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
  112. 112. Acido nucleico segun la reivindicacion 111 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 102.
  113. 113. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 109 a 112 que ademas comprende la subunidad (w) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 103, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 104.
  114. 114. Acido nucleico segun la reivindicacion 113 donde la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105.
  115. 115. Acido nucleico segun la reivindicacion 110 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92, la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 y la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105.
  116. 116. Acido nucleico segun la reivindicacion 115 donde el acido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 106.
  117. 117. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 116 que ademas comprende al menos un sitio de union a ribosomas (rbs) unido de forma operativa.
    5
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    30
    35
  118. 118. Acido nucleico segun la reivindicacion 117 donde el sitio de union a ribosomas esta unido a la posicion 5’ de cada subunidad, preferiblemente entre el sitio de union a ribosomas y la subunidad puede haber o no un polinucleotido espaciador.
  119. 119. Acido nucleico recombinante segun las reivindicaciones 117 o 118 donde el sitio de union a ribosomas se selecciona de la lista que consiste en: rbs se Streptomyces (SEQ ID NO: 79), rbs LMF (SEQ ID NO: 80), rbs consenso para Streptomyces (SEQ ID NO: 81), rbs de genes operon gly, rbs mit, rbs tipA, preferiblemente consiste en la secuencia SEQ ID NO: 79.
  120. 120. Acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 119 que ademas comprende al menos un promotor constitutivo o inducible unido de forma operativa.
  121. 121. Acido nucleico segun la reivindicacion 120 donde el promotor constitutivo o inducible esta unido de forma operativa delante de cada subunidad.
  122. 122. Acido nucleico segun la reivindicacion 121 donde el promotor se selecciona de la lista que consiste en: promotor del gen ermE (SEQ ID NO: 82), rp1M (SEQ ID NO: 83), tipA (SEQ ID NO: 84), tsr (SEQ ID NO: 85), snpA (SEQ ID NO: 86), gy1ABx (SEQ ID NO: 87), mcrB (SEQ ID NO: 88), aac(2)IV (SEQ ID NO: 89), preferiblemente es el promotor del gen ermE (SEQ ID NO: 82).
  123. 123. Cassette de expresion que comprende el acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122.
  124. 124. Vector que comprende el acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122 o el cassette de expresion segun la reivindicacion 123.
  125. 125. Vector segun la reivindicacion 124 donde el vector es replicativo o integrativo.
  126. 126. Vector segun cualquiera de las reivindicaciones 124 o 125 donde dicho vector se selecciona de la lista que consiste en: plasmido, cosmido, bacmido, vector viral y cromosoma artificial.
    5
    10
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    20
    25
    30
    35
  127. 127. Protelna de fusion que se genera a partir de la traduccion del acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122.
  128. 128. Celula que comprende el acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresion segun la reivindicacion 123, el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 124 a 126 y/o la protelna de fusion segun la reivindicacion 127.
  129. 129. Celula segun la reivindicacion 128 donde dicha celula es una bacteria, una arquea, una celula animal, una celula vegetal, una levadura o un hongo.
  130. 130. Celula segun la reivindicacion 129 donde dicha celula es del genero que se selecciona de la lista que consiste en Streptomyces, Saccharopolyspora, Micromonospora, Bifidobacterium, Frankia, Streptoverticillium, Kitasatospora, Propionibacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium, Escherichia, Lactobacillus, Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Bacillus.
  131. 131. Celula segun la reivindicacion 130 donde dicha celula es Streptomyces coelicolor o S. albus, S. venezuelae, S. avermitilis, S. lividans, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. clavuligerus, S. griseus, S. kanamyceticus, S. noursei, S. scabies, S. violaceoruber, Saccharopolyspora erythraea.
  132. 132. Uso del acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresion segun la reivindicacion 123, el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 124 a 126, la protelna de fusion segun la reivindicacion 127 y/o la celula segun cualquiera de las reivindicaciones 128-131 para la slntesis de polifenoles.
  133. 133. Metodo de production de polifenoles que comprende la utilization del acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresion segun la reivindicacion 123, el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 124 a 126 y/o la protelna de fusion segun la reivindicacion 127 y/o de la celula segun las reivindicaciones 128 a 131.
  134. 134. Kit que comprende del acido nucleico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresion segun la reivindicacion 123, el vector segun
    cualquiera de las reivindicaciones 124 a 125, la protelna de fusion segun la reivindicacion 127 y/o de la celula segun las reivindicaciones 128 a 131.
  135. 135. Uso del kit segun la reivindicacion 134 para generar polifenoles. 5
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