WO2016185057A2 - Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles - Google Patents

Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles Download PDF

Info

Publication number
WO2016185057A2
WO2016185057A2 PCT/ES2016/000062 ES2016000062W WO2016185057A2 WO 2016185057 A2 WO2016185057 A2 WO 2016185057A2 ES 2016000062 W ES2016000062 W ES 2016000062W WO 2016185057 A2 WO2016185057 A2 WO 2016185057A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence seq
subunit
nucleic acid
sequence
seq
Prior art date
Application number
PCT/ES2016/000062
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2016185057A3 (es
Inventor
Felipe LOMBÓ BRUGOS
Claudio J. VILLAR GRANJA
Laura MARlN FERNÁNDEZ
Javier FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ
Ignacio GUTIÉRREZ DEL RIO MENÉNDEZ
Original Assignee
Universidad De Oviedo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Oviedo filed Critical Universidad De Oviedo
Publication of WO2016185057A2 publication Critical patent/WO2016185057A2/es
Publication of WO2016185057A3 publication Critical patent/WO2016185057A3/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant nucleic acid comprising a subunit comprising a sequence encoding a protein with at least 70% with the sequence SEQ ID NO: 1 and a subunit comprising a sequence encoding a protein with at least 70% with the sequence SEQ ID NO: 4 for the generation of polyphenols. Therefore, the present invention can be framed in the medical field.
  • Polyphenols constitute one of the most numerous and widely distributed groups in the plant kingdom. They are secondary metabolites of plants, essential for their morphology and physiology. They participate in the pigmentation of flowers and other plant organs, and they are also involved in growth and reproduction (they attract pollinating agents ⁇ and protect plants against microbial infections and ultraviolet radiation (Harbome and Williams, 2000). characterized by having at least one aromatic ring with one or more attached hydroxyl groups and two of their main families are stilbenes and fiavonoids (Manach et ai, 2004).
  • Flavonoids are further subdivided into several subgroups depending on the degree of substitution: flavanones, flavones, isoflavones, flavanols, flavan-3-oles and anthocyanidins Flavonoids constitute the largest group of polyphenols in the diet, with more than 4,000 molecules (Kumar and Pandey, 2013) See Figure 1 ( Manach et al., 2004).
  • Phenylalanine ammonium lyase catalyzes the transformation of L-phenylalanine into cinnamic acid, which is hydroxylated by 4-cinnamate hydroxylase (C4H) to generate p-cumaric acid.
  • P-cumaric acid (or 4-hydroxy-cumaric acid) is the substrate of p-cumaroyl-CoA ligase (4CL), responsible for the production of p-cumaroyl-CoA (or 4-hydroxj-cumaroil-CoA) (Vogt , 2010).
  • Stilbenes originate thanks to the action of stilbene synthase (STS).
  • STS stilbene synthase
  • flavonoids begin their synthesis with the formation of two chalconas, that of naringenin and that of liquiritigenin.
  • This enzyme is also able to use naringenin as a substrate to form another isoflavone, genistein (Winkel-Shirley, 2001).
  • Other subfamilies of flavonoids derive from naringenin due to the activity of various enzymes: Flavona synthase (FNS): responsible for the formation of flavones, such as apigenin.
  • FNS Flavona synthase
  • Flavanone-3-hydroxylase originates dihydroflavonoles such as dihydrokampferol (aromadendrine). This compound is a substrate for other enzymes responsible for the formation of dihydroflavonoles such as dihydroquercetin and dihydromyricetin. These enzymes are flavonoid-3'-hydroxylase (F3 H) and flavonoid-3 ', 5-hydroxylase (F3'5'H) respectively.
  • Flavonol synthase (FLS): generates flavonols such as kaempferol and quercetin. Its substrates are dihydroflavonoles.
  • E. coli has been used for the production of some flavonoids in low concentrations, thanks to the use of the enzyme 4-cumaroil-CoA-ligase (4CL) of the bacterium Streptomyces coelicolor, which allows to form 4-cumaroil-CoA from 4-hydroxy-cumaric acid ⁇ a derivative of L-tyrosine) (Kaneko et al., 2003).
  • 4-cumaroil-CoA-ligase (4CL) of the bacterium Streptomyces coelicolor which allows to form 4-cumaroil-CoA from 4-hydroxy-cumaric acid ⁇ a derivative of L-tyrosine) (Kaneko et al., 2003).
  • 4-cumaroil-CoA-ligase (4CL) of the bacterium Streptomyces coelicolor which allows to form 4-cumaroil-CoA from 4-hydroxy-cumaric acid ⁇ a derivative of L-tyrosine) (Kaneko et al., 2003).
  • coli from phenylalanine and tyrosine respectively, expressing the gene encoding the enzyme phenyl-ammonium-lyase (PAL) of the Yeast Rhodotorula rubra, the 4CL of S. coelicolor and the CHS of the Glychyrrhiza echinata plant (Hwang et al. 2003).
  • PAL phenyl-ammonium-lyase
  • 4CL the 4CL of S. coelicolor
  • CHS Glychyrrhiza echinata plant
  • the flavonoles galangina and kaempferol and flavonas chrysin and apigenin were synthesized from phenylalanine and tyrosine respectively, thanks to the incorporation of new plasmids carrying the genes encoding the FNS1, F3H and FLS (Miyahisa et al., 2006).
  • the culture medium of different precursors coumaric acid. Caffeic acid, naringenin and eriodictyol
  • F3H enzyme and flavonoid 3 ', 5' - hydroxylase (F3'5'H) to produce in E.
  • flavonoids were synthesized in S. cerevisiae yeast, using the PAL, 4CL and CHS genes to synthesize naringenin and pinocembrin from L-phenylalanine (Jiang et al. 2005).
  • Added cumaric acid was also used in the culture medium, plus the genes encoding the enzymes C4H, 4CL, CHS, CHI to synthesize naringenin in this yeast (Yan et al. 2005).
  • isoflavone genistein was obtained in yeast and also kaempferol and quercetin (Kim et al., 2005) (Trantas ef al., 2009).
  • the present invention demonstrates the usefulness of several gene constructs in the synthesis of polyphenols, specifically stilbenes, chaicones, flavanones, isoflavones, flavones, flavonols. dihydroflavonoles, dihydroflavanoles, anthocyanidins and their derivatives.
  • polyphenols have been synthesized in Streptomyces, as a model of synthesis in actinomycetes, so that in order to correctly express the genes in the present invention, they were synthesized optimizing the codons for expression in Streptomyces.
  • the present invention relates to a recombinant nucleic acid comprising:
  • 4 (4CL protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 5 (4CL gene).
  • nucleic acid of the invention or “recombinant nucleic acid of the invention”.
  • subunit is understood as a nucleotide sequence.
  • Said subunit can be a deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA).
  • the recombinant nucleic acid is also called 'gene construction
  • “Recombinant” is understood to be that non-natural nucleic acid that has been artificially produced in vitro or in vivo by techniques known to those skilled in the art and which does not occur in nature.
  • identity refers to the proportion of identical amino acids between two peptides that are compared or the proportion of identical nucleotides between two nucleic acids that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the BLASTP or BLASTN, ClustalW and FASTA program. We can consider that peptides or nucleic acids with percentages of identity of at least 70% will maintain the same properties of said sequence.
  • 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 are included.
  • 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 are included.
  • nucleotide sequence In the present invention the terms "nucleotide sequence”, “polynucleotide”, “nucleotide sequence”, “nucleic acid” and “oligonucleotide” are used interchangeably.
  • the nucleic acid of the present invention may have conservative substitutions, known to those skilled in the art. Conservative substitutions in the polynucleotide lead to the same peptide being encoded.
  • nucleic acid includes genomic DNA or double or single stranded coding DNA, ribonucleic acid (RNA), any synthetic and genetically manipulated polynucleotide and both the coding chain and the antisense. This includes single and double stranded molecules, such as DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA hybrids.
  • the nucleotide sequence of the invention can be obtained artificially by conventional cloning and selection methods widely known in the state of the art.
  • the tyrosine-ammonium lyase (TAL, histidine ammonia-lyase) used in the present invention is from Rhodobacter capsulatus, accession number WP_013066811 (SEQ ID NO: 1 is the protein, SEQ ID NO: 2 is the nudeotide sequence and SEQ ID NO: 3 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • S. coelicolor 4CL is an enzyme capable of producing cumaroil-CoA from tyrosine (Kaneko et al., 2003).
  • the 4-cumaroyl ligase (4CL, 4-coumarate-CoA ligase) used in the present invention is from Streptomyces coelicolor, accession number NP_628552 (SEQ ID NO: 4 is the protein, SEQ ID NO: 5 is the nudeotide sequence and SEQ ID NO: 6 is the sequence optimized for Streptomyces)
  • a preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the recombinant nucleic acid where the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL) and the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 ( 4CL optimized).
  • the first aspect of the invention relates to the recombinant nucleic acid which further comprises a subunit (c) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 7 (protein STS), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO. 8 (STS gene).
  • the subunit (c) consists of the sequence SEQ ID NO: 9 (STS optimized).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 10 demonstrates that resveratrol is synthesized.
  • the present invention also relates to the pSTS6W plasmid comprising said sequence.
  • Stilbene synthase (STS) is the only one that has the ability to synthesize stilbenes and in nature it is synthesized mainly in various species of the chosen family.
  • the STS (slilbene synthase) used in the present invention is from Vitis vinifera, accession number AAB32488 (SEQ ID NO: 7 is the protein, SEQ ID NO: 8 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 9 is the optimized sequence for Streptomyces).
  • nucleic acid which further comprises a subunit (d) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 1 (protein CHS), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 12 (CHS gene).
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS).
  • the chalcona synthase (CHS, chalcone synthase 5) used in the present invention is from Glycine max, accession number L07647.1 (SEQ ID NO: 11 is the protein, SEQ ID NO: 12 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO : 13 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • a more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the nucleic acid which further comprises a subunit (e) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 14 (protein ALKR), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 15 (ALKR gene).
  • the nucleic acid where the subunit (e) consists of the sequence SEQ ID NO: 16 (optimized ALKR).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of the sequence SEQ ID NO: 17.
  • sequence SEQ ID NO: 17 demonstrates that floretin is synthesized.
  • the present invention also relates to plasmid pJFF-PHLO comprising said sequence.
  • alkenal reductase used in the present invention is from Malus domestica, accession number XP_008367739 (SEQ ID NO: 14 is the protein, SEQ ID NO: 15 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 16 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid which further comprises a subunit (f) comprising a sequence encoding the protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 18 (protein PRTase), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 19 (PRTase gene). More preferably to the nucleic acid where the subunit (f) consists of the sequence SEQ ID NO: 20 (optimized PRTase).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (f) consists of the sequence SEQ ID NO: 20 (optimized PRTase).
  • the aromatic prenyltransferase (PRTase or PRTase, Xanthohumol prenyl-transferase) used in the present invention is from Humulus lupulus, accession number XP_008367739 (SEQ ID NO: 18 is ia protein, SEQ ID NO: 19 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 20 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • An even more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the nucleic acid which further comprises a subunit (g) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 21 (OMTase protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 22 (OMTase gene).
  • the subunit (g) consists of the sequence SEQ ID NO: 23 (OMTase optimized).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (f) consists of the sequence SEQ ID NO: 20 (optimized PRTase)
  • the subunit (g) consists of the sequence SEQ ID NO: 23 (optimized OMTase).
  • a particular embodiment relates to the nucleic acid where the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 24 (inserted into plasmid pJFF-XAN). With the sequence SEQ ID NO: 24, xanthohumol can be synthesized.
  • the present invention also relates to plasmid pJFF-XAN comprising said sequence.
  • O-methyltransferase 1 used in the present invention is from Humulus lupulus, accession number FM164641.1 (SEQ ID NO: 21 is the protein, SEQ ID NO: 22 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 23 is the sequence optimized for Stmptomyces).
  • nucleic acid which further comprises a subunit (h) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 25 (protein CHI), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 26 (CHI gene).
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists in the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI).
  • a more particular embodiment relates to the nucleic acid where the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 28.
  • the present invention also relates to plasmid pNGM-NAR comprising said sequence.
  • chalcone isomerase used in the present invention is from Glycine max, accession number AY59S413.1 (SEQ ID NO: 25 is the protein, SEQ ID NO: 26 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 27 is the sequence optimized for Streptomyces)
  • An even more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the nucleic acid which further comprises a subunit (i) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 29 ( CHR protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 30 (CHR gene).
  • the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (optimized CHR).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO : 31 (optimized CHR).
  • a more particular embodiment refers to the nucleic acid comprising, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 32.
  • SEQ ID NO. 32 you can synthesize liquiritigenin.
  • the present invention also relates to plasmid pLMF-LQ comprising said sequence.
  • the chalcona reductase (CHR, NAD (P) H-dependent 6-deoxychalcone synthase) used in the present invention is from Glycine max, accession number X55730.1 (SEQ ID NO: 29 is the protein, SEQ ID NO: 30 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 31 is the sequence optimized for Streptomycas)
  • nucleic acid which further comprises a subunit (j) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 33 ⁇ N3DOX protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 34 (N3DOX gene).
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 ⁇ N3DOX optimized).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (optimized CHR)
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX)
  • An even more particular embodiment refers to the nucleic acid comprising, preferably consisting of, the sequence SEQ ID NO: 36 Using the sequence SEQ ID NO: 36 it is shown that garbanzol is synthesized.
  • the present invention also relates to plasmid pGR comprising said sequence.
  • the naringenin 3-dioxygenase (N3DOX, Flavanone 3-hydroxylase, Flavanone 3- dioxygenase, Naringenin 3-dioxygenase) used in the present invention is from Petroselinum cr ⁇ spum, accession number AY230248 (SEQ ID NO: 33 is the protein, SEQ ID NO : 34 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 35 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • nucleic acid which further comprises a subunit (k) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 37 (F3'H protein), preferably It comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 38 (F3'H gene).
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 ⁇ (optimized F3'H).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (TAL optimized), the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL), the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (Optimized CHS), the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI), the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (optimized CHR), the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX) and where the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (optimized F3'H).
  • a particular embodiment refers to the nucleic acid comprising, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 40.
  • the present invention also relates to plasmid pDF comprising said sequence.
  • the flavonoid 3 "-hydroxylase (F3 H, flavanoid 3-hydroxylase) used in the present invention is from Arabidopsis thaliana, accession number Q9SD85 (SEQ ID NO: 37 is the protein, SEQ ID NO: 38 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 39 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • nucleic acid which further comprises a subunit (I) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 41 (IFS protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 42 (IFS gene) and a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 43 (G reductase protein max), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 44 (reductase gene).
  • the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (optimized IFS + optimized reductase).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (Optimized CHR) and where the subunit (I) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (IFS + optimized reductase).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of. the sequence SEQ ID NO 47 (inserted into plasmid pLMFSSW). By using the sequence SEQ ID NO: 47, daidzein is generated.
  • the isoflavone synthase (IFS, isoflavone synthase 1) used in the present invention is from Glycine max, accession number AF195818 (SEQ ID NO. 41 is the protein, SEQ ID NO: 42 is the nucleotide sequence).
  • the NAPH P450 reductase (CPR) used in the present invention is from Glycine max, accession number AY170374.1 (SEQ ID NO 43 is the protein, SEQ ID NO: 44 is the nucleotide sequence)
  • the IFS-CPR chimera has the protein sequence SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 is the sequence optimized for Streptomyces.
  • the nucleic acid further comprises a subunit (m) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 50 (D2NR protein), preferably comprising a sequence with at minus 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 51 (DZNR gene).
  • the subunit (m) consists of the sequence SEQ ID NO: 52 (optimized DZNR).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (optimized CHR)
  • the subunit ( I) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (optimized IFS-reductase) and where the subunit (m) consists of the sequence SEQ ID NO: 52 (optimized DZNR).
  • the daidzein reductase (DZNR. Daidzein reducase) used in the present invention is from Lactococcus garvieae, accession number AB558141 (SEQ ID NO: 50 is the protein, SEQ ID NO: 51 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 52 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • nucleic acid further comprises a subunit (n) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 53 (DHDR protein), preferably it comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 54 (DHDR gene).
  • the subunit (n) consists of the sequence SEQ ID NO: 55 (optimized DHDR). More preferably the nucleic acid where the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL), the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL), the subunit (d) consists in the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS), the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI), the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (optimized CHR) and the subunit (I) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (optimized IFS-reductase), the subunit (m) consists of the sequence SEQ ID NO: 52 (optimized DZNR) and the subunit (n) consists of the sequence SEQ ID NO: 55 (optimized DHDR).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO:
  • the dihydrodaidzein reductase (DHDR) used in the present invention is from Lactococcus garvieae, accession number AB592970 (SEQ ID NO: 53 is protein, SEQ ID NO: 54 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 55 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid further comprises a subunit (or) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 56 (THDR protein), preferably comprising a sequence with at minus 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 57 (THDR gene), and a subunit (s) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 59 (prot RAC), preferably comprises a sequence with at least 65% identity with the sequence SEQ ID NO: 60 (RAC gene) .
  • THDR protein preferably comprising a sequence with at minus 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 57 (THDR gene)
  • a subunit (s) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 59 (prot RAC) preferably comprises a sequence with at least 65% identity with the sequence SEQ ID NO: 60 (RAC gene) .
  • the subunit (o) consists of the sequence SEQ ID NO: 58 (optimized THDR) and the subunit (s) consists of the sequence SEQ ID NO: 61 (optimized RAC). More preferably the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL), the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL), the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS), the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI), the subunit (i) consists of the sequence SEQ ID NO: 31 (optimized CHR) and the subunit ( I) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (optimized IFS-reductase), the subunit (m) consists of the sequence SEQ ID NO: 52 (optimized DZNR), the subunit (n) consists of the sequence SEQ ID NO: 55 (optimized
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 62.
  • the use of the sequence SEQ ID NO: 62 demonstrates that (S) -equol is generated.
  • the present invention also relates to plasmid pLMF56 comprising said sequence.
  • the tetrahydrodaidzein reductase (THDR, tetradrodaidzein reducase) used in the present invention is from Lactococcus garvieae, accession number AB592969 (SEQ ID NO: 56 is the protein.
  • SEQ ID NO: 57 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 58 is the sequence optimized for Streptomyces)
  • the racemase (RAC, dihydrodaidzein racemase) used in the present invention is from Lactococcus garvieae, accession number AB592969 (SEQ ID NO: 59 is the protein, SEQ ID NO: 60 is the nudeotide sequence and SEQ ID NO: 61 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (I) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 41 (IFS protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 42 (IFS gene) and a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 43 (G. max reductase protein ), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 44 (reductase gene).
  • the subunit (I) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (optimized IFS + reductase).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (I) consists of the sequence SEQ ID NO: 46 (optimized IFS + reductase).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 63.
  • sequence SEQ ID NO: 63 it is shown that genistein is synthesized.
  • the present invention also relates to plasmid pNGM-GEN comprising said sequence
  • the nucleic acid further comprises the subunit (k) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 37 (protein F3 H), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 38 (F3'H gene).
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (optimized F3'H).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (optimized F3 ! H).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 64
  • the present invention also relates to plasmid pNGM-ERY comprising said sequence.
  • the nucleic acid further comprises a subunit (p) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 65 (FNS protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 66 (FNS gene).
  • the subunit (p) consists of the sequence SEQ ID NO: 67 (FNS optimized).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (p) consists of the sequence SEQ ID NO: 67 (optimized FNS).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 68.
  • Apigenin is generated by the use of the sequence SEQ ID NO: 68.
  • the present invention also relates to the plasmid pIMG-API comprising said sequence
  • the flavone synthase (FNS, flavone synlhase I) used in the present invention is from Petrosetinum crispum, accession number AY230247.1 (SEQ ID NO: 65 is the protein, SEQ ID NO: 66 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO : 67 is the sequence optimized for Stneptomyces).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (k) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 37 (F3'H protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 38 (F3H gene).
  • the subunit (k) consists of the SEO ID sequence NO: 39 (F3'H optimized).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 ⁇ CHS optimized)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (p) consists of the sequence SEQ ID NO: 67 (FNS optimized)
  • the subunit ( k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (F3 H optimized).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 69.
  • the present invention also relates to plasmid pLT comprising said sequence.
  • the nucleic acid further comprises the subunit (j) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 33 (N3DOX protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 34 (N3DOX gene).
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX). More preferably the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 ⁇ TAL optimized), the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO.
  • the subunit ⁇ d consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (q) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 70 (FLS1 protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 71 (FLS1 gene).
  • the subunit (q) consists of the sequence SEQ ID NO: 72 (optimized FLS1).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists in the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX)
  • the subunit (q) consists of the sequence SEQ ID NO: 72 (optimized FLS1).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 73
  • the present invention also relates to plasmid pKF comprising said sequence.
  • the flavonol synthase (FLS1, flavonol synthase, flavanone 3-hydroxylase) used in the present invention is from Arabidopsis thaliana, accession number Q96330 (SEQ ID NO: 70 is the protein, SEQ ID NO: 71 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 72 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (r) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 74 (protein F3'5'H), preferably it comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 75 (F3'5'H gene).
  • the subunit (r) consists of the sequence SEQ ID NO: 76 (optimized F3'5'H).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX)
  • the subunit ( q) consists of the sequence SEQ ID NO-72 (FLS1 optimized)
  • the subunit (r) consists of the sequence SEQ ID NO. 76 (F3'5'H optimized).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 77.
  • SEQ ID NO: 77 By using the sequence SEQ ID NO: 77 it is demonstrated that myricetin is generated.
  • the present invention also relates to plasmid pM! R comprising said sequence.
  • the flavonoid 3'-S'-hydroxylase (F3'5'H, flavonoid 3'-5'-hydroxylase) used in the present invention is Petunia x hybrida, accession number Z22544.1 (SEQ ID NO: 74 is protelna, SEQ ID NO: 75 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 76 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (k) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 37 (F3'H protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 38 (F3'H gene).
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (optimized F3'H).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX)
  • the subunit ( k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (optimized F3'H).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (q) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 70 (FLS1 protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 71 (FLS1 gene).
  • the subunit (q) consists of the sequence SEQ ID NO: 72 (optimized FLS1).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3 (optimized TAL)
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 (optimized 4CL)
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13 (optimized CHS)
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27 (optimized CHI)
  • the subunit ( ⁇ ) consists of the sequence SEQ ID NO: 35 (optimized N3DOX)
  • the subunit ( k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 (optimized F3'H)
  • the subunit (q) consists of the sequence SEQ ID NO: 72 (optimized FLS1).
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 78.
  • sequence SEQ ID NO. 78 it is shown that quercetin is generated.
  • the present invention also relates to plasmid pQR comprising the sequence SEQ ID NO: 78.
  • the nucleic acid further comprises the subunit (t) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 90 (DFR protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 91 (DFR gene).
  • the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92 (optimized DFR) More preferably the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3, the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6 , the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13, the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27, the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35) and the subunit ( t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92.
  • the dihydroflavonol reductase (DFR. Dihydrof ⁇ avonol 4-reductase) used in the present invention is from Punica granatum, accession number KF841618 (SEQ ID NO: 90 is the protein, SEQ ID NO: 91 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 92 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (u) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 93 (ANS protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 94 (ANS gene)
  • the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95 (ANS optimized). More preferably the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3, the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6, the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13, the subunit ( h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27.
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35, the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92 and the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of. the sequence SEQ ID NO: 96 (insert of the pPEL).
  • the present invention also relates to plasmid pPEL comprising the sequence SEQ ID NO: 96.
  • the anthocyanidin synthase (ANS, anthacyanidin synthase) used in the present invention is from Punica granatum, accession number KF841619 (SEQ ID NO: 93 is the protein, SEQ ⁇ NO. 94 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 95 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the nucleic acid further comprises the subunit (r) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 74 (protein F3'5'H), preferably it comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 75 (F3'5'H gene).
  • the subunit (r) consists of the sequence SEQ ID NO: 76 (optimized F3'5'H).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO 3
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13
  • the subunit (h ) consists of the sequence SEQ ID NO: 27
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35)
  • the subunit (r) consists of the sequence SEQ ID NO: 76.
  • it further comprises the subunit (t ) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 90 (DFR protein), preferably comprising a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO 91 (DFR gene).
  • the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92 (optimized DFR).
  • the present invention also relates to a nucleic acid where the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3, the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6, the subunit (d) consists in the sequence SEQ ID NO: 13, the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27, the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO 35), the subunit (r) it consists of the sequence SEQ ID NO: 76 and the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92
  • it further comprises the subunit (u) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% of Identity with the sequence SEQ ID NO: 93 (ANS protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 94 (ANS gene).
  • the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95 (optimized ANS).
  • the nucleic acid where the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3.
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6,
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13.
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27,
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35)
  • the subunit (r) consists of the sequence SEQ ID NO: 76
  • the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92 and where the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95.
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO : 97 (pDEL insert).
  • sequence SEQ ID NO: 97 demonstrates that delfinidine is generated.
  • the present invention also relates to plasmid pDEL comprising the sequence SEQ ID NO: 97.
  • the nucleic acid further comprises the subunit (t) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 90 (DFR protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 91 (DFR gene).
  • the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92 (optimized DFR). More preferably where the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3, the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6, the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13, the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27.
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35.
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39 and the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92.
  • it further comprises the subunit (v) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 98 (LAR protein), preferably it comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 9 ⁇ (LAR gene).
  • the subunit (v) consists of the sequence SEQ ID NO. 100 (LAR optimized).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13
  • the subunit ( h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39
  • the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92
  • the subunit (v) consists of the sequence SEQ ID NO: 100.
  • nucleic acid comprises, preferably consists of : the sequence SEQ ID NO: 101 (pCTC insert).
  • the present invention also relates to plasmid pCTC comprising the sequence SEQ ID NO: 101.
  • leucoanthocyanidin reductase used in the present invention is Fragaria x ananassa, accession number AAZ78662 (SEQ ID NOr 98 is the protein, SEQ ID NO: 99 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 100 is the sequence optimized for Streptomyces)
  • the nucleic acid further comprises the subunit (u) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 93 (ANS protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 94 (ANS gene).
  • the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95 (optimized ANS).
  • the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3
  • the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6
  • the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO: 13
  • the subunit ( h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO. 39
  • the subunit (t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92
  • the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of. the sequence SEQ ID NO: 102 (insert of the pCYN).
  • the present invention also relates to plasmid pCYN comprising the sequence SEQ ID NO: 102.
  • the nucleic acid comprises the subunit (w) comprising a sequence encoding a protein with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 103 (ANR protein), preferably comprises a sequence with at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 104 (ANR gene)
  • the subunit (w) consists of the sequence SEQ ID NO: 105 (optimized ANR). More preferably the subunit (a) consists of the sequence SEQ ID NO: 3, the subunit (b) consists of the sequence SEQ ID NO: 6, the subunit (d) consists of the sequence SEQ ID NO.
  • the subunit (h) consists of the sequence SEQ ID NO: 27
  • the subunit (j) consists of the sequence SEQ ID NO: 35
  • the subunit (k) consists of the sequence SEQ ID NO: 39
  • the subunit ( t) consists of the sequence SEQ ID NO: 92
  • the subunit (u) consists of the sequence SEQ ID NO: 95
  • the subunit (w) consists of the sequence SEQ ID NO: 105.
  • the nucleic acid comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 106 (pECTC insert).
  • pECTC insert By using the sequence SEQ ID NO: 106 it is demonstrated that epicatechin is generated.
  • the present invention also relates to the pECTC plasmid comprising the sequence SEQ ID NO: 106.
  • the anthocyanidin reductase (ANR. Anthocyanidin reducase) used in the present invention is Fragarai x ananassa, accession number ABD95362 (SEQ ID NO: 103 is the protein.
  • SEQ ID NO: 104 is the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 105 is the sequence optimized for Streptomyces).
  • the genes can have at least one ribosome binding site (rbs), preferably all of them contain the ribosome binding site
  • the nucleic acid further comprises at least one ribosome binding site (rbs) operatively linked.
  • the rbs is attached to the 5 'position of each subunit, preferably between the ribosome binding site and the subunit there may or may not be a spacer polynucleotide.
  • the rbs is selected from the list consisting of: rbs are Streptomycos (SEQ ID NO: 79), rbs LMF (SEQ ID NO: 80), rbs consensus for Streptomyces (SEQ ID NO. 81). rbs of genes operon gly (aaaggag), rbs mil (aggagg), rbs tipA (agaagggag), preferably consists of the sequence SEQ ID NO: 79.
  • the nucleotide sequence of the invention in addition to the coding sequence, can carry other elements, such as, but not limited to, promoters, introns, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites, stabilizing sequences, cell detection sequences, recognition sequences for restriction enzymes, etc.
  • These polynucleotides can additionally also include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited, to increase the stability of the peptide generated from it or to allow a better purification thereof.
  • an even more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the nucleic acid which further comprises at least one constitutive or inducible promoter operatively linked.
  • the constitutive or inducible promoter is operatively linked in front of each subunit. More preferably the promoter is selected from the list consisting of: promoter of the e.rwE gene (SEQ ID NO: 82), rp1 M (SEQ ID NO: 83), tipA (SEQ ID NO: 84), tsr (SEQ ID NO: 85). snpA (SEQ ID NO: 86).
  • gylABx (SEQ ID NO: 87), mcrB (SEQ ID NO: 88), aac (2) IV (SEQ ID NO: 89), preferably is the promoter of the ermE gene (SEQ ID NO: 82).
  • promoter refers to a region of deoxyribonucleic acid, generally "upstream” or “upstream” of the transcription start point, which is capable of initiating transcription.
  • This term includes, for example, but without limitation, constitutive promoters, specific type promoters cell or tissue or inducible or repressive promoters.
  • Examples of prokaryotic promoters also include, for example, but not limited to, promoters of the genes trp, recA, tac, lacl, tet, gal, trc, or tac.
  • the term “constitutive promoter” refers to a genetic promoter that continuously expresses the gene it regulates.
  • inducible promoter refers to a genetic promoter that activates the expression of the nucleic acid of the invention to which it regulates in response to an external factor (or inducing agent), such as a chemical substance or an environmental condition, and that in this case it controls the transcription thereof (for example, isopropyl-beta-D-thiogalated pyranoside, nisin or by temperature).
  • an external factor or inducing agent
  • the inducible promoter in the present invention can also be any of the inducible promoters known to those skilled in the art, for example lacUVS, T7, P1, msA or phage 75 promoters.
  • operatively linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended manner.
  • a second aspect of the present invention relates to an expression cassette comprising the nucleic acid of the first aspect of the present invention.
  • the expression cassette of the invention hereinafter "the expression cassette of the invention”.
  • the expression cassette comprises the elements necessary for the expression of the nucleic acid of the invention, being operatively linked to transcription and / or translation control elements, such as, for example, start and end signals, cut-off sites. , or polyadenylation signal.
  • the nucleic acid sequences of the invention or the expression cassette of the present invention can be found as part of vectors that allow their multiplication or cloning as well as their expression.
  • Said vector may be, for example a cloning vector or an expression vector or a recombinant vector.
  • Cloning of the nucleotide sequence of the invention can be performed using a vector expression or recombinant, or a plasmid.
  • These vectors comprise the nucleotide sequence of the invention (or the expression cassette that comprises it) and may also comprise a series of amino acid coding sequences that are protease cleavage targets.
  • the advantage of this structure is that, once the fusion protein or peptide is produced, the expression system is lysed and purified by, for example, although without limitation, affinity chromatography, the carrier protein of the peptide of the invention can be cleaved by digestion with a protease and repurifying the peptide of the invention by the same chromatographic system.
  • vector refers to a nucleic acid molecule that is capable of transferring nucleic acid sequences contained therein to a cell.
  • vectors are linear DNA, plasmid DNA, modified viruses, adenoviruses / adeno-associated viruses, retroviral and viral vectors, etc .; all of them widely described in the literature and that can be used following standard molecular biology techniques or purchased from suppliers.
  • viral vectors for the introduction of genes into mammalian cells, there are vectors of poxvirus, herpes simplex, adenovirus. vectors associated with adenovirus, etc.
  • Vectors may be introduced by any method known to the person skilled in the art, for example, but not limited to, by transfection, transduction, transformation or infection of host cells, such as, but not limited to, plant, mammalian cells. , bacteria, archaea, yeasts, fungi or insect cells.
  • cloning vector refers to a DNA molecule in which another DNA fragment can be integrated, without losing the ability to replicate.
  • expression vectors are, but not limited, plasmids, cosmids, DNA phages or artificial yeast chromosomes.
  • expression vector refers to a cloning vector suitable for expressing a nucleic acid that has been cloned therein after being introduced into a cell, called a host cell. Said nucleic acid is generally operatively linked to control sequences.
  • expression refers to the process by which a polypeptide is synthesized from a polynucleotide. It includes transcription of the polynucleotide into a messenger RNA (mRNA) and the translation of said mRNA into a protein or a polypeptide. Expression can take place in a host cell.
  • mRNA messenger RNA
  • recombinant vector refers to a suitable vector for expressing a nucleic acid that has been cloned therein, so that expression of the polyphenol biosynthesis peptide is directly performed. in the target tissue or cell.
  • said vector is a virus or a plasmid. and it is produced by the union of different nucleic acid fragments from different sources and whose expression gives rise to a mobile genetic element that allows the expression in the target tissue or cell of the nucieotidic or peptide sequences of interest.
  • Expression in a tissue or cell of interest is carried out by the operative binding of the polynucleotide to control sequences, preferably specific control sequences of the tissue or cell where it is to be expressed; preferably said control sequences are promoters or enhancers.
  • a recombinant vector according to the invention can therefore be used both as a biotechnological tool to multiply it and be used in pharmaceutical compositions as a pharmacological treatment per se.
  • a typical recombinant vector is selected from the group consisting of a lentiviral vector, an adenoviral vector, an adeno-associated virus vector, a plasmid, a cosmid. or an artificial chromosome.
  • a third aspect of the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid of the first aspect of the present invention or the expression cassette of the second aspect of the present invention.
  • the vector is replicative or integrative. More preferably said vector is selected from the list comprising: plasmid, cosmid, bacmid, viral vector or artificial chromosome.
  • the vector of the invention relates to a vector comprising the nucleic acid of the invention or the expression cassette of the invention attached in reading phase to a nucieotidic sequence encoding a purification tag.
  • purification tag refers to an amino acid sequence that has been incorporated (generally, by genetic engineering) into a protein to facilitate its purification.
  • the tag which can be another protein or a short amino acid sequence, allows the protein to be purified, for example, by affinity chromatography.
  • Some examples of purification labels known in the state of the art are, for example, but not limited to: caimodulin-binding peptide (CBP), glutathione-S-transferase enzyme (GST) or a tail of histidine residues .
  • CBP caimodulin-binding peptide
  • GST glutathione-S-transferase enzyme
  • the purification tag consists of at least 6 histidine residues.
  • a fourth aspect of the present invention relates to a fusion protein that is generated from the translation of the nucleic acid of the first aspect of the invention, ie that encoded by the nucleic acid of the invention.
  • the protein of the invention is generated from the translation of the nucleic acid of the first aspect of the invention, ie that encoded by the nucleic acid of the invention.
  • amino acid sequence or “protein” are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be chemically or biochemically modified.
  • residue * corresponds to an amino acid
  • a fifth aspect of the present invention relates to a cell comprising the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention and / or the fusion protein of the fourth aspect of the invention.
  • the "host cell of the invention” or “the cell of the invention” Preferably said cell is a bacterium, a yeast, a fungus, a plant cell or an animal cell.
  • the cell is an actinomycete, preferably of the genus selected from the list consisting of Streptomyces, Sacchampolyspora, Micromonospora, Bifidobactenum, Frankia, Streptoverticillium, Kitasatospora, Propionibacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium; and others like Escherichia, LactobacMus, Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces or BacUlus.
  • the cell is Streptomyces coelicoior, S. albus, S. venezuelae, S. avermitilis, S.
  • host cell or "host cell” or “transformed cell” includes any cultivable cell that can be modified by introducing the nucleic acid of the invention, the cassette of the invention, the vector of the invention, or the protein of The present invention is not naturally contained in the cell.
  • a host cell is one in which the polynudeotide of the invention can be expressed, giving rise to a stable polypeptide, modified post-translationally and located in the appropriate subcellular compartment.
  • the choice of a suitable host cell may also be influenced by the choice of the detection signal.
  • the use of constructs with reporter genes eg. LacZ. Luciferase, thymidine kinase or the green fluorescent protein "GFP"
  • GFP green fluorescent protein
  • the host cell phenotype should be considered.
  • the transformed cell of the invention may have the nucleic acid of the first aspect of the invention or the gene construct cloned into a gene vector capable of replicating stably in said cell, such as in a plasmid, or the vector of the second aspect of the invention. Consequently, the cell transformation stage can be carried out by cloning the genetic construct in the vector (plasmid), which can be subsequently introduced into the target cell by a method of conjugation, transformation or electroporation, depending on the target cell and the chosen cloning vector.
  • the transformed cell may have the genetic construct integrated into the genome of said cell.
  • the cell transformation step a can be carried out by any of the known methods for homologous or non-homologous recombination, for example by the use of transposons or other molecular vectors that are not capable of self-replicating in the target cell, but that can mediate recombination processes between nucleic acids
  • conjugation method refers to any of the methods commonly used in molecular biology that allow a DNA molecule to be transferred from a donor bacterium to a recipient bacterium after direct contact.
  • transformation method refers to any of the methods commonly used in molecular biology that allow a DNA molecule to be introduced into a bacterial strain after direct contact of said bacterial strain with the DNA molecule.
  • electroporation method refers to any of the methods commonly used in molecular biology that allow a DNA molecule to be introduced into a bacterial strain after direct contact of said bacterial strain with the DNA molecule and applying an electric current
  • the host cell can be a non-pathogenic cell that can be ingested by a subject, for example bifidobaterias (B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. thermophilum, B. animaf ⁇ s, B. breve, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. adolescents, B. pullorum or B.
  • bifidobaterias B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. thermophilum, B. animaf ⁇ s, B. breve, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. adolescents, B. pullorum or B.
  • ruminantium It can also be a cell that is selected from the list consisting of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei , Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus jahnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnnosus and Lactobacillus Salivarium
  • the cell refers to L casei BL23.
  • L casei ATCC 334, L casei str. Zang These cells can be used as a polyphenol producing probiotic directly in the digestive tract of a person or an animal.
  • the present invention also relates to the use of the cell of the fifth aspect of the invention (non-pathogenic) for the production of a food, a fermented milk product, dietary supplement or an edible probiotic product.
  • the fermented dairy products are cheeses or yogurts.
  • the present invention also relates to a food, a fermented milk product, dietary supplement or an edible probiotic product comprising the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the invention. third aspect of the invention, the protein of the fourth aspect of the invention and / or the cell of the fifth aspect of the invention.
  • the fermented dairy products are cheeses or yogurts, or other fermented materials that can serve as food for animals or humans.
  • the invention also relates to a plant product fermented with the host cells of the invention. Said product can be administered as a functional food in animals or humans.
  • a sixth aspect of the present invention relates to the use of the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention, the fusion protein of the fourth aspect of the invention. invention and / or cell of the fifth aspect of the invention for the synthesis of polyphenols (production of polyphenols).
  • resveratrol, floretin, garbanzol, dihydrofisetine (fustine), liquiritigenin, daidzein are synthesized.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention, the fusion protein of the fourth aspect of the invention. and / or the cell of the fifth aspect of the invention as a medicament, that is, for the preparation of a medicament.
  • a medicament that is, for the preparation of a medicament.
  • diseases in which the polyphenols described in the present invention alleviate the symptoms, cure or mitigate the disease can be any of those known to those skilled in the art in which the action of the polyphenols described herein improves the health status of the individual.
  • the nucleic acid of the first aspect of the invention to the expression cassette of the second aspect of the invention, to the vector of the third aspect of the invention, to the fusion protein of the fourth aspect of the invention and / or to the cell of the fifth aspect of the invention for use in the treatment and / or prevention of said diseases
  • nucleic acid of the first aspect of the invention the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention, the fusion protein of the fourth aspect of the invention and / or of the cell of the fifth aspect of the invention for the decrease of the signs of age and aging, that is to say for the preparation of a medicament for said purpose. That is, it refers to the nucleic acid of the first aspect of the invention, to the expression cassette of the second aspect of the invention, to the vector of the third aspect of the invention, to the fusion protein of the fourth aspect of the invention and / or to the cell of the fifth aspect of the invention for use in reducing the signs of age and aging.
  • another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention, to the fusion protein of the fourth aspect of the invention and / or to the cell of the fifth aspect of the invention.
  • pharmaceutical composition refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of a disease in humans or animals.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be used both alone and in combination with other pharmaceutical compositions.
  • pharmaceutical composition and medicament are used interchangeably in that invention.
  • the pharmaceutical composition of the invention refers to a pharmaceutical composition or a medicament characterized by comprising the nucleic acid of the invention or the protein or vector or cell that allows its expression in the organism to be treated, in a therapeutically active amount, in a manner that the nucleic acid exerts its function in the tissue / target cell.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the pharmaceutical composition further comprises an adjuvant.
  • it further comprises another active ingredient (additional active ingredient).
  • the expression 'therapeutically effective amount' refers to the amount of the agent calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, in the case of a therapeutic composition, by the characteristics of the compounds, the route , form and frequency of administration thereof, and other factors, including the age, condition of the patient, as well as the severity of the alteration or disorder.
  • excipient * refers to a substance that helps the absorption of the elements of the composition of the invention, stabilizes said elements and activates or aids the preparation of the composition in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant, so the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as starches, sugars or cellulose, the sweetening function, the dye function, the composition protection function, such as for example, to isolate it from air and / or moisture, the filling function of a tablet, capsule or any other form Presentation, as for example, is the case of dibasic calcium phosphate, the disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • vehicle like the excipient, refers to a substance that is used in the pharmaceutical composition or medicament to dilute any of the components of the present invention comprised therein to a certain volume or weight.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other elements, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition.
  • the pharmacologically acceptable carrier is the diluent.
  • adjuvant refers to an agent that increases the effect of the nucleic acid or protein of the invention when it is supplied jointly to it or as part of the same treatment protocol.
  • compositions of the present invention are the vehicles known to those skilled in the art.
  • active substance means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different diagnostic effect , cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • said pharmaceutical composition is prepared in solid form or in aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • composition of this invention can be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • administration of the therapeutic composition provided by this The invention is carried out, for example, parenterally, orally, intraperitoneally or subcutaneously.
  • a seventh aspect of the present invention relates to a method of producing polyphenols comprising the use of the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention, the fusion protein of the fourth aspect of the invention and / or the cell of the fifth aspect of the invention.
  • resveratrol, floretin, garbanzole, dihydrofisetine (fustine), liquiritigenin, daidzein, (S) -equol, xanthohumol, naringenin, genistein, apigenin, luteolin, erodictio !, kaempferol, dihydrokaempferol, myricetin are produced.
  • An eighth aspect of the present invention relates to a kit (it can also be a device) comprising the nucleic acid of the first aspect of the invention, the expression cassette of the second aspect of the invention, the vector of the third aspect of the invention , the fusion protein of the fourth aspect of the invention and / or the cell of the fifth aspect of the invention.
  • a ninth aspect of the present invention relates to the use of the kit (or device) of the eighth aspect of the invention to generate polyphenols. Preferably to generate resveratrol, floretin, chickpea !, dihydrofisetine (fustin), liquiritigenin.
  • FIG. 1 General structure of flavonoids
  • FIG. 2 Resveratrol biosyrthetic route. The molecular mass in daltons (Da) is shown.
  • FIG. 3 Resveratrol-producing final plasmid (pSTS6W) containing the promoter (permE *), and the TAL, 4CL and STS genes. you have the thioestreptone resistance gene.
  • FIG. 4 Mass spectrum of an extract of the resveratrol-producing strain, S. coelicofor transformed with pSTS6W.
  • the spectrum shows the peaks of one of the fragments (227,3000> 143,0000) obtained after performing the MRM analysis.
  • the peaks correspond to the cis (4.5 min) and trans (5.3 min) isomers of resveratrol.
  • the retention times are shown.
  • FIG. 6 S Biosynthesis pathway of liquiritigenin, daidzelna, naringenin and genistein. Molecular masses are shown in Da.
  • FIG. 6 Final plasmid pLMF-LQ containing the genes of the liquiritigenin biosynthesis pathway (A).
  • Final plasmid pNGM-NAR containing the genes of the naringenin biosynthesis pathway (B).
  • ApR is the ampicillin resistance gene.
  • tsr is the thioestreptone resistance gene.
  • FIG. 7 Mass spectrum (EIC). The pattern of liquiritigenin superimposed (major peak) to the liquiritigenin produced by S. coelicolor with the plasmid pLMF-LQ (minor peak) is shown.
  • FIG. 8 Daidzein-producing plasmids: pLMF55 (integrative) (A) and pLMF55W (repirative) (B). Genistein-producing plasmid (pNGM-GEN).
  • FIG. 9 Production of daidzein in S. coelicolor transformed with pLMF55W (above) and pLMF55 (below). The retention time of ia daidzein is shown.
  • FIG. 10 Mass spectrum showing the flavonoids produced by S. albus containing the plasmid pLMF55 (above) and pLMF55W (below), after MRM analysis. Daidzein (DZ), liquiritigenin (LQ) and narinogenin (NAR) are shown.
  • FIG. 11 Biosynthetic route of (S) -equol. Molecular masses are shown in Da.
  • FIG. 12 Plasmid producing (S) -equol (pLMF56).
  • FIG. 13 Mass spectrum of production of (S) -equol (gray-shaded peak) by the coelicoior S strain containing plasmid pLMF56.
  • FIG. 14 Possible routes of obtaining flavones apigenin and luteolin, and flavanone eriodictiol, from naringenin. Molecular masses are shown in Da.
  • FIG. 15 Final plasmid construction producing luteolin (pLT) (A), apigenin (pNGM-AP) (B) and erodictiol (pNGM-ERY) (C)
  • FIG. 16 Mass spectrum showing flavonoids produced by S. albus transformed with plasmid pLT. Luteolin (LT), quercetin (QR) and apigenin (API) are shown.
  • LT Luteolin
  • QR quercetin
  • API apigenin
  • FIG. 17 Biosynthetic routes to obtain kaempferol, myricetin and quercetin from narinogenin. Molecular masses are shown in Da.
  • FIG. 18 Final plasmids producing kaempferol (pKF) (A), quercetin (pQR) (B) and myricetin (pMIR) (C).
  • FIG. 19 Mass spectrum obtained after MRM analysis of pKF transformed into S. albus Dihydrokaempferol (DHK) is shown. quercetin (QR), apigenin (API) and kaempferol (KF).
  • QR quercetin
  • API apigenin
  • KF kaempferol
  • FIG. 20 Mass spectrum showing the flavonoids detected by MRM of pQR transformed into S. albus. Dihydrokaempferol (DHK), quercetin (QR), apigenin (API) and kaempferol (KF) are shown.
  • FIG. 21 Mass spectrum of the results obtained after transforming pMIR into S. albus. Myricetin (MIR), dihydrokaempferol (DHK), quercetin (QR) and kaempferol (KF) are shown.
  • FIG. 22 Biosynthesis route of garbanzol and dihydrofisetine. Molecular masses are shown in Da.
  • FIG. 23 Garbanzole (pGR) (A) and dihydrofisetine (pDF) (B) producing plasmids.
  • FIG. 24 Mass spectra after SIM analysis. Spectrum corresponding to an extract of S. albus containing plasmid pGR (above) and that corresponding to the control strain (below). 3 new peaks are observed in the strain with pGR (minutes 3.8, 4.1 and 5.7), some of which could be garbanzol
  • FIG. Superposition of the spectra obtained after SIM analysis of an extract of S. albus containing the plasmid pDF (black color) and of the control strain (gray color). A differential peak is observed in minute 4.4 which could be dihydrofisetine.
  • FIG. 26 Floretin-producing plasmids (pJFF-PHLO) (A) and xanthohumol (pJFF-XAN) (B).
  • FIG. 27 HPLC-MS spectrum showing the retention times of the ions corresponding to each of the commercial standards used in this work. Commercial patterns were acquired in Sigma Aldrich The molecular masses and their retention time are indicated in table 1.
  • FIG. 28 Biosynthetic routes to obtain pelargonidine, delfinidine, catechin, cyanidine and epicatechin from dihydrokaempferol
  • FIG. 29 Plasmid producing pelargonidine (pPEL) (A), delfinidine (pDEL) (B), catechin (pCTC) (C). cyanidine (CYN) (D) and epicatechin (pECTC) (E).
  • TAL TAL
  • 4CL 4CL
  • STS Figure 2
  • Many of the enzymes belonging to the TAL family are bifunctional, they also have activity on phenylalin and the preference for this amino acid may be greater, so for the choice of our enzyme, the literature available so far was reviewed to ensure that had more activity on tyrosine.
  • the TAL chosen in the present invention is that from Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NO: 1).
  • Rhodobacter capsulatus SEQ ID NO: 1
  • Rhodobacter capsulatus Rhodobacter capsulatus
  • R sphaeroides was used to synthesize stilbenes and fiavonoids and has a high homology with the TAL of R. capsulatus (Watts et a /., 2004).
  • S. coelicolor 4CL SEQ ID NO: 4
  • Vitis vinifera STS SEQ ID NO: 7
  • This enzyme was chosen because it is the only one that has the ability to synthesize stilbenes and in nature it is mainly synthesized in various species of the chosen family. It is also widely described in the biography and was used in various studies to synthesize resveratrol (Donnez ef a /., 2009).
  • EXAMPLE 2 synthesis of flavanones
  • the first step for the synthesis of isoflavones is to obtain the naringenin chalcone.
  • CHS chalcone synthase
  • CHI chalcone synthase
  • the flavanone naringenin is obtained, from which numerous flavonoids can be obtained (Falcone Ferreyra et a /., 2012).
  • another flavanone, iichiritigenin is needed.
  • This enzyme catalyzes the formation of isoflavones from flavanones by migrating the aromatic ring from C2 to C3 (Falcone Ferreyra et al., 2012), giving rise to isoflavone daidzein from flavanone liquiritigenin (Figure 5)
  • This step is a challenge for the synthesis of isoflavones in microorganisms since it is a cytochrome P450 reductase attached to the membrane of the endoplasmic reticulum.
  • the action of the IFS directly on the flavanone naringenin results in the isoflavone genistein (Figure 5).
  • the first two genes were used to obtain naringenin, common with the synthesis of resveratrol: TAL of R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL of S. coelicolor (SEQ ID NO: 5).
  • the following genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO. 26) are from Glycine max.
  • they were synthesized by optimizing the codons for expression in Streptomyces (see SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 27).
  • they all contain the ribosome binding site (RBS) (SEQ ID NO: 79).
  • the promoter used was SEQ ID NO: 82.
  • the first two genes common with the synthesis of resveratrol, were used to obtain liquiritigenin: TAL of R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL of 5. coeiicolor (SEQ ID NO: 5).
  • the following genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26), CHR (SEQ ID NO: 30) are from Glycine max.
  • the first two genes were used to obtain daidzein, common with the synthesis of resveratrol: TAL of R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL of S. coeiicolor (SEQ ID NO: 5).
  • the following genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHR (SEQ ID NO: 30) and CHI (SEQ ID NO: 26), are from Glycine max, since this species is one of the main producers of isoflavones.
  • IFS IFS-NADPH P450 reductase chimera
  • a linker between the two enzymes was added to the design of this IFSR chimera, invented with a random sequence (from the position 527 to 536 of the sequence SEQ ID NO: 48) which does not form any secondary structure.
  • several amino acids were added at the amino-terminal end of the IFS after the initial methionine (12 amino acids, position 2-13), with e! in order to facilitate the binding of this IFS (and therefore its chimera) to the bacterial cell membrane (in the plant cell, it appears attached to cell organelle membranes).
  • the initial methionine and the following 64 amino acids were also removed from the NADPH: P450 reductase. and it was verified with the TMHMM server program that amino acids that anchor it to the membrane in the bacterial cell were not maintained in the reductase.
  • IFSm P450 reductase
  • SEQ ID NO: 46 the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 45 the protein sequence
  • IFS is an enzyme that needs reducing power, and this would be provided by the chimera reductase constructed (SEQ ID NO: 44)
  • the same linker between the two enzymes was added for the design of this chimera, invented with a random sequence (which goes from position 502 to 510 of the sequence SEQ ID NO: 45) which does not form any secondary structure.
  • Flavones are obtained from naringenin thanks to the action of two enzymes: flavone synthase (FNS), which leads to the synthesis of apigenin (the first of the flavones of the biosynthetic pathway) and Flavonoid-3-hydroxylase (F3 H), which if it acts on naringenin produces a flavanone (erythiocyol) but is capable of adding a hydroxyl group to apigenin transforming it into luteolin ( Figure 14).
  • FNS flavone synthase
  • F3 H Flavonoid-3-hydroxylase
  • flavonol synthase FLS1
  • FLS1 flavonol synthase
  • N3DOX genes of Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 34) were synthesized.
  • FLS1 (SEQ ID NO: 71) and F3'H (SEQ ID NO: 38) of Arabidopsis thaliana, F3'5'H of Petunia x hybrid (SEQ ID NO: 75)
  • the genes were optimized for synthesis in Streptomyces (SEQ ID NO: 35.
  • pKF for the synthesis of kaempferol
  • pQR for the synthesis of quercetin
  • pMIR for the synthesis of myricetin
  • the plasmids were transformed into S. coelicolor and 5. albus and the production of flavonoids was checked by mass chromatography. An MRM analysis was performed and the ions obtained were: 117 and 93 for kaempferol; 179.1 and 151.1 for quercetin; 179 and 151 for myricetin. The retention times were 5.81; 5.02 and 4.33 respectively.
  • High levels of kaempferol and residues of its precursor, dihydrokaempferol, were detected in strain extracts containing plasmid pKF (Fig. 18A). Quercetin and apigenin were also detected, although in very low amounts (Figure 19). High levels of quercetin and kaempferol were detected in strain extracts containing plasmid pQR (Fig. 18B). Dihydrokaempferol and apigenin were also observed although in small amounts (Figure 20)
  • a replicative plasmid was constructed containing the genes involved in the synthesis of liquiritigenin, which include the first two genes, common with the synthesis of resveratrol: TAL of R. capsulalus (SEQ ID NO: 2), 4CL of S. coelicolor (SEQ ID NO: 5), and the following genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26), CHR (SEQ ID NO: 30) of Glycine max. Also I know included the N3D0X gene of Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 34).
  • Plasmid pDF was transformed into S.albus, as was the control plasmid without any gene. With the extracts of these strains, a mass analysis of the SIM type (mass of the selected ion) was performed and the strain was compared with the plasmid pDF with the control strain. The presence of a differential peak not present in the control and corresponding to the molecular mass of dihydrofisetine (288.25 Da) was observed. This indicates that this peak could be dihydrofisetine ( Figure 25). There is no commercial standard for this compound.
  • the first two genes were used, common with the synthesis of resveratrol: TAL of R capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL of S. coelicolor (SEQ ID NO: 5).
  • the CHS gene SEQ ID NO. 12
  • the ALKR alkene reductase gene SEQ ID NO: 15
  • the first two genes were used, common with the synthesis of resveratrol: TAL of R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL of S. coelicolor (SEQ ID NO: 5).
  • CHS SEQ ID NO: 12
  • the PRTase transferase genes SEQ ID NO: 19
  • the OMTase O-methyl transferase SEQ ID NO. 22
  • DFR dihydroflavonol reductase
  • ANS Anthocyanidin synthase
  • Typical examples are pelargonidine, delfinidine and cyanidine.
  • plasmids Five plasmids were constructed: pPEL for the synthesis of pelargonidma (SEQ ID NO: 96), pDEL for the synthesis of delfinidine (SEQ ID NO: 97), pCYN for the synthesis of cyanidine (SEQ ID NO: 102), pCTC for catechin synthesis (SEQ ID NO: 101), and pECTC for epicatechin synthesis (SEQ ID NO: 106).
  • Glycine max CHS SEQ ID NO: 12
  • CHI SEQ ID NO: 26
  • N3DOX SEQ ID NO: 34
  • Punica granatum DFR SEQ ID NO: 91
  • ANS SEQ ID NO: 94
  • the first two genes common with the synthesis of resveratrol: TAL of R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL of S. coelicolor (SEQ) were used to obtain the anthocyanidin called delfinidine. ID NO: 5).
  • the Glycine max CHS genes SEQ ID NO: 12
  • CHI SEQ ID NO: 26
  • the F3'5'H gene SEQ ID NO: 75
  • Punica granatum DFR SEQ ID NO: 91
  • ANS SEQ ID NO: 94
  • they were synthesized by optimizing the codons for expression in S ⁇ roptomyces (see SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 92 and SEQ ID NO 95).
  • they all contain the ribosome binding site (RBS) (SEQ ID NO: 79).
  • the promoter used was SEQ ID NO: 82.
  • Glycine max CHS SEQ ID NO: 12
  • CHI SEQ ID NO: 26
  • N3DOX SEQ ID NO: 34
  • the F3'H gene SEQ ID NO: 38
  • the Punica granatum DFR SEQ ID NO: 91
  • ANS SEQ ID NO: 94
  • SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92 and SEQ ID NO. 95
  • all of them contain the ribosome binding site (RBS) (SEQ ID NO: 79).
  • the promoter used was SEQ ID NO: 82
  • the finai construct was cloned into the replicative plasmid pWHM3, generating pCYN (SEQ ID NO: 102) ( Figure 29D), which was transformed into protopiasts of S. coelicolor and S. albus.
  • pCYN SEQ ID NO: 102
  • the first two genes, common with the synthesis of resveratrol were used to obtain the anthocyanidin called catechin: R. capsulatus TAL (SEQ ID NO: 2), S. coelicolor 4CL (SEQ ID NO: 5).
  • the Gtycine max CHS (SEQ ID NO. 12) and CHI (SEQ ID NO: 26) genes were used, together with the N3DOX (SEQ ID NO: 34) gene of Petroselinum crispum, common with dihydrokampferol synthesis.
  • the F3'H gene (SEQ ID NO: 38) of Arabidopsis thaliana was also added.
  • Punica granatum DFR gene SEQ ID NO: 91
  • Fragaria x ananassa LAR gene SEQ ID NO: 99
  • they were synthesized by optimizing the codons for expression in Streptomyces (see SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92 and SEQ ID NO: 100).
  • they all contain the ribosome binding site (RBS) SEQ ID NO: 79).
  • the promoter used was SEQ ID NO: 82.
  • Punica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) and ANS (SEQ ID NO: 94) genes were added, together with the Fragaria x ananassa ANR gene (SEQ ID NO: 104).
  • these genes will be synthesized by optimizing the codons for expression in Streptomyces (see SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35.
  • they all contain the ribosome binding site (RBS) (SEQ ID NO: 79).
  • the promoter used was SEQ ID NO: 82.
  • the column used was an Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 1.8 ⁇ and 50 x 2.1 mm.
  • the temperature of the column was 30 ° C.
  • the solvents used were water with 0.1% formic acid and acetonitrile with 0.1% formic acid.
  • the conditions were 0-10% (percentage of acetonitrile with 0.1% formic acid) for 1 min, 10-35% for 3 min, 35% for 1 min. 35-80% for 3 min, 80% for 2 min and 80-10% for 1 min.
  • the flow was kept constant at 0.3 ml / min. These conditions were the same for all compounds. Table 1 shows the molecular mass detected and the retention time for each of them.
  • Figure 27 shows a spectrum of all of them analyzed in a single HPLC-MS experiment.
  • the E. co ⁇ i strains were grown at 37 ° C in solid medium (TSA), or under agitation (250 rpm) in the case of liquid medium (TSB or LB).
  • the co-motor was grown at 30 ° C in solid medium (SFM for sporulation, or R5A agar for production), or at 250 rpm in liquid medium (R5A for production, or YEME 34% sucrose to generate protopiasts).
  • S. albus was grown in the same conditions as S. coelicolor, but the sporulation medium in this case was Bennet and the YEME used is 17% sucrose.
  • glycerol 25% for E cot ⁇ and spores of Streptomyces
  • sucrose 10.3% for mycelium of Streptomyces
  • antibiotics For the selection of positive clones in E cali the following antibiotics were used: ampicillin (100 mg / ml, Ap) at a final concentration of 100 pg / ml, apramycin (200 mg / ml, Am) at a final concentration of 40 pg / ml, kanamycin (50 mg / ml, Kn) at a final concentration of 50 ug / mi.
  • ampicillin 100 mg / ml, Ap
  • apramycin 200 mg / ml, Am
  • kanamycin 50 mg / ml, Kn
  • cioranfenicol 50 mg / ml
  • alkaline phosphatase 5 U / ⁇
  • phosphatase 50 U / ⁇
  • 50 ⁇ of already digested and purified DNA, 6 ⁇ of buffer and 4 ⁇ of phosphatase were used. This mixture was incubated at 37 ° C for 7 min and purified (see below).
  • the DNA fragments obtained after digestion or amplification by PCR were visualized by electrophoresis in agarose gels in 1x TBE (10 mV / cm).
  • the amount of vector and band was previously evaluated by electrophoresis. Ligation was performed on a final volume of 10 ⁇ . 1 ⁇ of ligase, 1 ⁇ of ligase buffer and a 3: 1 band-vector ratio were added. The ligase used was the "T4 DNA ligase" of Fermentas. For ligations with cohesive ends the 1 U / ⁇ ligase was used and for SU / ⁇ ligase and its corresponding buffer. The ligaments were incubated for 1 h at room temperature, or a minimum of 4 h for blunt end ligaments.
  • the DNA samples were sequenced in the Sequencing Unit of the Scientific-Technological Services (SCTs) of the University of Oviedo, using the ABI PRISM® 3130x1 (Applied Biosystems) genetic analysis equipment. This equipment is based on the fluorescence mapping of DNA molecules and their subsequent separation by capillary electrophoresis.
  • sequences obtained after the sequencing analysis were read using the BioEdit Sequence Alignment Editor program and the ClustalW sequence comparison web tools of the European Bioinformatic Institute EMBL-EBI and BLASTN of the NCBI were used.
  • the New England Biolabs NEBcutter web tool was also used to analyze the cutting sites.
  • the NCAS BLASTP tool was used to study amino acid sequences.
  • the Clone Manager Basic 9 program was used for the planning of cloning strategies and design of new plasmids.
  • the filtered solutions were centrifuged 10 min at 8000 rpm and the pellets were washed twice with MilliQ. The final spore pellet was resuspended in H 2 0 MilliQ in a final volume between 0.5 and 2 ml depending on the size of the pellet. These solutions were stored at 4 ° C for later use.
  • HPLC analyzes were performed using the Agiient Technologies team, 1260 Infinity.
  • the column used was a Teknokroma reverse phase column of 5 ⁇ and 25 x 0.46 mm.
  • the mobile phases used were: water / acetic acid (98: 2). water / acetonitrile / acetic acid (73: 25: 2) and methanol.
  • the HPLC conditions were as follows: flow gradient of 1ml / min 100-20% water / acetic and 0-80% water / acetonitrile / acetic for 55 min; flow of 1, 2 ml / min and 20-10% water / acetic and 80-90% water / acetonitriium / acetic for 2 min; same flow and 10% water / acetic and 90% water / acetonitrile / acetic for 13 min; same flow and 10-5% water / acetic and 90-95% water / acetonitrile / acetic for 10 min; flow of 1 ml / min and 5-0% water / acetic, 95-0% water / acetonitrile / acetic 0-100% methanol for 20 min; same flow and 0-100% water / acetic and 100-0% methanol for 5 min and finally same flow and 100% water / acetic for 15 min.
  • the column temperature was 20 ° C.
  • Agilent Technologies 1290 Infinity, 6460 Triple Quadrupole LC / MS with electrospray ionization source was used for mass chromatography analysis.
  • the column used was an Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, 1, 8 ⁇ m and 50 x 2.1 mm.
  • the temperature of the column was 30 ° C.
  • the solvents used were water with 0.1% formic acid and acetonitrile with 0.1% formic acid.
  • the conditions were 0-10% (percentage of acetonitrile with 0.1% formic acid) for 1 min, 10-35% for 3 min, 35% for 1 min. 35-80% for 3 min, 80% for 2 min and 80-10% for 1 min.
  • the flow was kept constant at 0.3 ml / min. These conditions were the same for all compounds.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% con la secuencia SEQ SD NO 1 y una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 4. Además dicha secuencia puede comprender las secuencias de otros genes para la síntesis de polifenoles. En la presente invención se demuestra la utilidad de dichas construcciones génicas en la síntesis de polifenoles, en concreto de estilbenos, chaíconas, flavanonas, isoflavonas, flavonas, flavonoles: dihidroflavonoles, dihidroflavanoles, antocianidinas y sus derivados.

Description

Ácido nucleico recombinante para su uso an la producción de polifanoles
DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a un ácido nucleico recombinante que comprende una subunidad que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 1 y una subunidad que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 4 para la generación de polifenoles. Por lo tanto, la presente invención se puede encuadrar en el campo de la medicina.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los polifenoles constituyen uno de los grupos más numeroso y ampliamente distribuido del reino vegetal. Son metabolitos secundarios de las plantas, esenciales para la morfología y fisiología de las mismas. Participan en la pigmentación de flores y otros órganos vegetales, y además, están involucrados en el crecimiento y reproducción (atraen a agentes polinizadores} y protegen a las plantas frente a infecciones microbianas y radiación ultravioleta (Harbome y Williams, 2000). Químicamente, se caracterizan por tener al menos un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo unidos y dos de sus familias principales son los estilbenos y los fiavonoides (Manach et ai, 2004). Los flavonoides se subdividen a su vez en varios subgrupos en función del grado de sustitución: flavanonas, flavonas, isoflavonas, flavanoles, flavan-3-oles y antocianidinas. Los flavonoides constituyen el grupo más numeroso de los polifenoles de la dieta, con más de 4.000 moléculas. (Kumar y Pandey, 2013). Ver figura 1 (Manach et al., 2004).
Hasta ahora se han identificado más de 8 000 polifenoles distintos que forman parte de nuestra dieta, siendo de ellos más de 4.000 flavonoides. Aunque no son nutrientes necesarios para el bienestar a corto plazo, hay evidencias de que una ingesta moderada a largo plazo tiene efectos beneficiosos para la salud. Estos compuestos, al igual que los estilbenos, son potentes antioxidantes que previenen la aparición de tumores, enfermedades cardiovasculares y osteoporosis, mejoran las funciones cognitivas y la diabetes; o poseen acción fitoestrogénica, antiinflamatoria, antibacteriana o antiviral, teniendo por lo tanto un fuerte impacto sobre la salud humana (Kumar y Pandey, 2013).
La pnncipal ruta involucrada en la biosintesis de polifenoles en las plantas es la fenilpropanoide, siendo la L-fenilalanina el precursor principal. La fenilalanina amonio liasa (PAL) cataliza la transformación de L-fenilalanina en ácido cinámico, que es hidroxilado por la 4-cinamato hidroxilasa (C4H) para generar ácido p-cumárico. El ácido p-cumárico (o 4-hidroxi-cumárico) es el sustrato de la p-cumaroil-CoA ligasa (4CL), responsable de la producción de p-cumaroil-CoA (o 4-hidroxj-cumaroil-CoA) (Vogt, 2010).
Partiendo de este p-cumaroil-CoA y de tres moléculas de malonil-CoA, se originan estas dos importantes familias de polifenoles: los estilbenos y los flavonoides. Los estilbenos se originan gracias a la acción de la estilbeno sintasa (STS). Por el contrario, los flavonoides comienzan su síntesis con la formación de dos chalconas, la de naringenina y la de liquirítigenina. Para la formación de ambas se requiere la actividad de la chalcona sintasa (CHS) y adicionalmente la de la chalcona reductasa (CHR) para la formación de la chalcona de liquirítigenina Ambas chalconas son sustrato de la chalcona isomerasa (CHI) encargada de cerrar el anillo B, y que genera naringenina y liquirítigenina respectivamente (Crozier et al. , 2009). A partir de la liquirítigenina se forma la isoflavona daidzeína, gracias a la acción de la isoflavona sintasa (IFS). Esta enzima también es capaz de usar como sustrato la naringenina para formar otra isoflavona, la genisteína (Winkel-Shirley, 2001). De la naringenina derivan otras subfamilias de flavonoides debido a la actividad de diversas enzimas: · Flavona sintasa (FNS): responsable de la formación de flavonas, como por ejemplo la apigenina.
Flavanona-3-hidroxilasa (F3H): origina dihidroflavonoles como el dihidrokampferol (aromadendrina). Este compuesto es sustrato de otras enzimas responsables de la formación de dihidroflavonoles como la dihidroquercetina y la dihidromiricetina Estas enzimas son la flavonoide-3'-hidroxilasa (F3 H) y la flavonoide-3',5 - hidroxilasa (F3'5'H) respectivamente.
Flavonol sintasa (FLS): genera flavonoles como el kaempferol y la quercetina. Sus sustratos son los dihidroflavonoles.
Dihidroflavonol reductasa (DFR) y antocianidina sintasa (ANS): ambas enzimas originan las antocianidinas, como la pelargonidina. Antocianidina reductasa (ANR): actúa sobre las leucoantocianidinas originadas por la DFR para formar los flavan-3-oles, como la epicatequina (Winkel- Shirley, 2001). La importancia de los flavonoides como protectores de la salud humana ha estimulado la investigación y el desarrollo de nuevas plataformas para su producción a gran escala En las plantas se encuentran en bajas concentraciones y la síntesis química implica procesos complejos, asi que la biosintesis de estos compuestos en microorganismos podría ser una solución eficaz a estos problemas.
E. coli se ha empleado para la producción de algunos flavonoides en bajas concentraciones, gracias a la utilización de la enzima 4-cumaroil-CoA-ligasa (4CL) de la bacteria Streptomyces coelicolor, que permite formar 4-cumaroil-CoA a partir de ácido 4-hidroxi-cumárico {un derivado de L-tirosína) (Kaneko et al., 2003). Así se pudieron producir pinocembrína y naríngenina (dos flavonoides muy simples e iniciales en esta familia de compuestos) en E. coli, a partir de fenilalanina y tirosina respectivamente, expresando el gen codificador de la enzima fenil-amonio-liasa (PAL) de la levadura Rhodotorula rubra, la 4CL de S. coelicolor y la CHS de la planta Glychyrrhiza echinata (Hwang et al. 2003). El paso de estas chalconas hasta flavanonas se logró mediante la adición del gen CHI de la planta Fuerana lobata (Miyahisa et al. 2005). Posteriormente, se lograron sintetizar los flavonoles galangina y kaempferol y ¡as flavonas crisina y apigenina a partir de fenilalanina y tirosina respectivamente, gracias a la incorporación de nuevos plásmidos portadores de los genes codificadores de las FNS1 , F3H y FLS (Miyahisa et al. , 2006). Mediante adición al medio de cultivo de distintos precursores (ácido cumárico. ácido cafeico, naríngenina y eriodictiol) otros investigadores utilizaron la enzima F3H y también la flavonoide-3',5'-hidroxilasa (F3'5'H) para producir en E. coli los flavonoides eriodictiol, dihidrokampferol, kaempferol. dihidroquercetina y quercetina (Leonard et al., 2006a). Se logró también sintetizar apigenina y luteolina utilizando la FNS1 , a partir de la adición al medio de cultivo de naríngenina y eriodictiol, o de ácido cumárico y cafeico respectivamente (Leonard et al., 2006b). Recientemente se ha sintetizado en E. coli eriodictiol a partir de L-tirosina, utilizando la flavonoide-3'- hidroxilasa (F3'H) fusionada con una reductasa P450 truncada (Zhu et al., 2014). Hasta ahora se ha conseguido sintetizar las isoflavonas genisteína y daidzeina en E. coli a partir de los flavonoides naringenina y liquiritigenina añadidos como precursores en el caldo de cultivo, gracias a una citocromo P450 derivada de una enzima de Bacillus megaterium, fusionada con la IFS (Leonard y Koffas, 2007) (Kim, 2009).
Hasta hace pocos años, todos los flavonoides sintetizados en E coli necesitaban la adición al medio de cultivo de precursores como aminoácidos u otros flavonoides, pero desde entonces se ha logrado obtener naringenina en £ coli sin añadir precursores (Santos et a/. , 2011 )
Se han publicado estudios realizados en Streptomyces venezuelae, donde se ha logrado sintetizar naringenina y pinocembrina a partir de la adición al medio de cultivo de los precursores ácido cumárico y cinámico respectivamente, y el estilbeno resveratrol a partir de ácido cumánco (Park ef al., 2009). Con adición al medio de cultivo de naringenina y pinocembrina se ha logrado también producir apigenina, crisina, kampferol y galangina en S. venezuelae (Park ef a/., 2010b). En esta especie no se ha logrado sintetizar polifenoies hasta ahora sin recurrir a la adición de precursores en el medio de cultivo.
En 2005 se sintetizaron flavonoides en la levadura S. cerevisiae, utilizando los genes PAL, 4CL y CHS para sintetizar naringenina y pinocembrina a partir de L-fenilalanina (Jiang et al. 2005). También se utilizó ácido cumárico añadido en el medio de cultivo, más los genes codificadores de las enzimas C4H, 4CL, CHS, CHI para sintetizar naringenina en esta levadura (Yan et al. 2005). A partir de fenilalanina, o de ácido cumárico o naringenina (estos dos últimos añadidos al medio de cultivo), mediante el uso de la IFS y de una dtocromo reductasa P450, se obtuvo la isoflavona genisteína en levadura y también kaempferol y quercetina (Kim et al., 2005) (Trantas ef al., 2009).
Sin embargo, es necesaria una nueva plataforma que permita la producción de polifenoies, por ejemplo en actinomicetos, a gran escala y sin necesidad de añadir al medio de cultivo precursores de los mismos, lo que permita su producción industrial ilimitada y a bajo coste. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se demuestra la utilidad de varias construcciones génicas en la síntesis de polifenoles, en concreto de estilbenos, chaiconas, flavanonas, isoflavonas, flavonas, flavonoles. dihidroflavonoles, dihidroflavanoles, antocianidinas y sus derivados.
En la presente invención se han sintetizado polifenoles en Streptomyces, como modelo de síntesis en actinomicetos, por lo que para poder expresar correctamente los genes en la presente invención, los mismos se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico recombinante que comprende:
a. una subunidad (a) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 (proteina TAL), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2 (gen TAL), y b. una subunidad (b) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO:
4 (proteína 4CL), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 5 (gen 4CL).
En adelante "el ácido nucleico de la invención" o "ácido nucleico recombinante de la invención".
En la presente invención se entiende por "subunidad" a una secuencia de nucleótidos. Dicha subunidad puede ser una ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN).
El ácido nucleico recombinante también se denomina 'construcción génica
Se entiende como "recombinante' aquel ácido nucleico no natural que ha sido producido artificialmente in vitro o in vive por técnicas conocidas por el experto en la materia y que no ocurre en la naturaleza. El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos péptidos que se comparan o a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos ácidos nucleicos que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Podemos considerar, que péptidos o ácidos nucleicos con porcentajes de identidad de, al menos, un 70% mantendrán las mismas propiedades de dicha secuencia.
Cuando nos referimos a al menos un 70% de identidad quedan incluidos el 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77. 78. 79, 80, 81 , 82, 83, 84. 85. 86, 87, 88. 89, 90, 91 , 92. 93. 94, 95, 96, 97, 98, 99 % y 100% de identidad. Cuando nos referimos a al menos un 65% de identidad quedan incluidos el 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81. 82. 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90. 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % y 100% de identidad.
En la presente invención los términos "secuencia nucieotldica", "polinucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente.
El ácido nucleico de la presente invención puede presentar sustituciones conservativas, conocidas por el experto en la materia. Las sustituciones conservativas en el polinucleótido conllevan a que se codifique el mismo péptido.
El término ácido nucleico incluye ADN genómico o ADN codificante de cadena doble o sencilla, ácido ribonucleico (ARN), cualquier polinucleótido sintético y manipulado genéticamente y tanto ia cadena codificante como la antisentido. Esto incluye moléculas de cadena sencilla y de doble cadena, como por ejemplo, híbridos de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN.
La secuencia nucleotídica de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional ampliamente conocidos en el estado de la técnica. La tirosina-amonio liasa (TAL, histidine ammonia-lyase) utilizada en la presente invención es de Rhodobacter capsulatus, número de acceso WP_013066811 (SEQ ID NO: 1 es la proteína, SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nudeótidos y SEQ ID NO: 3 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
La 4CL de S. coelicolor es una enzima capaz de producir cumaroil-CoA a partir de tirosina (Kaneko et al., 2003).
La 4-cumaroil ligasa (4CL, 4-coumarate-CoA ligase) utilizada en la presente invención es de Streptomyces coelicolor, número de acceso NP_628552 (SEQ ID NO: 4 es la proteina, SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nudeótidos y SEQ ID NO: 6 es la secuencia optimizada para Streptomyces)
Una realizadón preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico recombinante donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada) y la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada).
Otra realizadón preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico recombinante que además comprende una subunidad (c) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 7 (proteina STS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuenda SEQ ID NO. 8 (gen STS). Preferiblemente, la subunidad (c) consiste en la secuenda SEQ ID NO: 9 (STS optimizada). Más preferiblemente se refiere al ácido nucleico recombinante donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada) y la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 (STS optimizada). En una realización más particular, el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 10.
El uso de la secuencia SEQ ID NO: 10 demuestra que se sintetiza resveratrol. La presente invención también se refiere al piásmido pSTS6W que comprende dicha secuencia. La estilbeno sintasa (STS) es la única que posee la capacidad de sintetizar estilbenos y en la naturaleza se sintetiza principalmente en diversas especies de la familia elegida.
La STS (slilbene synthase) utilizada en la presente invención es de Vitis vínifera, número de acceso AAB32488 (SEQ ID NO: 7 es la proteína, SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 9 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (d) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 1 (proteína CHS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 12 (gen CHS). Preferiblemente, en el ácido nucleico la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada). Aún más preferiblemente, la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada) y donde la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada).
La chalcona sintasa (CHS, chalcone synthase 5) utilizada en la presente invención es de Glycine max, número de acceso L07647.1 (SEQ ID NO: 11 es la proteina, SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 13 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Una realización más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (e) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 14 (proteina ALKR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 15 (gen ALKR). Preferiblemente, el ácido nucleico donde la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16 (ALKR optimizada). Más preferiblemente, el ácido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), ia subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), ia subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada) y la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16 (ALKR optimizada).
En una realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en la secuencia SEQ ID NO: 17.
El uso de la secuencia SEQ ID NO: 17 demuestra que se sintetiza floretina. La presente invención también se refiere al plásmido pJFF-PHLO que comprende dicha secuencia.
La alkenal reductasa (ALKR, phloretin alkenal- reducíase) utilizada en la presente invención es de Malus domestica, número de acceso XP_008367739 (SEQ ID NO: 14 es la proteina, SEQ ID NO: 15 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 16 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realización más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (f) que comprende una secuencia que codifica para la proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 18 (proteina PRTase), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 19 (gen PRTase). Más preferiblemente al ácido nucleico donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 (PRTase optimizada). Aún más preferiblemente al ácido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada) y donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 (PRTase optimizada).
La aromatic preniltransferasa (PRTasa o PRTase, Xanthohumol prenyl-transferase) utilizada en la presente invención es de Humulus lupulus, número de acceso XP_008367739 (SEQ ID NO: 18 es ia proteína, SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 20 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Una realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (g) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 21 (proteína OMTase), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 22 (gen OMTase). Preferiblemente la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23 (OMTase optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 (PRTase optimizada) y donde la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23 (OMTase optimizada).
Una realización particular se refiere al ácido nucleico donde el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 24 (inserto en el plásmido pJFF-XAN). Con la secuencia SEQ ID NO: 24 se puede sintetizar xanthohumol. La presente invención también se refiere al plásmido pJFF-XAN que comprende dicha secuencia.
La O-metiltransferasa 1 (OMTasa, OMTase o OMT1 , Xanthohumol-O-methyl- transferase) utilizada en la presente invención es de Humulus lupulus, número de acceso FM164641.1 (SEQ ID NO: 21 es la proteina, SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 23 es la secuencia optimizada para Stmptomyces).
Otra realización más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (h) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 25 (proteina CHI), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 26 (CHI gen). Preferiblemente en el ácido nucleico la subunidad (h) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada). Más preferiblemente en el ácido nucleico la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada) y donde la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada). Una realización más particular se refiere al ácido nucleico donde el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, ia secuencia SEQ ID NO: 28.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 28 se puede sintetizar naringenina. La presente invención también se refiere al plásmido pNGM-NAR que comprende dicha secuencia.
La chalcona isomerasa (CHI, chalcone fíavonone isomerase 1A) utilizada en la presente invención es de Glycine max, número de acceso AY59S413.1 (SEQ ID NO: 25 es la proteina, SEQ ID NO: 26 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 27 es la secuencia optimizada para Streptomyces)
Una realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (i) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 29 (proteina CHR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 30 (gen CHR). Preferiblemente en el ácido nucleico la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada). Más preferiblemente en el ácido nucleico según la reivindicación 26 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y donde la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada).
Una realización más particular se refiere al ácido nucleico que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 32. Mediante el uso de ia SEQ ID NO. 32 se puede sintetizar liquiritigenina. La presente invención también se refiere al plásmido pLMF-LQ que comprende dicha secuencia.
La chalcona reductasa (CHR, NAD(P)H-dependent 6-deoxychalcone synthase) utilizada en la presente invención es de Glycine max, número de acceso X55730.1 (SEQ ID NO: 29 es la proteina, SEQ ID NO: 30 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 31 es la secuencia optimizada para Streptomycas)
Otra realización más particular se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33 {proteina N3DOX), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34 (gen N3DOX). Preferiblemente la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 {N3DOX optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada)
Una realización aún más particular se refiere al ácido nucleico que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 36 Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 36 se demuestra que se sintetiza garbanzol. La presente invención también se refiere al plásmido pGR que comprende dicha secuencia.
La naringenina 3-dioxigenasa (N3DOX, Flavanone 3-hydroxylase, Flavanone 3- dioxygenase, Naringenin 3-dioxygenase) utilizada en la presente invención es de Petroselinum críspum, número de acceso AY230248 (SEQ ID NO: 33 es la proteina, SEQ ID NO: 34 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 35 es la secuencia optimizada para Streptomyces). Otra realización más particular se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (proteína F3'H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (gen F3'H). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3Θ (F3'H optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada) y donde ia subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3'H optimizada).
Una realización particular se refiere al ácido nucleico que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 40.
Mediante el uso de secuencia SEQ ID NO: 40 se demuestra que se genera dihidrofisetina. La presente invención también se refiere al plásmido pDF que comprende dicha secuencia.
La flavonoide 3"-hidroxilasa (F3 H, flavanoid 3-hydroxylase) utilizada en la presente invención es de Arabidopsis thaliana, número de acceso Q9SD85 (SEQ ID NO: 37 es la proteina, SEQ ID NO: 38 es ia secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 39 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otra realización más particular se refiere al ácido nucleico que además comprende una subunidad (I) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41 (proteina IFS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42 (gen IFS) y una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43 (proteina reductasa de G. max), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44 (gen de la reductasa). Preferiblemente la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS optimizada+reductasa optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y donde la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS+reductasa optimizada).
En una realización más particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en. la secuencia SEQ ID NO 47 (inserto en el plásmido pLMFSSW). Mediante ei uso de la secuencia SEQ ID NO: 47 se genera daidzeína.
La isoflavona sintasa (IFS, isoflavone synthase 1,) utilizada en la presente invención es de Glycine max, número de acceso AF195818 (SEQ ID NO. 41 es la proteina, SEQ ID NO: 42 es la secuencia de nucleótidos).
La NAPH P450 reductasa (CPR) utilizada en la presente invención es de Glycine max, número de acceso AY170374.1 (SEQ ID NO 43 es la proteína, SEQ ID NO: 44 es la secuencia de nucleótidos)
La quimera IFS-CPR tiene como secuencia de proteínas la SEQ ID NO: 45 y la SEQ ID NO: 46 es la secuencia optimizada para Streptomyces.
En una realización más particular el ácido nucleico además comprende una subunidad (m) que comprende una secuencia que codifica una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 50 (proteína D2NR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 51 (gen DZNR). Preferiblemente la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS-reductasa optimizada) y donde la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada).
La reductasa de daidzeína (DZNR. daidzein reducíase) utilizada en la presente invención es de Lactococcus garvíeae, número de acceso AB558141 (SEQ ID NO: 50 es la proteína, SEQ ID NO: 51 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 52 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
Otras reductasas que también pueden utilizarse son las siguientes (se identifican con su número de acceso): XP_006472452, XP_008338958, XP_006338052, AAZ39648.1 , P38038, AEE85738.1 , BAD05639, ΧΡ_002270732, 1408205A, AFW57103, CBG67789, CAM03474, AAB97736, XP_003610109, WP_010982013, WP_011027201 , EFE84508 En una realización más particular el ácido nucleico además comprende una subunidad (n) que comprende una secuencia que codifica una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 53 (proteina DHDR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 54 (gen DHDR). Preferiblemente en el ácido nucleico la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55 (DHDR optimizada). Más preferiblemente el ácido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada),la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS- reductasa optimizada), la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada) y la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55 (DHDR optimizada).
La reductasa de dihidrodaidzeína (DHDR, dhydrodaidzein reducíase) utilizada en la presente invención es de Lactococcus garvieae, número de acceso AB592970 (SEQ ID NO: 53 es ¡a proteína, SEQ ID NO: 54 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 55 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En una realización más particular el ácido nucleico además comprende una subunidad (o) que comprende una secuencia que codifica una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 56 (proteina THDR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 57 (gen THDR), y una subunidad (s) que comprende una secuencia que codifica una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 59 (prot RAC), preferiblemente comprende una secuencia con ai menos un 65% de identidad con ia secuencia SEQ ID NO: 60 (gen RAC). Preferiblemente la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 (THDR optimizada) y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61 (RAC optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 (CHR optimizada) y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS- reductasa optimizada), ia subunidad (m) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 52 (DZNR optimizada), la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55 (DHDR optimizada), la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 (THDR RAC optimizada) y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61 (RAC optimizada).
En una realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 62.
El uso de la secuencia SEQ ID NO: 62 demuestra que se genera (S)-equol. La presente invención también se refiere al plásmido pLMF56 que comprende dicha secuencia. La reductasa de tetrahidrodaidzeina (THDR, tetradrodaidzein reducíase) utilizada en la presente invención es de Lactococcus garvieae, número de acceso AB592969 (SEQ ID NO: 56 es la proteina. SEQ ID NO: 57 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 58 es la secuencia optimizada para Streptomyces) La racemasa (RAC, dihydrodaidzein racemase) utilizada en la presente invención es de Lactococcus garvieae, número de acceso AB592969 (SEQ ID NO: 59 es la proteina, SEQ ID NO: 60 es la secuencia de nudeótidos y SEQ ID NO: 61 es ia secuencia optimizada para Streptomyces). En otra realización más particular el ácido nucleico además comprende la subunidad (I) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41 (proteina IFS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42 (IFS gen) y una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43 (proteina reductasa de G. max), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44 (gen de la reductasa). Preferiblemente la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS+ reductasa optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 (IFS+ reductasa optimizada).
En una realización más particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 63. Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 63 se demuestra que se sintetiza genisteina. La presente invención también se refiere al plásmido pNGM-GEN que comprende dicha secuencia
En otra realización más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (proteina F3 H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (F3'H gen). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3'H optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3!H optimizada). En una realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 64
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 64 se demuestra que se genera erodictiol. La presente invención también se refiere al plásmido pNGM-ERY que comprende dicha secuencia.
En otra realización más particular el ácido nucleico además comprende una subunidad (p) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 65 (proteina FNS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 66 (FNS gen). Preferiblemente la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 (FNS optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 (FNS optimizada). En otra realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 68.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 68 se genera apigenina. La presente invención también se refiere al plásmido pIMG-API que comprende dicha secuencia
La flavona sintasa (FNS, flavone synlhase I) utilizada en la presente invención es de Petrosetinum crispum, número de acceso AY230247.1 (SEQ ID NO: 65 es la proteina, SEQ ID NO: 66 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 67 es la secuencia optimizada para Stneptomyces).
En una realización aún más particular el ácido nucleico además comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (proteína F3'H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (F3H gen). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEO ID NO: 39 (F3'H optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 {CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 (FNS optimizada) y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3 H optimizada).
En una realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 69.
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 69 se demuestra que se sintetiza luteolina. La presente invención también se refiere al plásmido pLT que comprende dicha secuencia.
En una realización aún más particular el ácido nucleico además comprende la subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33 (proteina N3DOX), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34 (N3DOX gen). Preferiblemente la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 {TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 6 (4CL optimizada), la subunidad {d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada) y ¡a subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada).
En otra realización aún más particular el ácido nucleico además comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70 (proteina FLS1), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71 (FLS1 gen). Preferiblemente la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada) y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada).
En una realización aún más particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 73
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 73 se demuestra que se genera kaempferol. La presente invención también se refiere al plásmido pKF que comprende dicha secuencia.
La flavonol sintasa (FLS1 , flavonol synthase, flavanone 3-hydroxylase ) utilizada en la presente invención es de Arabidopsis thaliana, número de acceso Q96330 (SEQ ID NO: 70 es la proteina, SEQ ID NO: 71 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 72 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En otra realización aún más particular el ácido nucleico además comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74 (proteína F3'5'H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75 (F3'5'H gen). Preferiblemente ia subunidad (r) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 76 (F3'5'H optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada), la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO- 72 (FLS1 optimizada) y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 76 (F3'5'H optimizada).
En una realización aún más preferida el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 77. Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 77 se demuestra que se genera miricetina. La presente invención también se refiere al plásmido pM!R que comprende dicha secuencia. La flavonoide 3'-S'-hidroxilasa (F3'5'H, flavonoid 3'-5'-hydroxylase) utilizada en la presente invención es de Petunia x hybrida, número de acceso Z22544.1 (SEQ ID NO: 74 es la protelna, SEQ ID NO: 75 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 76 es la secuencia optimizada para Streptomyces). En una realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37 (proteína F3'H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38 (F3'H gen). Preferiblemente la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3'H optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada) y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3'H optimizada).
En otra realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70 (proteína FLS1), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71 (FLS1 gen). Preferiblemente la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 (TAL optimizada), la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 (4CL optimizada), la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 (CHS optimizada), la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 (CHI optimizada), la subunidad (¡) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 (N3DOX optimizada), la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 (F3'H optimizada) y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 (FLS1 optimizada). En una realización aún más preferida el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 78. Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO. 78 se demuestra que se genera quercetina. La presente invención también se refiere al plásmido pQR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 78.
En otra realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90 (proteina DFR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91 (DFR gen). Preferiblemente la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 (DFR optimizada) Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
La dihidroflavonol reductasa (DFR. dihydrofíavonol 4-reductase) utilizada en la presente invención es de Púnica granatum, número de acceso KF841618 (SEQ ID NO: 90 es la proteina, SEQ ID NO: 91 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 92 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En una realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93 (proteina ANS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94 (ANS gen) Preferiblemente la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 (ANS optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27. la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95
En una realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en. la secuencia SEQ ID NO: 96 (inserto del pPEL).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 96 se demuestra que se genera pelargonidina. La presente invención también se refiere al plásmido pPEL que comprende la secuencia SEQ ID NO: 96.
La antocianidin sintasa (ANS, anthacyanidin synthase) utilizada en la presente invención es de Púnica granatum, número de acceso KF841619 (SEQ ID NO: 93 es la proteina, SEQ ¡D NO. 94 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 95 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En otra realización aun más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74 (proteina F3'5'H), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75 (F3'5'H gen). Preferiblemente la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 (F3'5'H optimizada). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76. Más preferiblemente además comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90 (proteina DFR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO 91 (DFR gen). Más preferiblemente la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 (DFR optimizada). Por lo que la presente invención también se refiere a un ácido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, ia subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, ia subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 Aún más preferiblemente además comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93 (proteina ANS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94 (ANS gen). Más preferiblemente la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 (ANS optimizada). Por lo que también se refiere al ácido nucleico donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3. la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13. la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95. En otra realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 97 (inserto del pDEL).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 97 se demuestra que se genera delfinidina. La presente invención también se refiere al plásmido pDEL que comprende la secuencia SEQ ID NO: 97.
En otra realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90 (proteina DFR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91 (gen DFR). Preferiblemente donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 (DFR optimizado). Más preferiblemente donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27. la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35. la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92. En una realización particular además comprende la subunidad (v) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con ai menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 98 (proteina LAR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 9Θ (gen LAR). Preferiblemente la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 100 (LAR optimizado). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, ia subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, ia subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, ia subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100.
En otra realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en: la secuencia SEQ ID NO: 101 (inserto del pCTC).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 101 se demuestra que se genera catequina. La presente invención también se refiere al plásmido pCTC que comprende la secuencia SEQ ID NO: 101.
La leucoantocianidin reductasa (LAR, leucoanthocyanidin reducíase) utilizada en la presente invención es de Fragaria x ananassa, número de acceso AAZ78662 (SEQ ID NOr 98 es la proteína, SEQ ID NO: 99 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 100 es la secuencia optimizada para Streptomyces)
En otra realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende ia subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con ia secuencia SEQ ID NO: 93 (proteína ANS), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94 (gen ANS). Preferiblemente la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 (ANS optimizado). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 En otra realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en. ia secuencia SEQ ID NO: 102 (inserto dei pCYN).
Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 102 se demuestra que se genera cianidina. La presente invención también se refiere al plásmido pCYN que comprende la secuencia SEQ ID NO: 102.
En otra realización aún más preferida el ácido nucleico comprende la subunidad (w) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 103 (proteina ANR), preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 104 (gen ANR) Preferiblemente la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105 (ANR optimizado). Más preferiblemente la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92, ia subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 y la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105.
En otra realización particular el ácido nucleico comprende, preferiblemente consiste en, ia secuencia SEQ ID NO: 106 (inserto del pECTC). Mediante el uso de la secuencia SEQ ID NO: 106 se demuestra que se genera epicatequina La presente invención también se refiere al plásmido pECTC que comprende la secuencia SEQ ID NO: 106.
La antocianidin reductasa (ANR. anthocyanidin reducíase) utilizada en la presente invención es de Fragarai x ananassa, número de acceso ABD95362 (SEQ ID NO: 103 es la proteina. SEQ ID NO: 104 es la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 105 es la secuencia optimizada para Streptomyces).
En la presente invención los genes pueden tener al menos un sitio de unión al ribosoma (rbs), preferiblemente todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma Por este motivo, en otra realización aún más preferida el ácido nucleico además comprende al menos un sitio de unión a ribosomas (rbs) unido de forma operativa. Preferiblemente el rbs está unido a la posición 5' de cada subunidad, preferiblemente entre el sitio de unión a ribosomas y la subunidad puede haber o no un polinucleótido espaciador. Aún más preferiblemente el rbs se selecciona de la lista que consiste en: rbs se Streptomycos (SEQ ID NO: 79), rbs LMF (SEQ ID NO: 80), rbs consenso para Streptomyces (SEQ ID NO. 81). rbs de genes operón gly (aaaggag), rbs mil (aggagg), rbs tipA (agaagggag), preferiblemente consiste en la secuencia SEQ ID NO: 79.
La secuencia nucleotidica de ia invencién, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, promotores, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, secuencias estabilizadoras, secuencias de detección celular, secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, etc. Estos polinucleótidos adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que pueden ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o para permitir una mejor purificación del mismo.
Por este motivo, una realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al ácido nucleico que además comprende al menos un promotor constitutivo o inducible unido de forma operativa. Preferiblemente el promotor constitutivo o inducible está unido de forma operativa delante de cada subunidad. Más preferiblemente el promotor se selecciona de la lista que consiste en: promotor del gen e.rwE (SEQ ID NO: 82), rp1 M (SEQ ID NO: 83), tipA (SEQ ID NO: 84), tsr (SEQ ID NO: 85). snpA (SEQ ID NO: 86). gylABx (SEQ ID NO: 87), mcrB (SEQ ID NO: 88), aac(2)IV (SEQ ID NO: 89), preferiblemente es el promotor del gen ermE (SEQ ID NO: 82).
En la presente invención el término "promotor" hace referencia a una región del ácido desoxirribonucleico, generalmente "aguas arriba" o "upstream" del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar ia transcripción Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimióles. Ejemplos de promotores procariotas incluyen también, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de ios genes trp, recA, tac, lacl, tet, gal, trc, o tac. Según ia presente invención, el término promotor constitutivo se refiere a un promotor genético que expresa continuamente el gen que regula. El término promotor inducible en la presente invención hace referencia a un promotor genético que activa la expresión del ácido nucleico de la invención al que regula en respuesta a un factor externo (o agente inductor), como por ejemplo una sustancia quimica o una condición ambiental, y que en este caso controla la transcripción del mismo (por ejemplo, isopropil-beta-D- tiogaladopiranósido, nisina o por temperatura). No obstante, es conocido por el experto en la materia que existen secuencias promotoras que se comportan como constitutivas o como inducibles dependiendo de la célula que los expresa. El promotor inducible en la presente invención también puede ser cualquiera de los promotores inducibles conocidos por el experto en la materia, por ejemplo los promotores lacUVS, T7, P1 , msA o del fago 75.
La expresión "unido operativamente" (o "unido de forma operativa"), tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes asi descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un cassette de expresión que comprende ei ácido nucleico del primer aspecto de la presente invención. En adelante "el cassette de expresión de la invención".
El cassette de expresión comprende ios elementos necesarios para la expresión del ácido nucleico de la invención, al estar unido operativamente a elementos de control de la transcripción y/o de traducción, tales como, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, o señal de poliadenilación.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o el cassette de expresión de la presente invención pueden hallarse formando parte de vectores que permitan su multiplicación o clonaje asi como su expresión. Dicho vector puede ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión o un vector recombinante. El clonaje de la secuencia nucleotídica de la invención se puede realizar empleando un vector de expresión o recombinante, o un plásmido. Estos vectores comprenden la secuencia nucleotídica de la invención (o el cassette de expresión que la comprende) y también pueden comprender una serie de secuencias codificantes para aminoácidos que son dianas de corte de proteasas. La ventaja de esta estructura es que, una vez producida la proteina o péptido de fusión, lisado el sistema de expresión y purificada ésta mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cromatografía de afinidad, se puede escindir la proteína portadora del péptido de la invención mediante digestión con una proteasa y repurificar el péptido de la invención mediante el mismo sistema cromatográfico.
Utilizando técnicas bien conocidas, un experto en ia materia sería capaz de obtener un vector adecuado para la clonación y/o expresión del ácido nucleico del primer aspecto de la invención en cualquier microorganismo. El término "vector", tai y como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de transferir secuencias de ácidos nucleicos contenidas en la misma a una célula. Algunos ejemplos de vectores recombinantes son ADN lineal, ADN plasmídico, virus modificados, adenovirus/virus adenoasociados, vectores retrovirales y virales, etc.; todos ellos ampliamente descritos en la literatura y que pueden ser empleados siguiendo técnicas estándar de biología molecular o comprados a proveedores. Entre los vectores virales más usados para la introducción de genes en células de mamífero, se encuentran, vectores de poxvirus, de herpes simplex, adenovirus. vectores asociados a adenovirus, etc.
Los vectores pueden ser introducidos por cualquier método conocido por el experto en la materia, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante transfección, transducción, transformación o infección de las células hospedadoras, como son, aunque sin limitarse a ellas, células vegetales, de mamífero, bacterias, arqueas, levaduras, hongos o células de insecto.
El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de replicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificíales de levadura.
El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un vector de clonación adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula huésped. Dicho ácido nucleico se encuentra, por lo general, unido operativamente a secuencias de control. El término "expresión" se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye la transcripción dei polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm en una proteína o un polipéptido. La expresión puede tener lugar en una célula hospedadora. El término "vector recombinante", tal y como se utiliza en ia presente descripción, se refiere a un vector adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo, de forma que ia expresión del péptido de biosintesis de polifenoles se realiza directamente en el tejido o célula diana. Generalmente dicho vector es un virus o un plásmido. y es producido por ia unión de diferentes fragmentos de ácidos nucleicos a partir de diferentes fuentes y cuya expresión da lugar a un elemento genético móvil que permite la expresión en el tejido o célula diana de las secuencias nucieotidicas o peptidicas de interés. La expresión en un tejido o célula de interés se realiza mediante la unión operativa del polinucléotido a secuencias de control, preferentemente secuencias de control específicas dei tejido o célula donde se quiere expresar; preferentemente dichas secuencias de control son promotores o enhancers. Un vector recombinante según la invención puede, por tanto, emplearse tanto como herramienta biotecnológica para multiplicarlo como emplearse en composiciones farmacéuticas como tratamiento farmacológico per se. Un vector recombinante típico se selecciona del grupo que consiste en un vector lentiviral, un vector adenoviral, un vector de virus adenoasociados, un plásmido, un cósmido. o un cromosoma artificial.
Un tercer aspecto de ia presente invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico del primer aspecto de la presente invención o el cassette de expresión dei segundo aspecto de la presente invención. Preferiblemente el vector es replicativo o integrativo. Más preferiblemente dicho vector se selecciona de la lista que comprende: plásmido, cósmido, bácmido, vector viral o cromosoma artificial. En adelante "el vector de la invención". Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico de la invención o el cassette de expresión de la invención unido en fase de lectura a una secuencia nucieotídica que codifica para una etiqueta de purificación. La expresión "etiqueta de purificación" o "etiqueta de afinidad", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos que ha sido incorporada (generalmente, por ingeniería genética) a una proteina para facilitar su purificación. La etiqueta, que puede ser otra proteina o una secuencia corta de aminoácidos, permite la purificación de la proteina, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. Algunos ejemplos de etiquetas de purificación conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse a: el péptido de unión a caimodulina (CBP), la enzima glutatión-S-transferasa (GST) o una cola de residuos de histidina. Preferiblemente, la etiqueta de purificación consiste en al menos 6 residuos de histidina.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a una proteina de fusión que se genera a partir de la traducción del ácido nucleico del primer aspecto de la invención, es decir la codificada por el ácido nucleico de la invención. En adelante "la proteina de la invención".
Los términos 'secuencia de aminoácidos" o "proteina" se usan aqui de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados. El término "residuo* corresponde a un aminoácido.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, el vector del tercer aspecto de la invención y/o la proteína de fusión del cuarto aspecto de la invención. En adelante, la "célula hospedadora de la invención" o "la célula de la invención" Preferiblemente dicha célula es una bacteria, una levadura, un hongo, una célula vegetal o una célula animal. Más preferiblemente la célula es un actinomiceto, preferiblemente del género que se selecciona de la lista que consiste en Streptomyces, Sacchampolyspora, Micromonospora, Bifídobactenum, Frankia, Streptoverticillium, Kitasatospora, Propionibacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium; y otros como Escherichia, LactobacMus, Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces o BacUlus. En una realización aún más particular del quinto aspecto de la invención la célula es Streptomyces coelicoior, S. albus, S. venezuelae, S. avermitilis, S lividans. S ambofaciens, S. achromogenes, S. clavuligerus, S. griseus, S. kanamyceticus, S. nourset, S scabies, S. violaceoruber o Saccharopolyspora erythraea. El término "célula hospedadora" o "célula huésped" o "célula transformada" incluye cualquier célula cultivable que puede ser modificada mediante la introducción del ácido nucleico de la invención, el cassette de la invención, del vector de la invención, o la proteina de la presente invención no contenidos de manera natural en la célula. Preferiblemente, una célula hospedadora es aquella en la que el polinudeótido de la invención puede ser expresado, dando lugar a un polipéptido estable, modificado post-traduccionalmente y localizado en el compartimento subcelular apropiado. La elección de una célula hospedadora adecuada puede también estar influida por la elección de la señal de detección. Por ejemplo, el uso de construcciones con genes reporteros (por ejemplo. lacZ. luciferasa, timidina quinasa o la proteina verde fluorescente "GFP") puede proporcionar una serial seleccionable mediante la activación o inhibición de la transcripción del gen de interés en respuesta a una proteina reguladora de la transcripción. De cara a conseguir una selección o "screening" Óptimo, el fenotipo de la célula hospedadora deberá ser considerado.
La célula transformada de la invención puede presentar el ácido nucleico del primer aspecto de la invención o la construcción génica clonada en un vector génico capaz de replicarse establemente en dicha célula, como por ejemplo en un plásmido, o el vector del segundo aspecto de ia invención. En consecuencia, la etapa de transformación celular puede llevarse a cabo clonando la construcción genética en el vector (plásmido), que puede ser posteriormente introducido en la célula de destino por un método de conjugación, transformación o electroporación, dependiendo de la célula de destino y del vector de clonación elegido. Alternativamente, la célula transformada puede presentar la construcción genética integrada en el genoma de dicha célula. En ese caso, la etapa de transformación celular a puede llevarse a cabo por alguno de los métodos conocidos para recombinación homóloga o no homóloga, por ejemplo mediante el uso de transposones u otros vectores moleculares que no son capaces de autorreplicarse en la célula de destino, pero que pueden mediar procesos de recombinación entre ácidos nucleicos
En la presente memoria, la expresión "método de conjugación" se refiere a cualquiera de los métodos habitualmente empleados en biología molecular que permiten transferir una molécula de ADN desde una bacteria donadora a una bacteria receptora tras ponerlas en contacto directo.
En la presente memoria, la expresión "método de transformación" se refiere a cualquiera de los métodos habitualmente empleados en biología molecular que permiten introducir una molécula de ADN en una cepa bacteriana tras poner en contacto directo dicha cepa bacteriana con la molécula de ADN
En la presente memoria, la expresión "método de electroporación" se refiere a cualquiera de los métodos habitualmente empleados en biología molecular que permiten introducir una molécula de ADN en una cepa bacteriana tras poner en contacto directo dicha cepa bacteriana con la molécula de ADN y aplicar una corriente eléctrica.
En una realización particular del quinto aspecto de la invención la célula hospedadora puede ser una célula no patógena que pueda ingerirse por un sujeto, por ejemplo bifidobaterias (B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. thermophilum, B. animafís, B. breve, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. adolescentes, B. pullorum o B. ruminantium) También puede ser una célula que se selecciona de la lista que consiste en Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus jahnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnnosus y Lactobacillus salivarium. En otra realización aún más particular, la célula se refiere a L casei BL23. L casei ATCC 334, L casei str. Zang Dichas células pueden ser usadas como probiótico productor de polifenoles directamente en el tracto digestivo de una persona o de un animal.
Por lo tanto la presente invención también se refiere al uso de la célula del quinto aspecto de la invención (no patógena) para la producción de un alimento, un producto lácteo fermentado, suplemento dietético o un producto probiótico comestible. En una realización particular los productos lácteos fermentados son quesos o yogures.
Además, la presente invención también se refiere a un alimento, un producto lácteo fermentado, suplemento dietético o un producto probiótico comestible que comprende el ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión dei segundo aspecto de ia invención, el vector del tercer aspecto de la invención, la proteina del cuarto aspecto de la invención y/o la célula dei quinto aspecto de la invención. En una realización particular los productos lácteos fermentados son quesos o yogures, u otros materiales fermentados que puedan servir de alimento a animales o humanos.
Además la invención también se refiere a un producto vegetal fermentado con las células hospedadoras de la invención. Dicho producto se puede administrar como alimento funcional en animales o humanos. Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso del ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, el vector del tercer aspecto de la invención, la proteína de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o de la célula del quinto aspecto de ia invención para la síntesis de polifenoles (producción de polifenoles). Preferiblemente se sintetiza resveratrol, floretina, garbanzol, dihidrofisetina (fustina), liquiritigenina, daidzeína. (S)-equol, xanthohumol, naríngenina, genisteina, apigenina, luteolina, erodictiol, kaempferol, dihidrokaempferoi, miricetina, dihidroquercetina, quercetina, catequina, epicatequina, cianidina.pelargonidina y/o delfinidina. Dicha síntesis de polifenoles puede ser realizad in vitro o ín vivo (por ejemplo en un humano o animal). Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, el vector del tercer aspecto de la invención, la proteina de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o de la célula del quinto aspecto de la invención como medicamento, es decir, para la elaboración de un medicamento. Preferiblemente para el tratamiento o la prevención de (o para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención o para su uso en el tratamiento o prevención) de enfermedades en las que los polifenoles descritos en la presente invención alivien los síntomas, curen o mitiguen la enfermedad; dichas enfermedades pueden ser cualquiera de las conocidas por el experto en la materia en las que la acción de los polifenoles aquí descritos mejoren el estado de salud del individuo. Por ejemplo pueden ser usados para prevenir y tratar tumores, enfermedades cardiovasculares, osteoporosis, mejorar las funciones cognitivas y la diabetes; como fitoestrógenos, antiinflamatorios, antibacterianos o antivirales. Es decir, se refiere al ácido nucleico del primer aspecto de la invención, al cassette de expresión del segunda aspecto de la invención, al vector del tercer aspecto de la invención, a la proteina de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o a la célula del quinto aspecto de la invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de dichas enfermedades
Además, también se refiere al uso del ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, el vector del tercer aspecto de la invención, la proteína de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o de la célula del quinto aspecto de la invención para la disminución de los signos de la edad y del envejecimiento, es decir para la elaboración de un medicamento para dicho fin. Es decir, se refiere al ácido nucleico del primer aspecto de la invención, al cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, al vector del tercer aspecto de la invención, a la proteína de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o a la célula del quinto aspecto de la invención para su uso en la disminución de los signos de la edad y del envejecimiento.
Por lo tanto otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al ácido nucleico del primer aspecto de la invención, al cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, al vector del tercer aspecto de la invención, a la proteína de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o a la célula del quinto aspecto de la invención.
El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de una enfermedad en el ser humano o en los animales. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones farmacéuticas. El término composición farmacéutica y medicamento se utilizan en esa invención de manera indistinta. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o un medicamento caracterizado por comprender el ácido nucleico de la invención o la proteina o vector o célula que permita su expresión en el organismo a tratar, en una cantidad terapéuticamente activa, de forma que el ácido nucleico ejerza su función en el tejido/célula diana. En una realización preferida, la composición farmacéutica de ia invención además comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable En una realización más preferida, la composición farmacéutica además comprende un adyuvante. En una realización aún más preferida, además comprende otro principio activo (principio activo adicional).
En la presente invención la expresión 'cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, para el caso de una composición terapéutica, por las características propias de los compuestos, la ruta, forma y frecuencia de administración de los mismos, y otros factores, incluyendo la edad, estado del paciente, asi como la severidad de la alteración o trastorno.
El término "excipiente* hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos y activa o ayuda a ia preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función como colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, como por ejemplo, es el caso del fosfato de calcio dibásico, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. El término "vehículo", al igual que el excipiente, hace referencia a una sustancia que se emplea en la composición farmacéutica o medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la presente invención comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.
En esta memoria, el término "adyuvante' se refiere a un agente que aumenta el efecto del ácido nucleico o proteina de la invención cuando es suministrado de forma conjunta a éste o bien formando parte de un mismo protocolo de tratamiento.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la composición farmacéutica de la presente invención son los vehículos conocidos por los expertos en la materia.
Como se emplea aquí, el término "principio activo" ("sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", ' ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo") significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales.
En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se prepara en forma sólida o en suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable.
La composición de esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por ejemplo por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal o subcutánea.
Un séptimo aspecto de ia presente invención se refiere a un método de producción de polifenoles que comprende la utilización del ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, el vector del tercer aspecto de la invención, la proteina de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o de la célula del quinto aspecto de la invención. Preferiblemente se produce resveratrol, floretina, garbanzol, dihidrofisetina (fustina), liquirítigenina, daidzeina, (S)-equol, xanthohumol, naringenina, genisteina, apigenina, luteolina, erodictio!, kaempferol, dihidrokaempferol, miricetina. dihidroquercetina, quercetina, catequina, epicatequina, cianidina, pelargonidina y/o delfinidina.
Un octavo aspecto de la presente invención se refiere a un kit (también puede ser un dispositivo) que comprende el ácido nucleico del primer aspecto de la invención, el cassette de expresión del segundo aspecto de la invención, el vector del tercer aspecto de la invención, la proteina de fusión del cuarto aspecto de la invención y/o de la célula del quinto aspecto de la invención. Un noveno aspecto de ia presente invención se refiere al uso del kit (o del dispositivo) del octavo aspecto de la invención para generar polifenoles. Preferiblemente para generar resveratrol, floretina, garbanzo!, dihidrofisetina (fustina), liquirítigenina. daidzeina, (S)-equol, xanthohumol, naringenina, genisteina, apigenina, luteolina, erodictiol. kaempferol, dihidrokaempferol, miricetina, dihidroquercetina. quercetina, catequina, epicatequina, cianidina, pelargonidina y/o delfinidina.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Estructura general de los flavonoides FIG. 2 Ruta biosirrtética del resveratrol. Se muestra la masa molecular en daltons (Da).
FIG. 3 Plásmido final productor de resveratrol (pSTS6W) que contiene el promotor (permE*), y los genes TAL, 4CL y STS. teres el gen de resistencia a tioestreptona.
FIG. 4 Espectro de masas de un extracto de la cepa productora de resveratrol, S. coelicofor transformado con pSTS6W. El espectro muestra ios picos de uno de los fragmentos (227,3000 > 143,0000) obtenidos tras realizar el análisis MRM Los picos corresponden a los isómeros cis (4,5 min) y trans (5,3 min) de resveratrol. Se muestran ios tiempos de retención.
FIG. S Ruta bioslntesis de la liquiritigenina, daidzelna, naringenina y genisteina. Se muestran las masas moleculares en Da. FIG. 6 Plásmido final pLMF-LQ conteniendo los genes de la ruta de bioslntesis de liquiritigenina (A). Plásmido final pNGM-NAR conteniendo los genes de la ruta de biosintesis de naringenina (B). ApR es el gen de resistencia a ampicilina. tsr es ei gen de resistencia a tioestreptona. FIG. 7 Espectro de masas (EIC). Se muestra el patrón de liquiritigenina superpuesto (pico mayor) a la liquiritigenina producida por S. coelicolor con el plásmido pLMF-LQ (pico menor).
FIG. 8 Plásmidos productores de daidzeina: pLMF55 (integrativo) (A) y pLMF55W (repiicativo) (B). Plásmido productor de genisteina (pNGM-GEN).
FIG. 9 Producción de daidzeina en S. coelicolor transformado con pLMF55W (arriba) y pLMF55 (abajo). Se muestra el tiempo de retención de ia daidzeina. FIG. 10 Espectro de masas mostrando los flavonoides producidos por S. albus conteniendo el plásmido pLMF55 (arriba) y pLMF55W (abajo), tras análisis MRM. Se muestran la daidzeína (DZ), la liquiritigenina (LQ) y la naríngenina (NAR). FIG. 11 Ruta biosintetica de (S)-equol. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 12 Plásmido productor de (S)-equol (pLMF56).
FIG. 13 Espectro de masas de producción de (S)-equol (pico sombreado en gris) por la cepa S coelicoior conteniendo el plásmido pLMF56.
FIG. 14 Posibles rutas de obtención de las flavonas apigenina y luteolina, y de la flavanona eriodictiol, a partir de naríngenina. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 15 Construcción plasmidica final productora de luteolina (pLT) (A), de apigenina (pNGM-AP) (B) y de erodictiol (pNGM-ERY) (C)
FIG. 16 Espectro de masas mostrando los flavonoides producidos por S. albus transformado con el plásmido pLT. Se muestra la luteolina (LT), la quercetina (QR) y la apigenina (API).
FIG. 17 Rutas biosintéticas para la obtención de kaempferol, miricetina y quercetina a partir de naríngenina. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 18 Plásmidos finales productores de kaempferol (pKF) (A), quercetina (pQR) (B) y miricetina (pMIR) (C).
FIG. 19 Especto de masas obtenido tras análisis MRM de pKF transformado en S. albus Se muestra el dihidrokaempferol (DHK). la quercetina (QR), la apigenina (API) y el kaempferol (KF).
FIG. 20 Espectro de masas mostrando los flavonoides detectados por MRM de pQR transformado en S. albus. Se muestra el dihidrokaempferol (DHK), la quercetina (QR), la apigenina (API) y el kaempferol (KF). FIG. 21 Espectro de masas de los resultados obtenidos tras transformar pMIR en S. albus. Se muestra la mirícetina (MIR), el dihidrokaempferol (DHK), la quercetina (QR) y el kaempferol (KF).
FIG. 22 Ruta de bioslntesis de garbanzol y dihidrofisetina. Se muestran las masas moleculares en Da.
FIG. 23 Plásmidos productores de garbanzol (pGR) (A) y de dihidrofisetina (pDF) (B).
FIG. 24 Espectros de masas tras análisis SIM. Espectro correspondiente a un extracto de S. albus conteniendo el plásmido pGR (arriba) y el correspondiente a la cepa control (abajo). Se observan 3 picos nuevos en la cepa con pGR (minutos 3,8; 4,1 y 5,7), alguno de los cuáles podría ser garbanzol
FIG. 25 Superposición de los espectros obtenidos tras análisis SIM de un extracto de S. albus conteniendo el plásmido pDF (color negro) y de la cepa control (color gris). Se observa un pico diferencial en el minuto 4,4 que podría ser dihidrofisetina. FIG. 26 Plásmidos productores de floretina (pJFF-PHLO) (A) y de xanthohumol (pJFF-XAN) (B).
FIG. 27 Espectro de HPLC-MS donde se muestran los tiempos de retención de los iones correspondientes a cada uno de los patrones comerciales usados en este trabajo. Los patrones comerciales fueron adquiridos en Sigma Aldrich Las masas moleculares y su tiempo de retención vienen indicados en la tabla 1.
FIG. 28 Rutas biosintéticas para la obtención de pelargonídina, delfinidina, catequina, cianidina y epicatequina a partir de dihidrokaempferol
FIG. 29 Plásmidos productores de pelargonídina (pPEL) (A), delfinidina (pDEL) (B), catequina (pCTC) (C). cianidina (CYN) (D) y epicatequina (pECTC) (E).
EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
EJEMPLO 1 : síntesis de estilbenos
Para la síntesis de resveratrol se requieren tres enzimas: TAL, 4CL y STS (Figura 2). Muchas de las enzimas pertenecientes a la familia de las TAL son bifuncionales, tienen actividad también sobre la fenilalalina y puede que la preferencia sobre este aminoácido sea mayor, asi que para la elección de nuestro enzima se revisó la bibliografía existente hasta el momento para asegurarnos de que tuviera mayor actividad sobre tirosina. La TAL elegida en la presente invención es la procedente de Rhodobacter capsulatus (SEQ ID NO: 1). Además otra TAL perteneciente a otra especie de Rhodobacter (R sphaeroides) fue utilizada para sintetizar estilbenos y fiavonoides y presenta una elevada homología con la TAL de R. capsulatus (Watts et a/., 2004).
Los otros dos enzimas utilizados fueron la 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 4), y la STS de Vitis vinifera (SEQ ID NO: 7). Este enzima fue elegido ya que es el único que posee la capacidad de sintetizar estilbenos y en la naturaleza se sintetiza principalmente en diversas especies de la familia elegida. Además está ampliamente descrita en la biografía y fue utilizada en diversos estudios para sintetizar resveratrol (Donnez ef a/., 2009).
Para poder expresar correctamente estos tres genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 9). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El plásmido final (Figura 3, pSTS6W, SEQ ID NO: 10) productor de resveratrol es un plásmido replicativo (pWHM3) que contiene un promotor constitutivo (permE") delante de los tres genes transformado en S. coelicolor y en S. albus.
La transformación se realizó en S. coelicolor M 145 y en S. albus J1074 En ambos casos para la producción de metabolitos se crecieron 3x107 esporas en 3 mi de R5A sólido durante una semana a 30° C La extracción se realizó con un volumen de acetato de etilo + 0,1 % ácido fórmico y se evaporó. El extracto seco se resuspendió en 200 μΙ de DMSO Metanol (1 :1) Este protocolo de producción y extracción se realizó también para comprobar la producción del resto de flavonoides sintetizados en este trabajo. La detección se realizó por cromatografía de masas (Figura 4) mediante monitorización de múltiples reacciones (MRM). Los iones obtenidos fueron de 185 y 143. El tiempo de retención fue de 4,63 para la forma cis y 5,14 para la forma trans. En S. coelicolor se detectó resveratrol, pero no en S. albus.
EJEMPLO 2: síntesis de flavanonas El primer paso para la síntesis de isoflavonas es obtener la chalcona de naringenina. En plantas, ocurre de forma muy similar al resveratrol pero en lugar de una estilbeno sintasa se requiere una chalcona sintasa (CHS) (Wang et al., 2011). Gracias a la acción de una chalcona ¡somerasa (CHI) se obtiene la flavanona naringenina, a partir de la cual se pueden obtener numerosos flavonoides (Falcone Ferreyra et a/., 2012). Sin embargo, para la obtención de daidzeina se necesita otra flavanona, la iiquiritigenina. En la síntesis de liquiritigenina está involucrada la chalcona reductasa (CHR) que actúa sobre la chalcona de naringenina eliminando un grupo hidroxilo para formar isoliquiritigenina (chalcona de liquiritigenina). Sobre esta chalcona actúa la CHI, que cierra el anillo central formando la iiquiritigenina. Finalmente, actúa una enzima clave para la síntesis de isoflavonas, la isoflavona sintasa (IFS). Esta enzima cataliza ia formación de isoflavonas a partir de flavanonas migrando el anillo aromático del C2 al C3 (Falcone Ferreyra et al., 2012), dando lugar a la isoflavona daidzeina a partir de la flavanona liquiritigenina (Figura 5) Este paso supone un reto para la síntesis de isoflavonas en microorganismos dado que es una citocromo P450 reductasa unida a la membrana del retículo endoplasmático. En ausencia de CHR, la acción de la IFS directamente sobre ia flavanona naringenina da lugar a la isoflavona genisteína (Figura 5).
En la presente invención, para la obtención de naringenina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO. 26) son de Glycine max. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 27). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final con todos los genes se clonó en el plásmido replicativo pWHM3 (Vara et al 1989) (pNGM-GEN, SEQ ID NO: 63) (Figura 6). Este plásmido se transformó en S. coeiicolor y S. albus, detectándose naringenina por HPLC-MS.
En la presente invención, para la obtención de liquiritigenina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de 5. coeiicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26), CHR (SEQ ID NO: 30) son de Glycine max. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando ios codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 31) Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final con todos los genes se clonó en el plásmido replicativo pWHM3 (pLMF-LQ) (Figura 6). Este plásmido se transformó en S. coeiicolor y S. albus, detectándose liquiritigenina por HPLC-MS (Figura 7).
EJEMPLO 3: síntesis de isoflavonas
En la presente invención para la obtención de daidzeína se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coeiicolor (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHR (SEQ ID NO: 30) y CHI (SEQ ID NO: 26), son de Glycine max, ya que esta especie es una de las principales productoras de isoflavonas. Por el mismo motivo se seleccionó también la IFS de la misma especie (SEQ ID NO: 42 el gen y SEQ ID NO: 41 la proteina) Para que este último enzima fuera funcional se sintetizó una quimera IFS - NADPH P450 reductasa (IFSR) (SEQ ID NO: 48 la proteína y SEQ ID NO: 49 la secuencia de nucleótidos), porque como se menciona anteriormente, la IFS es una enzima que necesita poder reductor, y éste asi se lo proporcionaría la reductasa de la quimera construida (SEQ ID NO: 44 el gen y SEQ ID NO: 43 la proteína). Además, para el diseño de esta quimera IFSR se añadió un linker entre ambas enzimas, inventado con una secuencia aleatoria (que va desde la posición 527 a la 536 de la secuencia SEQ ID NO: 48) que no forma ningún tipo de estructura secundaría. Además se añadieron en el extremo amino-terminal de la IFS varios aminoácidos después de la metionina inicial (12 aminoácidos, posición 2-13), con e! fin de facilitar la unión de esta IFS (y por tanto de su quimera) a la membrana celular de la bacteria (en la célula vegetal, aparece unida a membranas de orgánulos celulares). En la quimera, también se eliminaron la metionina inicial y los siguientes 64 aminoácidos de la NADPH:P450 reductasa. y se comprobó con el programa TMHMM server que no se mantenían en la reductasa aminoácidos que la anclasen a la membrana en la célula bacteriana.
Para poder expresar correctamente estos genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO. 27 y SEQ ID NO: 49). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final con todos los genes se clonó en el plásmido integrativo pKC796 (Kuhstoss ef al., 1991) (pLMF18). Este plásmido se transformó en S. coehcolor pero sólo se observó liquiritigenina. lo que nos indica que esta primera quimera IFSR no es funcional, ya que la liquiritigenina es el precursor inmediatamente anterior.
En un segundo experimento para la obtención de daidzeina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de res vera trol. TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S coehcolor (SEQ ID NO: 5) Los siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHR (SEQ ID NO: 30) y CHI (SEQ ID NO: 26), son de Gtycine max, ya que esta especie es una de las principales productoras de isoflavonas. Por el mismo motivo se seleccionó también la IFS de la misma especie (SEQ ID NO: 42). Para que este último enzima fuera funcional se sintetizó una nueva quimera IFS - NADPH:P450 reductasa (IFSm) (SEQ ID NO: 46 la secuencia de nucleótidos y SEQ ID NO: 45 la secuencia de proteínas), porque como se menciona anteriormente, la IFS es una enzima que necesita poder reductor, y éste asi se lo proporcionaría la reductasa de la quimera construida (SEQ ID NO: 44) Además, para el diseño de esta quimera se añadió el mismo linker entre ambas enzimas, inventado con una secuencia aleatoria (que va desde la posición 502 a la 510 de la secuencia SEQ ID NO: 45) que no forma ningún tipo de estructura secundaria. Pero en esta ocasión se eliminaron del extremo amino-terminal de la IFS los primeros 19 aminoácidos después de la metionina inicial, con el fin de evitar la unión de esta IFS (y por tanto de su quimera) a la membrana celular de la bacteria, y que actuase libre en el citoplasma (en la célula vegetal, esos aminoácidos la mantienen unida a membranas de orgánulos celulares, inexistentes en bacterias). En la quimera, también se eliminaron la metionina inicial y los siguientes 64 aminoácidos de la NADPH P450 reductasa, y se comprobó con el programa TMHMM server que no se mantenían en la reductasa aminoácidos que la anclasen a la membrana en la célula bacteriana Para poder expresar correctamente estos genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 46). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
Se construyeron así dos nuevos plásmidos, uno integrativo (pLMF55) y otro replicativo (pLMF55W) (Figura 8) y se transformaron en S. coelicoior y S. albus. En ambos casos se observó producción de daidzeina, lo que nos indica la funcionalidad de la nueva quimera. En S. coelicoior sólo se observa el producto final (Figura 9), la daidzeina. Sin embargo, en S. albus también se detectó naringenina y liquirítigenina (Figura 10). Los iones obtenidos por MRM fueron 151 y 119,1 para naringenina; 119 y 90,9 para liquirítigenina; 132 y 91 para daidzeina. Los tiempos de retención fueron 5,64; 4,88 y 4,75 respectivamente En un experimento diferente, para la obtención de genistefna, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicoior (SEQ ID NO: 5). Los siguientes genes. CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26) y la quimera IFSm (SEQ ID NO: 46), son de Glycine max, ya que esta especie es una de las principales productoras de isoflavonas.
Para poder expresar correctamente estos genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 46). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82. Se construyó asi un nuevo plásmido (pNGM GEN) (Figura 8) (SEQ ID NO: 63) y se transformó en S. coelicolor y S. albus Los extractos se analizaron con HPLC-MS y en ambos casos se observó producción de genisteina.
Recientemente se describió la ruta de biosintesis del (S)-equol (Figura 11) en distintas bacterias anaerobias, encargadas de producir (S)-equol a partir de daidzeina en el intestino (Kim et al., 2009; Tsují ef al , 2012). Además se identificaron las enzimas implicadas en su síntesis en Lactococcus garviae y se comprobó su actividad (Shimada et al. , 2010, 2011). También se identificó posteriormente una racemasa necesaria para una síntesis de (S)-equol más efectiva (Shimada et al. , 2012).
Decidimos partir de los plásmidos productores de daidzeina para crear uno productor de (S)-equol. Para ello se clonaron los 4 genes implicados en su síntesis descritos en l actococcus reductasa de daidzeina (DZNR) (SEQ ID NO. 51), reducíase de dihidrodaidzeína (DHDR) (SEQ ID NO: 54), reductasa de tetrahidrodaidzeina (THDR) (SEQ ID NO: 57), y la racemasa de dihidrodaidzeína (RAC) (SEQ ID NO: 60). Estos genes se sintetizaron optimizando los codones (SEQ ID NO: 52. SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 61 , respectivamente), se Íes añadió el rbs (SEQ ID NO: 79) y un promotor permE* (SEQ ID NO: 82) situado entre la IFSm y la DZNR (Figura 12).
Este nuevo plásmido (pLMF56, SEQ ID NO 62) (Figura 12), una vez transformado en S. coelicolor, producía (S)-equol, cuyo pico era observable en los extractos de esta cepa analizados por HPLC-MS (Figura 13).
EJEMPLO 4: síntesis de flavonas Las flavonas se obtienen a partir de la naringenina gracias a la acción de dos enzimas: la flavona sintasa (FNS), que lleva a la síntesis de la apigenina (la primera de las flavonas de la ruta biosintética) y la flavonoide-3-hidroxilasa (F3 H), que si actúa sobre la naringenina produce una flavanona (eríodictiol) pero es capaz de añadir un grupo hidroxilo a la apigenina transformándola en luteolina (Figura 14). Con el fin de sintetizar la flavona apigenina. se clonaron los genes que llevan a la síntesis de naringenína (TAL de R capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicoior (SEQ ID NO: 5); CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26) de Glycine max) junto con la FNS de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 66) en el plásmido replicativo pWHM3 junto con el promotor permE* (SEQ ID NO: 82) (pNGM-API) (Figura 15) y este plásmido se transformó en S. coelicoior y S. albus. Todos los genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67) y contienen el rbs de las ocasiones anteriores (SEQ ID NO: 79).
Tras la extracción de ios compuestos, se realizó una cromatografía de masas mediante análisis MRM para identificar la presencia de apigenina. Los iones obtenidos fueron de 150,9 y 117 para apigenina y el tiempo de retención fue 5,6 min. Se detectaron niveles elevados de apigenina.
Con el fin de sintetizar la flavanona eriodictiol, se clonaron los los genes que llevan a la síntesis de naringenina (TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicoior (SEQ ID NOt 5); CHS (SEQ ID NO. 12) y CHI (SEQ ID NO: 26) de Glycine max) junto con la F3'H de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 38) en el plásmido replicativo pWHM3 junto con el promotor permE* (SEQ ID NO: 82) (pNGM- ERY) (Figura 15) y este plásmido se transformó en S. coelicoior y S. albus. Todos los genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 39) y contienen el rbs de las ocasiones anteriores (SEQ ID NO: 79).
Tras la extracción de los compuestos, se realizó una cromatografía de masas mediante análisis MRM para identificar la presencia de eriodictiol. Se detectó el pico correspondiente a eriodictiol. Con el fin de sintetizar luteolina se clonaron los genes que llevan a la síntesis de naringenina (TAL de R capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicoior (SEQ ID NO: 5); CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26) de Glycine max) junto con la FNS de Petroseünum crispum (SEQ ID NO: 66) y la F3 H de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 38) en el plásmido replicativo pWHM3 junto con el promotor permE* (SEQ ID NO: 82) (pLT) (Figura 15) y este plásmido se transformó en S. coelicoior y S. albus Todos los genes se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ 10 NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 39) y contienen el rbs de las ocasiones anteriores (SEQ ID NO: 79).
Tras la extracción de los compuestos, se realizó una cromatografía de masas mediante análisis MRM para identificar la presencia de apigenina, eriodictiol y luteolina. Los iones obtenidos fueron de 150,9 y 1 17 para apigenina; 150,9 y 135 para ediodictiol y 151 ,2 y 131 ,1 para luteolina. Los tiempos de retención fueron 5,6; 4,9 y 4,95 respectivamente.
Se detectaron niveles elevados de apigenina, pero también se detectó luteolina, eriodictiol y además niveles similares de quercetina (Figura 16). EJEMPLO 5: síntesis de Pavonóles
En la síntesis de flavonoles están implicadas varias enzimas. La primera de ellas es la naringenina-3-dioxigenasa (N3DOX), que hidroxila la naringenina en el C3 para dar lugar al dihidrokaempferol. La flavonol sintasa (FLS1) cataliza la formación de kaempferol a partir de su forma dihidro A partir de este flavonol se origina otro, la miricetina, gracias a la acción de la flavonoide-3\5'-hidroxil8sa (F3'5'H). A partir del dihidrokaempferol, por la acción de la flavonok.e-3 -hidroxilasa (F3 H) se origina dihidroquercetina, y sobre ésta actúa la flavonol sintasa (FLS1) generando quercetina (Figura 17).
Para producir estos flavonoides se sintetizaron los genes N3DOX de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 34). FLS1 (SEQ ID NO: 71 ) y F3'H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana, F3'5'H de Petunia x hybrid (SEQ ID NO: 75) Se optimizaron los genes para la síntesis en Streptomyces (SEQ ID NO: 35. SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 76). Se construyeron tres plásmidos: pKF para ia síntesis de kaempferol (SEQ ID NO: 73), pQR para la síntesis de quercetina (SEQ ID NO: 78) y pMIR para la síntesis de miricetina (SEQ ID NO: 77). Todos ellos son plásmidos replicativos (pWHM3) y contienen el promotor permE*. el el rbs seleccionado (SEQ ID NO: 79), y los genes que generan naringenina (TAL, 4CL, CHS y CHI) además de la N3DOX y FLS1 en el caso de pKF; y adidonalmenie F3 H (pQR) o F3'5'H (pMIR) (Figura 18).
Los piásmidos se transformaron en S. coelicolor y 5. albus y se comprobó la producción de flavonoides mediante cromatografía de masas. Se realizó un análisis MRM y los iones obtenidos fueron: 117 y 93 para el kaempferol; 179,1 y 151,1 para la quercetina; 179 y 151 para la miricetina. Los tiempos de retención fueron 5,81; 5.02 y 4,33 respectivamente. En los extractos de cepas que contenían el plásmido pKF (Fig. 18A) se detectaron niveles elevados de kaempferol y residuos de su precursor, el dihidrokaempferol. Además se detectó quercetina y apigenina aunque en muy bajas cantidades (Figura 19). En los extractos de cepas que contenían el plásmido pQR (Fig. 18B) se detectaron niveles elevados de quercetina y kaempferol. También se observó dihidrokaempferol y apigenina aunque en pequeñas cantidades (Figura 20)
En los extractos de cepas que contenían el piásmido pMIR (Fig. 18C) se detectó mayoritariamente quercetina, seguido de miricetina. En menor medida se detectaron intermediarios de la ruta biosintética, el dihidrokaempferol y el kaempferol (Figura
21).
EJEMPLO 6: síntesis de dlhidroflavonoles
Partiendo de la flavanona liquiritigenina y utilizando tan sólo uno o dos de los genes empleados para sintetizar los demás flavonoides descritos anteriormente se pueden obtener de forma sencilla otros dos flavonoides: el garbanzol y la dihidrofisetina (Figura 22).
Para sintetizar garbanzol se construyó un plásmido replicativo que contiene los genes implicados en la síntesis de liquiritigenina, que incluyen los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulalus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5), y ios siguientes genes, CHS (SEQ ID NO: 12), CHI (SEQ ID NO: 26), CHR (SEQ ID NO: 30) de Glycine max. Además se incluyó el gen N3D0X de Petroselinum crispum (SEQ ID NO: 34). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO. 31 y SEQ ID NO: 35). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final con todos los genes se clonó en el plásmido replicativo pWHM3 (pGR) (SEQ ID NO: 36) (Figura 23). Este plásmido se transformó en S. albus, detectándose por HPLC-MS tres picos nuevos con masa molecular idéntica al garbanzo! (272,25 Da), que no existen en la cepa control (contiene sólo el vector vacio) y que son probablemente garbanzol e isómeros del mismo (Figura 24). No existe patrón comercial para garbanzo!. Partiendo de este plásmido pGR se construyó el que lleva a la síntesis de dihidrofisetina (pDF, (SEQ ID NO: 40) añadiendo tan sólo un gen más, la F3'H (SEQ ID NO: 38; optimizado SEQ ID NO: 39) (Figura 23).
El plásmido pDF se transformó en S.albus, al igual que el plásmido control sin ningún gen. Con los extractos de estas cepas se realizó un análisis por masas de tipo SIM (masa del ion seleccionado) y se comparó la cepa con el plásmido pDF con la cepa control. Se observó la presencia de un pico diferencial no presente en el control y correspondiente a la masa molecular de la dihidrofisetina (288,25 Da). Esto nos indica que ese pico podría ser dihidrofisetina (Figura 25). No existe patrón comercial para este compuesto.
EJEMPLO 7: síntesis de otras chalconas
En la presente invención, para la obtención de la chalcona denominada floretina, se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizó el gen CHS (SEQ ID NO. 12) de Gfycine max, común con la síntesis de la chalcona de naringenina. Y finalmente se añadió el gen de la alqueno reductasa ALKR (SEQ ID NO: 15) procedente de Malus domestica. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Stmptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEO ID NO: 6, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 16). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ríbosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82. La construcción final con todos los genes se clonó en el plásmido replicativo pWHM3 (pJFF-PHLO, SEQ ID NO: 17) (Figura 26). Este plásmido se transformó en S. coelicolor y S. atóus, detectándose floretina por HPLC-MS.
En otro experimento, para la obtención de la chalcona denominada xanthohumol, se utilizaron ios dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizó el siguiente gen, CHS (SEQ ID NO: 12) de Glycine max, común con la síntesis de la chalcona de naringenina. Y finalmente se añadieron los genes de la prenil- transferasa PRTase (SEQ ID NO: 19) y el de la O-metil-transferasa OMTase (SEQ ID NO. 22), ambos procedentes de Humulus lupulus. Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Stroptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 23). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final con todos los genes se clonó en el plásmido replicativo pWHM3 (pJFF-XAN, SEQ ID NO: 24) (Figura 26). Este plásmido se transformó en S. coelicolor y S. albus, detectándose xanthohumol por HPLC-MS. EJEMPLO 8: síntesis de antocianidinas
En la síntesis de antocianidinas están implicadas varias enzimas. La primera de ellas es la dihidroflavonol reductasa (DFR), que reduce el grupo ceto situado en el C4 de un dihidroflavonol, para dar lugar a una leucoantocianidina. La antocianidin sintasa (ANS) cataliza la formación de un heterociclo muy singular, donde el oxígeno del anillo posee una carga neta positiva, al contrario que todo los demás flavonoides. Ejemplos típicos son la pelargonidina, la delfinidina y la cianidina. A partir de estas antocianidinas primarias se originan otras, como la catequina y la epicatequina, gracias a la acción de la leucoantocianidin reductasa (LAR), y de la antocianidin reductasa (Figura 28) Para producir estos flavonoídes se sintetizaron los genes DFR de Púnica granatum (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94); y los genes de Fragaria x ananassa LAR (SEQ ID NO: 99) y ANR (SEQ ID NO: 104). Se optimizaron los genes para la síntesis en Straptomyces (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 105). Se construyeron cinco plásmidos: pPEL para la síntesis de pelargonidma (SEQ ID NO: 96), pDEL para la síntesis de delfinidina (SEQ ID NO: 97), pCYN para la síntesis de cianidina (SEQ ID NO: 102), pCTC para la síntesis de catequina (SEQ ID NO: 101), y pECTC para la síntesis de epicatequina (SEQ ID NO: 106). Todos ellos son plásmidos replicativos (pWHM3) y contienen el promotor permE*, el rbs seleccionado (SEQ ID NO: 79), y los genes que generan dihidrokaempferol (TAL, 4CL, CHS, CHI y N3DOX) además de la F3'5'H en el caso de pDEL, y F3 H en el caso de pCYN, pCTC y pECTC (Figura 29) En un experimento de la presente invención, para la obtención de la antocianidína denominada pelargonidina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la síntesis de dihidrokampferol. Además se añadieron los genes de Púnica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 95) Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final se donó en el plásmido replicativo pWHM3, generando pPEL (SEQ ID NO: 96) (Figura 29A), que se transformó en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observó pelargonidina por HPLC-MS.
En otro experimento de la presente invención, para la obtención de la antocianidína denominada delfinidina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizaron ios genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la síntesis de dihidrokampferol. Se añadió además el gen F3'5'H (SEQ ID NO: 75) de Petunia x hy brida. Y finalmente se añadieron los genes de Púnica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Síroptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO 95). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final se clonó en el piásmido replicativo pWHM3, generando pDEL (SEQ ID NO: 97) (Figura 29B), que se transformó en protopiastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observó deifinidina por HPLC-MS. En otro experimento de la presente invención, para la obtención de ia antocianidina denominada cianidina. se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizaron los genes de Glycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con ia síntesis de dihidrokampferol. Se añadió además el gen F3'H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana. Y finalmente se añadieron los genes de Púnica granatum DFR (SEQ ID NO: 91 ) y ANS (SEQ ID NO: 94). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO. 95) Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82
La construcción finai se clonó en el piásmido replicativo pWHM3, generando pCYN (SEQ ID NO: 102) (Figura 29D), que se transformó en protopiastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observó cianidina por HPLC-MS.
En otro experimento de la presente invención, para ia obtención de la antocianidina denominada catequina se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R. capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizaron los genes de Gtycine max CHS (SEQ ID NO. 12) y CHI (SEQ ID NO: 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la síntesis de dihidrokampferol. Se añadió además el gen F3'H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana. Y finalmente se añadió el gen de Púnica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y el gen de Fragaria x ananassa LAR (SEQ ID NO: 99). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaron optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 100). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final se clonó en el plásmido replicativo pWHM3, generando pCTC (SEQ ID NO: 101) (Figura 29C), que se transformó en protoplastos de S. coelicolor y S albus En los extractos de estos cultivos se observó catequina por HPLC-MS.
Por último, en otro experimento de la presente invención, para la obtención de la antocianidína denominada epicatequina. se utilizaron los dos primeros genes, comunes con la síntesis de resveratrol: TAL de R capsulatus (SEQ ID NO: 2), 4CL de S. coelicolor (SEQ ID NO: 5). Además se utilizaron los genes de Gtycine max CHS (SEQ ID NO: 12) y CHI (SEQ ID NO. 26), junto con el gen N3DOX (SEQ ID NO: 34) de Petroselinum crispum, comunes con la síntesis de dihidrokampferol. Se añadió además el gen F3 H (SEQ ID NO: 38) de Arabidopsis thaliana. Y finalmente se añadieron los genes de Púnica granatum DFR (SEQ ID NO: 91) y ANS (SEQ ID NO: 94), junto con el gen de Fragaria x ananassa ANR (SEQ ID NO: 104). Para poder expresar correctamente estos genes, se sintetizaran optimizando los codones para su expresión en Streptomyces (ver SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35. SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 105). Además todos ellos contienen el sitio de unión al ribosoma (RBS) (SEQ ID NO: 79). El promotor utilizado fue el SEQ ID NO: 82.
La construcción final se clonó en el plásmido replicativo pWHM3, generando pECTC (SEQ ID NO: 106) (Figura 29E), que se transformó en protoplastos de S. coelicolor y S. albus. En los extractos de estos cultivos se observó epicatequina por HPLC-MS. EJEMPLO 9: detección de polifenoles Con el fin de comparar los diversos polifenoles estudiados en la presente invención, se puso a punto un sistema para su separación e identificación por medio de HPLC- MS utilizando patrones comerciales disponibles para la mayoría de ellos El equipo utilizado fue 1290 Infinity de Agilent Technologies, 6460 Triple Quadrupole LC/MS con fuente de ionización por electrospray. La columna utilizada fue una Zorbax Eclipse Plus C18 de Agilent, de 1.8 μητι y 50 x 2,1 mm. La temperatura de la columna fue de 30 °C. Los solventes utilizados fueron agua con 0, 1% de ácido fórmico y acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico. Las condiciones fueron 0-10% (porcentaje de acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico) durante 1 min, 10-35% durante 3 min, 35% durante 1 min. 35-80% durante 3 min, 80% durante 2 min y 80-10% durante 1 min. El flujo se mantuvo constante a 0,3 ml/min. Estas condiciones fueron las mismas para todos los compuestos. La tabla 1 muestra la masa molecular detectada y el tiempo de retención para cada uno de ellos.
La figura 27 muestra un espectro de todos ellos analizados en un único experimento de HPLC-MS.
Tabla 1 : detección de polifenoles
Figure imgf000057_0001
Como se ha indicado anteriormente, en los ejemplos proporcionados se optimizaron ios genes para poder ser expresados en Straplomyces
Tabla 2. Identidades de nucleotidos entre genes originales y los optimizados en la presente invención
Figure imgf000058_0001
MATERIAL Y MÉTODOS:
1.1 CEPAS BACTERIANAS Y PLÁSMICOS Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este trabajo se muestran en las tablas 3 y 4 respectivamente.
Tabla 3: cepas utilizadas en la presente invención:
Figure imgf000059_0001
Tabla 4. plásmidos utilizados en la presente invención:
Figure imgf000059_0002
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
1.2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Las cepas de E. coíi se crecieron a 37 °C en medio sólido (TSA), o en agitación (250 rpm) en el caso de medio líquido (TSB o LB). S coelicotor se creció a 30 °C en medio sólido (SFM para esporulación, o R5A agar para producción), o a 250 rpm en medio liquido (R5A para producción, o YEME 34% sacarosa para generar protopiastos). S. albus se creció en las mismas condiciones que S. coelicolor, pero el medio de esporulación en este caso fue Bennet y el YEME utilizado es al 17% sacarosa.
Para la conservación de las cepas, se utilizó glicerol 25% (para E cotí y esporas de Streptomyces) o sacarosa 10,3% (para micelio de Streptomyces). Todos los antibióticos fueron suministrados por Applichem y una vez preparados se almacenaron a -20 °C.
Para la selección de clones positivos en E cali se utilizaron los siguientes antibióticos: ampicilina (100 mg/ml, Ap) a una concentración final de 100 pg/ml, apramicina (200 mg/ml, Am) a concentración final de 40 pg/ml, kanamicina (50 mg/ml, Kn) a concentración final de 50 ug/mi. Para la cepa de E. cotí ET12567 además se añadió cioranfenicol (50 mg/ml) a una concentración final de 25 pg/ml. Para seleccionar los plásmidos lacZ+ se añadió X-Gal (40 mg/mi) a una concentración final de 20 Mg/ml. Para la selección en Streptomyces se utilizaron los siguientes antibióticos: apramicina (200 mg/ml) a concentración final de 40 pg/ml y tiostreptona (50 mg/ml) a concentración final de 50 pg/ml. 1.3 PREPARACIÓN DE PROTOPLASTOS DE 5. coellcolor y S. albus.
El protocolo seguido para la preparación de protoplastos de ambas especies está basado en el descrito en Practical Streptomyces Genetics (Kieser y Bibb, 2000) Etapa 1 para S. albus:
Se inoculan 100 μΙ de esporas en un matraz de 150 mi estéril
Figure imgf000062_0001
con 10 mi de TSB. Se incuba a 30 °C durante 24 h a 250 rpm
Tras la incubación se añaden (por matraz) 750 μΙ de este preinóculo de micelio crecido, en matraces invaginados de 250 mi con 25 mi de YEME 17%, más 937 μΙ de glicina al 20% y 50 μΙ de MgCI2 2.5M. Se incuban durante 36 h a 30 °C en agitación.
Etapa 1 para S. coelicolor.
Se inoculan 100 μΙ de esporas (25 10e UFCs) en cada matraz invaginado de 250 mi con 25ml de YEME 34%, más 625 μΙ de glicina al 20% y 50 μΙ de MgCI2 2,5M. Se incuban durante 36 h a 30 °C en agitación.
Etapa 2 (igual para ambas especies):
Transferir el contenido de los matraces a tubos Falcon de 50 mi y centrifugar a 8000 rpm durante 5 min a 4 °C.
Eliminar sobrenadante y resuspender el pellet en sacarosa al 10,3%. Centrifugar igual que en paso anterior.
Repetir el lavado con sacarosa y eliminar el sobrenadante
Añadir a cada pellet 10 mi de tampón P ya suplementado y con lisozima (1 mg/ml). Incubar entre 60 y 90 min a 30 °C en estático.
Observar al microscopio para comprobar que se han generado protoplastos y filtrar con jeringas de algodón.
Centrifugar a 3500 rpm durante 10 min a 4 °C, descartar sobrenadante, resuspender pellet y añadir 5 mi de tampón P suplementado.
- Repetir paso anterior 2 veces. Resuspender pellet de protoplastos en 400 μΙ de tampón P suplementado y hacer alícuotas de 200 μΙ.
Almacenar a -80 °C. 1.4 TRANSFORMACIÓN DE PROTOPLASTOS DE Streptomyces.
Para transformar se añaden 500 μΙ de PEG6000 y 20 μΙ de ADN plasmídico por cada alícuota descongelada de protoplastos (200 μΙ). En el caso de S. coelicolor, el ADN tiene que provenir de la cepa de E. coli ET12567. Las células se siembran en 4 placas de medio R5 y se incuban a 30 °C entre 16-24 h hasta observar la formación de micelio sustrato bien desarrollado. Entonces se añaden 1 ,5 mi de agua filtrada con el antibiótico de selección por cada placa. Se incuban a 30 °C hasta observar la formación de colonias, que se pican para esporular en el medio correspondiente para cada especie (medio Bennet para S. albus y SFM para S. coelicolor. Una vez esporuladas, se recogen las esporas con bisturí y se almacenan en glicerol 50% a - 20 °C.
1.5 REACTIVOS PARA MANIPULACIÓN DE ADN Las soluciones empleadas para la obtención de ADN plasmidico en las bacterias señaladas anteriormente se obtuvieron de casas comerciales (VWR, ThermoFisherScientific) y se siguió el protocolo descrito por el fabricante para la obtención del mismo. El protocolo seguido para extraer ADN genomico de Streptomyces está basado en el método de salting oui descrito en Practical Streptomyces Genetics (Kieser y Bibb, 2000).
Para la extracción de ADN plasmidico de Streptomyces se utilizó el sistema de PrepMan® Ultra de Life Technologies siguiendo el protocolo de la casa comercial.
1.6 MANIPULACIÓN IN VITRO DEL ADN
Las enzimas utilizadas para realizar las digestiones de ADN fueron de Takara y EURx. Los tampones de digestión fueron de Roche y se utilizaron siguiendo los protocolos recomendados por las casas comerciales. La RNAsa fue de Roche y se preparó a una concentración de 5 mg/ml, que se almacena a -20 °C. Para preparar la RNAsa se utilizaron 50 mg de RNAsa, 9,9 mi de agua MilliQ y 100 μΙ de CH3COONa 3M pH=6, que se hirvieron durante 10 min y se alicuotaron a -20 °C.
Para las digestiones de comprobación de minipreparaciones de AON plasmídico o genómico se incubaron 7 μ) de ADN, 1 μΙ de tampón, 1 μΙ de RNAsa y 1 μΙ de enzima/s a 37 °C (excepto Smal que se incubó a 30 °C) durante 1h. Las digestiones para la obtención de bandas o plásmidos para realizar ligaciones se llevaron a cabo sobre un volumen final de 100 μΙ.
Para defosforilar extremos digeridos de ADN plasmídico se utilizó la fosfatasa alcalina (5 U/μΙ) de EURx con su correspondiente tampón. Se utilizaron 50 μΙ de ADN ya digerido y purificado, 6 μΙ de tampón y 4 μΙ de fosfatasa. Esta mezcla se incubó a 37 °C durante 7 min y se purificó (ver abajo).
1.7 ELECTROFORESIS DE ADN.
Los fragmentos de ADN obtenidos tras las digestiones o amplificación por PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa en TBE 1x (10 mV/cm).
1.8 PURIFICACIÓN DE ADN
Para purificar los fragmentos de ADN obtenidos a partir de geles de agarosa se utilizó el kit comercial "Gene JET Gel Extraction Kit" de Thermo Scientific, siguiendo el protocolo recomendado.
Para purificar el ADN obtenido tras amplificación por PCR, digestión o tras una defosforilación se usó el kit comercial "GeneJET PCR Purificatíon Kit" de Thermo Scientific siguiendo el protocolo recomendado.
Para la purificación de ADN para ser usado en secuenciación se usó el kit comercial "GeneJet Plasmid Miniprep Kit'' de Thermo Scientific siguiendo el protocolo recomendado. 1.9 LIGACIÓN DE BANDAS DE ADN
Para la realizar las ligaciones se evaluó previamente la cantidad de vector y banda mediante una electroforesis. La ligación se realizó sobre un volumen final de 10 μΙ. Se añadió 1 μΙ de ligasa, 1 μΙ de tampón ligasa y una proporción 3:1 de banda- vector. La ligasa utilizada fue la "T4 DNA ligase" de Fermentas. Para ligaciones con extremos cohesivos se usó la ligasa de 1 U/μΙ y para romos la de SU/μΙ y su correspondiente tampón. Las ligaciones se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, o un mínimo de 4h para las ligaciones de extremos romos.
1.10 SECUENCIACIÓN DE ADN
Las muestras de ADN se secuenciaron en la Unidad de Secuenciación de los Servicios Cientifico-Tecnológicos (SCTs) de la Universidad de Oviedo, utilizando el equipo de análisis genético ABI PRISM® 3130x1 (Applied Biosystems). Este equipo está basado en el mareaje por fluorescencia de las moléculas de ADN y su posterior separación mediante electroforesis capilar.
1.11 ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS Y AMINOÁCIDOS
Las secuencias obtenidas tras el análisis de secuenciación se leyeron utilizando el programa BioEdit Sequence Alignment Editor y se utilizaron las herramientas web de comparación de secuencias ClustalW del Instituto Bioinformático Europeo EMBL- EBI y BLASTN del NCBI. También se usó la herramienta web NEBcutter de New England Biolabs para analizar los sitios de corte.
Para el estudio de secuencias de aminoácidos se utilizó la herramienta BLASTP del NCBI. El programa Clone Manager Basic 9 fue utilizado para la planificación de estrategias de clonación y diseño de nuevos plásmidos.
1.12 CUANTIFICACIÓN DE ESPORAS. Para cuantificar las esporas se crecieron las cepas productoras en 10 placas de su medio correspondiente de esporulación (SFM para S. coelicolor y Bennet para 5. aibus) hasta observar esporulación. Las esporas se recogieron con bisturí raspando la superficie de la placa, utilizando por cada placa 5 mi de una solución de glicerol 25% 0,001% de tritón X-100. Estas soluciones con las esporas recogidas se pasaron a tubos Falcon de 50 mi. que se agitaron con vórtex durante 5 min, antes de filtrar las soluciones de esporas (y restos de micelio) a través de jeringas con algodón esterilizadas. Las soluciones filtradas se centrifugaron 10 min a 8000 rpm y se lavaron los pelleta dos veces con MilliQ. El pellet de esporas final se resuspendió en H20 MilliQ en un volumen final entre 0,5 y 2 mi en función del tamaño del pellet. Estas soluciones se almacenaron a 4 °C para su posterior uso.
Para realizar el contaje de esporas (en realidad UFCs) se hicieron diluciones seriadas partiendo de las esporas almacenadas en H20 MilliQ, que se sembraron por duplicado en placas de TSA Las placas se incubaron durante 2 días a 30 °C y se contaron las colonias
1.13 EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS DESDE CEPAS RECOMBINANTES DE Streptomyces.
Para la producción y extracción de compuestos se sembraron 107 esporas/ml en R5A sólido y líquido, y se dejaron crecer durante 5 días a 30 °C
La extracción se realizó añadiendo 1 volumen de una mezcla de acetato de etilo con 0,1% de ácido fórmico, e incubando todo a temperatura ambiente y en agitación durante 1 h. Posteriormente, esta mezcla de cultivo y solvente se centrifugó a 6000 rpm durante 5 min. El acetato de etilo se pasó a tubos eppendorf y se evaporó en speed-vac. El extracto seco se almacenó a -20 °C hasta su uso. 1.14 CROMATOGRAFÍA HPLC Y HPLC-MS.
Para el análisis de los compuestos extraídos de las cepas recombinantes se realizaron análisis por HPLC utilizando el equipo de Agiient Technologies, 1260 Infinity La columna utilizada fue una columna de fase reversa de Teknokroma de 5μιτι y 25 x 0,46 mm. Las fases móviles utilizadas fueron: agua/ácido acético (98:2). agua/acetonitrilo/ácido acético (73:25:2) y metanol. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: gradiente de flujo de 1ml/min 100-20% de agua/acético y 0-80% de agua/acetonitrílo/acético durante 55 min; flujo de 1 ,2 ml/min y 20-10% de agua/acético y 80-90% de agua/acetonitriio/acético durante 2 min; mismo flujo y 10% de agua/acético y 90% de agua/acetonitrilo/acético durante 13 min ; mismo flujo y 10-5% de agua/acético y 90-95% de agua/acetonitrilo/acético durante 10 min; flujo de 1 ml/min y 5-0% de agua/acético, 95-0% de agua/acetonitrílo/acético 0-100% de metanol durante 20 min; mismo flujo y 0-100% de agua/acético y 100-0% de metanol durante 5 min y finalmente mismo flujo y 100% de agua/acético durante 15 min. La temperatura de la columna fue de 20 °C. Estas condiciones fueran las mismas para todos ios compuestos sintetizados en este trabajo.
Para el análisis por cromatografía de masas se utilizó el equipo de Agilent Technologies 1290 Infinity, 6460 Triple Quadrupole LC/MS con fuente de ionización por electrospray. La columna utilizada fue una Zorbax Eclipse Plus C18 de Agilent, de 1 ,8 μm y 50 x 2,1 mm. La temperatura de la columna fue de 30 °C. Los solventes utilizados fueron agua con 0,1% de ácido fórmico y acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico. Las condiciones fueron 0-10% (porcentaje de acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico) durante 1 min, 10-35% durante 3 min, 35% durante 1 min. 35-80% durante 3 min, 80% durante 2 min y 80-10% durante 1 min. El flujo se mantuvo constante a 0,3 ml/min. Estas condiciones fueron las mismas para todos los compuestos.
BIBLIOGRAFÍA Aguirrezabalaga I, ef al. Identification and expression of genes involved in biosynthesis of L-oleandrose and its intermedíate L-olivose in the oieandomycin producer Streptomyces antibioticus. Antimicrob Agents Chemother. 2000 May;44(5): 1266-75.
Brosius, J. (1989). Superpolylinkers in cloning and expression vectors. DNA 8, 759- 777.
Chater, K.F., y Wilde, L.C. (1980). Streptomyces albus G mutants detective in the SalGI restriction-modification system. J. Gen. Microbiol 116, 323-334.
Crozier, A., et al. (2009). Dietary phenolics: chemístry, bioavailability and effects on health. Nat. Prod. Rep. 26. 1001-1043. Donnez. D., et al. (2009). Bioproduction of resveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms. Trends Biotechnol. 27, 706-713.
Falcone Ferreyra, M.L., et al. (2012). Flavonoids: biosynthesis, biologicai functions, and biotechnological applications. Front. Plant Sci. 3.
Harborne, J.B., y Williams, C.A. (2000). Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55, 481-504
Hopwood, D.A. (2007). Streptomyces in Nature and Medicine: The Antibiotic Markers (New York: Oxford University Press).
Hwang, E. II, et al. (2003) Production of Plant-Specific Flavanones by Escherichia coli Containing an Artificial Gene Cluster. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2699-2706
Jiang, H., et al. (2005). Metabolic engineering of the phenylpropanoid pathway in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 71 , 2962-2969.
Kaneko, M., et al. (2003). Cinnamate coenzyme A ligase from the filamentous bacterium streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 185, 20-27.
Kieser, T.M., et al. (2000). Praclical Streptomyces Genetics
Kim, D.H. (2009). Production of Genistein from Naringenin Using Escherichia coli Containing Isoflavone Synthase-Cytochrome P450 Reductase Fusión Protein. J. Microbiol. Biotechnol. 19, 1612-1616.
Kim, J.S., y Jobin, C. (2005). The flavonoid luteolin prevenís lipopolysaccharide- induced NF-kappaB signalling and gene expression by blocking IkappaB kinase activity in intestinal epithelial cells and bone-marrow derivad dendritic cells. Immunology 115, 375 -387.
Kim, M., et al. (2009). Stereospecific biotransformation of dihydrodaidzein into (3S)- equol by the human intestinal bacterium Eggerthella strain Julong 732. Appl Environ. Microbiol. 75, 3062-3068.
Kuhstoss, S , et al. (1991) Plasmid cloning vectors that intégrate site-specifically in Streptomyces spp. Gene 97, 143-146.
Kumar, S., y Pandey, A.K. (2013). Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview. Sci. World J. 2013. 162750
Kyndt, J.A., et al. (2002). Characterization of a bacterial tyrosine ammonia lyase, a biosynthetic enzyme for the photoactive yellow protein. FEBS Lett. 512, 240-244. Leonard, E , et al. (2006a). Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metab. Eng 8, 172-181
Leonard, E., et al. (2006b). Expression of a soluble flavone synthase allows the biosynthesis of phytoestrogen derivatives in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 70, 85-91.
Leonard, E , y Koffas, M. a G. (2007). Engineering of artificial plant cytochrome P450 enzymes for synthesis of isoflavones by Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73, 7246-7251
MacNeil, O.J., et al. (1992). Analysis of Streptomyces avermitilis genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector. Gene 111 , 61-68.
Manach, C, et al. (2004). Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 79, 727-747.
Miyahisa, I., et al. (2005). Efficient production of (2S)-flavanones by Escherichia coli containing an artificial biosynthetic gene cluster. Appl Microbiol Biotechnol. 68, 498- 504.
Miyahisa, I., et al. (2006) Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli Appl. Microbiol. Biotechnol. 71, 53-58
Santos, C N.S , et al. (2011). Optimization of a heterologous pathway for the production of flavonoids from glucose Metab. Eng. 13, 392-400.
Park, S.R.. et al. (2009). Engineering of plant-specific phenylpropanoids biosynthesis in Streptomyces venezuelae. J. Biotechnol. 141 , 181-188.
Park, S.R, et al. (2010b). Biosynthesis of Plant-Specific Flavones and Flavonols in Streptomyces venezuelae. J. Microbiol. Biotechnol. 20, 1295-1299.
Shimada, Y., et al. (2010). Cloning and expression of a novel NADP(H)-dependent daidzein reductase, an enzyme involved in the metabolism of daidzein, from equol- producing Lactococcus strain 20-92. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5892-5901.
Shimada, Y , et al. (2011). Identification of two novel reductases involved in equol biosynthesis in Lactococcus strain 20-92. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21 , 160-172. Shimada, Y , et al. (2012). Identification of a novel dihydrodaidzein racemase essential for biosynthesis of equol from daidzein in Lactococcus sp. strain 20-92. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4902-4907 Trantas, E., et al. (2009). Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metab. Eng. 11 , 355-366.
Tsujji, H., et al. (2012). Identification of an Enzyme System for Daidzein-to-Equol Conversión in Slackia sp. Strain NATTS. Appl. Environ. Microbiol. 78, 1228-1236.
Vara, J., et al. (1989). Cioning of genes governing the deoxysugar portion of the erythromycin biosynthesis pathway in Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus). J. Bacteriol. 171 , 5872-5881.
Vieira, J., y Messing, J. (1991 ). New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100, 189-194.
Vogt. T. (2010). Phenylpropanoid biosynthesis. Mol. Plant 3, 2-20.
Wang, Y , et al. (2011 ). Metabolic engineering of flavonoids in plants and microorganisms. Appl Microbiol. Biotechnoi. 91 , 949-956.
Watts, K.T., et al. (2004). Exploring recombinant flavonoid biosynthesis in metabolically engineered Escheríchia coii. ChemBioChem 5. 500-507.
Winkel-Shirley, B. (2001). Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiol. 126, 485-493.
Yan, Y , Kohli, A , y Koffas, M.A.G. (2005). Biosynthesis of natural flavanones in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol 71 , 5610-5613.
Zhu, S., al. (2014). EfMcient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escheríchia coli. Appl. Environ. Microbiol. 80. 3072-3080.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Ácido nucleico recombinante que comprende:
a una subunidad (a) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2, y
b. una subunidad (b) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 5, 2. Acido nucleico recombinante según la reivindicación 1 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3 y la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6. 3 Ácido nucleico recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que además comprende una subunidad (c) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. 7, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 8. 4. Ácido nucleico recombinante según la reivindicación 3 donde la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9. 5. Ácido nucleico recombinante según la reivindicación 4 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 y la subunidad (c) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9. 6. Ácido nucleico según la reivindicación 5 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 10.
7. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que además comprende una subunidad (d) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 11 , preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 12,
8. Ácido nucleico según la reivindicación 7 donde la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13.
9. Ácido nucleico según la reivindicación 8 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6 y donde la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13.
10. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que además comprende una subunidad (e) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 14, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 15.
11. Ácido nucleico según la reivindicación 10 donde la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16. 12. Ácido nucleico según la reivindicación 11 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 y la subunidad (e) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 16. 13. Ácido nucleico según la reivindicación 12 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 17.
14. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que además comprende una subunidad (f) que comprende una secuencia que codifica para la proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 18, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO 19
15 Ácido nucleico según la reivindicación 14 donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20
16. Ácido nucleico según la reivindicación 15 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 y donde la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20.
17. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que además comprende una subunidad (g) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 21 , preferiblemente comprende una secuencia con ai menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 22.
18. Ácido nucleico según la reivindicación 17 donde la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23.
19. Ácido nucleico según la reivindicación 18 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6. la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (f) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 20 y donde la subunidad (g) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 23.
20 Ácido nucleico según la reivindicación 19 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 24. 21 Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 que además comprende una subunidad (h) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 25, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 26.
22. Ácido nucleico según la reivindicación 21 donde la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27.
23. Ácido nucleico según la reivindicación 22 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13 y donde la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27.
24. Ácido nucleico según la reivindicación 23 donde el ácido nucleico comprende en la secuencia SEQ ID NO: 28.
25 Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que además comprende una subunidad (i) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 29 , preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 30.
26 Ácido nucleico según la reivindicación 25 donde la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31.
27. Ácido nucleico según la reivindicación 26 donde la subunidad (a} consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y donde la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31.
28 Ácido nucleico según la reivindicación 27 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 32. 29. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 que además comprende una subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. 33, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. 34
30. Ácido nucleico según la reivindicación 29 donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
31 Ácido nucleico según la reivindicación 30 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 74
6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13. la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO 31 y donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
32. Acido nucleico según la reivindicación 31 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 36.
33. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 que además comprende una subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38. 34 Acido nucleico según la reivindicación 33 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
35. Ácido nucleico según la reivindicación 34 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i} consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 , la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 y donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39. 36. Ácido nucleico según la reivindicación 35 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 40.
37. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 26 que además comprende una subunidad (I) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO:
41, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. 42 y una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44.
38. Ácido nucleico según la reivindicación 37 donde la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46. 39. Ácido nucleico según la reivindicación 38 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y donde la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46.
40. Ácido nucleico según la reivindicación 39 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 47. 41. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40 que además comprende una subunidad (m) que comprende una secuencia que codifica una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 50, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 51.
42. Acido nucleico según la reivindicación 41 donde la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 52
43. Ácido nucleico según la reivindicación 42 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO:
6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46 y donde la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52.
44. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 41 a 43 que además comprende una subunidad (n) que comprende una secuencia que codifica una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 53 , preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con ia secuencia SEQ ID NO: 54
45. Ácido nucleico según la reivindicación 44 donde la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55. 46. Ácido nucleico según la reivindicación 45 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46, la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52 y la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55.
47. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 que además comprende una subunidad (o) que comprende una secuencia que codifica una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 56, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 57;y una subunidad (s) que comprende una secuencia que codifica una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 59, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 65% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 60.
48. Ácido nucleico según la reivindicación 47 donde la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61.
4Θ. Ácido nucleico según la reivindicación 48 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (i) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 31 y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID
NO: 46, la subunidad (m) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 52, la subunidad (n) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 55, la subunidad (o) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 58 y la subunidad (s) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 61.
50. Ácido nucleico según la reivindicación 49 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 62.
51. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que además comprende la subunidad (I) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 41 , preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 42; y una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 43, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 44.
52. Ácido nucleico según la reivindicación 51 donde la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 46.
53. Ácido nucleico según la reivindicación 52 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (I) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 46
54. Ácido nucleico según la reivindicación 53 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 63. 55. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que además comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con ai menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. 38 .
56. Ácido nucleico según la reivindicación 55 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
57. Ácido nucleico según la reivindicación 56 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3. la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39. 58. Ácido nucleico según !a reivindicación 57 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 64.
59. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que además comprende una subunidad (p) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO:
65, preferiblemente comprende una secuencia con ai menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 66.
60. Ácido nucleico según la reivindicación 59 donde la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67
61. Ácido nucleico según la reivindicación 60 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO 67.
62. Ácido nucleico según la reivindicación 61 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 68.
63. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 59 a 62 que además comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38.
64. Ácido nucleico según la reivindicación 63 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
65. Ácido nucleico según la reivindicación 63 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiete en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (p) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 67 y la subunidad <k) consiste en la secuencia SEQ ID
NO: 39
66. Ácido nucleico según la reivindicación 65 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 69.
67. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 que además comprende la subunidad (j) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 33, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 34.
68. Ácido nucleico según la reivindicación 67 donde la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35. 69. Ácido nucleico según la reivindicación 68 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27 y la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35.
70. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que además comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 71.
71. Ácido nucleico según la reivindicación 70 donde la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72.
72. Ácido nucleico según la reivindicación 71 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID
NO: 72.
73. Ácido nucleico según la reivindicación 72 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 73.
74. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 70 a 73 que además comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75.
75. Ácido nucleico según la reivindicación 74 donde la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76. 76. Acido nucleico según la reivindicación 75 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 72 y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
77 Ácido nucleico según la reivindicación 76 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 77.
78. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que además comprende la subunidad (k) que comprende una secuencia que codifica para una protefna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 37, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 38
79. Ácido nucleico según la reivindicación 78 donde la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
80. Ácido nucleico según la reivindicación 79 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO.
6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad Q) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35 y la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39.
81. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 78 a 80 que además comprende la subunidad (q) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 70. preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO. 71.
82. Ácido nucleico según la reivindicación 78 donde la subunidad (q) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 72). 83. Ácido nucleico según la reivindicación 79 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3. la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39 y la subunidad (q) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 72.
84. Ácido nucleico según la reivindicación 83 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 78 85. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que además comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91.
86. Ácido nucleico según la reivindicación 85 donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
87 Ácido nucleico según la reivindicación 86 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO:
6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
88. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 85 a 87 que además comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94.
89. Ácido nucleico según la reivindicación 88 donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95. 90. Ácido nucleico según la reivindicación 89 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
91. Ácido nucleico según la reivindicación 90 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 96. 92. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 67 a 69 que además comprende la subunidad (r) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 74, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 75.
93. Ácido nucleico según la reivindicación 92 donde la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
94 Ácido nucleico según la reivindicación 93 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO:
6. la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35) y la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76.
95. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 92 a 94 que además comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91.
96. Ácido nucleico según la reivindicación 95 donde ia subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92. 97. Ácido nucleico según la reivindicación 93 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 76 y la subunidad <t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
98. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 95 a 97 que además comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 93, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94.
99. Ácido nucleico según la reivindicación 98 donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95
100. Ácido nucleico según la reivindicación 99 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3. la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27. la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35), la subunidad (r) consiste en la secuencia SEQ ID
NO: 76, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y donde la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95.
101. Ácido nucleico según ia reivindicación 100 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO. 97.
102. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 78 a 80 que además comprende la subunidad (t) que comprende una secuencia que codifica para una protelna con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 90, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 91.
103. Ácido nucleico según la reivindicación 102 donde la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
104. Ácido nucleico según la reivindicación 103 donde la subunidad (a) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, !a subunidad (j) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO:
39 y la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92.
105. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104 que además comprende la subunidad (v) que comprende una secuencia que codifica para una proteina con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID
NO: 98, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 99.
106. Ácido nucleico según la reivindicación 105 donde la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100
107. Ácido nucleico según la reivindicación 106 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27. la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (v) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 100. 108. Ácido nucleico según la reivindicación 107 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 101.
109. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 102 a 104 que además comprende la subunidad (u) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID
NO: 93, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 94
110. Ácido nucleico según la reivindicación 109 donde la subunidad (u) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 95.
111. Ácido nucleico según la reivindicación 110 donde ia subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en ia secuencia SEQ ID NO: 6, la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, la subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO. 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92 y la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95. 112. Ácido nucieico según la reivindicación 111 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO. 102.
113. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 109 a 112 que además comprende la subunidad (w) que comprende una secuencia que codifica para una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 103, preferiblemente comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad con ia secuencia SEQ ID NO: 104.
114. Ácido nucleico según la reivindicación 113 donde la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105.
1 15 Ácido nucleico según la reivindicación 110 donde la subunidad (a) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, la subunidad (b) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 6. la subunidad (d) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, ia subunidad (h) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 27, la subunidad (j) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 35, la subunidad (k) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 39, la subunidad (t) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 92, la subunidad (u) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 95 y la subunidad (w) consiste en la secuencia SEQ ID NO: 105.
116 Ácido nucleico según la reivindicación 115 donde el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO: 106.
117. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 116 que además comprende al menos un sitio de unión a ribosomas (rbs) unido de forma operativa
118. Ácido nucleico según la reivindicación 117 donde el sitio de unión a ribosomas está unido a la posición 5' de cada subunidad, preferiblemente entre el sitio de unión a ribosomas y la subunidad puede haber o no un polinucleótido espaciador.
119. Ácido nucleico recombinante según las reivindicaciones 1 17 o 1 18 donde el sitio de unión a ribosomas se selecciona de la lista que consiste en: rbs se Streptomyces (SEQ ID NO: 79}, rbs LMF (SEQ ID NO: 80), rbs consenso para Streptomyces (SEQ ID NO: 81). rbs de genes operón gly, rbs mil, rbs tipA, preferiblemente consiste en la secuencia SEQ ID NO: 79.
120. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 119 que además comprende al menos un promotor constitutivo o inducible unido de forma operativa. 121. Ácido nucleico según la reivindicación 120 donde el promotor constitutivo o inducible está unido de forma operativa delante de cada subunidad
122. Ácido nucleico según la reivindicación 121 donde el promotor se selecciona de la lista que consiste en: promotor del gen ermE (SEQ ID NO. 82), rp1 M (SEQ ID NO: 83), tipA (SEQ ID NO: 84), tsr (SEQ ID NO: 85), snpA (SEQ ID NO: 86), gylABx (SEQ ID NO: 87), mcrB (SEQ ID NO: 88), aac(2)IV (SEQ ID NO: 89), preferiblemente es el promotor del gen ermE (SEQ ID NO: 82).
123. Cassette de expresión que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122.
124. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122 o el cassette de expresión según la reivindicación 123 125. Vector según la reivindicación 124 donde el vector es replicativo o integrativo.
126. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 124 o 125 donde dicho vector se selecciona de la lista que consiste en: plásmido, cósmido, bácmido. vector virai y cromosoma artificial
127. Proteína de fusión que se genera a partir de la traducción del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122.
128. Célula que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresión según la reivindicación 123, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 124 a 126 y/o la proteína de fusión según la reivindicación 127.
129. Célula según la reivindicación 128 donde dicha célula es una bacteria, una arquea, una célula animal, una célula vegetal, una levadura o un hongo.
130. Célula según la reivindicación 129 donde dicha célula es del género que se selecciona de la lista que consiste en Stmptomyces, Sacchampolyspara, Micromonospora, Bifídobacterium, Frankia. StreptoverticilHum, Kitasatospora, Propionibacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Corynebacterium, Escherichia.
Lactobacillus, Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Baciilus.
131. Célula según la reivindicación 130 donde dicha célula es Streptomyces coelicoloro S. albus, S. venezuelae, S. avermitilis, S. lividens, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. clavuligerus, S. gríseus, S. kanamyceticus, S. noursei, S. scabies, S. violaceoruber, Saccharooolvsoora ervthraea.
132. Uso del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresión según la reivindicación 123. el vector según cualquiera de las reivindicaciones 124 a 126, la proteína de fusión según la reivindicación 127 y/o la célula según cualquiera de las reivindicaciones 128-131 para la síntesis de polifenoies.
133. Método de producción de polifenoies que comprende la utilización del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresión según la reivindicación 123, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 124 a 126 y/o la proteína de fusión según la reivindicación 127 y/o de la célula según las reivindicaciones 128 a 131. 134. Kit que comprende del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 122, el cassette de expresión según la reivindicación 123, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 124 a 125, la proteína de fusión según la reivindicación 127 y/o de la célula según las reivindicaciones 128 a 131. 135. Uso del kit según la reivindicación 134 para generar polifenoies
PCT/ES2016/000062 2015-05-18 2016-05-16 Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles WO2016185057A2 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP201530685 2015-05-18
ES201530685A ES2590221B1 (es) 2015-05-18 2015-05-18 Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2016185057A2 true WO2016185057A2 (es) 2016-11-24
WO2016185057A3 WO2016185057A3 (es) 2017-08-10

Family

ID=57280719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2016/000062 WO2016185057A2 (es) 2015-05-18 2016-05-16 Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2590221B1 (es)
WO (1) WO2016185057A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023056413A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered vectors and organisms containing the same for isoflavone conversion in the gut

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7241611B2 (en) * 2002-06-18 2007-07-10 Universiteit Gent Methods for synthesis of holo-photoactive yellow protein
CA2598687A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 Regents Of The University Of Minnesota Flavonoids
GB0503657D0 (en) * 2005-02-22 2005-03-30 Fluxome Sciences As Metabolically engineered cells for the production of resveratrol or an oligomeric or glycosidically-bound derivative thereof
US20070031951A1 (en) * 2005-05-19 2007-02-08 Huang Lixuan L Method for the production of resveratrol in a recombinant bacterial host cell
US7772444B2 (en) * 2005-05-19 2010-08-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginous microorganism
GB0714671D0 (en) * 2007-07-27 2007-09-05 Fluxome Sciences As Microbial bioreaction process
CA2718469C (en) * 2008-03-17 2017-07-04 National Research Council Of Canada Aromatic prenyltransferase from hop
US20120110703A1 (en) * 2009-06-19 2012-05-03 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Protein having novel prenyltransferase activity and gene encoding the same
DE102012213492A1 (de) * 2012-07-31 2014-02-06 Symrise Ag Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Dihydrochalkonen
WO2016016826A1 (en) * 2014-08-01 2016-02-04 Andrew Patrick Dare Methods and materials for manipulating phloridzin production
WO2016071505A1 (en) * 2014-11-07 2016-05-12 Danmarks Tekniske Universitet Microbial production of the flavonoids garbanzol, resokaempferol and fisetin
KR101797713B1 (ko) * 2015-05-14 2017-11-16 한국과학기술원 신남알데하이드의 제조 방법
WO2016193504A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Evolva Sa Biosynthesis of phenylpropanoid and dihydrophenylpropanoid derivatives

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023056413A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered vectors and organisms containing the same for isoflavone conversion in the gut

Also Published As

Publication number Publication date
ES2590221B1 (es) 2017-07-10
WO2016185057A3 (es) 2017-08-10
ES2590221A1 (es) 2016-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Leonard et al. Expression of a soluble flavone synthase allows the biosynthesis of phytoestrogen derivatives in Escherichia coli
Pandey et al. Glucosylation of isoflavonoids in engineered Escherichia coli
US10975403B2 (en) Biosynthesis of eriodictyol from engineered microbes
CN102181470B (zh) 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒
Okoye et al. Bacterial biosynthesis of flavonoids: Overview, current biotechnology applications, challenges, and prospects
AU2004292634B2 (en) DNA participating in hydroxylation of macrolide compound
ES2590221B1 (es) Ácido nucleico recombinante para su uso en la producción de polifenoles
Cho et al. Characterization of regiospecific flavonoid 3′/5′-O-methyltransferase from tomato and its application in flavonoid biotransformation
ES2271973T3 (es) Grupo de genes de la biosintesis de la rifamicina.
JP7454289B2 (ja) エリオジクチオールの生合成
Lombó et al. The novel hybrid antitumor compound premithramycinone H provides indirect evidence for a tricyclic intermediate of the biosynthesis of the aureolic acid antibiotic mithramycin
CN102703495A (zh) 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒
CN109072271A (zh) 用于制备鼠李糖基化类黄酮的方法
Ferraiuolo et al. Optimization of Pre-Inoculum, Fermentation Process Parameters and Precursor Supplementation Conditions to Enhance Apigenin Production by a Recombinant Streptomyces albus Strain.
KR101342774B1 (ko) 토마토 유래의 플라보노이드 3&#39;&#39;/5&#39;&#39;-ｏ-메틸전이효소 및 이의 용도
CN102719388A (zh) 提高链霉菌抗生素产量的方法及其质粒
KR20150045247A (ko) 레스베라트롤 글루코시드의 제조방법
KR101750251B1 (ko) 나린제닌의 생물전환을 통한 사쿠라네틴의 제조방법
ES2334755B2 (es) Procedimiento para aislar genes implicados en la biosintesis de estreptolidigina, moleculas de adn, manipulacion genetica de la ruta y sus usos.
KR101585165B1 (ko) 메틸전이효소 암호화 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 메틸화 스틸벤 화합물의 생산방법
ES2255331B1 (es) Procedimiento de obtencion de indolocarbazoles mediante la utilizacion de genes biosinteticos de rebecamicina.
Poudel et al. Functional characterization of a regiospecific sugar-O-methyltransferase from Nocardia
Kim et al. Production of 7
CN102382788B (zh) 含有异黄酮合成酶-细胞色素p450还原酶融合基因的乳酸菌及其应用
KR101794980B1 (ko) O-메틸전이효소를 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 메틸화된 플라보노이드 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16794366

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16794366

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2