PT98428B - Clonagem da via de biossintese para formacao de clortetraciclina e tetraciclina a partir de streptomyces aureofaciens e sua expressao em streptomyces lividans - Google Patents

Description

FUNDAMENTO DO INVENTO presente invento está relacionado com a aplicação ds técnicas de genética molecular para, a clonagem do conjunto de genes CDNA) codificador da. via de biossíntese completa da clortetraciclina e portanto também da. tetraciclina derivada de S, aureofaciens s sua expressão no hospedeiro heterólogo S, lividarts. 0 conjunta de genes de biossíntese isolado CDNA) serve como substrato de bioengenharia no sentido de se conseguir melhores rendimentos das fermentações -assim como novas estruturas de antibióticos, antibiótico clortetraciclina e compostos derivados ( e, g, tetracic 1 ina., dsraeti Ic lortetracic 1 ina, demeti 1 te trac ic 1 ina) são produzidos comercialmente em fermentação submersa. por Streptomyces aureofaciens (Dugar, 1948), Mais de- 3© anos de manipulação industrial deste microorganísmo resultou no desenvolvimento ds técnicasa de fermentação sofisticadas e formulações de? meios que permitiram melhorias significativas no rendimento da fermentação (Goodman,. 1985) » Estes avanços também foram auxiliados pelo isolamento de mutantes de 5, aureof adens com maior capacidade para produzir o antibiótico (Veselova, 1969), Estas estirpes altamente produtoras foram isoladas na sua maior parte pelo processa de mutagénese, seguido de rastreio ao acaso relativamento a um rendimento melhorado, As mesmas técnicas permitiram o isolamento de mutantes bloqueados na biossíntese de antibióticos que foram armas críticas para a elucidação da sequência de biossíntese da formação de clortetraciclina (McCormick_? 1968), •Apesar destes resultados, uma compreensão da regulação genética da biossíntese de clortetraciclina riãa foi totalmente realizada. Desenvolvimentos recentes no campo dagenétics de Streptomyces criaram a oportunidade de estudar a genética molecular dos organismos produtores de metabolitos importantes- sob o ponto de vista industrial»

A demonstração ds recombínação das marcas cromossémicas pela fusão e subsequente regeneração de protoplastos de

Streptomyees íHopwood_P et ai» 1978 e Baltz, et al», 1981 > foi um acontecimento fundamental na genética dos actinomicetes. Enquanto que antes do desenvolvimento de técnicas de fusão de protoplastos, os cruzamentos genéticos podiam ser feitos de forma reprodutível apenas- nalgumas espécies para as quais se tinha demonstrado a existência de sistemas de conjugação ÍHopwood, 1967), agora a análise genética pode ser realizada em quaisquer es-pécies que possam ser transformadas em protoplastos e regeneradas. Mais importante ainda, os protoplastos mais tarde mostraram-se um substrato ideal para a transformação pelo DNA de plasmídeo, criando assim a oportunidade para a realização de experiências com DNA recombinante nestes organismos (Bibb, et al., 1978)» 0 isolamento de genes para várias resistências s antibióticos tais como, tiostreptona, viomicina e neomicina, permitiram a construção de vectores ds clonagem facilmente seleccionáveis a partir de plasmídeos endógenos de 51reptomyces (Thompson, et al», 1982)»

Um dos primeiros genes da biossíntese de antibióticos a ser clonado foi a O-metiltransferase envolvida na formação do pigmento do antibiótico undeciIprodigiosina CUDP») (Feitslson, et al», 1980). 0 gene foi identificado pela sua capacidade para complementar uma mutação conhecida na via de biossíntese de UDP» Outras técnicas empregues nestes esforços inciais para isolar genes da biossíntese incluem clonagem mutacional usando o fago 0C13 para a metilenomicina (Chater, et al», 1983)uroa selecção de clones recombinant.es usando ensaios enzimáticos in vitro para fenoxazinona-sintetase da actinomicina (Jones, et al», 1984) e resistência à sulfonamida conferida pela sulfonamida ácido

-4p-benzóico-sintstase envolvida na produção de candicidirja íGil et identificê íMurakami et al, 1983). Senes da biossíntese de bialafos foram identifiçados através da complementação ds mutantes bloqueados al., 1986).

Qs genes envolvidos na biosssíntese de actinorrodina foram clonados por complementação ds mutantes de Streptomyces coeiicolor bloqueados na biossíntese íhalpartida st al., 1984)., Neste último caso, dois clones sobreponíveis complementando classes distintas de mutantes foram combinados num único plasmídeo que ss mostrou conferir a capacidade de sintetizar actinorrodina quando introduzido num hospedeiro heterólogo Streρtomvces parvulus.

Uma outra série importante de observações foi que genes ds biossíntese de antibióticos estavam fisicamente ligados a determinantes ds resistência ao mesmo antibiótico no organismo produtor. Assim, um fragmento de DNA derivado de Streptomyces qriseus conferindo resistência à estreptomicina é contíguo ao DNA que complementou bloqueios biossintéticos CDistler et al., 1985). A mesma situação foi observada sm Strsptomyces fradias em que os genes de biossíntese foram identificados por rastreio de uma biblioteca de cosmídeos relatívamente à homologia com um oligonucleótido de bases mistas construído para representar a sequência de DNA do extremo amina da enzima final na via ds biossíntese da tilosina (Fishman et

1989). Um gene de resistência á tilosina anteriormente clonado CtlrB) está dentro desta região de DNA, a qual complementa nove classes de mutantes boqueados CBaltz et a.l, 1988) e tetracenomicina, CMotamedi, et al., 1987), uma selecção primária da expressão do gene de resistência a antibióticos no hospedeiro heterólogo Streptpmyces 1ivídans permitiu subsequente identificação de genes da biossíntese de antibióticos situado;» no mesmo fragmento de DNA clonado.

A utilização de -sondas de ácido-s nuclsicos ajudou α

isolamento de genes de biossintese. esta abordagem baseia-se na existência de um corpo de informação pré-existente respeitante ã via ou obtido antes da clonagem ter sido realizada» Assim, no caso da tilosina atrás, foi construída uma sonda usando informação de uma sequência de aminoácidos parcial de uma enzima de biossintese (Fishman, et al», Í987), De forma semelhante, o gene codificador de isopenicilina N-sintetase foi clonado a partir de Streptoroyces cIavu 1 iqerus através da. identificação de um clone que hibrida com um oligonucleótido sonda construído com um conhecimento da sequência de aminoácidos N-terminal da enzima CLeskiw, 1988)» Os genes envolvidos na biossintese da eritromicina foram identificados por rastreia de uma biblioteca de cosmídeos com um gene de resistência á. eritromicina anteriormente clonado CStanzak, 1986)» De forma semelhante, os genes envolvidos na biossintese de oxitetraciclina foram identificados por hibridação com um determinante de resistência anteriormente clonado CButler et al», 1989) e um oligonucleótido sintetizado para representar a sequência de DNA correspondente à sequência ds aminoácidos parcialmente elucidada da enzima de biossintese anidrotetraciclina-oxigenas© CBinnis et al», 1989), A utilização das sondas heterólogas actl e actll permitiu a identificação de genes envolvidos na biossintese de antraciclina em Streotomyces peuçetius CStutzman-Enqwal1 et al», 1989).

A utilização destas técnicas individualmente ou em combinação permitiu o isolamento ou montagem de vias de biossín— tesa completas e nalguns casos a suai expressão num hospedeiro heterõlogo» Todo o conjunto de biossintese de bialafos foi clonada por uma combinação de selacçSes de complementação de actividades e expressão CMurakami et al», 1986). respeitante ao isolamento heteróloga de resistência a bialafos Se bem que se tenha» feito uma nota com êxito de toda a. via num único passo

em Streptomyces 1ividans por selecção da resistência a bialafos, não foi feita referência respeitante à expressão dos genes de biossíntese. A montagem do conjunto da actinorrodina a partir de clones consplementarss e a su.a expressão em Streptomvces parvulus foi aqui já discutida (Malpartida et al., 1984),

Um clone de plasmídeo bifuncional que hibridou com um deeterminante de resistência á eritromicína homólogo foi isolado a partir de uma biblioteca de Saccharopolvspora erythrea e mostrou-se que dirige a síntese de eritromicína quando transferido para Streptomvces 1 ividans CStanzak et al.., 1986). Um clone de cosmídeos de e» coli que apresentou hibridação com uma sonda do gene ds resistência & oxitetraciclina s com uma sonda de um gene de biossíntese Canidrotetraciclina-oxigenase) permitiu o isolamento do conjunto de biossíntese da oxitetraciclina a partir de Streptomyces rimosus CBinnie et al», 1989). Subsequente subclona— gem num vector plasmídeo de Streptoroyces permitiu a produção de oxitetraciclina em Streptomvces 1ividans

Dois clones sobreponíveis do produtor de tetracenomicina fora identificados por complementação de mutantes bloqueados de Streptomvces galucescens e capacidade para conferir resistência á tetracenomicina em S» 1 i v idu 1 ans (Motamedi et al», 1987’}»

Suando ambos residem separadamente em S»_1 ividans e são cofermentados ou quando são co—residentes nc? mesmo hospedeiro 5.

x xv auu. {—> r.

isolados a produs-se tetracenomicina» Os bifuncionais partir de uma biblioteca em E, coli de DNA de Streptomvces peucetius por hibridação com as sondas acti e actll de S. caelicplor dirigem a síntese de antibiótico pigmentado quando introduzidos em S» 1ividans íStutzman-Enqwal1, 1989)»

Em adição, deu.—ss o isolamento da via de biossíntese para a produção de csptamicina C (Chen et al», 1988)« Neste caso»

clones ao acaso em 8»_lividans foram despistados individualmente reiativamente à produção de cefamicina C usando um método de fermentação em blocos de agar. Um transformante de S. lividans em 30060 despistados produz cefamicina C.

presente invento é o primeiro caso em que genes de DMA relacionados com a via de biossíntese para a produção de tetraciclina e clortetraciclIna são isolados e utilizados.

BREVE DESCRIÇgQ DOS DESNHOS

Figura Is Estrutura dos componentes do vector cosmídeo bifuncional e método para a obtenção de braços de cosmídeo. Os braços do vector cosmídeo L e R foram gerados a partir dos como se mostra na figura e As linhas simples representam plasmídeos A e B» respectivamente, um

Em coíhu u€uâlnado no uxemplu o porçSss do replicão de Escherichia coli das construções» No plasmídeo A a porção de E. coli deriva do fragmenta EcoRI-SalI de '3,7 Kb do pBR322 CSutcliffe, 1979)» 0 plasmídeo B contem fragmento EcoRI-Salide SCP2$ Ca tracejado! que proporciona função de replicação nos actinomicetes CLarson et al., 1986)« ambas as plasmídeos são proporcionados três sítios de extremos coesivos em tandem derivados de um fragmento BqlII-BstEII de 7®0 pb contendo cas de pHC79 ÍHahn et al», 198®) [aberto!. 0 gene ds resistência à tiostreptona [sombreado! presente no plasmídeo A deriva de um fragmenta Bell de 1,1 kb (Katz et al», 1983). Uma região espaçadora de 1,1 kb no plasmídeo A [ponteado! deriva de um fragmenta SacI da bacteriofago lambda CSanger et al, 1982).

Figura 2s Mapa física de LP127 e LF'~128« Ambos os plasmídeos apresentam estruturas equivalentes por mapeamento de restrição? assim uma única estrutura representativa de ambos está

-8representada por uma linha dupla? a região de biossintese TC/CTG está, apresentada como uma linha simples. 0 DNA clonado a partir de 5» aureofaciens tem 31,9 kb? o vector tem 11,1 kb» As regiões do vector evidenciadas são ρϊΒΪ-24 Etracejado!, resistência à tiostreptona Cl istrada3» Os dois sítios EcoRI marcados com um ( + ) derivam do vector e delimitam a junção Sau3A~Bq111 que demarca o vector e DNA de 5, aureofaciens,

Figura 3s Mapa de endonucleases de restrição do DNA de

S» aureofaciens clonado em LF'^J‘127 e LP^iSS. As 31,9 Kb de DNA *3 *7 clonado em LP127 ε LP12S estão apresentadas numa forma linear. O mapa foi desenhada de forma a incluir os sítios EcoRl derivadas do vector como as posiçSes iniciais e finais á esquerda e á direita» Os tamanhos dos fragmentos de restrição estão apresentados em pares de kiloh-ases e a sua precisão está dentro dos limites de resolução normais das análises electroforéticas em gel de agarose (~5®0pfe>.

SUMÁRIO DO INVENTO presente invento está relacionado cckr a clonagem de toda a via de biossintese para a formação de tetraciclina e clortetraciclina a partir de Streptomyces aureofaciens e sua

expressão no hospedeiro hsterólogo Streptomyces 1ividans» Portanto, o presente invento está relacionado com os qenes isolados (conjunto) codificadores da via de biossintese para a destes antibióticos, clortetracíclina e tetraciclina e processos de hibridação restringentes, conhecidos dos zados com a área., hi brida com conjuntos de genes de DNA produção DNA que em familiariisolados codιτιcadares da via de formação < tetraciclina» Ainda, o presente invento utilização destes genes para aumentar a clortetracíclina s está relacionado cc>m a os rendimentos destes _φ_ antibióticos ε em métodos de rastreio da produção análogos da tetraciclina e clortetraciclina.

de novos

Para se prosseguir com o isolamento dos genes de biossintese, empregou-se um rastreio de uma biblioteca recombinante de S, lividans para um clone expressando a resistência à tetraciclina. As inserções de DNA de S. aureofaciens nos cosmídeos recombinantes que compreendem a biblioteca são necessáriamente grandes pois as restrições do sistema de empacotamento de lambda in vitro empregue requere moléculas de cosmxdeo com inserções de DNA de 25~40 Kb para dar uma partícula de fago com transdução viável» Quando os clones resistentes à tetraciclina são seleccionados entre esta população de clones genómicos de S» aursafaciens, é seleccionada uma série de clones de cosmídeos. Espera-se que muitos ou todos estes contenham genes da biossíntese de antibióticos ligados ao gene de resistência à tetraciclina seleccionado» Entre os que são suficientemente grandes e correctamente colocados encontra-se uma sub-série englobando toda a via de biossintese. Assim, a clonagem de genes e de facto de todos os genes, da formação de tetraciclina e clortetraciclina é possível sem qualquer conhecimento prévio da estrutura ou sequência da região» Se bem que tenham sido publicados artigos respeitantes è. clonagem de um determinante de resistência à tetraciclina (Reynes et al., 19SS) e uma bromoperoxidase (Vam Pee, Í988) derivados de Streptomvces aureofaciens, estes estudos não se estendem ao isolamento de genes da biossintese da clortetraciclina ou de todo o conjunto dos genes, é proporcionada a seguir uma descrição mais detalhada do presente invento através de Exemplos que são ilustrativos do inventa não o limitando»

-10~

DESCRICSO DETALHADA DO

4VEWTQ

O método usado para o isolamento do DNA envolve a digestão das células com lisozima num tampão osmótico, seguido de lise suave, extracção da proteína e enriquecimento em DNA de alto peso molecular. Se bem que o método descrito seja eficaz, os familiarizados com a matéria reconhecerão que pode ser empregue uma variedade de métodos alternativos, como sejam os descritos por Hopwood et al», 1985»

A fonte de DNA total usado no exemplo é Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 mas o invento não está de forma alguma limitado a esta fonte particular» Um variedade de outras estirpes de Streptomyces aureafaciens produtoras de anticorpos da classe das tetraciclinas poderá ser usado no presente invento com igual sucesso» Estas estirpes de S» aurofaciens incluem estirpes mutantes e tipos selvagens alternativos produtores de clortetraciclina, tetracic1ina, ó-demeti1c1ortetracíclina, ó-demeti1tetraciclina, T-cloro-Sa,1la-desidrotetracic1ina, 2-decarboxamido-2-acetiltetraciclina e outros compostos membros das famílias das tetraciclinas. 0 presente invento está relacionado também com a clonagem de clortetraciclina, tetraciclina e composotos relacionadas com a tetraciclinade outros organismos os quais incluem mas não estão produtores de tais compostos, limitados s Streptomyces rimosus„ virififaciens, S » psammoti c us.

Dac ty .1 osporanq ium vssca» avEiianeus, » lusÍtanus. ti,

Ac tinomadura brunnea

Fez—se uma digestão parcial do DNA de S»______aureofaciens com a endonulcease de restrição SauSA para gerar fragmentos de DNA grandes na gama de tamanho pretendida das 35 Kbilobases extremos homólogos dos braços do vector cosmídeo bifuncional» com

neste caso, fez-se uma determinação empírica das condições óptimas de digestão foi conseguida fazendo uma série de digestões e analisando uma amostra dos produtos finais por electroforese em gel de agarose. Ds familiarizados oom a matéria conhecem construções de bibliotecas e métodos de recuperação alternativos para o DNA clonado com interesse. A utilização de E, coli, assim como a selecção por tamanho imposta pelo empacotamento em lambda do exemplo não é limitativo do presente invento uma vez que a utilização de outros vectores è igualmente útil. Os familiarizados com a área reconhecem que vectores monofuncionais de Streptomyces» tais como pIJ922 (Lydiate et al., 1985) podem ser empregues no presente invento, com a condição de a construção da biblioteca e a recuperação do plasmídeo recombinante ser realizada dentro dos actinomicetes,

Os passos que se seguem nos exemplos envolvem empacotamento in vitro dos produtos de ligação e DNA fraccionado pelo tamanho, transdução de E. coli X2819T, colheita da população de transdutantes e isolamento de DNA a partir deles para dar uma invento não está limitado pelos descritos no exemplo. Métodos alternativos podem ser empregues com a mesma finalidade sem consequências adversas. Assim, podem ser empregues protocolos alternativos para a ligação e empacotamento in vitro, assim como hospedeiros E. coli alternativos deficientes na recomhinação CrecA), processos de amplificação de bibliotecas Ce.g. crescimento em caldo selectivo) e processos de preparação de plasmídeos, todos eles tendo sido publicados na literatura (Maniatis et al», 1982).

- ife-n t x fica

Passos subsequentes nos exemplos descrevem a introdução da preparação ds DMA do conjunto de cosmídeos em Streptomyces

Iividans, criação de uma biblioteca de ce subsequente

despiste de tal biblioteca reTativamente a transformantes de S» lividans apresentando resistência a pg/ml de tetraciclina. Apesar de mais laborioso, os transformantes podem ser directamente despistados relativamente á resistência à tetraciolina por transferência de réplicas» Níveis alternativos de tetraciolina poderão ser usados no rastreio conforme ditado pela resistência inata apresentada pelo hospedeiro ou organismos fonte» Outros hospedeiros não restrictivos sensíveis à tetraciclina, tais como Streptomyces qriseofuscus, podem susbtituir S» lividans.

Em seguida, obtem-se a recuperação do plasmídeo recombinante através do isolamento de DÍMA de plasmídeo a partir de S. 1ivirians resistente â tetraciclina seguido de empacotamento in vitro do refeido DNA e transdução sm E» co1i. □ DNA de plasmídeo isolado a partir de tais transdutantes é estruturalmente caracterizado por análise com enzimas de restrição? e os dois plasmideos isolados no exemplo, L.P^127 e LP^ISQ, demonstrou-se possuírem estruturas equivalentes. Os familiarizados com a área reconhecerão qus regiões de DNA semelhantes clonadas a partir de organismos alternativos poderão apresentar polimorfismo no arranjo dos sítios de restrição, mas que um fragmento de DNA suficientemente grande conferindo resistência à tetraciclina espera-se que confira as propriedades descritas abaixo»

A natureza da resistência à tetraciclina transportada pelo plasmídeo foi confirmada demonstrando que os transformantes resistentes à tiostreptona de 5. lividans obtidos com LP‘^£Í27 e

L.P^128 são também resistentes ã tetraciclina» A elaboração do antibiótico do tipo tetraciclina é demonstrada pela produção em agar por S» lividans resistente à tiostreptona e tetraciclina, .atrás referida, da actividade antibótica eficaz contra E» coli mas menos contra E» coli resistente à tetraciclina»

Finalmente, demonstrou-se que a síntese de tstraci-

hospedeiro heterólogo por fermentação em agar stracicIina inicialmente lividans produzem tetraem que são isolados os clinas é dirigida por LP‘127 no S t reρ tomyc es 1i y i dans. Isto é conseguido e em caldo. S, lividans resistente à fr isolada e um transformante LP^x'i27 de S._ ciclina e clortetraciclina nas condições mesmos produtos a partir do organismo fonte de DNA Streρ tomyces aureofaciens ATCC 13889» Por outro lado, um transformante de S. 1ividans contenda apenas vector plasmídeo sem DNA inserido não apresenta produção de antibiótico.

A demonstração da produção de tetraciclinas pelo hospedeiro heterólogo não está limitada às condições de fermentação ou sistemas de HPLC analíticos descritos no exemplo, se bem que estes permitem claramente uma analise eficaz. Um grand® número de processos para a fermentação s análise de tetraciclinas

foi descrito e podem substituir os aqui descritos. Também, apesar de de Streρtomyc es 1ividans ser usado como hospedeiro heterólogo nos exemplos, a expressão heteróloga de genes da biossíntese de antibióticos ê esperada numa série de actinomicetes e outros grupos bacterianos incluindo, mas não estando limitados a Bacillus, Corynebacteria, Thermoactinomycetes, desde que ales sejam transformados com as construções de plasmídeos relativamente grandes aqui descritas. Os que são transformados incluem paiexemplo Streptomvces qriseofuscus e Streptomyces ambofaciens que são conhecidos como sendo relativamente não restriπgentes.

EXEMPLO ls PREPARAÇÃO DE DNA TOTAL DP

STREPTOMVCES AUREOFAC I EMS

Uma preparação liofilizada de ATCC 13899 foi rsssuspensa em 0,8 ml de IX íó g/1 de Na^HPO^/, 3 g/1 de KH„PO_A,

Streptomvces aureofac iens solução sintética de sais 0,57 g/1 de citrato de

-14—

sódio) e semeada em agar de Bennett il g/1 de extracto de levedura, 2g/l de NZ-Amina A, 1 g/1 de extracto de carne, 20 g/1 de D-glucose, 2© g/1 de agar Bacto. Após incubação a 2S°C durante dois dias, as células de uma só placa foram raspadas para 6 ml de Tryptic Soy Broth íDifco) e sonicadas rapidamente (Bl® segundos) com um sonicador Heat Systems Ultrssonics W200P equipado com uma microponta. Obteve-se uma cultura de sementeira inoculando 2 ml da suspensão sonicada em 3® ml de Tryptic Soy Broth TSB), seguido ds incubação a 28*C, 2®© rpm durante 2 dias» Cinco ml da cultura de sementeira foi então inoculado em 1©© ml de TSB supleentado com 27 de glicina e incubado a 28'-’C, 29© rpm durante 48 horas,

As células foram colhidas por centrifugação a 98©0Xg durante 30 minutos» 0 sedimento de células foi lavado com 20© ml íl©© <3/1 de sucrose, ©,2 g/1 de K.~,Sí ce meio ml/1 de solução de micronutrientes a qual consiste em 4® mg/1 de 2nCl.~ e

FeCl^.óH^O,

CuC 1 »2H.—L-.

Na-B_oO-,.í0H^O *t *<£ /

MnC 1 »4H.₇O, de cada. 0 sedimento de células foi congelado a -2©°C e depois descongelado e ressuspenso em 12 ml de P (meio P suplementado para conter 25 mM TES, 23 mM CaCl^, 1© mM MgCl^, 3,7 mM ΚΗ.-,ΡΟ^) contendo 1© mg/ml de lisozima (Sigma, recristalizada 3X)„ As células foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas altura em era evidente a formação de protoplastos. Fez-ss uma adição de 2,5 mg de Proteinase K CBoehringer-Mannhsim) e a mistura foi incubada a 37^OC durante 15 minutos. A lise foi conseguida pela adição de 1© nsl de ©,2 M EDTA pH 8,©, ©,1M Tris pH 8 seguido imediatamente da adição de 2,4 ml de lauril-sulfato de sódio a 1©% (SDS). A mistura viscosa foi incubada a 50’^:’C durante ó© minutos com agitação suave ocasional« í NH , ) , M0_._,,. 4H ,,0) 1 & mq /1 ti Z ,-.4 *·;

Uma vez equilibrado (5© g 8, 1 mM EDTA pH 8 completada a. lise, adicionou-se 2® ml de fenol de fenol f 6,5 ml de i®0 mM NaCl, í® mM Tris pH + ©,©S g de 8-hidroxiquinolína), a preparação

foi. agitada suavemente e depois centrifugada numa centrífuga de bancada a 155® x g durante 3© minutos. A fase aquosa superior foi colhida e novamente extraída como atrás; o fenol da primeira extracção foi novamente extraído com 2® ml de 1® mM Tris pH 7.4, imM EDTA pH 8 (TE), As fases aquosas colhidas foram então extraídas com igual volume ds clorofórmio, centrifugado como atrás e distribuído em volumes de í® ml por tubos de ensaio separados. Adicionou-se a cada um dos tubos um Ím de acetato de amónio 3M pH 5 e 1® ml de etanol frio sobre a solução viscosa. 0 DNA foi suavemente enrolado à volta de uma vareta de vidro, lavado duas vezes com etanol frio e dissolvido em 8 ml de TE durante a noite a 4°C. Uma leitura espectofotométrica de A.-,,,. foi feita para

ZOv cálculo de ácidos nucleicos totais presentes ípredominantemente DNA) .

EXEMPLO 2s BI SESTRO PARCIAL E ENRIQUECIMENTO POR TAMANHO DE DNA DE S. AUREOFACIENS

Determinou—se empiricamente as condiçSes de uma digestão parcialque dá produtos de digestão com SauSA do DNA de S, aureof ac iens na gama de 35 kilobases (Kb). Preparou—se uma série de tubos de reacção contendo ~25 pg de DNA contido em 3®© pl de tampão de reacção consistindo em í®© mM NaCl, i® mM Tris pH 7,4, 1® mM MgCl_o ε adicionou-se endonuclease de restrição SauSA (New England Biolabs) para dar concentrações finais de 0,5, ©,i 0,05, ®,©1, 0,005 unidades de enzima/pg de DNA, As reacções incubadas a 37'^?'C durante 6© minutos, depois colocadas a durante 2® minutos e finalmente removidas para gelo, Retirou-se 2® pl e aplicou-se num gel ds ®,5”(, de agarose para comparação do tamanho com fragmentos de tamanho conhecido (DNA de lambda digerido com HindlII, Xhol e não digerido). 0 DNA no restante volume foi precipitado por adições sequenciadas de 5® pl de acetato ds amónio 3M e 1 ml de etanol, sequido de arrefecimento a foram

6-5 *C

-20°C. □ DNA precipitado foi então sedimentado por centrifugação a 8800 xg, novamente dissolvido em 300 μΐ de acetato de amónio 0,3M, precipitado de forma semelhante, sedimentado, lavado com etanol, seco sob vácuo e o sedimento seco foi finalmente dissolvido em 100 μΐ de TE» Uma observação do gel de agarose corado com brometo de etídio que sujeito a electroforese durante a noite a 1 volt/cm, revela que a digestão com 0,05 unidades Sau3A/uq de DNA dá produtos de digestão na gama pretendida à volta de 35 Kb»

EXEMPLO

PREPARAÇÃO yt

DE

DOSMfDEO

Ds componentes do vector cosmideo bifuncional foram retirados dos plasmideos A e B mostrados na Figura 1. 0 plasmídeo A contem pIBI24 que proporciona uma origem de replicação e um gene ds resistência á ampicilina para replicação e selecção em E» coli« Este plasmídeo também proporciona um gene de resistência ã tiostreptona para selecção de plasmideos nos actinomicetes, assim como múltiplos sítios de extremos coesivos (cos) do bacteriofago lambda gue servem como substratos para o emapacotamento in vitro» □ plasmídeo 8 foi projectado para proporcionar uma origem de replicação 8CP2# para manutenção do plasmídeo em actinomicetes e múltiplos sítios cos» □ plasmídeo A foi digerido com Asp718 e depois desfosforilado com fosfatase alcalina de intestino de vitela CCIAP5» 0 DNA foi então extraído com clorpano e clorofórmio, precipitado com etanol e seco sob vácuo» 0 DNA foi então ressuspenso e digerido com Eo111» 0 plasmídeo B foi digerido com Sall e subssquentemente tratado com CIAP» Após extracção com clorpano, precipitação com etanol e secagem sob vácuo o DNA foi ressuspenso e digerido com Bg1ϊI»

As reacções de digestão referidas atrás foram aplicadas num gel ds agarose e sujeitas a electroforsss durante a noite» Um fragmento de 6 kb do plasmídeo A e um fragmento de 8,© kb do plasmídeo B, que contem as regiões bifuncionais descritas atrás, foram isolados do gel de agarose por electroeluição,

EXEMPLO 48 LISAÇ-ÃQ DOS BRAgQS DE CQMíaDEQ AO DNA GENóMICU DISERIDO COM SAU3A E EMPACOTAMENTO ΪΝ VITRO —'! 7—

Us fragmentos de DNA genómico digeridos com Sau3A e analisados relativamente ao tamanho do DNA de S.

aureafaciens foram ligados aos braços de cosmídeo através de uma ligação in vitroQuatro pl de DNA de 5« aureofaciens digerido com SauSA correspondendo a cerca de 8 pg foram combinados com i pg de cada um dos braços de cosmídeo i e 2 em 1©μ1 de mistura de ligação que contem èé mM Tris pH 7,4, 10 mM MgCI_o, 1 mM ATP, ditiotreitol 1© mM B 4© unidades (unidades de extremos coesivos) de DNA-ligase de T4 (New England Biolabs), A mistura de ligação foi incubada a Í1‘^:'C durante 18 horas e depois sujeita a uma reacção de empacotamento in vitro através da adição dos 10 pl de mistura de reacção a um extracto de sistema de empacotamento de DNA do fago lambda Packagene' CPromega Biotec),. Após uma incubação de 2 horas à temperatura ambiente, adicionou-se 5©© pl de tampão de diluição de fagos CPDB) Ci@© mM NaCl, í© mM TRIS-HC1 pH 7,4, í© mM MgSO.) seguido da adição de 25 pl de clorofórmio. A mistura foi tratada com vortex © guardada a 4°C.

EXEMPLO 5e TRANSDUçãO EM ESCHERICHIA COLI E PREPARAÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE COSMÍDEO BIFUNCIONAL

A preparação de fagos derivada da reacção de empacotamento in vitro foi transduzida em Escherichia coli X2819T CR, com _o objectivo de obtenção de milhares de com

transdutantes a partir dos quais ss pode obter uma preparação de um conjunto de DNA de plasmídeos ou. biblioteca, de cosmídeos bif uncionais. Com esta finalidade, 3,3 ml de de uma cultura crescida durante a noite de X2B19T foi inoculado em 10 ml/1 de 20-10-5 (23 g/1 de Triptona, 13 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de NaCl, 53 mg/1 de timidina) e incubou-se a 2B*C, 2,5 horas» Quatro porções de 0,4 ml de células X2819T foram então combinadas com 0,8 ml de PDB e centrifugado na velocidade máxima durante 5 minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas em 13ô μΐ de PDB. Em seguida adicionou-se 5® μϊ de preparação de fagos do empacotamento in vitro. Os fagos foram adsorvidos a células a 37°C, 25 minutos» Dois ml de 20-10-5 foram adicionados a cada uma das misturas e a suspensão incubada com agitação a 28 *C durante 2 horas» Amostras de cem microlitros foram semeadas num total de 50 placas de Petri contendo agar 20-10-5 (caldo 20-10-5 e 20 g/1 de agar bacto) suplementado com 100 mg/1 de -Sigma). As placas foram incubadas a ' depois deixado à temperatura ambiente contagem de placas de cinco piacas repre· obteve um total de K12000 colónias resis

ampicilina (sal sódico28''C durante a noite e durante três dias» Uma sentativas revela que se tentes è. ampicilina»

Cada uma das placas foi inunoada com 5 ml de solução consistindo em glucose 50 mM, 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8 (GTE), As colónias foram ressuspsnsas com um espalhados- estéril e todos os elu.atos reunidos para dar uma suspensão de células que foi centrifugada a 9S00xg durante cinco minutos. As células sedimentadas foram ressuspensas em '72 ml de GTE» Em seguida adicionou-se 8 ml de GTE contendo 4© mg de lisozima/ml. A digestão com lisozima foi incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida adicionou-se ló@ ϊώ! de base-SDS <8g/l de NaOH, ί© g/i de SDS)que dá origem a u.m lisado viscoso após mistura suave. Após incubação em gelo durante 20 minutos, adicionou—se 6© ml de acetato de potássio 5M, misturou—se e incubou—se

mais 20 minutos em gele, o sobrenadante foi colhido ε adicionado 2®0 ml de isopropanol frio, misturou—se e incubou-se em gelo durante 15 minutos., seguido de centrifugação a 9800>;g durante 20 minutos» □ sedimento de ácidos nucleicos foi dissolvido sm 20 ml de TE suplementado com 1% tíe sarcosinato de sódio. Adicionou-se vinte e duas gramas ds CsCl e uma vez dissolvido, adicionou-se 2 ml de uma solução de IO mg/ml de brometo de etídio. A mistura ds? CsCl-brometo de etídio foi colocada em tubos adequados e centrifuqada num rotor Beckman 70.1TÍ a 55000 rpm durante ÍV horas.

Os tubos foram retirados e a banda de plasmídeo foi recuperada furando lateralmente com seringa. 0 brometo de etídio foi removido da amostra extraindo 4 vezes com igual volume ds butanolsaturado com água» A solução aquosa foi ajustada a 6 ml com TE; .adicionou-se 1 ml de acetato de amónio 3M e o DNA de plasmideo foi precipitado com 18 ml de etanol. Após arrefecimento a. ~20*C o DNA foi sedimentado por centrifugação a 3400 xg durante 30 minutos» Uma segunda precipitação foi realizada de forma semelhante, em seguida o DNA foi lavado com etanol, seco sob vácuo, dissolvido em 1 ml de TE e determinada a concentração de DiMA por es pectofo tometria»

EXEMPLO ós INTRODUçao DA BIBLIOTECA DE PLASMÍDEO EM STREPTOMVCES LIVIDANS E CONSTRUÇÃO DE UMA

BIBLIOTECA DE CÉLULAS RECOMBINANTES DE S. LIVIDANS

A biblioteca ds plasmideos bifuncionais construída no passo anterior foi usada para transformar Streptomvces 1ividans JK54 onde é conseguida a expressão fenotipica de genes de Streptomyces. Com esta finalidade- protoplastos de Streptomyces 1ividans TK54 foram preparados essencialmente segunda métodos convencionais CHopwood et al,, 1985)» Resumidamente, as células de uma cultura de 45 horas de S. 1ividans TK54, obtida por inoculação de 0 ,2 ml de uma suspensão de esporos em dez

20quantidades de 5© ml de meie? completo YEME C3g de extracto de levedura/l, 5 g/1 ds peptorsa, 3g/l ds extracto de malte, 10 g/1 de glucose, 340 g/1 de sucrose, 5 g/1 de glicina, 5 mM MgCl^,

L-histidina e L-leucina, 40 mg/1 de cada) foram sedimentadas por centrifugação a 98®0xg durante 15 minutos» 0 sedimento de células foi lavado duas vezes com meio P e depois ressuspenso em 60 ml de p*. Vinte ml de P⁺ contendo 14 mg de lisozima/ml foi adicionado e ai suspensão incubada a 30^OC num banho maria com agitação a 15S rpm durante 90 minutos» Subssquentemente, 100 ml de P⁺ foi adicionado e a suspensão de protoplastos foi passada através de um algodão não absorvente esterilizada. 0 filtrado foi centrifugado a 3800xg durante í© minutos, o sedimento de protoplastos foi ressuspenso e lavado com ΙΘ0 ml de P' e após uma segunda centrifugação ressuspenso em 120 ml de P'. ft preparação de protoplastos foi distribuída por criotubas de 1,8 ml e congelada a -7®°C. ft transformação foi realizada distribuindo 0,3 ml da preparação de

O protoplastos) por cada um dos protoplastos TK45 (contendo ~ 1x10' quatro tubos de centrífuga contendo ml de P . Os protoplastos foram sedimentados por centrifugação a 34®0xg durante ίθ minutos e depois ressuspendeu—se no volume residual» Aproximadamente 10 μα de DNA da biblioteca de cosmídeos foi adicionado a cada um, seguido da adição ds 0,5 ml de PES 1000 a 25% Cl q ds PEG1000

CSigmal dissolvido em 3 ml de uma solução consistindo em 25 g sucrose/1 ml/1 de solução de micronutrientes 500x_:

0,

K^SO^/I, .100 mM LaCl^, 5© mM TRIS-maleato pK 8>» Após mistura incubação durante 30 segundos, adicionou-se 5 de de a

Os de mj de protoplastos foram então sedimentados e ressuspensas em 1 ml >·

P . Volumes de cem pl foram então espalhados sobre agar seco R_OYE (100 g/1 de sucrose, 0,25 g/1 de K^SQ^/l, 2 ml/1 solução de micronutrientes, 2 g de L-prolina XL, 20 g de D-glucose, 5 g/1 de extracto de levedura, e,®5 g/1 de KH^PD,, 25 mM TES, 25 mM CaCl^, 5 mM MgCl_?, 20 g/1 de agar Bacto) e incubados a 28°C. às 24 horas cada uma das placas foi coberta com ml de agar R mole

ou (formulado como atrás mas sem extracto de levedura, glucose

KH^PO^ e contendo 8 g ds agar Bacto IL) contendo 50® pg/ml de tiostreptona e depois incubados durante mais 12 dias.

Obtiveram-se aproximadamente 910® colónias resistentes à tiostreptona» Estas foram colhidas por raspagem das colónias das placas de agar para 3 tubos contendo c-ada um 25 ml de glicerol a 2®%» As suspensões de colónias foram fragmentadas por sonicação durante 9® segundos, reunidas, depois distribuídas por criotubos í,8 ml e congeladas a -7®^OC» Esta preparação congelada constitui a biblioteca de células recombinantes de S» lividans.

EXEMPLO 7s 13DL AMENSMTO DE 5» LIVIDANS LL535 UM TRANSFQRMAMTE RESISTENTE A TETRACICLINA

A PARTIR DA SUAL. SE OBTEM 0 PLASMÍDEO 1.9^127

A biblioteca de células recombinantes de S»__lividans foi em seguida sujeita a um despiste relativamente -à resistência á tetraciclina» PorçSss de 10® pl da biblioteca de células S» 1ividans fragmentadas foram semeadas em agar de Bennett suplementado com Í00 pg/ml de tetraciclina» Após incubação a 23 *C durante 5 dias detectaram~se duas colónias resistentes è tetraciclina» Uma destas, LL535 Cinicialmente designada LL529-2) foi escolhida para posterior analise» A colónia LL535 foi semeada sm agar de Bennett fresco contendo 1Θ® ug/ml de teti

iclzna» 0	crescimento
:S*C, A cul	tura obtida
com 1® g/1	de glucose
pensão foi	incubada a
LL535 foi	rapidamente

3®^!:!C, 2©0 rpm durante 3 dias» A- cultura de LL535 sonicada e uma porção distribuída por criotubos de 1,8 ml e guardada a -7®*C« 0 restante volume foi usado para inocular quatro frascos de 2 litros contendo cada um 5®® ml de meio YEME (como anteriormente descrito mas contendo i-ó g/1 de glicina, MOPS

2bmM e sem MgCl^, L“-bistidina ou tetraciclina. A cultura crescida

L-leucina) contendo 10© p.g/ml de após dois dias foi então processada relativamente ao isolamento de? DNA de plasmídeo como anteriormente descrito excepto todos os volumes empregues serem quatro vezes os do exemplo anterior» 0 precipitado final de DNA foi dissolvido em í ml de TE»

Uma porção de 1© p.l ds DNA de plasmídeo isolado a partir do transformante de S» lividans foi sujeito a uma reacção ds empacotamento in____vitro s subsequentemente usadc? para fazer transduçSo de E„____coli X2819T usando métodos descritos atrás» Um transdutante resistente à ampicilina (designado LL537ÍOÍ semeado em agar 20-10-5 contendo í©© pg/ml de ampicilina e a cultura crescida após um dia de incubação a 3®°C foi usada, para inocular dois volumes de 5©© ml ds caldo 2©~í©-5 contendo í©ô pg/ml de ampicilina» Após incubação a 3©'^:'C, 2>ã© rpm durante a noite o DNA ds plasmídeo foi novamente isolado como anteriormente descrito, 0 plasmideo isolada foi designada LP^Í27? a tamanha calculado do plasmídeo ê 43 Kilopares de bases.

Obteve-se um mapa de restrição para 1.9^127 realizando digestões simples e duplas com endonucleases de restrição» A localização das sítios de clivagem para BamHI, Bc11» Bc111, Bsral, BstI „ BsfcBI, Ca 11. EcoRI. Mlu 1, Ncol» SacI« Seal». Sphl e StuI (New England Biolabs) foram determinados por digestão com cada uma das enzimas sózinha e em combinação com enzimas que cortam em sítios conhecidos dentro do vector, como sejam EcoRI, EcoRV ou HíndIII, As digestões com endonucleases de restrição foram pg de DNA de plasmídeo, 4 μΐ de uma são óptimas para a endonuclease de restrição a ser empregue e aproximadamente 5—4© unidades de enzima num volume total de 4® μΐ« As soluções ds sais Í©X empregues são as seguintes5 para BamHI, EcoRV e SalI» NaCl, ©,©6N realizadas combinando 1-2 solução 1©X de sais que

©UM

BqlII ε Seal

1,0M NaCl,

Tris pH S_?@, 0,06M MgClí2^? P^31-a

Tris pH 7,4, ©,ÍM MgCÍ,,; para. Bell, ©,75M KCi, ©,©6M Tris pH 7,4, .tl» ©,1M íigCl._j para BstBI, ©,6M NaCl, 0,06M Tris pH 7,4, ®,06H !*toC 1

2rs para 6-rai, 0,5M NaCl, 0,©&M Tris pHS, o,o6M Tris pH 7,4, 0,®6M MgCl_o; para Ciai, ©,5M NaCl, ©,©6M Tris pH 8, 0,©6M MgCl.-,?

-ti. j£~ para. EcoRI 0,5M Tris pHS, ©,1M MgCl.-,» para Nlu I, ©,5M NaCl, 0,ÍM Tris pH 7,4, ©,1M MgCI_o? para. Saci, ©,ÍM Tris pH 7,4, ©,1M MgCl_r,| *Mv »fci.

1,©M NaCl, ©,1M Tris pH8, ©,ÍM Tris pH7,4, ©,1M

Stu 1, 1,@M NaCl, ©,1M Tris pHS, ©,ÍN NgCl.-,» As duplas digestões foram realizadas com condições de sais compatíveis com ambas as -enzimas, de acordo com o recomendado pelo fabricante. Todas as reacções de digestão foram realizadas a 37°Ç excepto para Bell que foi realizada a 50^c'C e Bsml e BstBI que foram realizadas a 65°C» 0 tempo de incubação foi de 60-12® minutos.Adicionou-se um volume de 5 μϊ de corante <5©% glicerol, 0, ÍM EDTA pH 8, ®,25% azul de hromofsnol) para parar a reacção e para facilitar a aplicação subsequente nos -géis de agarose.

& para StuI, MgCl^s e para

Os resultados da digestão foram observados por electroforese em géis ds 0,8% de agarose. 0 mapa foi construído por digestão directa de LF’*127 assim como por digestão de fragmentos subclonados. 0 mapeamento de sítios Bell e de sítios Ciai foi inibido por metilação do hospedeiro e, portanto, auxiliado pela utilização de Lp^x258, que ê obtida por empacotamento in vitro de LP'127, transdução de E. coli BM1Í9 (dais-dcis-) e isolamento dos plasmídeos como descrita anteriormente. A estrutura física ds LP“127 estâ apresentada na Figura 2. Na Figura 3 está apresentado um mapa, de restrição mais detalhado para as 31,7 Kb de DNA de S. aureofaciens clonado em 1.8^127.

EXEMPLO „8 2_ XeOLAMENTQ Dtf TRANSFORMAMlE DE

S. LIVIDANS LL529-TT2, RESISTENTE A

TIOSTREPTONA, RESISTENTE A TETRACICLINA,

A PARTIR DO QUAL

UBTEM

PLASMÍDEO LP^Í28

O isolamento de Streptomyces 1ividans LL329—TT2 foi realizado de forma semelhante ao descrito para LL535 excepto a biblioteca de células recombinantes de 5. 1ividans ser semeada em agar de Bennett contendo 5© pg/ml de tiostreptona e 1©0 gg/ml de tetraciclina. Após incubação a 28°C, durante 11 dias, observaram”se duas colónias resistentes» Uma destas, LL529-TT2 foi semeada

s. Após três dias ada para inocular e 100 pg/ml d© 28 *’C, 200 r pm, minipreparação, o d £5 β £ 3 -Ξ-ΓΠ i. d J tó isopropanol, No em agar de Bennett contendo ambos os antibiótico de incubação a 28°C, a cultura resultante foi us 50 ml de TSB contendo 10 pg/ml de tiostreptona tetraciclina» Após cinco dias de incubação a preparou-se DMA de plasmídeo por um processo de qual έ semelhante aos processos de isolamento descritos até ao passo de precipitação com entanto, neste caso os volumes empregues são de ?íJ./4 dos anteriormente observados» Após precipitação com isopropanol, o sedimento de ácidos nucleicos foi dissolvida em 1 ml de TE e extraído com igual volume de clorpano (500 g de fenol e 0,5 g de

8-hidroxiquinolina equilibrada num tampão contendo 10© mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10 mM acetato de sódio pH 6, mais 500 ml de clorofórmio) agitando e depois centrifuganda numa centrífuga Eppendorf na velocidade máxima durante 3 minutos» A fase aquosa foi em seguida novamente extraída com clorpano e depois extraída com clorofórmio de forma semelhante, A fase aquosa final foi colhida e adicionada 100 pl de acetato de amónio 3 M e 1,8 ml de etanol para precipitar os ácidos nucleicos. Após arrefecimento até -20^<:'C a reacção de precipitação foi centrifugada a 8800 Xg durante 30 minutos, 0 sedimento resultante foi dissolvido em 300 pl de acetato de amónio 0,3M, precipitado de forma semelhante com 1 ml

COm de etanol e centrifugado» 0 sedimento resultante foi lavado etanol, seco sob vácuo e dissolvido em 1 ml de TE,

A minipreparação de plasmídeo LL529-TT2 foi usada para realizar empacotamento in vitro como anteriormente descrito» Um transdutante resistente à ampicilina (designado LL538) foi escolhido para a preparação de plasmídeo que se realizou como descrito no exemplo para LL535» 0 plasmídeo resultante purificada foi designado LP^ISS» Qs padrões de bandas de restrição obtidos quando LP'12S foi digerido com 2® endonuc leases ds restrição diferentes foi comparado com o obtido para ΕΡ^Ί27 por análise dos produtos de digestão no mesmo gel de agarose. Os padrões de

J—J bandas obtidos para LP^ÍSS são idênticos aos observados para LP'127, indicando que os dois plasmídeos são equivalentes. Assim,

O as Figuras 2 e 3 descrevem a estrutura ds LF'^128 assim como LP²127.

EXEMPLO 9? OS PLASMÍDEOS LP'Í27 E LP^Í2S CONFERM

UMA RESISTÊNCIA

TRACICLINA ASSOCIADA A PLASMÍDEO

Para confirmar se as resistências á tetraciclina encontradas são transportadas por plasmídeos, os plasmídeos Lp-127 e LP‘^_i2S foram usados para transformar protoplastos ds Streptomyces 1ividans e os transformantes resultantes resistentes à tiastreptona foram testados tetraciclina. Os processos para relativamente è a preparação ε transformação de pre uop 1 âs Cus de S» .»iv i d-^.nes a subsequente ssTecção de transfor— mantes resistentes è tiastreptona foram realizados como anterior‘3 -“3 mente descrito. Dez p.g de LP'“Í27 e LPT2S foram transformados,

O assim como 5 μα de uma testemunha sensível ã tetraciclina, LP‘ili (um vector consistindo em pIBl24, as regiões de replicação SCP2Í Cento e de estabilidade e o gene de resistência â tiostrepton.a). e cinquenta transformantes de cada plasmídeo testado foram sequenciadamente repicados para pares de placas de

Bennett contendo 10® pg/ml de tetraciclina ou 25 gg de ay aí de tiostre—

ptona.

O crescimento 28 °C durante 5 dias, tiostreptona derivados clina, enquanto que 80% •'7 ptona testados de 1_Ρ^12 tetraciclina.

das culturas foi contado após incubação a

Todos os transformantes resistentes à de LP^ii mostraram-se sensíveis à tetracidos transformantes resistentes á tiostre7 ou de LP*Í2B mostraram-se resistentes à

EXEMPLO tOs PRODUÇÃO DE CL0RTETRAC1CLINA E DE TETRACICLINA POR STREPTOMYCES LIVÍDANS CONTENDO

LP^127 E LP^IES

Realizou-se uma série que Lp*127 e LP*12S dirigem a de experiências para demonstrar biossíntese de clortetraciclina (CTC) e de tetraciclina (TC) no hospedeiro heterólogo Streptomyce lividans. 0 isolado original LL535, assim como S. 1ivídans transformados com LP^X’127 produzem CTC e TC na fermentação em agar e em caldo, enquanto que S. lividans contenda um vector de clonagem plasmídeo sem DNA inserido não produz um antibiótico tetraciclina. LP^IES usado para transformar S. lividans dirige a síntese de um antibiótico com actividade contra Escher ichia co1i que pode ser biologicamente caracterizada como tetraciclina. Tal actividade não foi produzida pelo hospedeiro S»_lividans.

Inicialmente, S. lividans estirpe LL535, o isolado resistente à tiostreptona a partir do qual foi isolado LF'^X'127, foi semeada em agar Bennett (que contem 25 gg/ml de tiostreptona) numa diluição de células destinada a dar aproximadamente 20® colónias por placa. S.__lividans estirpe LL531 (que contem vector plasmídeo LP^lii) foi semeado de modo semelhante a uma densidade alvo ds ~400 colónias por placa.

Após oito dias de incubação a 30’’C, a.s colónias de LL535 apresentam uma fluorescência amarela com UV quando ilumina) da com uma lampada de· UV de 366 nm. Isto é característico de culturas produtoras ds tetraciclina s não se observa para LL531.

As placas foram então testadas quanto ã actividade biológica cobrindo as colónias com 5 ml de agar mole 20-10-5 <8 g/1 de agar bacto) que foi previamente semeado com 0,1 ml de uma cultura crescida durante a noite do organismo do ensaio. As estirpes do ensaio empregues são Baoi11us subti11is T1325 adquiridas à University of Leicester (Dr. Eric Clundliffe) T1325 <a qual contem um plasmídeo que confere resistência á tiostreptona), Escherichia coli MM294 e MF-1294 CATCC 3362S) contendo pBR322 (que confere resistência à tetraciclina e à -ampicilina). As culturas cresceram durante a noite a 37°C em 10 ml de 20-10-3, que foi suplementado com 25 pg/ml de tiostreptona para TÍ325 e Í0Ô pg/ml ampicilina para MM294/pBR322. Depois de cobertas e incubadas a 37°C durante a noite as placas foram examinadas no que respeita a zonas de inibição nas camadas do organismo usado para cobrir» A estirpe LL53Í não dá zonas com estirpes de E» coli e apenas algumas colónias dão pequenas zonas localizadas com a grsm-positiva T1325. Todas estas colónias apresentam pigmentação vermelha que ê característica da expressão de actinorrodamina, sabe-se que

S«___1 ividans expressa esta via normalmente críptica com alguma frequência (Horinouchi et al., 1989). Por comparação, a estirpe LL’535 mostrou produção de um antibiótico que inibe totalmente o crescimento de T1325 e de Mi-1294 na camada (Nas últimas experiências com menos colónias por placa, foram observadas zonas pequenas discretas e nmuito grandes à volta de colónias individuais bem separadas com estes organismos de ensaio). As colónias de

LL535 cobertas na presente experiência com MM294ZpBR322 apresentam zonas discretas à volta das colónias» Este efeito de activi-

com MM294ZpBR322 parece indicar uma devido ã expressão da resistência á dade reduzida observado sensibiIidade reduz ida tetraciclina presente no plasmídeo pBR322» antibiótico elaborado no agar é caracterizado extraindo antibiótico de blocas de agar de culturas com placas confluentes. As estirpes LL535 e LL53Í foram cultivadas em agar Bsnnetfc contendo 25 pg/ml de estreptomicina? S. aureofaciens ATCC 13399, a fonte do DNA clonado em LP'ⁱ'í27 e LF'^12S, foi semeada em agar de Bsnnetfc sem droga. Após cinco dias ds crescimento a 30°C, cortaram-se blocos de agar quadrados de 1” e maceraram-se em 3 ml de metanol ácido í11,5 ml de H₇SO^ concentrado em 4 litros de metanol). Após agitação com vortex durante 5 minutos, o sobrenaP dante foi filtrado através de uma membrana Acro 'LC-25 e submetido a análise por HPLC.

As análises de HPLC foram realizadas isocraticamente numa coluna de fase reversa com uma fase móvel consistindo em tampão oxalato a pH 2,9 contendo 227. DF4F=Nr.M-dimetilformamida« 0 fluxo foi de ÍmlZmin e o eluato foi controlado a 365 nm. Como padrões usaram-se tetraciclina e clortetraciclina autênticas»

Os cromatogransas ds HPLC mostram que LL535 e ATCC 13399 produzem substâncias com tempos de retenção idênticos aos de TC e CTC» Os extractos de LL531 não apresentam estes picos»

Os transformantes resistentes à tiostreptona de S„

D -*7 O lividans obtidos com LPⁱ'127_s LP'ⁱ’12S e LP^óS (um vector plasmídeo consistindo em píBI24 clonado no sitio ScaI de pIJ702> foram analisados de modo semelhante relativamente a produção de antibiótico cobrindo com os orqanismos de ensaio T1325 e MM294» Os transformantes LF‘^12/ e LP' 128 apresentam produção de antibióticos activos contra ambos os organismos de ensaie? ao contrário dos transformantes ds LP^óS, indicando que a capacidade para produzir antibiótico está associada ao DNA de S« aurso f aciens presente em

LP²Í27 e LP²12S»

As fermentações em caldo foram também realizadas como confirmação adicional de que os antibióticos produzidos por S» lividans portadora de LP^ÍZ? são tetraciclina e clortetraciclina. Cinquenta ml de culturas de sementeira de ATCC 13899, LL53Í e L.L873 (um transformam ta de 5.1 ividans) foram cultivadas usando meio B (4g/l de extracto de levedura, 4 q/1 de peptona, 10 q/1 de glucose, *0,5 g/1 de MgSO».7H^O3 contendo 5 uq/ml ds tiostreptona; ATCC 13899 foi cultivada sem tiostreptona. Após incubação a 3õ°C durante três dias, o,5 ml de inóculo foi transferido para fermentaçãoe-s de 25 ml contendo Í0 pg/ml de tiostreptona (excepto não se usar qualquer droga com ATCC Í3899). Após incubação a 28°C durante 10 dias, amostras de 0,5 ml das misturas finais foram diluídas em 4,5 ml de metanol ácido, processadas como anteriormente descrito e sujeitas a análise por HPLC» A estirpe LL53Í não dá compostos do tipo tetraciclina, enquanto que ATCC 13899, LL535 e LL873 dão 37, 56 e 6 pg/ml de CTC respectivamente» Uma pequena quantidade de Tc foi também detectada nas misturas de fermentação destas três estirpes.

E» coli estirpes LL537 e LL538 são os transdutantes de

£. coli a partir dos quais foram isolados os plasmídeos LP^127 e

LP^ISB e depositados de acordo com o Tratado de Budapeste, na

American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,

Rockville, Karyland e têm os números de acesso ATCC que se ^*1 seguem» E. coli X2818T contendo LP*127 (LL537) tem o número d© acesso ATCC 68357 e E« coli X2SÍ9T contendo LPⁱ12S ÍLL53S) tem o número de acesso ATCC 68358«

Ambos foram entregues em 10 de

-ΛΜJulho, 199® e estão disponíveis ao público quando aplicáveis» leg a Intente

I

BIBLIOGRAFIA

1. Baltz, R.H. and P. Matsushima. 1981. Protoplast fusion in Streptomvces: conditions for efficient genetic recombination and cell regeneration. J. Gen. Microbiol. 127:137-146.

2. Baltz, R.H. and E.T. Seno. 1988. Genetics of Streptomvces fradiae and tylosin biosnthesis. Ann Rive. Microbiol. 42:547-574.

3. Bibb, M·. J., J.M. Ward, and D.A. Hopwood. 1978. Transformation of plasmid DNA into Streptomvces protoplasts at high frequency. Nature (London) 274:398-400.

4. Binnie, C., M. Warren, and M.J. Butler. 1989. Cloning and heterologous expression in Streptomvces lividans of Streptomvces rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis. J. Bateriol. 171:887-895.

5. Butler, M.J., E.J. Priend, I.S. Hunter, F.S. Kaczmarek, D. A. Sugden and M. Warren. 1989. Molecular cloning of resistance genes and architecture of a linked gene cluster involved in biosynthesis of oxytetracycline by Streptomvces rimosus. Mol. Gen. Genet. 215:231-238.

6. Chater, K.F. and C.J. Bruton. 1983. Mutational cloning in Streptomvces and the isolation of antibiotic production genes. Gene 26:67-78

7. Chen, C.W., H.-F. Lin, C.L. Kuo. H.-L, Tsai and J.F.-Y. Tsai. 1988. Cloning and expression of a DNA sequence conferring cephamycin C production. Bio/Technology 6:1222-1224.

8. Cox, K.L. and R.H. Baltz. 1984. Restriction of bacteriophage plaque formation in Streptomvces spp. J. Bacteriol. 159:499-504.

9. Distler, J., K. Mansouri and W. Piepersberg. 1985. Streptomycin biosynthesis in Streptomvces qriseus II. Adjacent genomic location of biosynethetic genes and one of two stretomycin resistance genes. FEMS Microbiol. Lett 30:151-154.

10. Duggar, B.M. 1948. Aureomycin: a product of the continuing search for new antibotics. Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:171-181.

11. Feitelson, J.S. and D.A. Hopwood. 1983. Cloning of a Streptomvces gene for an O-methyltransferase involved in antibiotic biosynthesis. Mol. Gen. Genet. 190:394-398.,

12. Fishman, S.E., K. Cox, J.L. Larson, P.A. Reynolds,

E.T. Seno, W.-K Yeh, R. Van Frank and C.L. Hershberger. 1987. Cloning genes for the biosynthesis of a macrolide antibiotic. Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 84:8248-8252,.

13. Gil, J.A. and D.A. Hopwood. 1983. Cloning and expression of a p-aminobenzoic, acid synthetase gene of the candicidin-producing Streptomvces qriseus. Gene 25:119-132.

»

14. Goodman, J.J. 1985. Fermentation and mutational development of the tetracyclines. p.5-57. In:

J.J. Hlavka and J.H. Boothe (eds), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 78, The Tetracyclines. Springer-Verlag, Berlin.

15. Hohn, B. and J. Coliins. A small cosmid for

efficient cloning of large DNA fragments. Gene

11:291-298.

16. Hopwood, D.A. and H.M. Wright. 1978. Bacterial protoplast fusion: recombination in fused protoplasts of Streptomyces coelicolor. Mol.

Gen. Genet. 162:307-317.

17. Hopwood, D.A., 1967. Genetic analysis and genome structure in Streptomyces coelicolor. Bacteriol. Rev. 31:373-403.

18. Hopwood, D.A., M.J. Bibb, K.F. Chater, T. Kieser,

C.J. Bruton, H.M. Kieser, D.J. Lydiate, C.P.

Smith, J.M. Ward and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces- a laboratory manual. The John Innes Foundation. Norwich, England.

19. Horinouchi, S., F. Malpartida, D.A. Hopwood and T. Beppu. 1989. afsB stimulates transcription of the actinorhodin biosynthetic pathway in Streptomyces ÇQâlÍff-Ç>l,9X A3 (2) and Streptomyces lividans. Mol. Gen. Genet. 215:355-357.

20. Jones, G.H. and D.A. Hopwood. 1984. Molecular cloning and expression of the phenoxazinone synthase gene from Streptomyces antibioticus. J. Biol. chem. 259:14151-14157.

21. Katz, E., C.J. Thompson and D.A. Hopwood. 1983. Cloning and expression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in Streptomyces lividans. J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714.

22. Larson, J.L. and C.L. Hershberger. 1986. The minimal replicon of a streptomycete plasmid produces ultrahigh levei of plasmid DNA. Plasmid

15:199-209

23. Leskiw, B.K., Y. Aharonowitz, M. Mevarech. S. Wolfe, L.C. Vining. D.W.S. Westlake and S.E. Jensen. 1988.

Cloning and nucleotide sequence determination of the isopenicillin N synthetase gene frora Streptomvces clavulicrerus. Gene 62:187-196.

24. Lydiate, D.J., F. Malpartida and D.A. Hopwood. 1985. The Streptomvces plasmid SCP2*: its funtional analysis and development into useful cloning vectors. Gene 35:223-235.

25. Malpartida, F. and D.A. Hopwood. 1984. Molecular cloning of the whole biosynthetic pathway of a Streptomvces antibiotic and its expression in a heterologous host.. Nature (London) 309:462-464.

26. Maniatas, T., E.F. Fritsch and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

McCormick, J.R.D. 1968. Point blocked mutants and biogenesis of tetracyclines. p. 163-173. In: G. Sermonti and M. Alecevic (eds), Genetícs and Breeding of Streptomvcetes. Yugoslav, Acad. Sei. and Arts, Zagreb.

28. Motamedi, H. and C.R. Hutchinson. 1987. Cloning and heterologous expression of a gene cluster for the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antbiotic of Streptomvces olaucescens. Proc. Natl. Acad. Sei. USA

84:4445-4449.

29.

Murakami, T.,

H. Anzai,

S. Imai, A. Satoh, K.

Nagaoka and C.J. Thompson. 1986. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomvces hvqroscopicus:

molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mol. Gen. Genet. 205:42-50.

30. Reynes, J.P., T. Calmeis, D. Drocourt and G. Tiraby. 1988. Cloning, expression in Escherichia coli and nucleotide sequence of a tetracycline-resistance gene from Streptomvces rimosus. J. Gen. Microbiol. 134:585-598.

31. Sanger, F., A.R. Coulson, G.F. Hong, D.F. Hill and G.B. Peterson. 1982. Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J. Mol. Biol. 162:729-773.

32. Stanzak, R., p. Matsushima, R.H. Baltz and R.N. Rao. 1986. Cloning and expression in Streptomvces 1ividans of clustered erythromycin biosynthesis genes from Streptomvces ervthreus. Bio/Technology 4:229-232.

Stutzman-Engwall, K.J. and C.R. Hutchinson. 1989. Multigene families for anthracycline antibiotic production in Streptomvces peucetius. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3135-3139.

34. Sutcliffe, J.G. 1979. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90.

35. Thompson, C.J., T. Kieser, J.M. Ward, and D.A. Hopwood. 1982. Physical analysis of antibiotic-resistance genes from Streptomvces and their use in vector construction. Gene 20:51-62.

36. van Pee, K.-H. 1988. Molecular cloning and high-level expression of a bromoperoxidase gene from Streptomvces aureofaciens Tu24. J. Bacteriol. 170:5890-5894.

37. Vara, J.A., D. Pulido, R.A. Lacalle and A.

Jimenez. 1988. Two genes in Streptomvces alboniger puromycin biosynthesis pathway are closely linked. Gene 69:135-140.

38. Veselova, S.I. 1969. Combined effect of nitrous acid, ultraviolet light, streptomycin and chlortetracycline on Actinomyces aureofaciens.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES:

   l^ã. - Processo para o isolamento de um conjunto de genes de DNA isolado, caracterizado por ser codificador da via de biossintese da tetraciclina e da clortetraciclina, caracterizado por compreender:

   a) a purificação do DNA a partir de um organismo que produz tetraciclina e clortetraciclina;

   b) a transformação de uma célula hospedeira que não produz tetraciclina ou clortetraciclina com o DNA isolado sob condições adequadas de modo a que o fragmen· to de DNA seja fenotipicamente expresso;

   c) a identificação das transformantes que são resistentes à tetraciclina ou à clortetraciclina;

   d) o isolamento do DNA que produzir as células hospedeiras resistentes à tetraciclina ou à clortetraciclina.
2. 2^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracte rizado por a célula hospedeira ser uma célula hospedeira procariótica.
3. 3^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 2, caracte rizado por o hospedeiro procariótico ser E. coli. Streptomyces lividans, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces ambofuchsus, Actinomycetes, Bacillus. Cornebacteria ou Thermoactinomyces.
4. 4®. - Processo de acordo com a Reivindicação 3, caracte rizado por o hospedeiro procariótico ser Streptomyces lividans.

   -385^a. - Processo de acordo cora a Reivindicação 4, caracterizado por o DNÀ isolado no passo d) ser o conjunto de genes de

   DNA situado em LP²127, LP²128, ou DNA que hibrida com LP²127 ou 2

   LP 128, sob condições restringentes.
5. 6³. - Processo para aumentar o rendimento da produção dos antibióticos tetraciclina, clortetraciclina ou seus análogos, caracterizado por compreender: a regulação da via de biossíntese de um microorganismo produtor dos antibióticos através da manipulação do conjunto de genes de DNA codificador da via de biosíntese para aumentar a produção dos antibióticos.
6. 7^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por o conjunto de genes de DNA ser expresso num hospedeiro procariótico.
7. 8^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por o hospedeiro procariótico ser E. coli. Streptomyces lividans. Streptomyces griseofuscus, Streptomyces ambofuchsus. Actinomvcetes. Bacillus. Cornebacteria ou Thermoactinomvces.
8. 9^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por o hospedeiro procariótico ser Streptomyces lividans.
9. 10^a. - Processo de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por o conjunto de genes de DNA estar situado em LP²127, LP²128, ou DNA que hibrida com LP²127 ou LP²128, sob condições restringentes.
10. 11*. - Processo para a identificação de um análogo do conjunto de genes de DNA codificador da via de biossíntese de tetraciclina ou clortetraciclina, caracterizado por compreender a hibridação de uma amostra de DNA, sob condições restringentes,

    -39com um conjunto de genes de DNA codificador da via da biossíntese para a tetraciclina ou clortetraciclina, a identificação da amostra de DNA que hibridou com o conjunto de genes de DNA, identificando, deste modo, o análogo do conjunto de genes de DNA.
11. 12®. - Processo de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por o conjunto de genes codificador da via de bios2 síntese para a tetraciclina ou clortetraciclina ser LP 127 ou