HUT60771A - Process for cloning fragment encoding the synthesis of tetracycline and chlorotetracycline and for expressing cloned fragments - Google Patents

Description

A találmány tárgya molekuláris genetikai technikák alkalmazása a klórtetratciklin teljes bioszintézisútját kódoló géncsoport (DNS) klónozására, valamint ezzel a módszerrel a tetraciklin bioszintézisút jának klónozására is Streptomyces aureofaciensből, és ezek expressziójára a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben. Az izolált bioszintetikus géncsoport szolgál szubsztrátként a megnövelt fermentációs szint elérését célzó technológiai kísérletekben, valamint az új antibiotikum struktúrák előállításában.

A klórtetraciklin és származék vegyületeit (például a tetraciklint, demetil-klórtetraciklint, demetiltetraciklint), kereskedelmi mennyiségben állítják elő süllyesztett, levegőztetett fermentációval Streptomyces aureofaciens mikroorganizmus alkalmazásával (Dugar, 1948) . Ennek a mikroorganizmusnak több mint 30 éves ipari célú manipulálása eredményeképpen kifinomult fermentációs technikák és táptalaj összetételek alakultak ki, amelyek lehetővé tették a fermentációs kitermelés jelentős emelkedését (Goodman, 1985). A kitermelés ilyen javulását elősegítette olyan Streptomyces aureofaciens mutánsok izolálása, amelyek megnövekedett antibiotikum-termelő képességgel rendelkeznek (Veselova, 1969). Ezeket a magas termelőképességű mutánsokat főleg mutagén kezeléssel, majd a megnövekedett kitermelésre való véletlenszerű szelekcióval állították elő. Ugyanez a technika tette lehetővé az antibiotikum bioszintézisben blokkolt mutánsok előállítását, amelyek igen hasznos eszközei a * · · · · · · « · • · · · · · · • ·»·««· · • · · « ·»·« · ·«·· · · · · ··· klórtetraciklin keletkezés bioszintézis útjának felderítésében (McCormick, 1968). Ezen hozzájárulások nélkül a klórtetraciklin bioszintézis genetikai szabályozása nem lett volna teljesen megvalósítható. A Streptomyces genetika területén lejátszódó legújabb fejlődés lehetővé tette hogy az iparilag fontos metabolitokat termelő szervezetek molekuláris genetikáját tanulmányozzuk.

A kromoszómális markerek rekombinációjának igazolása Streptomyces protoplasztok fúziójával és azt követő regenerálásával (Hopwood et al., 1978; Baltz et al., 1981) egy döntő lépés volt az aktinomicéták genetikájában. Míg a protoplaszt-fúziós technika kifejlődése előtt a genetikai keresztezéseket csak néhány, konjugációs rendszerrel rendelkező fajban lehetett megbízhatóan kimutatni (Hopwood, 1967), most a genetikai elemzéseket bármely olyan fajban el lehet végezni, amelyből protoplasztok készíthetők és azok regenerálhatok. Még fontosabb, hogy a protoplasztok a későbbiekben ideális szubsztrátnak bizonyultak a plazmid DNS-sel való transzformáéióhoz, így megteremtve annak lehetőségét hogy ezekben a mikroorganizmusokban rekombináns DNS kísérleteket végezhessünk (Bibb et al., 1978). Számos antibiotikum rezisztencia gén izolálása, úgymint a tiostrepton, viomicin és neomicin rezisztencia géneké, lehetővé tette a könnyen szelektálható klónozó vektorok készítését a Streptomycesek saját plazmidjai alapján (Thompson et al., 1982).

A egyik elsőnek klónozott antibiotikum bioszintézis • » · ·

- 4 gén az undecil-prodigiozin (UDP) antibiotikus hatású pigment keletkezésében szerepet játszó O-metil-transzferáz volt (Feitelson et al., 1980). A gént azon az alapon azonosították, hogy az UDP bioszintézisútjának ismert mutációját képes volt komplementálni. Az ezekben a korai erőfeszítésekben bioszintézis gének izolálására alkalmazott más technikák tartozott a metilenomicin esetében a mutációs klónozás, az OC31 fág alkalmazásával (Chater et al., 1983), az aktinomicin fenoxazinon szintetáz esetében a rekombináns kiónok sib szelekciója in vitro enzimvizsgálatokban (Jones et al., 1984), valamint a kandicidin termelésben a p-amino-benzoesav szintetáz által biztosított szulfonamid rezisztencia (Gil et al., 1983). A bialaphos bioszintézis géneket a blokkolt mutánsok komplementációja alapján azonosították (Murakami et al., 1986).

Az aktinorodin bioszintézisben szereplő géneket a Streptomyces coelicolor blokkolt mutánsainak komplementációja alapján klónozták (Malpartida et al., 1984) . Ez utóbbi esetben két olyan átfedőkiónt kombináltak egyetlen plazmidon, amelyek különböző osztályba tartozó mutánsokat komplementéltak, és amelyekről igazolták, hogy ha a heterológ Streptomyces parvulus gazdaszervezetbe bejuttatják, akkor azt aktinorodin bioszintézisére teszi képessé.

Egy másik fontos megfigyeléssorozat az volt, hogy az antibiotikum bioszintézis génjei fizikailag kapcsolódnak az(ok)hoz a rezisztencia determináns(ok)hoz, amelyek az adott antibiotikumhoz tartoznak az adott • « ···· · * *. · • · · · · · · » » · ····· · ···· · ·· · ···

- 5 mikroorganizmusban. Egy Streptomyces griseus-ból származó, streptomicin rezisztenciát kódoló DNS fragmentről igazolták, hogy folyamatosan kapcsolódik ahhoz a DNS-hez, amelyik a bioszintézis blokkokat komplementálja (Distler et al., 1985). Ugyanez a helyzet tapasztalható Streptomyces fradiae-ben, ahol a bioszintézis géneket úgy azonosították, hogy a tilozin bioszintézis út végső enzimének aminoterminálisa alapján készített kevert oligonukleotiddal mint próbával vizsgáltak át egy kozmid könyvtárat a homológiákat keresve (Fishman et al., 1989). Egy korában klónozott tilozin rezisztencia génről (tlrB) kimutatták, hogy abban a DNS-régióban található, amely kilenc különböző blokkolt mutánst képes komplementéin! (Baltz et al., 1988). A puromicin (Var2 et al., 1988) és a tetracenomicin esetében (Motamedi et al., 1987) a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben expresszálódó antibiotikum rezisztenciára való primer szelekcióval vált lehetővé az ugyanazon a klónozott DNS fragmenten található antibiotikum bioszintézis gének azonosítása.

A nukleinsav próbák alkalmazása elősegítette a bioszintézis gének izolálását. Ez a megközelítés azokon a már létező információkon alapul, melyeket a bioszintézis útról vagy korábbi klónozási kísérletekből szereztek. Tehát az előzőkben leírt tilozin esetben próbát készítettünk egy bioszintézis enzim részleges aminosav szekvenciája alapján (Fishman et al., 1987). Hasonlóképpen, az izopenicillin N szintetáz génjét Streptomyces clavuligerus-ból klónozták egy olyan klón azonosításával, amely az enzim N-terminális • · · · aminosav szekvenciája alapján készült próbához hibridizál (Leskiw, 1988) . Az eritromicin bioszintézisben szereplő géneket azon az alapon azonosítottak, hogy mind egy korábban klónozott rezisztencia determinánshoz hibridizáltak, (Butler et al., 1989), mind egy szintetikus oligonukleotidhoz, amely az anhidro-tetraciklin-oxigenáz bioszintézis enzim (Binnie antitest al., 1989) részlegesen felderített aminosav szekvenciája alapján meghatározott DNS szekvenciát reprezentál. Az actl és actll heterológ próbák lehetővé tették Streptomyces peucetius-ban (StutzmanEngwall et al., 1989) az antraciklin bioszintézisben szereplő gének azonosítását.

Ezeknek a technikáknak az alkalmazása egyenként vagy kombinációban lehetővé tette a teljes bioszintézis út izolálását vagy összeállítását, és néhány esetben heterológ gazdaszervezetben való expressziójukat. A bialaphos teljes bioszintézis clusterét a komplementáló aktivitásokra való szelekciók és a bialaphos rezisztencia heterológ expressziója alapján klónozták (Murakami et al., 1986). Jóllahet említik a teljes bioszintézis út sikeres izolálását Streptomyces lividánsban egyetlen lépésben, de nem említik a bioszintézis gének expresszióját. Az aktinirodin cluster összeállítását a komplementáló kiónokból és expresszióját Streptomyces parvulus-ban az előzőkben tárgyaltuk (Malpartida et al., 1984).

Egy homológ eredetű eritromicin rezisztencia determinánshoz hibridizáló bifunkcionális kozmid kiónt izoláltak Saccharopolyspora erythrea könyvtárból, és ···· *4 · · • · · · · • · · « ♦ · · • « «··*· · • · « « · · ·

- 7 igazolták, hogy Streptomyces lividansba átvive eritromicin szintézist eredményez (Stanzák et al., 1986). Egy mind egy oxitetraciklin rezisztencia gén próbához, mind egy bioszintézis gén próbához (anhidro-tetraciklin-oxigenáz) hibridizáló Escherichia coli kozmid klón lehetővé tette az oxitetraciklin bioszintézis cluster klónozását Streptomyces rimosus-ból (Binnie et al., 1989). A Streptomyces plazmidban való ezt követő szubklónozás lehetővé tette az oxitetraciklin termelését Streptomyces lividans-ban.

A tetracenomicin termelőből előállított két átfedő kiónt azon az alapon azonosították, hogy a Streptomyces glaucescens blokkolt mutánsait komplementélták, és képesek voltak a Streptomyces lividanst tetracenomicin rezisztenssé tenni (Motamedi et al., 1987). Amikor a két klón külön volt Streptomyces lividans-ban és együtt fermentálták őket, illetve ha együtt voltak megtalálhatók ugyanabban a Streptomyces gazdaszervezetben, akkor tetracenomicin keletkezett. Streptomyces peucetius DNS Escherichia coli könyvtárából a Streptomyces coelicolor actl és actIII próbáihoz való hibridizálás alapján izolált bifunkciós klónokról igazolták, hogy színes antibiotikum szintézisét irányítják, ha Streptomyces lividans-ba bejuttatjuk őket (Stutzman-Engwall, 1989).

Emellett, a cefamicin C termelés bioszintézis útjának izolálása is megtörtént (Chen et al., 1988). Ebben az esetben Streptomyces lividans random kiónjait vizsgáltuk át egyenként, hogy termelnek-e cefamicin C-t, agarkorong fermentációt alkalmazva. A Streptomyces lividans • · · · «· ·· « · • · · · · ·« • ····«· · • · « ····· · ·«·· · ·· · · · ·

000 transzformánsa közül egy termelt cefamicin C-t.

A jelen szabadalmi leírás tartalmazza először a tetraciklin és klórtetraciklin bioszintézis útjába tartozó gének izolálását és alkalmazását.

Az ábrák rövid leírása

1. ábra: A bifunkciós kozmid vektor szerkezete, és módszer kozmid karok előállítására. Az L és R kozmid karokat az A illetve B plazmidokból állítjuk elő, amint az az ábrán látható, és a 3. példában részletesen leírjuk. Az egyszeres vonalak a konstrukció Escherichia coli replikon részét jelentik. Az A plazmidban az Escherichia coli rész a pBR322 3.7 kb méretű EcoRI-Sall fragmentjéből származik (Sutcliffe, 1979). A B plazmid tartalmazza az SCP2*-ből származó [csíkozott] 5.9 kb méretű EcoRI-Sall fragmentet, amely az aktinomiceszekben működő replikációs origót szolgáltatja (Larson et al., 1986). Mindkét plazmidon három egymás után levő tapadós vég található, amelyek a pHC79 (Hohn et al., 1980) 700 bp méretű BglII-BstEII costartalmú fragmentjéről származnak (nyitott). Az A plazmidon levő tiostrepton-rezisztencia gén [sötét] a pIJ702 plazmidból kinyert 1.1 kb méretű Bell fragmentből származik (Katz et al·, 1983). Az a plazmidban egy 1.1 kb méretű spacer régió [pontozott] a Φ bakteriofág SacI fragmentjéből származik (Sanger et al., 1982).

2. ábra: Az LP²127 és LP²128 fizikai térképe. Mindkét plazmid ekvivalens struktúrát mutat a restrikciós térképezés alapján, ennélfogva egyetlen, mindkettőt leíró ·· ···· «· · · • * · · · ·· • ····»· · • · · · · · · · · ···· · ·· · · · ·

- 9 szerkezetet mutatunk be itt és a 3. ábrán. A vektor részt dupla vonallal jelöljük; a TC/CTC bioszintézis régiót egyes vonallal jelöljük. A Streptomyces aurefoaciensből klónozott DNS 31.9 kb méretű; a vektor mérete 11.1 kb. A jelzett vektor régiók a pIBI-24 [sraffozott], tiostrepton rezisztencia [csíkozott]. A két (+) jellel jelzett EcoRI hasítási hely vektor eredetű, a Sau3A-BglII kapcsolódási helyet veszik közre, amely a vektor és a Streptomyces aureofaciens DNS határát jelzi.

3. ábra: Restrikciós emésztési térkép az LP²127 és LP²128 vaktorokban klónozott Streptomyces aureofaciens DNS-ről. Az LP²127-ben és LP²128-ban klónozott 31.9 kb méretű DNSt lineáris formában mutatjuk be. A térképet úgy rajzoltuk meg, hogy a vektor úból származó EcoRI hasítási helyeket tartalmazza a kiindulási és vég-pozíciókban, a bal- és jobboldalon. A restrikciós fragmentek méretét kilobázis párban adjuk meg, és ezek a normál agaróz gélelektroforézis feloldási határain belül (körülbelül 500 bp) .

A jelen találmány tárgya a tetraciklin és oxitetraciklin teljes bioszintézis útjának klónozása Streptomyces aureofaciensből, és expressziója a heterológ Streptomyces lividans gazdaszervezetben. A jelen találmány tehát az ezen az antibiotikumok (klór-tetraciklin és tetraciklin) előállításának bioszintézisútját kódoló izolált DNS gén(ek)re (cluster) vonatkozik, valamint azokra • · • · · « · · · • ······ · • · · ···«· · ♦··· · ·· · ···

- 10 a DNS-ekre, amelyek a szakterületen ismert, úgynevezett szigorú hibridizálási körülmények között a klór-tetraciklin és tetraciklin keletkezése bioszintézisútját kódoló, izolált gén clusterek DNS-éhez hibridizálnak. A jelen találmány továbbá vonatkozik ezen gének felhasználására ezeknek az antibiotikumoknak a termelési szintje növelésében, valamint a klór-tetraciklin és tetraciklin új analógjai előállításának vizsgálatára.

A bioszintézis gének izolálására a rekombináns Streptomyces lividans könyvtárt vizsgáljuk át, hogy tetraciklin rezisztenciát expresszáló kiónt izoláljunk. A rekombináns kozmidokban levő Streptomyces aureofaciens DNS inszertek, amelyek a könyvtárat képezik, szükségszerűen elég nagyok , mivel az alkalmazott in vitro lambda pakolóelegy olyan kozmid molekulákat igényel, amelyekben a DNS inszert mérete 25-40 kb, hogy életképes transzdukáló fágokat kapjunk. Ha a tetraciklin rezisztens kiónokat szelektáljuk a Streptomyces aureofaciens genomiális kiónok említett populációjából, akkor a kozmid kiónok egy korlátozott alcsoportját kapjuk. Ezek közül sokról vagy mindegyikről elvárható, hogy a kiválasztott tetraciklin rezisztencia génhez kapcsolódó antibiotikum bioszintézis géneket tartalmaz. Azok között, amelyek elég nagyok, és megfelelő pozícióban vannak, van egy olyan alcsoport, amely lefedi a teljes bioszintézis utat. Tehát a génekvagy valójában az összes gén klónozása lehetséges a régió szerkezetét vagy struktúráját illető bármely előzetes ismeret nélkül. Jóllehet vannak publikációk, amelyekben a • · • · • · · · · · · • ······ · • · · ····· · ···· · ·· · ··*

- 11 tetraciklin rezisztencia determináns klónozását írják le (Reynes et al., 1988), valamint egy brómperoxidáz klónozását (Vám Pee, 1988) Streptomyces aureofaciensből, ezek a vizsgálatok egyáltalán nem terjedtek ki a klórtetraciklin bioszintézis génjeinek vagy a teljes génclusternek az izolálására.

A jelen találmány részeletesebb laírását az alábbiakban adjuk meg példákon keresztül, amelyek illusztrálják a találmányt, de nem korlátozzák.

A DNS izolálására használt módszerek közé tartozik a sejtek emésztése lizozimmel ozmotikus pufferben, az ezt követő óvatos lízis, a fehérje extrakciója, majd a nagy molekulasúlyú DNS dúsítása és töményítése. Jóllehet az ismertetett módszer hatékony, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy alternatív módszerek is használhatók, például amelyeket Hopwood és munkatársai közöltek 1985-ben.

A példában alkalmazott össz-DNS eredete a Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 törzs, de a találmányt semmi nem korlátozza erre az adott törzsre. Számos különböző, a tetraciklin osztályba tartozó antibiotikumokat termelő Streptomyces aureofaciens törzset lehet a jelen találmányban alkalmazni, azonos sikerrel. Ezek közé a Streptomyces aureofaciens törzsek közé tartoznak a mutáns törzsek, alternatív vad-típusú izolátumok, amelyek klórtetraciklint, tetraciklint, 6-demetil-klór-tetraciklint, 6• « · · • ······ · • · · ····· · ···· · ·· « ·«·

- 12 demetil-tetraciklint, 7-klór-5a,lla-dehidro-tetraciklint,

2-dekarboxamido-2-acetil-tetraciklint és a tetraciklin vegyület-család más tagjait teremelik. A jelen találmány vonatkozik továbbá a klór-tetraciklin, tetraciklin és tetraciklin-rokon vegyületek klónozására más, ezeket a vegyületeket termelő szervezetekből, amelyek közé tartoznak, nem korlátozó jelleggel a Streptomyces rimosus, a Streptomyces avellaneus, a Streptomyces lusitanus, a Streptomyces viridifaciens, a Streptomyces psammoticus, az actinomadura brunnea és a Dactylosporangium vesca.

A Streptomyces aureofaciens DNS-t Sau3A restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük, hogy nagyméretű, a kívánt 35 kb mérettartományba eső DNS fragmenteket állítsunk elő, amelyeknek a vége homológ az alkalmazott bifunkciós kozmid vektor karjainak a végével. Ebben az esetben az optimális emésztési körülményeket tapasztalati úton határozzuk meg, olymódon hogy egy sorozat emésztést végzünk, és a végtermékeket agaróz gélelektroforézissei vizsgáljuk. A szakterületen jártas szakember számará nyilvánvaló, hogy az érdekes DNS klónozásához alternatív könyvtár készítési és kinyerési módszerek léteznek. A példábanaz Escherichia coli alkalmazása, valamint a lambda pakolás által meghatározott méret-szelekció nem korlátozza a jelen találmányt, mivel más vektorok alkalmazása szintén lehetséges. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a monofunkcionális Streptomyces vektorok, például a pIJ922 (Lydiate et al., 1985) is alkalmazhatók a jelen találmányban, azzal a feltétellel, hogy a könyvtár ··«······ · • * · · 4 ·· • ·····» · • · · ·»··· · ···· · ·· · ···

- 13 készítése és a plazmid kinyerése aktinomiceszekben történik.

A példákban következő eljárások közé tartozik a kozmid karok és a méret szerint frakcionált DNS ligálási termékeinek in vitro pakolása, transzdukció az Escherichia coli X2819T törzsbe, a transzduktánsok populációjának összegyűjtése, majd ezekből a DNS izolálása egy kozmid könyvtár előállítása céljából. Az alkalmazott módszerek ismertek, de a találmány nem korlátozódik a példákban leírtakra. Alternatív módszerek is alkalmazhatók ugyanazzal a végeredménnyel, következmények nélkül. Azaz a ligálásnál és az in vitro pakolásnál alternatív módszerek alkalmazhatók, valamint alternatív rekombináció deficiens (recA) Escherichia coli gazdaszervezetek, amplifikálási eljárások (azaz például szelektív táptalajon való növesztés), és plazmid izolálási eljárások, ezeket már mindegyiket publikálták a tudományos szakirodalomban [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1982)].

A példákban az ezt követő lépések leírják az egyesített kozmid DNS preparátumok bejuttatását Streptomyces lividans-ba, egy sejt-könyvtár előállítását, majd ezt követően egy ilyen könyvtár átvizsgálását olyan Streptomyces lividans transzformánsok izolálása céljából, amelyek 100 gg/ml tetraciklinre rezisztensek. Jóllehet sokkal munkaigényesebb, a transzformánsokat közvetlenül vizsgálhatjuk tetraciklin rezisztenciára replikázással.

·· Λ«« · ·· 4 · ♦ · · · « ·· • « ··♦ » ♦ · • · « ····« · «··· · ·« · ··«

Eltérő tetraciklin rezisztencia szint alkalmazható a vizsgálatokban, ahogy azt a gazdasejt vagy a kiindulási mikroorganizmus által mutatott eredeti rezisztencia diktálja. Más tetraciklin érzékeny, nem restriktív gazdaszervezetek, például a Streptomyces griseofuscus alkalmazható a Streptomyces lividans helyett.

Ezt követően, a rekombináns plazmid kinyerése a tetraciklin rezisztens Streptomyces lividansból, majd az említett DNS in vitro pakolása és transzdukciója Escherichia coli-ba történik. Az ilyen transzduktánsokból izolált plazmid DNS-eket szerkezetileg restrikciós térképezéssel jellemezzük; majd a példában izolált két két plazmidról, az LP²127 és LP²1228 plazmidokról kiderült, hogy azonos szerkezettel rendelkeznek. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy hasonló DNS régiókat alternatív mikroorganizmusokból klónozva polimorfizmust kaphatunk a restrikciós hasítási helyek elrendezésében, de egy elég nagy, tetraciklin rezisztenciát biztosító DNS fragment valószínűleg a leírt tulajdonságokat mutatja.

A tetraciklin rezisztencia plazmidon való elhelyezkedését az erősíti meg, hogy az LP²127 és LP²128 plazmidokkal kapott tiostrepton rezisztens Streptomyces lividans transzformánsok tetraciklin rezisztensek is. A tetraciklin-szerű antibiotikum keletkezését agaron való termelődéssel lehet igazolni, az említett tiostrepton és tetraciklin rezisztens Streptomyces lividans törzssel olymódon hogy a keletkező antibiotikum aktivitás hatékony ·« ·< · · • · · ♦ · · · « »··<♦· · • · · ···«« · ···· · ·· · ·««

Escherichia coli ellen, de kevésbé hatékony egy tetraciklin rezisztens Escherichia coli ellen.

Végül aazt is igazoljuk, hogy a tetraciklin szintézist az LP²127 irányítja a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben. Ezt mind agaron, mind táptalajon fermentálva el lehet érni. Mind az eredetileg tetraciklin rezisztens Streptomyces lividans, mind a Streptomyces lividans LP²127 transzformáns termel tetraciklint és klór-tetraciklint, olyan körülmények között, amelyek között ugyanezeket a termékeket izolálják a DNS forrásául szolgáló Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 törzsből. Másrészt viszont, egy Streptomyces lividans transzformáns, amely inszert nélküli plazmid vektort tartalmaz, nem mutat antibiotikum termelést.

A heterológ gazdaszervezet által való tetraciklin termelés nem korlátozódik a példában leírt fermentációs körülményekre vagy a HPLC analitikai rendszerekre, jóllehet ezek tisztán lehetővé teszik a hatékony elemzést. Nagyszámú fermentációs eljárást és a tetraciklinek elemzését írták le, és helyettesíthető a továbbiakban. Emellett, jóllehet a Streptomyces lividanst használjuk heterológ gazdaszervezetként a példákban, az antibiotikum bioszintézis gének heterológ expressziója várható számos aktinomicétában és más baktérium csoportban, ideértve, de nem korlátozva magunkat a Bacillusokra, Corynebaktériumokra, Theremoactinomycesekre, mindadig, amíg transzformálhatok az alábbiakban ismertetett viszonylag nagy plazmidokkal. A transzformáltak közé tartozik például • »···♦« « • 4 ·««··« · ···· « ·« * ·««

- 16 a Streptomyces griseofuscus és a Streptomyces ambofaciens, amelyekről ismert, hogy viszonylag kevéssé restriktívek.

1. Példa:

A Streptomyces aureofaciens össz-DNS előállítása

A Streptomyces aureofaciens ATCC 13899 törzs liofilezett preparátumát 0.8 ml lx szintetikus sóoldatban szuszpendáljuk (6g Na2HPO₄/liter, 3g KH2PO₄/liter, 0.57 g nátrium-citrát /liter) , majd Bennett agarra szuszpendáljuk (lg élesztőkivonat/liter, 2g NZ-Amin A/liter, lg húskivonat/liter, 20g D-glükóz/liter, 20 g Bactoagar/liter). Két napig 28°C-on inkubáljuk, majd a sejteket az egyik lemezről 5 ml Tryptic Soy Broth-ba (Difco) kaparjuk bele, és röviden besugározzuk ultrahanggal (körülbelül 10 másodperc) egy Heat Systems Ultrasonics W200P, mikrocsúcssal ellátott berendezésben. Oltótenyészetet állítunk elő olymódon hogy 2 ml ultrahanggal besugárzott tenyészetet oltunk bele 50 ml Tryptic Sós Broth-ba (TSB), majd ezt követően 2 napig 28°C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámmal. Az oltó tenyészetből öt ml-t oltunk be 100 ml TSB táptalajba, amelyet 2% glicinnel egészítünk ki, és 48 órán át 28°C-on rázatjuk 200/perc fordulatszámmal.

A sejteket centrifugálással szedjük össze (9800 g, 30 perc). A sejt-üledéket 200 ml P táptalajjal mossuk (összetétele:100 g/liter szacharóz, 0.2 g/liter K2SO₄, 2 ml nyomelem oldat /liter, amelynek összetétele 40 mg/1 ZnC12, valamint 10-10 mg/liter FeC13 x 6H2O, CUCI2 x 2 H2O,

MnCl₂ x 4H₂O, Na₄B₂O₇ X 10H₂0 és (ΝΗ₄)₆Μθ₂₄ X 4H₂O). A sejt-üledéket -20°C-on lefagyasztjuk, majd felolvasztjuk és 12 ml P⁺ táptalajban (kiegészített P táptalaj, amely 25 mmol TES-t, 25 mmol CaCl₂-t, 10 mmol MgCl₂-t, és 3.7 mmol KH₂PO₄-et tartalmaz). A sejteket szobahőmérsékleten inkubáljuk 2 óra hosszat, ezalatt a protoplasztok képződése nyilvánvaló lesz. 2.5 mg Proteinase K-t adunk hozzá (Boehringer Mannheim), majd az elegyet 15 percig 37°C-on inkubáljuk. A lízist úgy érjük el, hogy 10 ml 0.2 mólos EDTA (pH=8.0), 0.1 mól TRIS-HC1 pH=8.0 összetételű oldatot adunk hozzá, majd ezt követően azonnal hozzáadunk 2.4 ml 10%-os nátrium-lauril-szulfátot (SDS). A viszkózus elegyet 60 percig inkubáljuk 50°C-on, alkalmankénti rázogatással.

Ha egyszer a lízis teljes, akkor 20 ml kiegyensúlyozott fenolt (50 g fenol + 6.5 ml 100 mmolos NaCl, 10 mmol TRIS pH=8, 1 mmol EDTA pH=8 + 0.05 g 8hidroxy-kinolin) adunk hozzá, a preparátumot enyhén rázogatjuk, majd egy asztali centrifugán lecentrifugáljuk (1500 x g, 30 perc). A felső, vizes fázist összegyűjtjük, majd újra extraháljuk a fentiekben leírtak szerint; az első extrakcióból megmaradt fenolt vissza-extraháljuk 20 ml 10 mmolos TRIS-HC1 pH=7.4, 1 mmol EDTA pH=8 összetételű pufferrel (TE). Az összegyűjtött vizes fázisokat ezután azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk, a fentiek szerint extraháljuk, majd 10 ml-enként külön csövekbe mérjük szét. Egy ml 3 molos ammónium-acetátot (pH=5) adunk hozzájuk, majd 10 ml hideg etanolt rétegzünk a viszkózus oldatra. A DNS-t óvatosan egy üvegbotra csavarjuk, kétszer « 9 ··· · « · • · ···«·· · « « · · · «« · ··· öblítjük hideg etanollal, majd éjszakán át 4°C-on oldjuk 8 ml TE pufferben. 260 nm-en végzünk egy spektrofotometriás mérést, hogy meghatározzuk a jelenlevő össszes nukleinsav mennyiségét (túlnyomó részben DNS).

2. Példa

A Streptomvces aureofaciens DNS részleges emésztése és méret szerinti dúsítása

Azokat a részleges emésztési körülményeket, amelyek a Streptomyces aureofaciens DNS-ből a 35 kb mérettartományba eső Sau3A emésztési termékeket eredményeznek, tapasztalati alapon határozzuk meg. Egy reakcióelegy sorozatot készítünk, mindegyikben 25 gg DNS található 300 μΐ reakcióelegyben, melynek összetétele 100 mmol NaCl, 10 mmól TRIS pH=7.4, 10 mmol MgC12, majd Sau3A restrikciós endonukleázt (New England Biolabs) adunk hozzá 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 illetve 0.005 enzim egység/;xg DNS mennyiségben. A reakcióelegyeket 60 percig 37°C-on inkubáljuk, majd 20 percre 65°C-ra tesszük, végül jégre tesszük. 20 μΐ alikvot részt 0.5%-os agaróz gélre viszünk, hogy ismert hosszúságú fragmentekkel összehasonlítva (lambda DNS, Hindin, Xhol és emésztetlen) meghatározzuk a méretüket. A megmaradó térfogatban levő DNS-t 50 μΐ ammónium-acetát és 1 ml etanol egymás után való hozzáadásával kicsapjuk, -20°C-ra hűtve az elegyeket. A kicsapott DNS-t ezután 8800 x g-vek centrifugálva ülepítjük, újra oldjuk 300 μΐ 0.3 mól ammónium-acetátban, ··* » w

- 19 hasonló módon kicsapjuk, ülepítjük, etanollal öblítjük, vákuumban szárítjuk, és a megszáradt üledéket végül 100 μΐ TE pufferben oldjuk. Az etídium-bromiddal festett, éjszakán át 1 volt/cm feszültségeséssel elektroforetizált agaróz gél vizsgálata alapján kiderül, hogy a 0.05 egység Sau3A restrikciós enzim /μg DNS ad olyan restrikciós emésztési termékeket, amelyeknek a mérete főleg a kívánt 35 kb mérettartományba esik.

3. Példa

A kozmid karok előállítása

A bifunkcionális kozmid vektor komponenseit az 1. ábrán látható A és B plazmidokból nyerjük ki. Az A plazmid a pIBI24-et tartalmazza, amely replikációs origót és ampicillin rezisztencia gént szolgáltat az Escherichia coli-ban való replikációhoz és szelekcióhoz. Ez a plazmid szolgáltat még egy tiostrepton-rezisztencia gént is, amely a plazmid aktinomiceszekben való szelekcióját teszi lehetővé, valamint egy töbszörös tapadó véget (cos) a lambda bakteriofágból, amely az in vitro pakolás szubsztrátjaként működik. A B plazmidot úgy terevezték, hogy egy SCP* replikációs origót szolgáltasson a plazmid aktinomiceszekben való fennmaradáshoz, valamint többszörös cos helyeket.

Az A plazmidot Asp718 restrikciós enzimmel emésztjük, majd borjúbél alkalikus foszfatázzal (CIAP) defoszforilezzük. A DNS-t ezután chlorpan-nal és kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és vákuumban szárítjuk. A DNS-t ezután szuszpendáljuk és BglII restrikciós enzimmel emésztjük. A B plazmidot Sáli restrikciós enzimmel emésztjük, majd ezt követően CIAP-pal kezeljük. A chlorpan extrakció, etanol kicsapás és vákuumban való szárítás után a DNS-t reszuszpendáljuk és BglII restrikciós enzimmel emésztjük.

Az előzőkben említett emésztési reakcióelegyeket agaróz gélre visszük, majd éjszakán át elektroforetizáljuk. Az A plazmidból egy 6 kb méretű fragmentet, a B plazmidból egy 8.0 kb méretű fragmentet, amelyek az előzőkben leírt funkcionális régiókat tartalmazzák, elektroelúcióval izoláljuk az agaróz gélből.

4. Példa

A kozmid karok ligálása a Sau3A restrikciós enzimmel emésztett qenomiális DNS-hez, és in vitro pakolásuk

A Streptomyces aureofaciens DNSSau3A restrikciós enzimmel emésztett és méret alapján ellenőrzött genomiális fragmentjeit kozmid karokhoz kapcsoljuk in vitro ligálással. Négy μ.1 Sau3A restrikciós enzimmel emésztett Streptomyces aureofaciens DNS-t (megfelel körülbelül 8 mű nak) kombinálunk 1-1 Mg 1-es illetve 2-es kozmid karral, 10 Ml ligáló reakcióelegyben, melynek összetétele: 66 mmol TRIS pH=7.4, 10 mmol MgC12, 1 mmol ATP, 10 mmol ditiotreitol és 40 egység (tapadó vég egység) T4 DNS ligáz (New England Biolabs). A ligáló reakcióelegyet 18 órán át ll°C-on inkubáljuk, majd in vitro pakoljuk, a teljes 10 μΐ reakcióelegyet egy Packagene^R lambda DNS pakoló rendszer kivonathoz adva (Promega Biotec). Miután 2 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáltuk, 500 μΐ fág hígító puffért (PDB, összetétele: 100 mmol NaCl., 10 mmol TRIS-HC1 pH=7.4 10 mmol MgSO4) adunk hozzá, majd 25 μΐ kloroformot. Az elegyet vortexeljük és 4°C-on tároljuk.

5. Példa

Transzdukció Escherichia coli-ba, és bifunkciós kozmid könyvtár készítése

Az in vitro pakoló reakcióelegyből származó fágpreparátumot Escherichia coli X2819 törzsbe transzdukáljuk (R. Curtiss), azzal a céllal, hogy sokezer transzduktánst kapjunk, amelyekből egy egyesített plazmid DNS preparátum, vagy bifunkciós kozmid könyvtár kapható. Ezért 0.3 ml Escherichia coli X2819 éjszakán át növesztett tenyészetet oltunk be 10 ml 20-10-5 táptalajba (20 g/liter Trypton, 10 g/liter élesztőkivonat, 5 g/liter NaCl, 50 mg/liter tmidin), majd 2.5 órán át 28°C-on inkubáljuk. Ezután négy rész 0.4 ml-es Escherichia coli X2819 sejtet kombinálunk 0.8 ml PDB-vel és mikrocentrifugában teljes sebességgel 5 percig centrifugáljuk. Az ülepített sejteket 100 μΐ PDBben szuszpendáljuk. Ezután az in vitro pakolásból származó 50-50 μΐ fág-preparátumot adunk mindegyikhez. A fágok 25 percig adszorbeálnak a sejtekre 37°C-on. Mindegyik keverékhez 2 ml 20-10-5 táptalajt adunk, majd a • · · ·

- 22 szuszpenziót 28°C-on 2 óra hosszat rázatjuk. Egytized ml-es alikvot részeket szélesztünk összesen 50 db Petri-csészére, amelyek 100 mg/liter ampicillinnel (nátrium-só, Sigma) kiegészített 20-10-5 táptalajt (20-10-5 táptalaj és 20 g/liter Bacto agar) tartalmaznak. A lemezeket éjszakán át 28°C-on inkubáljuk, majd három napig szobahőmérsékleten hagyjuk. Öt jellemző lemez telepszámának meghatározásából kiderül, hogy összesen körülbelül 12 000 ampicillin rezisztens telepet kaptunk.

Mindegyik lemezt 5 ml 50 mmol glükóz, 25 mmol TRISHC1 pH=8, 10 mmol EDTA pH=8 öösszetételű oldattal (GTE) árasztjuk el. A telepeket egy steril szélesztőbottal szuszpendáljuk, majd mindegyik eluátumot egyesítjük, így kapunk egy sejt-szuszpenziót, amelyet 5 percig 9800 g-vel centrifugálunk. Az ülepített sejteket 72 ml GTE-be szuszpendáljuk. Ezután 8 ml, 40 mg/ml lizozimet tartalmazó GTE-t adunk hozzá. A lizozimes emésztést 20 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Ezután 160 ml lúgos SDS-t (8g/liter NaOH, 10 g/liter SDS) adunk hozzá, ezáltal enyhe keverés után egy viszkózus lizátumot kapunk. Miután 20 percig jégen tartottok, 80 ml kálium-acetátot adunk hozzó, összekeverjük, majd további 20 percig jégen tartjuk. A preparátumot ezután 20 percig 9800 g-vel centrifugáljuk, a felülúszót összegyűjtjük és 200 ml hideg izopropanolt adunk hozzá, összekeverjük, és 15 percig jégen inkubáljuk, majd 20 percig 9800 g-vel centrifugáljuk. A nukleinsav üledéket 20 ml, 1% nátrium-szarkozináttal kiegészített TE pufferben oldjuk. Huszonkét gramm CsCl-t adunk hozzá, majd feloldjuk, • · · · • · • · · · · • ······ • · · ····· ···· · ·· ·

- 23 és 2 ml 10 mg/ml koncentrációjú etídium-bromid oldatot adunk hozzá. A CsCl-etídium-bromid elegyet megfelelő csövekbe töltjük, majd Beckman 70.1TÍ rotorban centrifugáljuk 55 000/perc fordulatszámmal 19 órán át. A csöveket eltávolítjuk a rotorból, majd a plazmid csíkokat oldalról, fecskendővel leszívjuk. Az etídium-bromidot eltávolítjuk a mintából, olymódon hogy négyszer azonos térfogatú, vízzel telített butanollal extraháljuk. A vizes oldat térfogatát 6 ml-re állítjuk be TE pufferrel; 1 ml 3 molos ammónium-acetátot adunk hozzá, majd a plazmid DNS-t 18 ml etanollal kicsapjuk. -20°C-ra hűtjük az elegyet, majd a DNS-t centrifugálással ülepítjük (3400 g, 30 perc). Egy második kicsapást hasonlóképpen hajtunk végre, majd a DNS-t etanollal öblítjük, vákuumban szárítjuk, 1 ml TE-ben oldjuk, és a DNS koncentrációt spektrofotometriásán meghatározzuk.

6. Példa

Plazmid könyvtár bejuttatása Streptomyces lividansba, majd Streptomyces lividans rekombináns sejt-könyvtár létrehozása

Az előző lépésben előállított bifunkciós plazmid könyvtárat Streptomyces lividans TK54 sejtekbe transzforrnáÍjuk, ahol a Streptomyces gének fenotipikus expressziója elérhető. Ebből a célból a Streptomyces lividans TK54 sejtekből protoplasztokat állítunk elő, lényegében a standard módszerekkel (Hopwood et al., 1985).

• · • ·

Röviden, a Streptomyces lividans TK54 45 órás tenyészetéből származó sejteket, amelyek úgy szaporodtak el, hogy 0.2-0.2 ml spóraszuszpenziót oltottunk komplett YEME táptalaj 10 db 50 ml-es alikvot részébe (YEME: 3 g/liter élesztőkivonat, 5 g/liter pepton, 3g/liter malátakivonat, 10 g/liter glükóz, 340 g/liter szacharóz, 5 g/liter glicin, 5 mmol MgC12, 40 mg/liter L-hisztidin illetve L-leucin), centrifugálással ülepítjük (9800 g, 15 perc). A sejt-üledéket kétszer mossuk P táptalajban, majd 60 ml P⁺-ban oldjuk. Ezután 14 mg/ml koncentrációjú lizozimet tartalmazó P⁺ oldatból húsz ml-t adunk hozzá, majd a szuszpenziót 30°-s vízfürdőben 150/perc fordulatszámmal rázatjuk 90 percig. Ezt követően 100 ml P⁺ táptalajt adunk hozzá, és a protoplaszt szuszpenziót steril, nem abszorbeáló gyapoton szűrjük át. A szűrletet 10 percig 3800 g-vel centrifugáljuk, a protoplaszt üledéket reszuszpendáljuk és mossuk 100 ml P⁺ táptalajjal, majd egy második centrifugálás után 120 ml P⁺ táptalajban szuszpendáljuk. A protoplaszt preparátumot 1.8 ml-es fagyálló csövekbe osztjuk szét, majd -70°C-ra lefagyasztjuk. A transzformálást olymódon végezzük el, hogy 0.3-0.3 ml TK54 protoplaszt preparátumot (körülbelül 1 x 10⁹ protoplasztot tartalmaz) adunk 4 centrifuga csőhöz, amelyek 4 ml P⁺ táptalajt tartalmaz. A protoplasztokat leülepítjük, olymódon hogy 3400 g-vel centrifugáljuk 10 percig, majd a reziduális térfogatban szuszpendáljuk. Körülbelül 10 Mg kozmid könyvtár DNS-t adunk mindegyikhez, majd 0.5 ml 25%-os PEG 1000-et (1 g PEG 1000 [SIGMA], 3 ml oldatban oldva, amelynek összetétele: 25 g/liter szacharóz, • · · ·

- 25 2 ml 500 x nyomelem oldat/liter, 0.25 g/liter K2SO4, 100 mmol CaC12, 50 mmol TRIS-maleát pH=8) adunk hozzá. Összekeverjük, majd 30 másodpercig inkubáljuk, és 5 ml P⁺ oldatot adunk hozzá. A protoplasztokat ezután ülepítjük és 1 ml P⁺-ban szuszpendáljuk. Egytized ml-es térfogatokat ezután szárított R2YE agarra szélesztünk (összetétele: 100 g/liter szacharóz, 0.25 g/liter K2SO4, 2 ml 500 x nyomelem oldat/liter, 2 g/liter L-prolin, 20 g/liter D-glükóz, 5 g/liter élesztőkivonat, 0.05 g/liter KH2PO4, 25 mmöl TES, 25 mmol CaC12, 5 mmol MgC12, 20 g/liter Bacto-agar) és 28°C-on inkubálunk. 24 óra elteltével mindegyik lemezt 500 gg/ml tiostreptont tartalmazó 3 ml lágy R agarral rétegezzük le (összetétele megegyezik az előzővel, de nem tartalmaz élesztőkivonatot, glükózt vagy K2HPO4~et, de tartalmaz 8g/liter Bacto agart), és további 12 napig inkubáljuk.

Körülbelül 9100 tiostrepton rezisztens telepet kapunk. Ezeket úgy nyerjük ki, hogy az agarlemezeken levő telepeket 3 olyan csőbe kaparjuk bele, amelyek 25-25 ml 20%-os glicerint tartalmaznak. A telepszuszpenziókat ultrahanggal besugározzuk 90 másodpercig, egyesítjük, majd 1.8 ml-es fagyálló csövekbe mérjük szét és -70°C-ra lefagyasztjuk. Ez a lefagyasztott preparátum alkotja a Streptomyces lividans rekombináns sejt-könyvtárat.

7. Példa

A Streptomyces lividans LL535, egy tetraciklin • · • · · * · · · · · • · · · · • · ·

- 26 rezisztens transzformáns izolálása, amelyből az LP^-127 plazmid származik

A Streptomyces lividans rekombináns sejt-könyvtárat ezután tetraciklin rezisztencia alapú vizsgálatnak vetjük alá. A fragmentáit Streptomyces lividans sejt-könyvtár egytized ml-es részeit 100 gg/ml tetraciklinnel kiegészített Bennett agarra szélesztjük. Miután 5 napig 28°C-on inkubáltuk, két tetraciklin rezisztens telepet tudtunk kimutatni. Ezek közül az egyiket, az LL535-öt (eredeti jelzése LL529-2) választjuk ki a további elemzés céljára. Az LL535 telepet friss, 100 Mg/ml tetraciklint tartalmazó Bennett agarra szélesztjük. A növekedést 3 napi, 28°C-on való növesztés után figyelhetjük meg. A kapott növekedést 50 ml, 10 g/liter glükózzal és 100 Mg/ml tetraciklinnel kiegészített TSB-be (TSBG) kaparjuk, majd a szuszpenziót 3 napig 30°C-on rázatjuk. Az LL535 tenyészetet röviden besugározzuk ultrahanggal, majd egy részét 1.8 mles fagyálló csövekbe mérjük szét és -70°C-on tartjuk. A megmaradó térfogatot használjuk négy darab, 500-500 ml módosított, 100 gg/ml tetraciklint tartalmazó YEME táptalajt (összetétele megegyezik az előzőkben leírtakkal, de tartalmaz 16 g/liter glicint, 25 mmol MOPS-ot, de nincs benne MgC12, L-hisztidin vagy L-leucin) tartalmazó 2 literes lombik beoltására. A két nap után kapott növekedést azután feldolgozzuk a plazmid DNS izolálása céljából az előzőkben leírt módon, azzal a különbséggel, hogy minden térfogat a négyszerese annak, mint amit az előző példában • · * · · · · ♦ * • · · · · • ······ • · · · · · · ···· · ·· ·

- 27 használtunk. A végső DNS csapadékot 1 ml TE pufferben oldjuk.

A Streptomyces lividans LL535 transzformánsból izolált plazmid DNS 10 μΐ-es részét egy in vitro pakolási rekciónak vetjük alá, majd Escherichia coli X2819T sejtekbe transzdukáljuk, az előzőkben leírt módon. Egy ampicillin rezisztens transzdukánst (jele LL537) 100 Mg/ml ampicillint tartalmazó 20-10-5 agarra szélesztjük, majd az egy nap után 30°C-on kapott növekedést használjuk 2 500-500 ml-nyi, 100 Mg/ml ampicillint tartalmazó 20-10-5 táptalaj beoltására. Miután 30°C-on inkubáltuk, plazmid DNS-t izolálunk az előzőkben leírt módon. Az izolált DNS jele LP²127; a plazmid becsült mérete 43 kb pár.

Az LP²127-ről restrikciós térképet készítünk, olymódon hogy egyszeres és kétszeres emésztéseket végzünk restrikciós endonukleázokkal. A BamHI, Bell, BglII, BstBI, Clal, EcoRI, Miül, NcoI,SacI, Scal Sphl és Stul restrikciós enzimek (New England Biolabs) hasítási helyét olymódon határozzuk meg, hogy mindegyik enzimmel emésztünk külön, majd olyan enzimekkel kombinálva, amelyekről ismert hogy a vektor részen belül ismert helyeken hasítanak, ilyen például az EcoRI, EcoRV vagy Hindin restrikciós enzim. A restrikciós endonukleázos emésztéseket olymódon végezzük, hogy 1-2 Mg plazmid DNS-t kombinálunk 4 μ,Ι olyan lOx sóoldattal, amely optimális az alkalmazott restrikciós enzimhez, valamint körülbelül 5-40 egység enzimmel 40 μΐ össztérfogatban. A használt lOx sóoldatok összetétele az alábbi:

• · · ·

- 28 BamHI, EcoRV és Sáli enzimekhez:

1.5 mól NaCl, 0.06 mól TRIS-HC1 pH=8, 0.06 mól

MgCl₂;

BqlII és Scal enzimekhez

1.0 mól NaCl, 0.1 mól TRIS-HC1 pH=7.4, 0.1 mól

MgCl₂;

Bel enzimhez:

0.75 mól KC1,	0.06 mól TRIS-HC1 pH=7.4,	0.1 mól
MgCl2;
BstBI enzimhez	•
0.6 mól NaCl,	0.06 mól TRIS-HC1 pH=7.4,	0.06 mól
MgCl2;
Clal enzimhez:
0.5 mól NaCl,	0.06 mól TRIS-HC1 pH=8.0,	0.06 mól

Mgci₂;

EcoRI enzimhez

0.5 mól TRIS-HC1 pH=8.0, 0.1 möl MgCl₂;

Miül enzimhez:

0.5 mól NaCl, 0.1 mól TRIS-HC1 pH=7.4, 0.1 mól

MgCl₂;

SacI enzimhez:

0.1 mól TRIS-HC1 pH=7.4, 0.1 mól MgCl₂;

Stul enzimhez:

1.0 möl NaCl, 0.1 mól TRIS-HC1 pH=8.0, 0.1 möl

MgCl₂.

A dupla emésztéseket mindkét enzim számára megfelelő sóoldattal végezzük, a gyártó javaslatai alapján. Az összes emésztési reakciót 37°C-on hajtjuk végre, a BclI-es • · ·*·« · · • · · · • » ··· • · · • · · · · ·«

- 29 emésztés kivételével, amelyet 50°C-on végzünk, és a BstBIes emésztés kivételével, amelyet 65°C-on végzünk. Az inkubálás hossza 60-120 perc. Egy 5 μΐ térfogatú stopkeveréket (50% glicerin, 0.1 mól EDTA pH=8, 0.25% brómfenolkék) adunk a reakció leállításához, és a minta agaróz gélre való felviteléhez.

Az emésztési eredményeket 0.8%-os agaróz gélen végzett elektroforézissel tesszük láthatóvá. A térképet az LP²127 közvetlen emésztésével, valamint a szubklónozott fragmentek emésztésével állítjuk össze. A Bell valamint a Clal hasítási helyek térképezését a gazdaszervezet metilációja gátolja, és ezért az LP²258 alkalmazásával végezhető el, amelyet úgy kapunk, hogy az LP²127-et in vitro pakoljuk, transzdukáljuk Escherichia coli GM19(damdem-) törzsbe, majd az előzőkben leírt módon plazmid izolálunk belőle. Az LP²127 fizikai szerkezetét a 2. ábrán láthatjuk. Az LP²127-ben klónozott 31.9 kb méretű Streptomyces aureofaciens DNS restrikciós endonukleázos térképét a 3. ábrán mutatjuk be.

8. Példa:

A Streptomyces lividans LL529-TT2 tiostrepton rezisztens, tetraciklin rezisztens transzformáns izolálása, amelyből az LP^-128 plazmid származik.

A Streptomyces lividans LL529-TT2 izolálását hasonló módon végezzük, mint az LL535 izolálását, azzal a különbséggel, hogy a rekombináns Streptomyces lividans

- 30 • e ·· · · ·

sejt-könyvtárat 50 gg/ml tiostreptont és 100 Mg/ml tetraciklint tartalmazó Bennett agarra szélesztjük. Miután 28°C-on 11 napig inkubáltuk, két rezisztens telepet kaptunk. Ezek közül az egyiket, az LL529-TT2-t mindkét antibiotikumot tartalmazó Bennett agarra szélesztjük.

Miután három napig 28°C-in inkubáltuk, a kapott növekedést használjuk arra, hogy 50 ml, 10 Mg/ml tiostreptont és 100 Mg/ml tetraciklint tartalmazó TSB-t oltsunk vele. Öt napig inkubáljuk 28°C-on 200/perc fordulatszámmal rázatva, majd a plazmid DNS-t miniprep módszerrel preparáljuk, amely hasonlít az előzőkben leírtakhoz, egészen az izopropanolos kicsapásig. Ebben az esetben azonban az alkalmazott térfogat körülbelül egynegyede az előzőkben említettnek. Az izopropanolos kicsapás után a nukleinsav üledéket 1 ml TEben oldjuk, majd azonos térfogatú chlorpannal (500 g fenol és 0.5 g 8-hidroxi-kinolin, 100 mmol NaCl-t, 1 mmol EDTA pH=8.0, 10 mmol nátrium-acetát pH=6 összetételű oldattal egyensúlyba hozva, plusz 500 ml kloroform) extraháljuk kevertetéssel, majd 3 percig mikrocentrifugában centrifugáljuk teljes sebességgel. A vizes fázist újra extraháljuk chlorpannal,majd kloroformmal extraháljuk hasonló módon. A végső vizes fázist összegyűjtjük, majd 100 μΐ ammónium-acetátot és 1.8 ml etanolt adunk hozzá a nukleinsav kicsapására. Lehűtjük -20°C-ra, majd a csapadékot 30 percig 8800 g-vel centrifugáljuk. A kapott csapadékot 300 μΐ 0.3 molos ammónium-acetátban oldjuk, hasonló módon kicsapjuk 1 ml etanollal és centrifugáljuk. A kapott csapadékot etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk, • ♦ ····· • · · ····· ···· · ·« *

- 31 majd 1 ml TE-ben oldjuk.

Az LL529-TT2 plazmid minipreparátumot használjuk arra, hogy az előzőkben leírt módon in vitro pakolást végezzünk vele. Egy ampicillin rezisztens transzduktánst (jele LL538) választunk a plazmid előállítására, amelyet az LL535 előállítását leíró példa szerint végzünk. A kapott tisztított plazmid jele LP²128. Azt a restrikciós emésztési mintázatot, amelyet akkor kapunk, amikor az LP²128-et 20 különböző restrikciós enzimmel emésztjük, összehasonlítjuk az LP²-vel kapottal, a restrikciós enzimes emésztési képet ugyanazon az agaróz gélen hasonlítva össze. Az LP²²128-cal kapott gél mintázat azonos azzal, amelyet az LP²127-tel kapunk, jelezve, hogy a két plazmid egyenlő. Ezért a 2. és 3. példa leírja mind az LP²128 mind az LP²127 plazmid szerkezetét.

9. Példa

Az LP-2.127 és LP-2.128 plazmidok egy plazmidhoz kapcsolt tetraciklin rezisztenciát mutatnak Annak igazolására, hogy a megefigyelt tetraciklin rezisztencia plazmidon található, az LP²127 és LP²128 plazmidokat Streptomyces lividans protoplasztokba transzformáljuk, és akapott tiostrepton rezisztens transzformánsokat vizsgáljuk, hogy tetraciklin rezisztensek-e. A Streptomyces lividans protoplasztok készítését és transzformálását, valamint a tiostrepton rezisztens transzformánsok ezt követő szelektálását az • -J ···· ·♦ ·

- 32 előzőkben leírt módon végezzük. 10 μg-ot transzformálunk mind az LP²127 mind az LP² 128 plazmidból, valamint a tetraciklin érzékeny kontroliból, az LP²111-ből (ez a vektor tartalmazza a pIBI24-et, az SCP2* replikációs origót és stabilitási régiót, valamint a tiostrepton rezisztencia gént). Mindegyik plazmidból 150 transzformánst vizsgálunk le és izolálunk 100 μg/ml tetraciklint illetve 25 μg/ml tiostreptont tartalmazó Bennett agarlemezre.

Az izolálások eredményét 5 napi, 28°C-on való növekedés után értékeljük ki. Az LP²111-ből származó összes tiostrepton-rezisztens transzformáns tetraciklin érzékenynek bizonyult, míg az akár az LP²127-ből, akár az LP²128-ból tiostrepton rezisztens transzformánsok 80%-a tetraciklin rezisztensnek bizonyult.

10. Példa

Klór-tetraciklin és tetraciklin előállítása LP^-127et és LP^-128-antitest tartalmazó Streptomyces lividans-szal

Kísérletsorozatot végzünk annak demonstrálására, hogy az LP²127 és LP²128 klór-tetraciklin (CTC) és tetraciklin (TC) bioszintézisét szabályozza a Streptomyces lividans heterológ gazdaszervezetben. Az eredeti LL535 izolátum, valamint az LP²127-tel transzformált Streptomyces lividans termel CTC-t és TC-t mind agaron, mind folyadék táptalajon, míg az inszert nélküli plazmid klónozó vektor nem termel tetraciklin antibiotikumot. A Streptomyces lividansba transzformált LP²128 plazmid egy Escherichia coli elleni aktivitással rendelkező antibiotikum szintézisét irányítja, amely tetraciklinként írható le. Ilyen aktivitást e Streptomyces lividans gazdaszervezet nem termel.

Először a Streptomyces lividans LL535-öt a tiostrepton rezisztens izolátumot, amelyből az LP²-t izoláltuk, Bennett agarra szélesztjük (amely 25 /ig/ml tiostreptont tartalmaz), olyan hígításban, hogy körülbelül 200 telepet kapjunk lemezenként. A Streptomyces lividans LL531 törzset (amely az előzőkben említett LP²111 plazmid vektort tartalmazza), hasonlóképpen szélesztjük, körülbelül 400 telep per lemez sűrűségben.

Miután nyolc napig inkubáltuk 30°C-on, az LL535 telepek sárga UV fluoreszcenciát mutatnak 366 nm-es UV lámpával való besugárzás után. Ez jellemző a tetraciklin termelő tenyészetekre, és nem figyelhető meg az LL531-nél.

Ezután mindegyik lemezen megvizsgáljuk a biológiai aktivitást, olymódon hogy a telepeket 5 ml olyanlágy 20-105 agarral (8 g/liter Bacto Agár) rétegezzük le, amelyet 0.1 ml éjszakán át növesztett teszt-organizmussal oltottunk be. Az alkalmazott vizsgáló mikroorganizmusok: a Bacillus subtilis T1325 törzs, amelyet a University of Leicester-ről kaptunk (dr. Eric Cundliffe), amelyik a tiostrepton rezisztenciát biztosító plazmidot tartalmazza), az Escherichia coli MM294 és MM294 (ATCC 33625), amely a pBR322 plazmidot tartalmazza (ez hordozza a tetraciklin és ampicillin rezisztenciát). A tenyészeteket éjszakán át • · · • · · · · · • · · · · · · • · · ····· ···· · · · · ·

- 34 növesztjük 37°C-on 10 ml 20-10-5 táptalajban, amelyet a T1325 számára 25 gg/ml tiostreptonnal, és az MM294/pBR322 számára 100 Mg/ml ampicillinnel egészítünk ki. Miután lerétegeztük és éjszakán át inkubáltuk 37°C-on, a lemezeken megvizsgáljuk a gátlási zónákat a rétegző mikroorganizmusban. Az LL531 törzs nem ad zónákat az Escherichia coli törzsekkel, és csak néhány telep ad kisméretű lokalizált gátlási zónát a Gram-pozitív T1325tel. Mindez utóbbi telep vörös pigmentet termel, amely az aktinorodin expresszióra jellemző; a Streptomyces lividansról ismert, hogy ezt a normális körülmények között kriptikus bioszintézis utat megfigyelhető frekvenciával expresszálja (Horinouchi et al., 1989). Összehasonlítva, az LL535 törzs egy olyan antibiotikumot termel, amely teljesen gátolja a T13225 és MM294 növekedését a rétegzett agarban (a későbbi kísérletekben kevesebb teleppel lemezenként, kicsi, diszkrét és nagyon nagy gátlási zónák láthatók a megfelelően szeparált telepek körül ezekkel a vizsgáló mikroorganizmusokkal). A jelen kísérletben MM294/pBR322-vel felülrétegzett LL535 telepek diszkrét gátlási zónákat mutatnak a telepek körül. Az MM294/pBR322-vel látható redukált aktivitást úgy lehet venni, hogy egy csökkent érzékenységet mutat, a pBR322-n található tetraciklin rezisztencia gén expressziója következtében.

Az agaron keletkező antibiotikumot úgy jellemezzük, hogy egybefüggő tenyészetet adó lemezeknél agar-blokkokból extraháljuk az antibiotikumot. Az LL535 és LL531 törzseket 25 Mg/ml tiostreptont tartalmazó Bennett agaron növesztjük;

• · ··< · · · · • · · · · • «····· • · · ····· • · · · · ·· · a Streptomyces aueofaciens ATCC 13899 törzset, amely a klónozott LP²127 és LP²128 DNS forrása, antibiotikum nélküli Bennett agarra szélesztjük. Miután öt napig növesztettük 30°C-on, 2.5 cm-es négyzet alakú agarblokkokat vágunk ki és maceráljuk 3 ml savas metanollal (11.5 ml tömény kénsav 4 liter metanolban). Miután öt percig Vortexeltük, a felülúszót egy Acro LC-25-ös membránszűrőn szűrjük át, és HPLC elemzésnek vetjük alá.

A HPLC elemzéseket izokratikus körülmények között végezzük C18 fordított fázisú oszlopon egy olyan mobil fázissá, amelynek összetétele pH=2.9-es oxalát puffer, benne 22% DMF (N,N,-dimetil-formamid). Az áramlási sebesség 1 ml/perc, az eluátumot 365 nm-en követjük. Standardként autentikus tetraciklint és klór-tetraciklint alkalmazunk.

A HPLC kromatogrammok azt mutatják, hogy az LL535 és az ATCC 13899 olyan anyagokat termelnek, amelyeknek a retenciós idejük azonos a tetraciklinével és a klórtetraciklinével. Az LL531 extraktumai nem mutatják ezeket a csúcsokat.

Az LP²127-tel, LP²128-cal és LP²63-mal (ez utóbbi egy olyan plazmid vektor, amely a pIBI24-et tartalmazza a pIJ702 SacI hasítási helyére klónozva) kapott Streptomyces lividans tiostrepton rezisztens transzformánsokat hasonlóképpen analizáljuk a rétegzési technikávalaz antibiotikum-termelés szempontjából, a T1325 és MM294 mikroorganizmusok alkalmazásával. Az LP²127 és LP²128 transzformánsok mutatják mindkét vizsgáló mikroorganizmussal szemben antibiotikum aktivitás • · · · • «····· • · · ····· • ··· · · · ·

- 36 termelődését, míg az LP²63 transzformánsok nem, ezzel jelezve, hogy az antibiotikum-termelő képesség az LP²127 és LP²128 plazmidokban levő Streptomyces aureofaciens DNS-hez kötődik.

Folyadék-fermentációkat is végzünk, annak ismételt megerősítésére, hogy az LP²127 plazmidot tartalmazó Streptomyces lividans által termelt antibiotikumok a tetraciklin és a klór-tetraciklin. Ötven-ötven ml-es oltóanyag tenyészeteket állítunk elő az ATCC 13899 , az LL531 és LL873 törzsekből (az utóbbi a Streptomyces lividansnak egy LP²127 transzformánsa) 5 Mg/ml tiostreptont tartalmazó S táptalajt alkalmazva (az S táptalaj összetétele: 4 g/liter élesztőkivonat, 4 g/liter pepton, 10 g/liter glükóz, 0.5 g/liter MgSO₄ x 7H₂O); az ATCC 13899-et tiostrepton nélkül növesztjük. Miután három napig inkubáltuk 30°C-on, 0.5 ml oltóanyagot átviszünk 25 ml-es táptalajba, amely 10 μg/ml tiostreptont tartalmaz (az ATCC 13899-et antibiotikum nélkül növesztjük). Miután tíz napig 28°C-on inkubáltuk, a végső tenyészetből 0.5 ml-es alikvot részeket hígítunk 4.5 ml savas metanolban, az előzőkben leírt módon feldolgozzuk, majd HPLC elemzésnek vetjük alá. Az LL531 törzs nem eredményez tetraciklin vegyületeket, míg az ATCC 13899, az LL535 és az LL873 37, 56 illetve 6 Mg/ml klór-tetraciklint termel. Kismennyiségű tetraciklin is kimutatható az említett három törzs fermentlevében.

Az LL537 és LL538 Escherichia coli törzsek az Escherichia coli transzdukánsok, amelyekből az LP²127 és LP²128 plazmidot izoláltuk, és a Budapesti Egyezmény • · · ····· ···· · ·· ·

- 37 alapján letétbe helyeztünk az American Type Culture Collection-nál (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland), az ATCC letéti számok az alábbiak. Az LP²127-et tartalmazó Escherichia coli X2818T letéti száma ATCC 68537, és az LP²128-at (LL538) tartalmazó Escherichia coli X2819T törzs letéti száma ATCC 68358. Mindkettőt 1990 július 10-én helyeztük letétbe, és legális igény esetén bárki számára hozzáférhető.

A leírásban hivatkozott publikációkat az alábbiakban adjuk meg részletesen.

• · ·

1. Baltz, R.H. and P. Matsushima. 1981. Protoplast fusion in Streptomvces: conditions fór efficient genetic recombination and cell regeneration. J. Gén. Microbiol. 127:137-146.

2. Baltz, R.H. and E.T. Seno. 1988. Genetics of Streptomvces fradiae and tylosin biosnthesis. Ann. Rive. Microbiol. 42:547-574.

3. Bibb, M.J., J.M. Ward, and D.A. Hopwood. 1978. Transformation of plasmid DNA intő Streptomvces protoplasts at high frequency. Natúré (London) 274:398-400.

4. Binnie, C., M. Warren, and M.J. Butler. 1989. Cloning and heterologous expression in Str.ggtcw<7<?9 lividans of Streptomyces rimosus genes involved in oxytetracycline biosynthesis.

J. Bateriol. 171:887-895.

5. Butler, M.J., E.J. Friend, I.S. Hunter, F.S. Kaczmarek, D. A. Sugden and M. Warren. 1989. Molecular cloning of resistance genes and architecture of a linked gene cluster involved in biosynthesis of oxytetracycline by Streptomvces rimosus. Mól. Gén. Génét. 215:231-238.

6. Chater, K.F. and C.J. Bruton. 1983. Mutational cloning in Streotomvcer and the isolation of antibiotic production genes. Gene 26:67-78

7. Chen, C.W., H.-F. Lin, C.L. Kuo. H.-L. Tsai and J.F.-Y. Tsai. 1988. Cloning and expression of a DNA sequence conferrinc cephamycin C production. Bio/Technology 6:1222-1224.

8. Cox, K.L. and R.H. Baltz. 1984. Restriction of bacteriophage plaque formation in Streptomyces spp. J. Bacteriol. 159:499-504.

9. Distler, J., K. Mansouri and W. Piepersberg. 1985. Streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus

II. Adjacent genomic location of biosynethetic genes and one of two stretomycin resistance genes. FEMS Microbiol. Lett 30:151-154.

10. Duggar, B.M. 1948. Aureomycin: a product of the continuing search fór new antibotics. Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:171-181.

11. Feitelson, J.S. and D.A. Hopwood. 1983. Cloning of a Streptomyces gene fór an O-methyltransferase involved in antibiotic biosynthesis. Mól. Gén. Génét. 190:394-398.

12. Fishman, S.E., K. Cox. J.L. Larson, P.A. Reynolds, E.T. Seno, w.-K Yeh, R. Van Frank and C.L. Hershberger. 1987. Cloning genes fór the biosynthesis of a macrolide antibiotic. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 34:8248-8252.

13. Gil, J.A. and D.A. Hopwood. 1983. Cloning and expression of a p-aminobenzoic, acid synthetase gene of the candicidin-producing Streptomyces griseus. Gene 25:119-132.

14. Goodman, J.J. 1985. Fermentation and mutational development of the tetracyclines. p.5-57. In: J.J. Hlavka and J.H. Boothe (eds), Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 78, The Tetracyclines. Springer-Verlag, Berlin.

15. Hohn, B. and J. Colliris. A small cosmid fór

- .'.0 efficient cloning of large DNA fragments. Gene 11:291-298.

( 16. Hopwood, D.A. and H.M. Wright. 1978. Bacterial protoplast fusion: recombination in fused protoplasts of Streptomyces coelicolor. Mól. Gén. Génét. 162:307-317.

17. Hopwood, D.A., 1967. Genetic analysis and genome structure in Streptomyces coelicolor. Bacteriol. Rév. 31:373-403.

18. Hopwood, D.A., M.J. Bibb, K.F. Chater, T. Kieser, C.J. Bruton, H.M. Kieser, D.J. Lydiate, C.P. Smith, J.M. Ward and H. Schrempf. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces- a laboratory manual. The John Innes Foundatíon. Norwich, England.

19. Horinouchi, S., F. Malpartida, D.A. Hopwood and T. Beppu. 1989. afsB stimulates transcription of the actinorhodin biosynthetic pathway in Streptomyces gg^líCQlQr A3 (2) and SXrePtQfflYges lividans. Mól. Gén. Génét. 215:355-357.

20. Jones, G.H. and D.A. Hopwood. 1984. Molecular « cloning and expression of the phenoxazinone synthase gene from gtgSPtgmygSS · J·

Bioi. Chem. 259:14151-14157.

21. Katz, E., C.J. Thompson and D.A. Hopwood. 1983. Cloning and expression of the tyrosinase gene from Streptomyces antibioticus in gtreptglilYSSS lividans. J. Gén. Microbiol. 129:2703-2714.

22. Larson, J.L. and C.L. Hershberger. 1986. The minimál replicon of a streptomycete plasmid produces ultrahigh level of plasmid DNA. Plasmid

15:199-209

23. Leskiw, B.K., Y. Aharonowitz, M. Mevarech. S. Wolfe, L.C. Vining. D.W.S. Westlake and S.E. Jensen. 1988.

Cloning and nucleotide sequence determination of the isopenicillin N synthetase gene from Streptomyces clavuligerus. Gene 62:187-196.

24. Lydiate, D.J., F. Malpartida and D.A. Hopwood. 1985. The Streptomyces plasmid SCP2*: its funtional analysis and development intő useful cloning vectors. Gene 35:223-235.

25. Malpartida, F. and D.A. Hopwood. 1984. Molecular cloning of the whole hiosynthetic pathway of a Streptomyces antibiotic and its expression in a heterologous hőst. Natúré (London) 309:462-464.

26. Maniatas, T., E.F. Fritsch and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

27. McCormick, J.R.D. 1968. Point blocked mutants and biogenesis of tetracyclines. p. 163-173. In: G.

Sermonti and M. Alecevic (eds), Genetícs and Breeding of Streotomvcetes. Yugoslav. Acad. Sci. and Árts, Zagreb.

28. Motamedi, H. and C.R. Hutchinson. 1987. Cloning and heterologous expression of a gene cluster fór the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumcr antbiotic of Streptomyces glaucescens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4445-4449.

29. Murakami, T., H. Anzai, S. Imái, A. Satoh, K.

• * ···· ·· • ·

4· • ·*4·

1,2 Nagaoka and C.J. Thompson. 1986. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hvaroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mól. Gén. Génét. 205:42-50.

30. Reynes, J.P., T. Calmels, D. Drocourt and G. Tiraby. 1988. Cloning, expression in Escherichia coli and nucleotide sequence of a tetracycline-resistance gene from Streptomyces rimosus♦ J. Gén. Microbiol. 134:585-598.

31. Sanger, F., A.R. Coulson, G.F. Hong, D.F. Hill and G.B. Peterson. 1982. Nucleotide sequence of bacteriophage lambda DNA. J. Mól. Bioi. 162:729-773 .

32. Stanzák, R., P. Matsushima, R.H. Baltz and R.N. Rao. 1986. Cloning and expression in Streptomyces lividans of clustered erythromycin biosynthesis genes from Streptomyces ervthreus. Bio/Technology 4:229-232.

33. Stutzman-Engwall, K.J. and C.R. Hutchinson. 1989. Multigene famiiies fór anthracycline antibiotic production in Streptomyces peucetius. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3135-3139.

34. Sutcliffe, J.G. 1979. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 43:77-90.

35. Thompson, C.J., T. Kieser, J.M. Ward, and D.A. Hopwood. 1982. Physical analysis of antibiotic-resistance genes from Streptomyces and their use in vector construction. Gene 20:51-62.

36. van Pee, K.-H. 1988. Molecular cloning and high-level expression of a bromoperoxidase gene from Streptomyces aureofaciens Tu24. J. Bacteriol. 170:5890-5894.

(

37. Vara, J.A., D. Pulido, R.A. Lacalle and A. Jimenez. 1988. Two genes in Streptomyces alboniger puromycin biosynthesis pathway are closely linked. Gene 69:135-140.

38. Veselova, S.I. 1969. Combined effect of nitrous acid, ultraviolet light, streptomycin and chlortetracycline on aureofaciens.

Antiobiotiki 14:698-702.

Claims (14)

1. A tetraciklin és klór-tetraciklin bioszintézisútját kódoló izolált DNS cluster

2. Az 1. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy szigorú hibridizációs körülmények között az 1. igénypont szerinti DNS-sel hibridizál.

3. A 2. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-t prokarióta gazdaszervezetben expresszáljuk.

4. A 3. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az említett gazdaszervezet Escherichia coli, Streptomyces lividans, Streptomyces grriseofuscus,

Streptomyces ambofuchsus, Actinomycetes, Bacillus,

Corynebacterium vagy Thermoactinomyces.

5. λ 4. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az említett gazdaszervezet Streptomyces lividans.

6. Az 5. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy az említett DNS az LP²127-en vagy az

LP²128-on található gén-cluster.

7. Eljárás a tetraciklin, klór-tetraciklin vagy analógjaik kitermelésének növelésére, azzal jellemezve, hogy az említett antibiotikumokat termelő mikroorganizmus bioszintézisútját úgy szabályozzuk, hogy az említett bioszintézis utat kódoló gén-clustert úgy manipuláljuk, hogy a tetraciklin, klór-tetraciklin vagy analógjaik kitermelése növekedjék.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-t prokarióta gazdaszervezetben expresszáljuk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdaszervezet Escherichia coli, Streptomyces lividans, Streptomyces grriseofuscus, Streptomyces ambofuchsus, Actinomycetes, Bacillus, Corynebacterium vagy Thermoactinomyces.

10.

9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdaszervezet Streptomyces lividans.

11.

10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS az LP²127-en vagy az

LP²128-on található gén-cluster.

12. Eljárás a tetraciklin vagy klór-tetraciklin antibiotikum analógok szűrővizsgálatára, azzal jellemezve, hogy a bioszintézis utat vagy annak egy részét kódoló DNS gén-clustert tartalmazó rezisztens transzformánsokat megvizsgáljuk a tetraciklin vagy klór-tetraciklin termelés szempontjából.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS szigorú hibridizációs körülmények között hibridizál a 12. igénypontban szereplő DNS-sel.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-t prokarióta gazdaszervezetben expresszáljuk.