ES2255331B1 - Procedimiento de obtencion de indolocarbazoles mediante la utilizacion de genes biosinteticos de rebecamicina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de obtención de indolocarbazoles
mediante la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina,
basado en la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina de
Saccharothrix aerocolonigenes para la producción de
indolocarbazoles en microorganismos relacionados (Streptomyces
spp.). El método comprende el aislamiento de un fragmento de
ADN de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243 que contiene
la agrupación de genes biosintéticos de rebecamicina y la expresión
de dichos genes en Streptomyces albus, consiguiendo la
producción de rebecamicina y derivados.
De aplicación al campo farmacéutico.
Description
Procedimiento de obtención de indolocarbazoles
mediante la utilización de genes biosintéticos de rebecamicina.
La invención se adscribe al campo de la
farmacología y en concreto a compuestos con potencial aplicación en
oncología, con estructura química de indolocarbazoles y que se
obtienen por fermentación de microorganismos transformados.
La rebecamicina (Figura 1, A) es un producto
natural de la bacteria Saccharothrix aerocolonigenes
ATCC39243, perteneciente al grupo de los actinomicetos (Bush et
al. J. Antibiot. 40: 668-678, 1987). Los
actinomicetos son bacterias Gram-positivas cuyo
hábitat natural es el suelo y que poseen un gran interés industrial
y biotecnológico, en particular el género Streptomyces, pues
producen una gran parte de los compuestos bioactivos conocidos.
Muchos de estos compuestos poseen aplicación farmacéutica debido a
su actividad antitumoral, antibacteriana, antifúngica,
antiparasitaria, inmunosupresora, etc. La rebecamicina presenta
actividad antibacteriana frente a bacterias
Gram-positivas tales como Staphylococcus aureus,
Micrococcus luteus y Streptococcus faecalis (Bush et al. J.
Antibiot. 40: 668-678, 1987). Sin embargo, su
mayor interés se centra en su actividad antitumoral, la cual ha
sido demostrada in vivo frente a diversos tumores
implantados en ratón, e in vitro frente a varias líneas
celulares tumorales (Bush et al. J. Antibiot. 40:
668-678, 1987).). En estos momentos existen dos
derivados de rebecamicina en ensayos clínicos para su futuro uso
como agentes antineoplásicos (NB-506,
NSC655649).
Desde el punto de vista de su estructura
química, la rebecamicina pertenece a la familia de productos
naturales de los indolocarbazoles. Desde su descubrimiento en 1977,
se han descrito más de 60 productos naturales de dicha familia, la
cual puede ser clasificada en tres grupos según contengan
estructuras de tipo
indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol
(p.ej. rebecamicina), indolo[2,3-alcarbazol
(p.ej. tjipanazoles), o bis-indolilmaleimida (p.ej.
arciriarrubina). Debido a lo novedoso de estas estructuras y a la
amplia variedad de actividades de sus miembros (antimicrobiana,
antifúngica, inmunosupresora, antitumoral, etc.), este grupo de
alcaloides ha atraído considerable interés. En particular, los
indolopirrolocarbazoles constituyen una nueva clase de agentes
antitumorales, que pueden clasificarse en dos subgrupos según su
mecanismo de acción. Un subgrupo consiste en inhibidores de
quinasas, especialmente quinasa C, e incluye la estaurosporina
(Figura 1, B) y análogos. El segundo subgrupo consiste en agentes
que dañan el ADN actuando sobre la topoisomerasa I ó II, pero no
sobre quinasas, e incluye la rebecamicina (Figura 1, A) y análogos.
Actualmente hay varios indolocarbazoles en ensayos clínicos en
Estados Unidos, Japón y Europa, incluyendo tanto inhibidores de
quinasas (UCN-01, CGP41251,
CEP-751) como agentes que dañan el ADN
(NB-506, NSC655649) (Akinaga et al.
Anti-Cancer Drug Design 15:
43-52, 2000).
En nuestros días existe una gran necesidad de
nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos
efectos secundarios indeseables, y con mayor selectividad, en
comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente,
la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante
dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales,
y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos.
Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir
inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía),
pues normalmente es necesario analizar miles de productos para
encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la
tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de
investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos
mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de
agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los
actinomicetos. Estas técnicas también pueden ser usadas para
mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las
cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del
metabolito de interés.
La mayoría de los indolocarbazoles de origen
natural poseen, en su estructura química, dos componentes: el
aglicón indolocarbazol, y uno o más azúcares unidos a él. El
aglicón indolocarbazol se biosintetiza a partir de dos moléculas de
triptófano, al menos en el caso de los indolopirrolocarbazoles. En
el caso de la rebecamicina (Figura 1, A), el azúcar es
4-O-metil-\beta-D-glucosa.
En el caso de la estaurosporina (Figura 1, B), el azúcar es un
derivado de L-ramnosa. Recientemente se han descrito
algunos genes implicados en la biosíntesis de la parte glucídica de
estos dos indolocarbazoles:
- (1)
- Una región del cromosoma de Streptomyces longisporoflavus DSM10189 implicada en la biosíntesis del azúcar de la estaurosporina. Dicha región de ADN era capaz de complementar una mutación que afectaba a la biosíntesis del azúcar. No existe ninguna prueba conocida de que dicha región de ADN esté implicada en la biosíntesis del aglicón indolocarbazol (Schupp et al. United States Patent No.: US 6210935, 2001).
- (2)
- El gen ngt que codifica la N-glucosiltransferasa de rebecamicina de Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, responsable de la transferencia del azúcar al aglicón indolocarbazol (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000). Tampoco existen pruebas conocidas de que la región de ADN identificada esté implicada en la biosíntesis del aglicón indolocarbazol. La secuencia de ADN del gen ngt ha sido previamente usada para la bioconversión de aglicones indolocarbazoles en derivados D-glucosilados. El procedimiento consistía en añadir un determinado aglicón indolocarbazol (sintetizado químicamente, o aislado de una cepa productora) al medio de cultivo de una cepa de Streptomyces lividans que contenía un plásmido con el gen ngt, y aislar el producto glucosilado del cultivo (Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000).
Con la excepción mencionada del gen ngt
(Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403,
2000), no se conoce descripción previa de la secuencia de
nucleótidos a la que se refiere la presente invención. Además, no se
conoce ninguna descripción previa de secuencias de nucleótidos que
hayan sido implicadas en la biosíntesis de un aglicón
indolocarbazol.
La presente invención se refiere a un
procedimiento basado en la utilización de genes biosintéticos de
rebecamicina para la producción de indolocarbazoles que comprende
las siguientes etapas:
- (1)
- Aislamiento de la región del cromosoma de Saccharothrix aerocolonigenes que contiene, entre otros, el gen que codifica la N-glucosiltransferasa de rebecamicina.
- (2)
- Transferencia de la capacidad de biosintetizar rebecamicina a un microorganismo del género Streptomyces, mediante la introducción en el mismo de dicha región cromosómica.
- (3)
- Obtención y análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de rebecamicina.
- (4)
- Expresión de ciertos genes de dicho agrupamiento génico en un organismo hospedador, para producir indolocarbazoles derivados de rebecamicina.
Los procedimientos experimentales de la presente
invención incluyen métodos de Biología Molecular convencionales en
el actual estado de la técnica. Pueden encontrarse descripciones
detalladas de las técnicas no explicadas aquí en los manuales de
Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics. The
John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000) y Sambrook
et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU,
1989). Los siguientes ejemplos describen en detalle, sin
limitación, la presente invención.
Etapa
1
Con el fin de obtener ADN genómico de
Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243, se usó una
suspensión densa de esporas de este organismo para inocular
matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 25 ml de medio TSB (caldo
de soja tripticaseína, Oxoid), y se incubaron a 28°C durante 48
horas. Las células obtenidas fueron recogidas mediante
centrifugación y seguidamente fueron procesadas siguiendo el método
de aislamiento de ADN genómico tal como se describe detalladamente
en Kieser et al. (Practical Streptomyces genetics.
The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). Este ADN
genómico fue entonces digerido parcialmente con el enzima de
restricción Sau3AI, originándose fragmentos de ADN de un
tamaño aproximado de 30 kb. La cantidad necesaria de enzima, así
como el tiempo de digestión, se determinó empíricamente analizando
la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa. La reacción
enzimática fue interrumpida por congelación rápida, seguida de
extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.
Para la preparación de la genoteca a partir del
ADN genómico de Saccharothrix aerocolonigenes se utilizó el
vector pKC505, que es capaz de replicarse tanto en Escherichia
coli como en Streptomyces spp. Se sometió el vector
pKC505 a digestión total con el enzima de restricción HpaI,
seguida de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con
etanol, y posterior tratamiento con fosfatasa alcalina (Boehringer
Mannheim). Tras inactivar la fosfatasa, el vector fue digerido
totalmente con el enzima de restricción BamHI, y sometido a
extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. El
vector así tratado fue entonces ligado con el ADN genómico
parcialmente digerido (previamente obtenido) utilizando ADN ligasa
de T4 (New England Biolabs). Esta mezcla de ligación fue
empaquetada, in vitro, en partículas de fago lambda
empleando un sistema disponible comercialmente ("DNA Packaging
Kit", Boehringer Mannheim). La preparación fágica así obtenida
se utilizó para infectar células de Escherichia coli ED8767
y los transductantes fueron seleccionados en placas con medio TSA
(caldo de soja tripticaseína [Oxoid] con 2% agar) conteniendo 20
\mug/ml tobramicina. Unas 3000 colonias transductantes elegidas
al azar fueron cultivadas en placas de microtitulación y, tras la
adición de glicerol (25% concentración final), esta genoteca
representativa del ADN genómico de Saccharothrix
aerocolonigenes fue guardada a -70°C para su preservación.
La identificación de clones de la genoteca que
contenían genes biosintéticos de rebecamicina se realizó mediante
hibridación en colonia, utilizando como sonda un fragmento interno
del gen ngt de Saccharothrix aerocolonigenes que
codifica la N-glucosiltransferasa de rebecamicina (Ohuchi
et al. J. Antibiot. 53: 393-403, 2000). Este
fragmento del gen ngt fue obtenido mediante técnicas
estándar de PCR, usando como molde ADN genómico de Saccharothrix
aerocolonigenes (obtenido según Ejemplo 1) y los
oligonucleótidos sintéticos CS003 SEQ ID NO: 20 Y SEQ ID NO: 21
diseñados a partir de la secuencia conocida del gen ngt
(Ohuchi et al. J. Antibiot. 53: 393-403,
2000). La identidad del fragmento de ADN amplificado se verificó
mediante su donación en el vector pUC19 y posterior secuenciación
de nucleótidos mediante técnicas estándar de Biología Molecular.
Este fragmento de ADN fue empleado como sonda en una hibridación en
colonia frente a la genoteca de Saccharothrix
aerocolonigenes. Para ello se usó un sistema disponible
comercialmente ("DIG DNA Labeling and Detection Kit",
Boehringer Mannheim), siguiendo procedimientos estándar y
recomendaciones del fabricante. Varios clones dieron señal
positiva, y los correspondientes cósmidos fueron estudiados mediante
análisis Southern usando la misma sonda ngt. De este modo se
seleccionaron cuatro cósmidos que incluían el gen ngt (10A4,
14E8, 17Al2 y 24B2) y mostraban mapas de restricción solapantes. La
cepa E. coli ED8767 portadora del cósmido 14E8 fue
depositada con fecha 10/10/2001 en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot,
46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT
5984.
El vector pKC505 (como control) y los cuatro
cósmidos que incluían el gen ngt fueron introducidos
separadamente en una cepa del género Streptomyces mediante
transformación de protoplastos, tal como se describe en Kieser
et al (Practical Streptomyces genetics. The John Innes
Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000). La cepa hospedadora
elegida fue Streptomyces albus J1074, la cual no produce
rebecamicina ni ningún metabolito similar, aunque para este fin
puede utilizarse cualquier otro actinomiceto en el que pueda
replicarse el vector pKC505. Varias colonias de cada una de las
transformaciones fueron cultivadas a 28°C durante 10 días en medio
sólido R5A conteniendo 25 \mug/ml apramicina y 2,2% agar. El medio
R5A es el medio R5 modificado descrito por Fernández et al.
(J. Bacteriol. 180: 4929-4937, 1998). Estos
cultivos fueron extraídos con acetona, y los correspondientes
extractos fueron analizados mediante bioensayo y mediante HPLC, en
busca de rebecamicina. Los bioensayos se realizaron siguiendo
técnicas estándar de Microbiología, empleando la bacteria
Microccocus luteus ATCC1024, la cual es sensible a
rebecamicina. Los extractos obtenidos a partir de transformantes
S. albus J1074/14E8 y S. albus J1074/17Al2 inhibían
el crecimiento de M. luteus, mientras que los extractos
obtenidos a partir del control S. albus J1074/pKC505 no
tenían ningún efecto aparente.
El análisis mediante HPLC se realizó empleando
una columna de fase reversa (Symmetry C18, 4.6 x 250 mm, Waters),
con acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroacético en agua como
solventes. Se utilizó un gradiente lineal de 20 a 75% de
acetonitrilo en 20 minutos, con un flujo de 1 ml/min. La detección
y la caracterización espectral de los picos se realizaron con un
detector de fotodiodos y software Millenium (Waters), extrayéndose
cromatogramas bidimensionales a 316 nm. El análisis HPLC de los
extractos de S. albus J1074/14E8 y S. albus
J1074/17Al2 mostró cromatogramas similares entre sí, con dos picos
nuevos (Figura 2, B) no detectables en el extracto del control
S. albus J1074/pKC505 (Figura 2, A). El pico mayoritario
presentaba el mismo tiempo de retención que una muestra de
rebecamicina pura (Figura 2, C) y mostraba el espectro de absorción
característico de la rebecamicina. El pico minoritario, a pesar de
tener diferente tiempo de retención, también presentaba un espectro
de absorción similar al de rebecamicina. Este pico minoritario
podría corresponder a un producto de degradación de rebecamicina,
pues se observa a veces en cromatogramas de HPLC de muestras de
rebecamicina pura.
El compuesto correspondiente al pico mayoritario
fue purificado de la siguiente manera. Se emplearon esporas de
S. albus J1074/14E8 para inocular medio TSB (caldo de soja
tripticaseína, Oxoid) conteniendo 25 \mug/ml apramicina, y se
incubaron a 30°C, 250 r.p.m., durante 24 horas. Este preinóculo fue
usado para inocular (al 2.5%, v/v) ocho matraces Erlenmeyer de dos
litros conteniendo 400 ml de medio R5A. Después de una incubación
de 5 días a 30°C, 250 r.p.m., los cultivos fueron centrifugados
(12000 rpm, 30 min). El compuesto de interés se encontraba
mayoritariamente asociado al micelio, por lo que se descartó el
sobrenadante. El micelio fue extraído con 400 ml de acetona,
sometido a agitación durante 2 horas, centrifugado, y el extracto
orgánico fue evaporado in vacuo. Este material fue redisuelto
en 5 ml de una mezcla de DMSO y acetona (50:50). Este extracto fue
sometido a cromatografía en un cartucho de compresión radial
"\muBondapak C18" (PrepPak Cartridge, 25 x 100 mm, Waters),
empleándose una elución isocrática con acetonitrilo y agua (55:45)
a 10 ml/min. El compuesto de interés fue recolectado a partir de
varias inyecciones, secado in vacuo y finalmente
liofilizado. Este compuesto fue analizado mediante espectrometría de
masas MALDI-ToF utilizando un espectrómetro
"Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation".
Como resultado se obtuvo un pico principal con una masa de 568 que
corresponde con la de rebecamicina, y un pico secundario con una
masa de 392 que corresponde con el aglicón de rebecamicina.
La producción de rebecamicina obtenida con la
cepa S. albus J1074/14E8 fue varias veces mayor que la
observada en las mismas condiciones con la cepa natural
Saccharothrix aerocolonigenes ATCC39243.
Es conocido que la rebecamicina posee actividad
antibacteriana frente a algunas bacterias
Gram-positivas (Bush et al. J. Antibiot. 40:
668-678, 1987), y que produce una inhibición débil
del crecimiento en algunas especies de Streptomyces, entre
ellas S. albus J1074. Por tanto los cósmidos 14E8 y 17Al2,
que conferían la capacidad de producir rebecamicina, debían también
conferir resistencia a dicha molécula. Con el fin de comprobar este
punto, se estudió el efecto de la rebecamicina añadida exógenamente
sobre el crecimiento de S. albus J1074/14E8 y del control
S. albus J1074/pKC505. Para ello se usaron esporas de estas
dos cepas para inocular sendas placas con medio sólido Bennett
(Kieser et al. Practical Streptomyces genetics. The
John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000) conteniendo 25
\mug/ml apramicina. Sobre este medio ya inoculado, se colocaron
discos absorbentes a los que se añadieron diferentes cantidades de
rebecamicina disuelta en acetona. Tras dejar las placas a 4°C
durante una hora para que la solución de rebecamicina difundiera en
el medio, se incubaron a 28ºC durante 4 días. Así pudo comprobarse
que, en las condiciones descritas, el crecimiento de la cepa
control S. albus J1074/pKC505 era inhibido por cantidades de
rebecamicina de 100 \mug o superiores. Sin embargo la cepa S.
albus J1074/14E8 era totalmente resistente a 100 y 200 \mug
de rebecamicina.
El cósmido 14E8 fue elegido para un estudio más
detallado, y se determinó la secuencia nucleotídica completa de su
inserto. La secuenciación se realizó sobre ADN molde de doble
cadena en pUC18, empleando el método de terminación de la síntesis
de ADN por didesoxinucleótidos y el sistema comercial "Cy5
AutoCycle Sequencing Kit" (Amersham Pharmacia Biotech). Se
secuenciaron ambas hebras del ADN, empleando un secuenciador de ADN
automático "Alf-express" (Amersham Pharmacia
Biotech). Para el análisis informático de la secuencia se empleó el
paquete de programas GCG, del Genetics Computer Group de la
Universidad de Wisconsin. La secuencia obtenida (SEQ ID NO: 1)
resultó ser de 25.681 nucleótidos. El análisis informático de esta
secuencia reveló la existencia de 16 marcos abiertos de lectura
(ORFs) completos y dos incompletos (Figura 3). Los productos
génicos deducidos de dichas ORFs fueron comparados con proteínas de
función conocida presentes en las bases de datos empleando el
programa BLAST. Esto nos permitió asignar funciones probables, de
manera preliminar, a la mayoría de las ORFs, tal como se muestra en
la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Gen | Posición | Aminoácidos | Función deducida | Notas |
| orfD13 | 1-136 | 44 | desconocida | SEQ ID NO: 2 |
| no completa | ||||
| orfR5 | 302-3313 compl | 1003 | proteína reguladora | SEQ ID NO: 3 |
| orfR4 | 3395-4027 compl | 210 | dipeptidasa | SEQ ID NO: 4 |
| orfD1 | 4402-5718 | 438 | esterasa | SEQ ID NO: 5 |
| orfR3 | 5946-6347 compl | 133 | desconocida | SEQ ID NO: 6 |
| orfD2 | 6581-7768 | 395 | desconocida | SEQ ID NO: 7 |
| orfR2 | 7841-9106 compl | 421 | N-glucosiltransferasa | SEQ ID NO: 8 |
| orfD3 | 9316-10737 | 473 | oxidasa de L-triptófano | SEQ ID NO: 9 |
| Gen | Posición | Aminoácidos | Función deducida | Notas |
| orfD4 | 10734-13775 | 1013 | desconocida | SEQ ID NO: 10 |
| orfD5 | 13772-15361 | 529 | monooxigenasa | SEQ ID NO: 11 |
| orfD6 | 15358-16551 | 397 | citocromo P450 | SEQ ID NO: 12 |
| orfD7 | 16578-17399 | 273 | metiltransferasa | SEQ ID NO: 13 |
| orfD8 | 17730-20501 | 923 | proteína reguladora | SEQ ID NO: 14 |
| orfD9 | 20498-21010 | 170 | reductasa de flavina | SEQ ID NO: 15 |
| orfD10 | 21007-22287 | 426 | transportador de membrana | SEQ ID NO: 16 |
| orfD11 | 22271-23863 | 530 | halogenasa de triptófano | SEQ ID NO: 17 |
| orfR1 | 23933-25354 | 473 | transportador de membrana | SEQ ID NO: 18 |
| compl | ||||
| orfD12 | 25439-25681 | 81 | proteína reguladora | SEQ ID NO: 19 |
| no completa |
Con el fin de determinar la cantidad mínima de
ADN necesaria para dirigir la biosíntesis de rebecamicina o de
alguno de sus intermediarios, se construyeron tres nuevos
plásmidos, denominados pREB5, pREB6 y pREB7, que contenían
fragmentos del inserto presente en el cósmido 14E8 (Figura 4). Para
ello se emplearon técnicas estándar de Biología Molecular descritas
en Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva
York, EE.UU, 1989). El plásmido pREB5 fue construido mediante la
inserción del fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos
7119 (BglII) y 17783 (EcoRI) de SEQ ID NO: 1 en el
vector pWHM3 (Kieser et al. Practical Streptomyces
genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000).
El plásmido pREB6 fue construido mediante la inserción del
fragmento de ADN comprendido entre los nucleótidos 8562
(BglII) y 17783 (EcoRI) de SEQ ID NO: 1 en el vector
pEM4 (Quirós et al. Mol. Microbiol. 28:
1177-1185, 1998). Por último, el plásmido pREB7 fue
construido mediante la inserción del fragmento de ADN comprendido
entre los nucleótidos 7119 (BglII) y 22241 (EcoRI) de
SEQ ID NO: 1 en el vector pWHM3 (Kieser et al. Practical
Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Norwich,
Gran Bretaña, 2000).
Los tres plásmidos se replican en alto número de
copias tanto en E. coli. como en Streptomyces, debido
a la elección de los vectores empleados para su construcción. En
pREB5 y pREB7, la posible expresión de los genes incluidos se
debería a sus propias secuencias promotoras y reguladoras
naturales. Sin embargo, el plásmido pREB6 contiene el promotor del
gen de resistencia a eritromicina (ermE) de
Saccharopolyspora erythraea, el cual dirigiría la expresión
constitutiva de los genes incluidos. La elección de otros vectores
y/o la adición de determinadas secuencias promotoras o reguladoras
permite la expresión de los genes mencionados en otros
organismos.
Los plásmidos pREB5, pREB6 y pREB7, y el control
pEM4, fueron introducidos separadamente en Streptomyces
albus J1074 mediante transformación de protoplastos, tal como
se describe en Kieser et al. (Practical Streptomyces
genetics. The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000).
De nuevo se eligió Streptomyces albus J1074 como cepa
hospedadora, pero muchos otros actinomicetos podrían usarse debido
al amplio rango de huésped de los vectores empleados para la
construcción de pREB5, pREB6 y pREB7. Los transformantes fueron
cultivados y se obtuvieron extractos que se analizaron por HPLC en
las condiciones ya descritas en el Ejemplo 3.
Los extractos obtenidos de transformantes S.
albus J1074/pREB5 no contenían aparentemente ningún
indolocarbazol, siendo sus cromatogramas de HPLC esencialmente
idénticos a los de los extractos del control S. albus
J1074/pEM4 (Figura 5, A).
El análisis mediante HPLC de los extractos de
transformantes S. albus J1074/pREB6 (Figura 5, B) reveló la
presencia de un producto, al que denominamos RM62, que poseía un
tiempo de elución diferente al de la rebecamicina (Figura 5, D). La
comparación del espectro de absorción de RM62 (Figura 6, B) con el
de rebecamicina (Figura 6, A) indica que RM62 es efectivamente un
indolocarbazol derivado, o precursor, de rebecamicina. Este
resultado indica que la ausencia de producción de indolocarbazoles
en S. albus J1074/pREB5 se debe a una baja expresión de los
genes incluidos, y que este defecto es solucionado en pREB6 por la
presencia del promotor añadido del gen de resistencia a
eritromicina.
El análisis mediante HPLC de los extractos de
transformantes S. albus J1074/pREB7 (Figura 5, C) reveló la
presencia de dos nuevos productos: RM761, minoritario, y RM762,
mayoritario. Tanto RM761 como RM762 poseían tiempos de elución
diferentes al de rebecamicina (Figura 5, D), pero sus espectros de
absorción (Figura 6, C-D) indican que son derivados,
o precursores, de rebecamicina. La comparación de estos resultados
con los obtenidos con pREB5 y pREB6, indica que el fragmento de ADN
contenido en pREB7 contiene algún elemento regulador (probablemente
orfD8) que estimula la expresión de los genes de biosíntesis
del indolocarbazol.
La introducción en un determinado organismo de
los genes biosintéticos de rebecamicina descritos en la presente
invención puede ser utilizada para diversos fines, entre ellos:
(1) Si el organismo en cuestión no produce de
forma natural ningún tipo de indolocarbazol, los genes
biosintéticos de rebecamicina pueden ser utilizados en:
- (a)
- La producción de rebecamicina, mediante el uso del agrupamiento génico completo.
- (b)
- La producción de intermediarios biosintéticos de rebecamicina, mediante el uso de una parte del agrupamiento génico.
- (c)
- La obtención de un organismo resistente a rebecamicina.
(2) Si a un organismo del apartado anterior (1)
se le introducen además genes procedentes de otros organismos, se
puede conseguir la producción de derivados de rebecamicina. Por
ejemplo, si se introduce un gen que codifica un determinado enzima
modificador de triptófano (p.ej. hidroxilasa) pueden obtenerse
derivados de rebecamicina con modificaciones (p.ej.
hidroxilaciones) en posiciones específicas del aglicón
indolocarbazol. Otro ejemplo: si se introduce uno o varios genes
implicados en biosíntesis de un determinado azúcar, es posible
obtener derivados de rebecamicina que incorporen nuevos azúcares en
lugar de
4-O-metil-\beta-D-glucosa.
(3) Si el organismo en cuestión produce de forma
natural algún tipo de indolocarbazol (tales como estaurosporina,
K-252a, UCN-01,
J-104303, AT-2433, arciriaflavinas,
arciriarrubina, arciriacianina, arciroxocina, arciriaverdina,
etc.), los genes biosintéticos de rebecamicina pueden usarse
para:
- (a)
- La mejora de la producción de ese indolocarbazol, mediante el uso de un gen regulador tal como orfD8.
- (b)
- La obtención de nuevos indolocarbazoles ("híbridos"), mediante el uso del agrupamiento génico de rebecamicina o de una parte del mismo. Por ejemplo, si se introduce el gen orfD11 (o los genes orfD9 y orfD11) que codifica una halogenasa de triptófano, pueden obtenerse nuevos indolocarbazoles halogenados. Otro ejemplo: si se introduce el gen orfR2 y/o orfD7, pueden obtenerse nuevos indolocarbazoles con azúcares modificados.
(4) Si el organismo en cuestión produce de forma
natural algún metabolito biosintetizado a partir de triptófano,
aunque no de tipo indolocarbazol (tal como violaceína), los genes
biosintéticos de rebecamicina pueden utilizarse para la producción
de nuevas variantes ("híbridas") de dicho metabolito, de forma
análoga a la descrita en el apartado anterior (3b).
Figura 1. Estructura de la rebecamicina (A) y la
estaurosporina (B).
Fiqura 2. Análisis por HPLC de:
(A) Un extracto de S. albus
J1074/pKC505.
(B) Un extracto de S. albus
J1074/14E8.
(C) Una muestra de rebecamicina pura.
Figura 3. Mapa de restricción del inserto
contenido en el cósmido 14E8, el cual incluye el agrupamiento de
genes biosintéticos de rebecamicina.
Figura 4. Esquema de los insertos incluidos en
los plásmidos pREB5, pREB6 y pREB7.
Fiqura 5. Análisis por HPLC de:
(A) Un extracto de S. albus
J1074/pEM4.
(B) Un extracto de S. albus J1074/pREB6.
El pico principal corresponde al producto RM62.
(C) Un extracto de S. albus J1074/pREB7.
El pico principal corresponde al producto RM762. El pico
minoritario, en tomo al minuto 12.3, corresponde al producto
RM761.
(D) Una muestra de rebecamicina pura. Figura 6.
Espectros de absorción de:
(A) Rebecamicina.
(B) Producto RM62, procedente de un extracto de
S. albus J1074/pREB6.
(C) Producto RM761, procedente de un extracto de
S. albus J1074/pREB7.
(D) Producto RM762, procedente de un extracto de
S. albus J1074/pREB7.
<110> UNIVERSIDAD DE OVIEDO
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE
INDOLOCARBAZOLES MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE GENES BIOSINTÉTICOS DE
REBECAMICINA.
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25681 pares de bases
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ácido nucléico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharothrix
aerocolonigenes
\hskip1cm ATCC
39243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD13, no completa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Phe Thr Tyr Ala Asp His Asn Gly Arg His
Ile Arg Phe Gly Val}
\sac{Asp Phe Tyr Cys Gly Gly Thr Ala Ser Leu
Ala Glu Pro Glu Val Ser}
\sac{Thr Arg His Asp Gly Arg Thr Pro Ile Ser
Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1003 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfR5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 210 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfR4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfR3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfR2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 473 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1013 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 529 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 397 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> orfD7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 923 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 530 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 473 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfR1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81 aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<212> polipéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> OrfD12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23 pares de base
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Oligonucléotido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucléotido sintético CS003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGAATTCATCGAACCCGCGGCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24 pares de base
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Oligonucléotido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucléotido sintético CS004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATAAGCTTCGGCTGCCAGCGCTC
\hfill24
Claims (23)
1. Procedimiento de obtención de
indolocarbazoles mediante la utilización de genes biosintéticos de
rebecamicina caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- (a)
- Aislar un fragmento de ADN del genoma de Saccharothrix aerocolonigenes.
- (b)
- Insertar dicho fragmento de ADN, o una parte de él, en un vector apropiado para las células hospedadoras, de modo que pueda mantenerse dentro de ellas.
- (c)
- Transformar las células hospedadoras con dicho plásmido recombinante.
- (d)
- Cultivar las células hospedadoras transformadas en un medio de cultivo adecuado que permita la producción de indolocarbazoles.
2. Una molécula de ácido nucleico que consiste
en:
- (a)
- una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1; o
- (b)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1; o
- (c)
- una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1; o
- (d)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID NO: 1, con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 o de su hebra complementaria; o
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1; o
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 65% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y que preferiblemente codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de rebecamicina o una parte de él.
3. Una molécula de ácido nucleico que contiene
una parte de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizada porque dicha parte tiene al
menos 15 nucleótidos de longitud.
4. Una molécula de ácido nucleico, según
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, que codifica uno o más
polipéptidos, o que incluye uno o más elementos genéticos, que
poseen una actividad funcional en la síntesis de un indolocarbazol
o un precursor de un indolocarbazol.
5. Una molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 4, caracterizada porque dicha estructura de
tipo indolocarbazol es rebecamicina, un derivado de rebecamicina o
un precursor de rebecamicina.
6. Una molécula de ácido nucleico, según
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizada por
incluir uno o más genes, y/o una o más secuencias reguladoras, o
elementos genéticos codificantes o no codificantes de un
agrupamiento génico de biosíntesis de un indolocarbazol.
7. Una molécula de ácido nucleico,
caracterizada por incluir una secuencia de nucleótidos que
codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en
SEQ ID Nos: 2 a 19, o una secuencia de nucleótidos que es
complementaria o degenerada a una secuencia de nucleótidos que
codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un
60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID Nos: 2 a
19.
8. Una molécula de ácido nucleico, según la
reivindicación 7, que codifica una o más secuencias aminoacídicas
que poseen al menos un 85% de identidad de secuencia con cualquiera
de SEQ ID Nos: 2 a 19.
9. Un polipéptido codificado por una molécula de
ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, que
incluye una secuencia aminoacídica descrita en SEQ ID Nos: 2 a 19
que posee una actividad funcional en la síntesis de una estructura
de tipo indolocarbazol.
10. Un vector que incluye una molécula de ácido
nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
11. Un vector, según la reivindicación 10,
caracterizado por consistir en el cósmido 14E8 depositado en
la cepa de Escherichia coli ED8767/14E8 con el número de
identificación CECT 5984.
12. Una célula hospedadora o un organismo
transgénico que contiene una molécula de ácido nucleico, según las
reivindicaciones 2 a 8.
13. Una célula hospedadora o un organismo
transgénico que contiene un vector, según la reivindicación 10.
14. Células hospedadoras, según cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 13, caracterizadas por consistir
en una cepa pura de Streptomyces spp., sus mutantes o sus
derivados transformados.
15. Células hospedadoras, según la
reivindicación 14, caracterizadas por consistir en una cepa
pura de Streptomyces albus, sus mutantes o sus derivados
transformados.
16. Células hospedadoras, según cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 15, caracterizadas por expresar
resistencia a rebecamicina.
17. Células hospedadoras, según cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 15, caracterizadas por expresar
resistencia a un indolocarbazol.
18. Utilización de una molécula de ácido
nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la
producción de indolocarbazoles, derivados de indolocarbazoles o
precursores de indolocarbazoles.
19. Utilización de una molécula de. ácido
nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en la
producción de rebecamicina, derivados de rebecamicina o precursores
de rebecamicina.
20. Utilización de una molécula de ácido
nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para
aumentar el nivel de producción de un indolocarbazol.
21. Utilización de una molécula de ácido
nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, para la
obtención de células hospedadoras que expresen resistencia a un
indolocarbazol.
22. Utilización de células hospedadoras u
organismos transgénicos, según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 17, en la producción de indolocarbazoles, derivados de
indolocarbazoles o precursores de indolocarbazoles.
23. Utilización de células hospedadoras u
organismos transgénicos, según cualquiera de las reivindicaciones
12 a 17, en la producción de rebecamicina, derivados de
rebecamicina o precursores de rebecamicina.
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