FR2766496A1 - Genes de biosynthese et de transfert des 6-desoxyhexoses chez saccharopolyspora erythraea et leur utilisation - Google Patents

Genes de biosynthese et de transfert des 6-desoxyhexoses chez saccharopolyspora erythraea et leur utilisation Download PDF

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Abstract

L'invention a pour objet la séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et la séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 correspondant à la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.

Description

Gènes de biosynthèse et de transfert des 6-désoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et leur utilisation dans la production d'analogues de l'érythromycine par manipulation génétique.
La présente invention décrit des gènes impliqués dans la biosynthèse et le transfert des 6-désoxyhexoses chez
Saccharopolyspora erythraea et leur utilisation dans la production d'analogues de I'érythromycine par manipulation génétique.
L'érythromycine A est un antibiotique macrolide cliniquement important produit par la bactérie gram-positive
Sac. erythraea. Les gènes de la biosynthèse de l'érythromycine sont organisés en un cluster de gènes ery qui inclut aussi le gène d'auto-résistance à l'érythromycine ermE.
Le cluster ery contient les trois grands gènes eryAI, eryAII et eryAIII (locus eryA) codant pour trois polypeptides composant la polykétide synthétase (dénommée PKS) flanqués par deux régions comprenant les gènes impliqués dans les stades ultérieurs de conversion du noyau lactone (6-désoxyérythronolide B) en érythromycine A.
Pendant le processus de biosynthèse de l'érythromycine A représenté à la figure 1, la biosynthèse des 6-désoxyhexoses comprend l'ensemble des réactions enzymatiques conduisant du glucose-l-phosphate au sucre activé final dTDP-L-mycarose ou dTDP-D-désosamine. Le dTDP-L-mycarose ou la dTDP-D-désosamine ainsi produits sont ensuite utilisés comme substrats pour le transfert des deux désoxyhexoses sur le noyau lactone. La formation de l'érythromycine requiert l'attachement du mycarose via l'hydroxyle en position C-3 du noyau lactone et l'attachement de la désosamine via l'hydroxyle en position C-5. L'ensemble des gènes eryB impliqués dans la biosynthèse ou le transfert du mycarose et l'ensemble des gènes eryC impliqués dans la biosynthèse ou le transfert de la désosamine n'ont pas encore été clairement identifiés.
Le cluster ery d'une longueur de 56 kb comprend 21 phases ouvertes de lecture ou "open reading frames" (ORFs) dont la numérotation a été établie par Haydock et al. (1991) et Donadio et al. (1993). Le locus eryA comprend les ORFs 10, 11 et 12.
Des travaux précoces d'interruption ou de remplacement de gène dans la partie gauche du cluster ery a permis une première identification du gène eryCI (ORF1) (Dhillon et al., 1989), puis du gène eryBI (ORF2), du locus eryH (ORFs 3, 4 et 5) dont l'inactivation conduit à la production de 6-désoxyérythronolide B, d'un locus eryBII (ORFs 7 et 8) et le gène eryCII (Weber et al., 1990).
Parmi les activités enzymatiques impliquées dans les modifications ultérieures du noyau lactone ont été identifiées le gène eryF (ORF4) responsable de l'hydroxyla- tion en C6 (Weber et al., 1991) et le gène eryK (ORF20) responsable de l'hydroxylation en C12 (Stassi et al., 1993).
D'autre part, le gène eryG (ORF6) responsable de la
O-méthylation du mycarose en cladinose (position 3"0H) a été identifié (Weber et al., 1989). L'érythromycine A est ainsi formée via l'érythromycine B ou l'érythromycine C à partir de l'érythromycine D selon le schéma proposé (figure 1).
La caractérisation fonctionnelle des gènes eryB et eryC situés sur la partie droite de cluster ery (ORFs 13 à 19) n'a pas encore été établie de façon précise, malgré les informations parcellaires communiquées dans différents articles de revues (Donadio et al., 1993 ; Liu et Thorson, 1994 ; Katz et Donadio, 1995).
En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment l'obtention d'analogues de l'érythromycine ayant des propriétés avantageuses, est intensivement recherchée. Les modifications peuvent être désirées dans la partie aglycone (macrolactone) ou/et dans son hydroxylation secondaire ainsi que dans la partie sucre (cladinose et/ou désosamine) de l'érythromycine.
Les méthodes courantes telles que les modifications chimiques sont difficiles et limitées vis-à-vis du type de produit que l'on peut obtenir à partir de l'érythromycine.
Par exemple, Sakakibara et al. (1984) passent en revue des modifications chimiques réalisées à partir de l'érythromycine
A ou B, aussi bien dans la partie sucre que dans la macro lactone.
Des modifications de la macrolactone de l'érythromycine
A par manipulation génétique du microorganisme Sac. erythraea ont été décrites dans la demande de brevet internationale
WO 93/13663 ainsi que l'obtention de nouvelles molécules polykétides par altérations génétiques spécifiques du locus eryA du chromosome codant pour la PKS. Par exemple la 7-hydroxyérythromycine A, la 6-désoxy-7-hydroxyérythromycine
A ou le 3-oxo-3-désoxy-5-désoaminyl-érythronolide A ont été ainsi obtenus.
La présente invention concerne la caractérisation fonctionnelle de dix gènes de Sac. erythraea impliqués dans la biosynthèse ou l'attachement du mycarose et de la désosamine (eryBII, eryCIII et eryCII situés en aval du locus eryA et eryBIV, eryBV, eryCVI, eryBVi, eryCIV, eryCV et eryBVII situés en amont), leur utilisation dans la production d'analogues de l'érythromycine ainsi qu'un procédé de préparation de ceux-ci.
La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et a particulièrement pour objet une séquence d'ADN ci-dessus comprenant - la séquence eryBII correspondant à 1'ORF7 et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 et codant pour une désosaminyltransférase et - la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase.
La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 2 est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue par exemple par sous-clonage de fragments de restriction d'un fragment d'ADN génomique de Sac. erythraea, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin.
L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 choisie parmi la séquence eryBII correspondant à l'ORF7, la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 ou la séquence eryCII correspondant à l'oRF9 et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
L'invention a tout particulièrement pour objet la séquence d'ADN isolée eryCIII représentée à la figure 2 correspondant à l'ORF8 et codant pour une désosaminyltransférase.
La séquence eryBII correspondant à l'ORF7 code pour un polypeptide ayant 333 acides aminés, la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 code pour un polypeptide ayant 421 acides aminés et la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 code pour un polypeptide ayant 361 acides aminés.
La mise en évidence des activités enzymatiques respect in ves indiquées ci-dessus a été réalisée par introduction d'une délétion interne au gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale.
Par séquences qui hybrident et ayant la même fonction, on inclut les séquences d'ADN qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus sous des conditions standards de stringence élevée ou moyenne décrites par Sambrook et al.
(1989) et qui codent pour une protéine ayant la même fonction enzymatique. Par même fonction enzymatique, on entend une activité enzymatique donnée sur des substrats de même nature, par exemple un dTDP-6-désoxyhexose ou une macrolactone nue ou glycosylée. Les conditions de forte stringence comprennent par exemple une hybridation à 650C pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE, 10 x Denhardt, 100 pg/ml DNAss, 1 % SDS suivie de 2 lavages pendant 20 minutes avec une solution 2 x SSC, 0,05 % SDS à 650C suivis d'un dernier lavage pendant 45 minutes dans une solution 0,1 x SSC, 0,1 % SDS à 65OC. Les conditions de stringence moyenne comprennent par exemple un dernier lavage pendant 20 minutes dans une solution 0,2 x
SSC, 0,1 % SDS à 650C.
Par séquences qui présentent des homologies significatives et ayant la même fonction, on inclut les séquences ayant une identité de séquence nucléotidique d'au moins 60 % avec l'une des séquences ADN ci-dessus et qui codent pour une protéine ayant la même fonction enzymatique.
L'invention a aussi pour objet un polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN ci-dessus et a spécialement pour objet un polypeptide correspondant à une ORF choisie parmi l'ORF7, l'ORF8 ou l'oRF9 représentée à la figure 2 et les analogues de ce polypeptide.
Par analogues, on inclut les peptides ayant une séquence en acides aminés modifiée par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs acides aminés pour autant que ces produits conservent la même fonction enzymatique. Les séquences modifiées peuvent être par exemple préparées en utilisant la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier.
L'invention a plus spécialement pour objet le polypeptide correspondant à l'ORF 8 représentée à la figure 2 et ayant une activité désosaminyltransférase.
L'invention a aussi pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 correspondant à la région eryAI- eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et a particulièrement pour objet une séquence d'ADN ci-dessus comprenant - la séquence eryBIV correspondant à l'ORFl3 et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - la séquence eryBV correspondant à l'ORFl4 et codant pour une mycarosyltransférase, - la séquence eryCVI correspondant à l'ORFl5 et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - la séquence eryBVI correspondant à l'ORFl6 et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - la séquence eryCIV correspondant à l'ORFl7 et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - la séquence eryCV correspondant à l'ORFl8 et codant pour une dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase et - la séquence eryBVII correspondant à l'ORFl9 et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 3 est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue, par exemple, par sous-clonage de fragments de restriction de cosmides contenant une banque d'ADN génomique de Sac.
erythraea, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin.
L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 choisie parmi la séquence eryBIV correspondant à l'ORFl3, la séquence eryBV correspondant à l'ORFl4, la séquence eryCVI correspondant à l'ORFî5, la séquence eryBVI correspondant à l'ORFî6, la séquence eryCIV correspondant à 1'ORF17, la séquence eryCV correspondant à l'ORFl8 ou la séquence eryBVII correspondant à l'ORFl9 et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
L'invention a tout particulièrement pour objet la séquence d'ADN isolée eryBV représentée à la figure 3 correspondant à l'ORFl4 et codant pour une mycarosyltransféra se.
La séquence eryBIV correspondant à l'ORFl3 code pour un polypeptide ayant 323 acides aminés, la séquence eryBV correspondant à l'ORFl4 code pour un polypeptide ayant 415 acides aminés, la séquence eryCVI correspondant à l'ORFl5 code pour un polypeptide ayant 237 acides aminés, la séquence eryBVI correspondant à l'ORFl6 code pour un polypeptide ayant 510 acides aminés, la séquence eryCIV correspondant à l'ORFl7 code pour un polypeptide ayant 401 acides aminés, la séquence eryCV correspondant à 1'ORF18 code pour un polypeptide ayant 489 acides aminés et la séquence eryBVII correspondant à l'ORFl9 code pour un polypeptide ayant 193 acides aminés.
La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par introduction d'une délétion interne au gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale.
Les séquences d'ADN qui hybrident ainsi que les séquences d'ADN qui présentent des homologies significatives et ayant la même fonction ont la même signification que celle indiquée précédemment.
L'invention a aussi pour objet un polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN ci-dessus et a spécialement pour objet un polypeptide correspondant à une ORF choisie parmi l'ORFl3, l'ORFl4, l'ORFl5, l'ORFl6, loRFl7 l'ORFl8 ou l'ORFl9 représentée à la figure 3 et les analogues de ce peptide.
Les analogues du polypeptide ont la même signification que celle indiquée précédemment.
L'invention a plus spécialement pour objet le polypeptide correspondant à l'ORFl4 représentée à la figure 3 et ayant une activité mycarosyltransférase.
La connaissance de chaque séquence d'ADN eryB ou eryC de l'invention indiquée ci-dessus et montrée à la figure 2 ou à la figure 3 permet de reproduire la présente invention par exemple par des méthodes connues de synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques connues d'hybridation ou par amplification par PCR.
Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes connues, par exemple par synthèse chimique ou par la méthodologie de l'ADN recombinant par expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII, eryCIII ou eryCII représentées à la figure 2, eryBIV, eryBv, erycvl, eryBVi, eryclv, eryCV ou eryBVII représentées à la figure 3, pour synthétiser des métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea.
Par métabolites secondaires hybrides, on entend soit des analogues de l'érythromycine, c'est-à-dire des dérivés de l'érythromycine ayant une ou plusieurs modifications portant sur la partie sucre et possédant une activité antibiotique, soit des précurseurs de l'érythromycine tels que le 6désoxyérythronolide B ou l'érythronolide B auxquels sont attachés un ou plusieurs résidus sucre modifiés ou non et ne possédant pas d'activité antibiotique. Le résidu sucre modifié peut être par exemple, le 4-céto-L-mycarose.
La synthèse de métabolites secondaires hybrides chez
Sac. erythraea par utilisation de séquences d'ADN eryB ou eryC de l'invention peut être réalisée par exemple, par l'inactivation d'un ou plusieurs gènes eryB ou eryc ci-dessus et l'introduction d'un ou plusieurs gènes exogènes ou de leurs dérivés obtenus par exemple par mutagénèse, ayant des séquences nucléotidiques codant pour des enzymes ayant la même fonction chez des souches productrices d'autres macrolides, par exemple la tylosine, la picromycine ou la méthymycine. En particulier, l'introduction de gènes exogènes peut être effectuée par intégration d'une séquence d'ADN obtenue selon la méthodologie du "DNA shuffling" (Stemmer, 1994) ou par la construction d'une séquence d'ADN chimère,par exemple à partir d'une séquence eryB ou eryc de l'invention intervenant dans le transfert d'un résidu sucre, par exemple la séquence eryCIII ou eryBv, et de gènes homologues isolés à partir de souches productrices de macrolides, par exemple
Streptomyces fradiae, Streptomyces olivaceus, Streptomyces venezuelae ou Streptomyces antibioticus.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII, eryCIII ou eryCII représentée à la figure 2, les séquences eryBIV, eryBV, erycvl, eryBVI, eryCIV, eryCV ou eryBVII représentée à la figure 3 ou d'un fragment de cette séquence, comme sondes d'hybridation.
Les séquences d'ADN eryB ou eryC de l'invention peuvent être utilisées pour constituer des sondes d'hybridation d'au moins 19 nucléotides, permettant d'isoler des gènes homologues dans des souches productrices de macrolides en utilisant les méthodes classiques d'hybridation d'acides nucléiques immobilisées sur des filtres ou d'amplification par PCR, selon les conditions décrites par Sambrook et al.
(1989).
L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea dans lequel - on isole une séquence ADN contenant au moins une séquence eryB ou une séquence eryC du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine représentée à la figure 2 ou à la figure 3, - on crée une modification dans la dite séquence et on obtient une séquence altérée, - on intègre la séquence altérée dans le chromosome de la souche hôte et on obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant la formation du métabolite secondaire hybride et - on isole le métabolite secondaire hybride.
La modification de la séquence d'ADN peut être réalisée par exemple par une addition et/ou par une délétion de séquences d'ADN d'au moins un nucléotide, dans une séquence eryB ou eryC de l'invention qui code pour l'une des enzymes correspondantes indiquées ci-dessus.
L'intégration de la séquence altérée dans la souche hôte peut être réalisée par exemple par la méthodologie de la recombinaison homologue qui peut être effectuée selon le schéma montré à la figure 4 et conduit à la génération de mutants chromosomiques de souches Sac. erythraea que l'on cultive ensuite selon les méthodes générales connues de culture cellulaire.
L'invention a particulièrement pour objet le procédé cidessus dans lequel la séquence ADN code pour l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé ci-dessus dans lequel l'altération de la séquence résulte dans l'inactivation d'au moins l'une des enzymes indiquées ci-dessus.
L'inactivation d'au moins l'une des enzymes est mise en évidence, d'une part par l'absence de production d'érythromycine, d'autre part par l'accumulation de précur seurs de l'érythromycine tels que le 6-désoxyérythronolide B, l'érythronolide B ou le 3-a-mycarosyl érythronolide B et/ou l'accumulation de métabolites secondaires hybrides tels que définis précédemment dans les surnageants de cultures des souches modifiées correspondantes.
L'invention concerne tout particulièrement le procédé ci-dessus dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto
L-6-désoxyhexose 4-réductase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une mycarosyltransférase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase.
L'invention concerne aussi le procédé ci-dessus dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est un analogue de l'érythromycine choisi parmi la 4"-céto-érythromycine, la 4'-hydroxy-érythromycine ou la 3"-C désméthyl-2",3"-èneérythromycine ou dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est le désosaminyl érythronolide B.
Des exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention sont donnés dans la partie expérimentale. L'accumulation de métabolites secondaires hybrides dans des souches de
Sac. erythraea modifiées est également décrite plus loin.
L'invention concerne aussi une souche de Sac. erythraea modifiée dans laquelle au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase est inactivée et produisant au moins un métabolite secondaire hybride.
L'invention concerne particulièrement la souche de Sac.
erythraea modifiée BII92 dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase est inactivée et produisant la 3'-C désméthyl-2",3"-ène-érythromycine C, la souche de Sac.
erythraea modifiée BIV87 dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 4-réductase est inactivée et produisant la 4"céto-érythromycine, la souche de Sac. erythraea modifiée CIV89 dans laquelle une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydra- tase est inactivée et produisant la 4'-hydroxyérythromycine D ainsi que la souche de Sac. erythraea modifiée BV88 dans laquelle une mycarosyltransférase est inactivée et produisant du désoaminyl érythronolide B. Des constructions détaillées des souches ci-dessus sont données plus loin dans la partie expérimentale.
Matériels et méthodes générales.
1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de croissance.
La souche Sac. erythraea utilisée pour la réalisation de l'invention est un variant phénotypique spontané dit "red variant" (Hessler et al., 1997) de la souche sauvage
Sac. erythraea NRRL 2338 dont la croissance est effectuée en routine soit sur milieu solide R2T2 (milieu R2T décrit par
Weber et al., 1985 sans peptone), R2T20 (Yamamoto et al., 1986) ou M1-102 sur agar (Kaneda et al., 1962), soit en milieu liquide TSB (Oxoid) à 30 C
La souche Streptomyces lividans 1326 (John Innes Culture
Collection) décrite par Hopwood et al. (1983), utilisée pour la préparation de plasmides dépourvus d'origine de réplication d'Escherichia coli tels que pIJ702 et pIJ486, a été maintenue sur milieu solide R2YE(R5) (Hopwood et al., 1985).
La croissance des souches E. coli XL1-blue (Stratagene),
JM110 (Stratagene) et DHSa.MCR (GibcoBRL), utilisées pour les préparations de plasmides, a été effectuée en routine en milieu liquide 2 x YT ou LB ou en milieu solide LB sur agar, tels que décrits par Sambrook et al. (1989). La souche
E. coli XL1-blue est utilisée pour les clonages en routine.
La souche JM110 est utilisée pour des clonages où l'on utilise des sites de restriction tels que BclI. La souche DH5a.MCR est utilisée pour la préparation de plasmides destinés à être introduits chez Sac. erythreae pour une transformation optimale.
La sélection des plasmides dans E. coli a été effectuée sur ampicilline (Sigma) à 100 ssg/ml.
Les souches Bacillus subtilis ATCC 6633 ou Bacillus pumilus ATCC 14884 ont été utilisées comme souches indicatrices pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme.
Les plasmides Litmus28, pUC18 et pUC19 (New England
Biolabs) ont été utilisés en routine pour les sous-clonages.
Le vecteur pIJ702 (Katz et al., 1983) a été obtenu du John
Innes Institute. Le vecteur pIJ486 (Ward et al., 1986) a été obtenu de C.J. Thompson (Université de Bâle, Suisse). Le phagmide pTZ18R a été obtenu de Pharmacia Biotech. Le vecteur navette coli-streptomyces pUWL218 (Wehmeier, 1995) utilisé pour l'intégration chromosomique dans Sac. erythraea a été obtenu de W.Piepersberg (Université de Wuppertal, Allemagne).
2. Manipulation de l'ADN et séquençage.
Les méthodes générales de biologie moléculaire utilisées sont décrites par Sambrook et al., 1989.
Les réactifs d'origine commerciale ont été utilisés incluant les enzymes de restriction (New England Biolabs et
Boehringer Mannheim), le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I (Boehringer Mannheim). La trousse "DNA ligation system" (Amersham) a été utilisée pour effectuer les ligations et la trousse Plasmid Midi kit (Quiagen) ou RPM kit (BiolOl Inc.) pour purifier l'ADN plasmidique.
La préparation de l'ADN du bactériophage X a été réalisée selon Ausubel et al. (1995) et l'isolement de l'ADN chromosomique de Sac. erythraea selon Hopwood et al. (1985).
La transformation de S. lividans et l'isolement des plasmides ont été effectués selon Hopwood et al. (1985).
3. Préparation de l'érythronolide B et du 3-a-mycarosyl érythronolide B.
L'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B ont été purifiés à partir d'extraits de culture du mutant eryci (clone WHB2221 décrit par Dhillon et al., 1989) par chromatographie sur gel d'aminopropyl (LichroprepNH2 25-40 ,
Merck) avec un gradient d'élution par des mélanges chlorure de butyle/chlorure de méthylène successifs (100:0, 80:20, 50:50 et 20:80) suivi d'un gradient d'élution linéaire par le mélange chlorure de butyle/méthanol variant de 99:1 à 90:10.
Les fractions contenant les produits attendus sont amenées à sec sous vide puis analysées par chromatographie en couche mince (ccm). L'érythronolide B est ensuite cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/hexane puis recristallisé dans l'éthanol. Le 3-a-mycarosyl érythronolide B est cristallisé deux fois dans un mélange acétate d'éthyle/hexane.
Milieux cités.
1. R2T2
Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 103 g ; K2 S04 0,25g ; extrait de levure 6,5 g ; tryptone 5,0 g ; bactoagar 22,0 g ; eau distillée qsp 860 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 0c. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 20 ml de glucose à 50 % ; 25 ml de Tris-Hcl 1M, pH7,0 ; 5 ml de KH2P04 à 0,5 % ; 2,5 ml de NaOH 1N ; 50 ml de CaCl2 1M ; 50 ml de MgCl2,6H2O 1M et 2 ml de solution de "trace elements" (Hopwood et al., 1985).
2. R2T20
Pour un litre de solution aqueuse : milieu R2T2 contenant 206 g de sucrose.
3. M1-102 (Kaneda et al., 1962)
Pour 1 litre de solution aqueuse : glucose 5 g ; sucre brun commercial 10 g ; tryptone 5 g ; extrait de levure 2,5 g
Versène 36 mg ; eau courante 1000 ml ; pH final ajusté à 7,0 à 7,2 avec KOH. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 0c.
4. R2YE(R5) (Hopwood et al., 1985)
Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 103 g ; K2S04 0,25 g ; MgC12,6H2O 10,12 g ; casaminoacides 0,1 g ; solution de "trace elements" 2 ml ; extrait de levure 5 g ; TES 5,72 g ; bactoagar 15 g ; eau distillée qsp 940 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 1200C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 10 ml de KH2PO4 0,5 % ; 20 ml de
CaCl2 1M ; 15 ml de L-proline à 20 % ; 20 ml de glucose à 50 % et 1 ml de Cucul2 lOmM.
5. 2 x TY
Pour 1 litre de solution aqueuse : tryptone 10 g ; extrait de levure 10 g ; NaCl 5 g.
6. Tampon PT
Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 100 g ; K2 S04 0,25 g ; MgCl26H2O 5,1 g ; solution de "trace elements 2 ml ; eau distillée qsp 875 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 1200C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 5 ml de CaCl2 et 20 ml de TES 5,3 %.
7. Sucrose-succinate (Caffrey et al., 1992)
Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 0,2 M ; acide succinique 20 mM ; phosphate de potassium 20 mM (pH 6,6) ; sulfate de magnésium 5 mM ; nitrate de potassium 100 mM ; solution de "trace elements" 2 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120"C.
Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention.
La figure 1 représente représente la voie de biosynthèse de l'érythromycine A.
La figure 2 représente la séquence nucléotidique de la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine comprenant les ORFs 7, 8 et 9 et leurs séquences protéiques déduites.
La figure 3 représente la séquence nucléotidique de la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de 1'érythromycine comprenant les ORFs 13 à 19 et leurs séquences protéiques déduites.
La figure 4 représente le schéma de substitution de gène par recombinaison homologue.
La figure 5A représente l'organisation de la partie gauche du cluster des gènes de la biosynthèse de l'érythromy- cine chez Sac. erythraea dont les ORFs 1 à 9 sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction des plasmides pK62, pBCK1, pKB22, pBK44, pBIISB, pEco2 et pK23, générés à partir du clone génomique XSE5.5. (Abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Bc, BclI ; Bg, BglII ; E,
EcoRI ; K, KpnI ; M, MluI ; P, PstI ; S, SacI ; Sa, SalI.)
La figure 5B représente l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'érythromycine chez Sac. erythraea dont les ORFs 13 à 21 sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction des plasmides pBK6-12, pCN9, pNCO28, pNB49, pNCO62, pPSP4, pNCO62X et pBAB18. (Abréviations des enzymes de restriction
B, BamHI ; Ba, BalI ; Bc, BclI ; C, ClaI ; E, EcoRI ; K,
KpnI ; N, NcoI ; Ns, NsiI ; P, PstI ; Pv, PvuII ; S, SacI
Sc, ScaI ; Sh, SphI ; Sp, SpeI ; X, XbaI ; Xh, XhoI).
La figure 6A représente le schéma de construction du plasmide pBIIA.
La figure 6B représente une carte de restriction du plasmide pUWL218.
La figure 6C représente une carte de restriction du plasmide pBIIA.
La figure 7A représente le schéma de construction du plasmide pdel88.
La figure 7B représente le schéma de construction du plasmide pdel88A.
La figure 7C représente le schéma de construction du plasmide pOBB.
La figure 7D représente le schéma de construction et une carte de restriction du plasmide pCIII.
La figure 8A représente le schéma de construction du plasmide pCII.
La figure 8B représente une carte de restriction du plasmide pORT1.
La figure 8C représente une carte de restriction du plasmide pCII.
La figure 9A représente le schéma de construction du plasmide pBIV.
La figure 9B représente une carte de restriction du plasmide pBIV.
La figure 10A représente le schéma de construction du plasmide pBV.
La figure 10B représente une carte de restriction du plasmide pBV.
La figure IlA représente le schéma de construction du plasmide pPSTI.
La figure llB représente une carte de restriction du plasmide pPSTI.
La figure 12A représente le schéma de construction du plasmide pXhoI.
La figure 12B représente une carte de restriction du plasmide pXhoI.
La figure 13A représente le schéma de construction du plasmide pCIVd.
La figure 13B représente une carte de restriction du plasmide pCIVA.
La figure 14A représente le schéma de construction du plasmide pCVA.
La figure 14B représente une carte de restriction du plasmide pCVA.
La figure 15 représente l'analyse par Southern blot des souches mutantes BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et
CV90, comparativement à la souche sauvage "red variant" notée
Wt. Pour chaque mutant, l'enzyme de restriction utilisée est indiquée en-dessous de chaque blot et la taille des bandes détectées devant chaque blot est estimée par rapport aux marqueurs de poids moléculaire XHindIII et XBstEII (non détectables par auto-radiographie).
La figure 16 représente l'analyse par PCR des souches mutantes BII91, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement à la souche sauvage "red variant" notée Wt et aux plasmides pBII, pCIII, pCII, pBIVA, pBV, PCIVA et pCVA# utilisés respectivement pour obtenir le mutant par recombinaison homologue. Les tailles des bandes détectées par coloration au bromure d'éthydium sont estimées par rapport aux marqueurs de poids moléculaire X174-HaeII ou X-BstEII.
La figure 17 représente l'analyse par CCM des métabolites produits par les souches mutantes BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement aux produits standards érythromycine A (Er A), érythronolide B (EB) et 3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB).
EXEMPLE 1 : clonage et séquençage de la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de 1'érythromycine.
Un fragment d'ADN génomique de Sac. erythraea NRRL 2338 ayant > 20 kb en aval du gène ermE couvrant notamment les
ORFs 3 à 9 et correspondant au clone XSE5.5 ainsi que la séquence nucléotidique d'un fragment de 4,5 kb correspondant à la région du cluster ery comprise entre 3,7 kb et 8,0 kb à partir de l'extrémité 3' du gène ermE et comprenant les ORFs 3, 4, 5 et 6 ont été décrits par Haydock et al. (1991).
En tenant compte de la carte de restriction montrée par
Haydock et al. (1991), des sous-clones ont été dérivés du clone XSE5.5 par sous-clonage de fragments de restriction dans pUC19. Les plasmides pKB22, pBK44, pBIISB et pEco2 ont été ainsi générés selon la figure 5A de la façon suivante
A partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction KpnI, les plasmides pK62 et pK66 ont été directement construits par sous-clonage du fragment KpnI de 5,8 kb dans pUC19, le plasmide pK66 correspondant au même fragment KpnI sous-cloné avec une orientation inversée de l'insert par rapport au vecteur. Le plasmide pKB22 contenant un insert de 2,9 kb a été ensuite dérivé du plasmide pK62 par excision du fragment BamHI-BglII (2,9 kb) couvrant l'oRF8 ainsi qu'une partie des ORFs 7 et 9 par digestion avec les enzymes de restriction BamHI et BglII. De la même façon, le plasmide pKB44 contenant un insert de 2,9 kb a été obtenu à partir du plasmide pK66 par excision du fragment BamHI-BglII (2,9 kb) couvrant le gène eryG correspondant aux ORFs 5 et 6 et le gène eryF correspondant à 1'ORF4.
Le plasmide pBIISB a été dérivé du plasmide pBK44 par sous-clonage dans pUC19 du fragment SalI de 600 pb obtenu à partir du plasmide pBK44 digéré par l'enzyme de restriction
SalI (figure 5A).
A partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, le plasmide pEco2 a été directement construit par sous-clonage du fragment EcoRI (2,2 kb) dans pUC19.
Les sous-clones pKB22, pBK44, pBIISB et pEco2 ainsi obtenus ont été ensuite séquencés. L'analyse a été faite sur des échantillons d'ADN plasmidique, préalablement purifié sur une colonne de Quiagen 100 (Quiagen), sur le séquenceur automatique ABI prism 377. Les réactions de séquençage ont été réalisées par la méthode de Sanger (1977) en utilisant les amorces M13 conventionnelles ou des amorces synthétiques et des didésoxynucléosides triphosphate fluorescents et la polymérase Taq FS (Perkin Elmer) en présence de 5 % de diméthylsulfoxide, les amorces synthétiques utilisées ayant les séquences suivantes
C3R2 5' TCCTCGATGGAGACCTGCC 3'
B2R1 5' GAGACCATGCCCAGGGAGT 3'
C3S2 5' TCTGGGAGCCGCTCACCTT 3'
C2R1 5' GACGAGGCCGAAGAGGTGG 3' C25 5' GCACACCGGAATGGATGCG 3' fullC3S 5' CCGTCGAGCTCTGAGGTAA 3' fullC3R 5' GCCCGAGCCGCACGTGCGT 3' et
C4 5' TGCACGCGCTGCTGCCGACC 3'
L'assemblage des données de séquence a été réalisé avec le logiciel AutoassemblerTM pakage (Applied Biosystem). Les séquences ont été analysées en utilisant l'ensemble des logiciels GCG (Devereux 1984).
Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir une séquence nucléotidique de 3365 bp (figure 2) dans laquelle trois ORFs (7, 8 et 9) ont été identifiées respectivement du nucléotide 8957 au nucléotide 7959, du nucléotide 10219 au nucléotide 8957 et du nucléotide 11315 au nucléotide 10233 (numérotés à partir du site BamHI situé à l'extrémité 5' du gène ermE) et correspondant respectivement aux gènes eryBII, eryCIII et eryCII selon Liu et Thorson (1994) dont les caractérisations fonctionnelles n'avaient pas encore été identifiées. Les trois ORFs 7, 8 et 9 ont la même orientation, la lecture se faisant à partir de la région 3' du gène eryAIII.
Des échantillons de E. coli XLl-blue contenant la région codante des ORFs ci-dessus ont été déposés à la CNCM le 16 juillet 1997 - le plasmide pK62 comprenant la séquence codante pour l'oRF7, l'oRF8 et une partie de l'ORF9 sous le numéro I-1897, - le plasmide pEco2 comprenant la séquence codante pour l'oRF9 et une partie de l'ORF8 sous le numéro I-1899.
EXEMPLE 2 : construction du plasmide pBIIA.
Un plasmide d'intégration, dénommé pBIIA et portant une délétion dans le gène eryBII codant pour l'ORF7, a été construit selon le schéma de la figure 6A.
Le fragment BclI-BamHI de 598 pb a été délecté dans le plasmide pK62 obtenu à l'exemple 1 par digestion avec les enzymes BclI et BamHI. Le plasmide pBCK1 résultant a été ensuite digéré avec les enzymes de restriction MluI et BglII de façon à déléter un fragment ayant 853 pb à l'intérieur de l'ORF7 du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 de la séquence de la figure 2. Après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow de 1'ADN polymérase I, le plasmide contenant la délétion , a été religaturé et transformé dans
E. coli XL1-blue. A partir du plasmide pl9BIIA ainsi généré, le fragment KpnI-HindIII (4,3 kb) qui porte la délétion a été sous-cloné dans le plasmide pUWL218 (figure 6B). La présence de la délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 dans le plasmide pBIIA ainsi généré (figure 6C) a été confirmée par séquençage.
Le plasmide pBIIA a ensuite été transféré dans la souche
E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac.
erythraea.
EXEMPLE 3 : construction d'une souche Sac. erythraea ery BIIA (BII92).
La construction d'une souche Sac. erythraea dans laquelle le gène eryBII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBIIA préparé à l'exemple 2 et le processus d'intégration ont été réalisés de la façon suivante
La préparation des protoplastes a été réalisée selon la méthode décrite par Weber et Losick (1988), en utilisant du
PEG 3350 (Sigma) au lieu de PEG 1000 et un tampon P modifié (dénommé PT) contenant MgCl2,6H2O 28 mM et sans PO4H2K au lieu des tampons P, L ou T décrits, selon les conditions opératoires suivantes
Les cellules (au moins 108 spores) de Sac. erythraea ired variant" (dont un échantillon a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro I-1902) ont été mises à pousser dans 50 ml de milieu TBS pendant 3 à 5 jours à 300C, puis lavées dans du sucrose à 10,3 t. Les cellules ont été remises en suspension dans 50 ml de tampon PT contenant 2 à 5 mg/ml de lysozyme (Sigma), puis incubées à 300C pendant 1 à 2 heures en désagrégeant les amas de mycélium toutes les 15 minutes jusqu'à conversion d'au moins 50 % du mycélium en protoplastes. Les protoplastes ont été lavés avec 50 ml de tampon PT, remis en suspension dans 12,5 à 25 ml du même tampon, congelés lentement puis stockés à -80 C par aliquots de 200 pl.
Pour la transformation, un aliquot a été decongelé et 50 jil ont été prélevés puis transférés dans un tube de 15 ml.
Un à 10 pg d'ADN plasmidique pBIIA, préparé à l'exemple 2 à partir de la souche E. coli DH5aMRC ont été mis en solution dans 5 à 10 ssl de tampon TE (Tris HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) puis déposés sur la paroi du tube incliné auquel a été ensuite ajouté 0,5 ml d'une solution de PEG 3350 dans le tampon PT préparée extemporanément à partir d'une solution aqueuse à 50 % que l'on dilue au demi dans le tampon 2 x PT.
Après dilution avec 3 à 5 ml de tampon PT puis centrifugation à 2500 rpm pendant 15 mn, le culot a été dissocié dans 0,5 ml de tampon PT et la suspension de protoplastes transformés ainsi obtenue a été immédiatement répartie sur 2 ou 3 boîtes
R2T2 très sèches (3 h sous une hotte à flux laminaire). Les boîtes ont été ensuite incubées à 320C pendant 16 à 24 h jusqu'à apparition du voile de régénération des protoplastes.
A partir d'une solution stock de thiostrepton (Sigma) à 50 mg/ml dans le DMSO, une quantité appropriée a été diluée dans 0,5 à 1 ml d'eau puis étalée sur les boîtes de façon à obtenir une concentration finale de 20 Zg de thiostrepton/ml de gélose. Après absorption complète de l'antibiotique, les boîtes ont été incubées à 320C pendant 3 à 4 jours, ce qui permet la visualisation des transformants. Les boîtes ont encore été incubées plusieurs jours jusqu'à développement complet des spores.
La sélection des intégrants correspondant au premier événement de recombinaison (figure 4) a été réalisée par réplication des boites sporulées à l'aide de velours ou par étalement d'une suspension des spores sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton puis incubation à 320C, ce qui permet la croissance des clones d'intégrants potentiels.
Pour la sélection de clones ayant subi un deuxième événement de recombinaison (figure 4), 5 à 10 clones résistants au thiostrepton obtenus ci-dessus ont été mis en culture dans 8 ml de milieu liquide TSB à 300C pendant 3 à 4 jours. 50 à 100 41 ont été prélevés et remis en culture dans les mêmes conditions. Après 4 cycles successifs de dilution et culture destinés à favoriser la perte du marqueur de résistance au thiostrepton, des protoplastes ont été préparées à partir des cellules comme indiqué ci-dessus, de façon à chasser le plasmide. Les protoplastes ont ensuite été étalés sur des boîtes R2T2 de façon à obtenir des colonies individualisées dont la sensibilité au thiostrepton a été déterminée par réplique sur des boites R2T2 contenant du thiostrepton.
Selon la position du deuxième événement de recombinaison par rapport au site de délétion (figure 4), on peut attendre que le phénotype des colonies sensibles au thiostrepton soit du type sauvage ou du type muté porteur de la délétion.
Parmi les colonies sensibles au thiostrepton, la sélection des mutants ayant le phénotype ery a été réalisée par antibiogramme sur la souche B. pumilus ATCC 14884 sensible à l'érythromycine. La souche B. pumilus a été utilisée comme souche indicatrice pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme. Les colonies ont été étalées à l'anse de platine sur des boîtes R2T2, puis incubées pendant 3 à 4 jours à 300C. Des zones d'agar où le mutant a poussé à confluence ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes A-Merck recouvertes d'une surcouche de 4 ml de 0,5 x A
Merck (Antibiotic agar N"1 Merck) inoculée d'une suspension de spores de B. pumilus, puis incubées une nuit à 37"C.
La présence de la délétion attendue dans le chromosome du mutant (délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléo tide 8863) a ensuite été confirmée par analyse génomique par
Southern blot ainsi que par PCR de la façon suivante
Pour l'analyse par Southern blot, le transfert d'ADN génomique, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction appropriée, sur des membranes GeenscreenPlus (Dupont NEN) a été réalisé dans NaOH 0,4 M selon Ausubel et al. (1995). Les hybridations ont été effectuées en utilisant comme sonde l'oligonucléotide marqué à son extrémité 5' en utilisant du [Y32P]ATP (Amersham) et la polynucléotide kinase (Boehringer
Mannheim) selon Sambroock et al. (1989), ayant la séquence suivante
B2-S 5' TTGGCGAAGTCGACCAGGTC 3' correspondant à la région d'ADN du début du gène eryG située de la position 4118 à la position 4137 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X60379 et décrite par
Haydock et al. (1991). Les hybridations ont été effectuées avec un tampon d'hybridation rapide (Amersham) et les conditions de lavage suivantes : 2 x 5 mn, 2 x SSC, 200C 30 mn, 2 x SSC, 650C ; 30 mn, 0,1 x SSC, 200C.
Par hybridation Southern sur l'ADN génomique isolé selon
Hopwood et al. (1985) puis digéré par l'enzyme de restriction
KpnI, une bande de 5,8 kb à partir de la souche sauvage "red variant" et une bande de 4,9 kb à partir du mutant BII92 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 900 pb dans cette région du chromosome.
Pour l'analyse par PCR ,un échantillon de 100 41 d'une culture de 3 jours en milieu TSB a été centrifugé. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 10 41 de milieu TSB, puis utilisé pour l'amplification dans l'appareil genAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer Cetus). Après chauffage de l'échantillon pendant 3 mn à 94dC, les conditions d'amplification suivantes ont été utilisées : 940C, 1 mn 550C, 1 mn ; 720C, 3 mn ; 30 cycles ; polymérase Ampli Taq (Perkin Elmer) en présence de diméthylsufoxyde 10 % (v/v) suivis d'une élongation de 3 mn à 72"C . L'amplification a été effectuée en utilisant 1'oligonucléotide B2S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
B2-R 5' GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA 3' correspondant à la séquence du brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 8873 à la position 8892 de la séquence de la figure 2 à laquelle ont été ajoutés trois nucléotides à l'extrémité 5' et permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF7.
L'analyse par amplification par PCR sur des cellules entières a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande de 0,16 kb dans le mutant BII92 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBIIA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBIIA (853 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BII92, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 4 : fermentation de la souche BII92 et identification des métabolites secondaires produits.
Des extraits de bouillon de culture de la souche ont été analysés par chromatographie en couche mince (ccm) avec l'érythromycine A, l'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B comme standards.
La souche BII92 a été cultivée en erlen de 50 ml dans les conditions permettant une production optimale d'érythromycine A et de ses dérivés qui consistent à effectuer une préculture cellulaire à 28"C pendant 48 heures dans le milieu EP1 (Solulys L-Corn steep liquor (Roquette frères) 5 g/l ; farine de soja déshuilée (Cargill) 10 g/l ;
CO3Ca 2 g/l ; CîNa 5 g/l ; pH = 6,8 ; glucose qsp 15 g/l ajouté après autoclavage), puis une culture pendant 72 heures après dilution à 7 % v/v avec le milieu EP2 (farine de soja déshuilée 10 g/l ; CO3Ca 0,2 g/l ; Cl2Co-6H20 1 mg/l ; pH = 6,8-7; glucose qsp 20 g/l ajouté après autoclavage).
Le surnageant de culture a été ensuite extrait à pH 9-10 avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques ont été séchées sur S04Mg, amenées à sec sous pression réduite puis analysées par ccm sur gel de silice 60 F254 (Merck) [dichlorométhane/méthanol (90:10, v/v) ou éther isopropylique/méthanol/NH40H à 25 % (75:35:2, v/v)]. De façon alternative, l'analyse a été réalisée par ccm sur des plaques de gel de silice greffées de type NH2 F254 (Merk) [chlorure de butyle/méthanol (90:10, v/v)].
La révélation chimique des plaques a été effectuée par pulvérisation d'une solution de p-anisaldéhyde-acide sulfurique 98 %-éthanol (1:1:9, v/v), suivie de chauffage pendant quelques minutes à 800C. Les activités antibiotiques potentielles ont été analysées par bioautographie directe des plaques de ccm sur agar ensemencé de B. pumilus ATCC 14884.
Les résultats obtenus par révélation chimique (figure 17) montrent que la souche BII92 accumule préférentiellement l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB.
Des métabolites mineurs de faible mobilité manifestant une activité antibiotique ont également été détectés. Ces métabolites ont été extraits à l'acétate d'éthyle et identifiés par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) couplée à la spectrométrie de masse.
La RP-HPLC a été effectuée sur colonne (250 x 4,6mm) de
Kromasil C18 54 en utilisant comme phase mobile le mélange acétonitrile/méthanol/acétate d'ammonium 0,065 M pH 6,7 (350:150:500, v/v) sur un chromatographe Waters équipé d'un spectromètre de masse Finningan TSQ 7000.
A côté de traces d'érythromycine A, B, C et D, 4 métabolites mineurs dénommés M1 à M4 ont été détectés - M1 donne un pic apparent à m/z 704 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. La présence de désaminylérythronolide A (m/z 576) indique que la différence de m/z de 30 comparée à 1'érythromycine A (m/z 734) ou de 16 comparée à l'érythromycine C (m/z 720) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M1 est la 3"-C désméthyl 2", 3"-ène-érythromycine C.
- M2 donne un pic apparent à m/z 706 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. La présence de désaminylérythronolide A (m/z 576) indique que la différence de m/z de 28 comparée à l'érythromycine A (m/z 734) ou de 14 comparée à l'érythromycine C (m/z 720) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M2 est la 3"-C désméthylérythromycine C.
- M3 donne un pic apparent à m/z 690 et des produits de fragmentation à m/z 560 et m/z 158. La présence de désaminylérythronolide B (m/z 560) indique que la différence de m/z de 28 comparée à l'érythromycine B (m/z 718) ou de 14 comparée à l'érythromycine D (m/z 704) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M3 est la 3" -C désméthylérythromycine D.
- M4 donne un pic apparent à m/z 720 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. Le profil est identique à celui de l'érythromycine C (m/z 720) avec la présence de désosaminylérythronolide A (m/z 576) et la perte du résidu sucre (m/z 158), mais le métabolite M4 n'a pas le même temps de rétention en RP-HPLC que l'érythromycine. La structure proposée pour M4 est la 3" -C désméthyl-érythromycine A.
La détection par SM-SM du métabolite mineur M1 ayant un sucre neutre insaturé (3"-C désméthyl-2",3"-ène-érythromycine
C) indique que le gène eryBII code pour la dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase dans la voie de biosynthèse du dTDP-mycarose.
La souche BII92 a été déposée à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro I-1903.
EXEMPLE 5 : construction du plasmide pCIIIA.
L'ORF8 étant traductionnellement couplée à l'ORF7 située en aval, une délétion en phase a été introduite de façon à éviter un effet polaire. Un plasmide d'intégration, dénommé pCIIIA porteur d'une telle délétion, a été construit selon le schéma de la figure 7(A-D).
Une délétion SalI de 663 pb a été introduite dans l'oRF8 du nucléotide 9384 au nucléotide 10046 de la séquence de la figure 2 en sous-clonant dans le plasmide pUCl9 les deux fragments SalI (a : 794 pb et b : 631 pb montrés à la figure 5A ) isolés à partir du plasmide pBK44 obtenu à l'exemple 1 pour générer le plasmide pdel88 (figure 7A). La présence de la délétion de 663 pb a été confirmée par séquençage. Le plasmide pdel88 a été ensuite soumis à deux sous-clonages additionnels de façon à élargir les régions chromosomiques utilisables pour la recombinaison homologue des deux cotés du site de délétion. Le fragment SacI (450 pb) du plasmide pdel88 a d'abord été remplacé par le fragment SacI (1,1 kb) du plasmide pEco2 obtenu à l'exemple 1 pour générer le plasmide pdel88A (figure 7B). Puis le fragment EcoRI (1,5 kb) portant la délétion dans l'ORF8 a été isolé du plasmide pdel88A et utilisé pour remplacer le fragment EcoRI (1,66 kb) porteur de l'ORF intacte dans le plasmide pOBB. Le plasmide pOBB, représenté à la figure 7C, correspond au plasmide pBK44 préparé à l'exemple 1 dans le site PstI duquel a été souscloné le fragment PstI de 4 kb du plasmide pIJ486 obtenu par digestion par l'enzyme de restriction PstI et porteur de l'origine de réplication streptomyces ainsi que du gène de résistance au thiostrepton. Le plasmide résultant pCIIIA porte des régions chromosomiques pour la recombinaison homologue de 1,27 kb et 1,38 kb respectivement en amont et en aval du site de délétion. Le plasmide pCIIIA ainsi obtenu (figure 7D) a ensuite été transféré dans la souche E. coli
DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 6 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCIII (CIII68).
Une souche dans laquelle le gène eryCIII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCIIIA obtenu à l'exemple 5 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCIIIt. correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 10196 à la position 10219 de la séquence de la figure 2, une bande de 2,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 1,5 kb à partir du mutant CI1168 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 700 pb dans cette région du chromosome.
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide C3-S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C3-R 5' TCATCGTGGTTCTCTCCTTCC 3' correspondant à la séquence située de la position 8954 à la position 8974 de la séquence de la figure 2 permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF8. L'analyse par amplification par
PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,2 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 0,6 kb dans le mutant CIII68 de façon identique au signal obtenu avec pCIIIA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 700 pb détectée par l'analyse de Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIIIA (663 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CIII68, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 7 : fermentation de la souche CIII 68 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche CIII68 et les analyses par ccm suivie de bioautographie ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.
Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CII 68 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de petites quantités d'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.
La séquence eryCIII présente une forte homologie avec d'autres glycosyltransférases putatives telles que DauH (43 % d'identité au niveau protéique) et DnrS (47 % d'identité) impliquées dans la biosynthèse de la daunorubicine chez
S. peucetius (Otten et al., 1995) et chez Streptomyces sp C5 (Dickens et al., 1996) ainsi que TylM2 (50 % d'identité) impliquée dans le transfert du mycaminose sur la tylactone dans la voie de biosynthèse de la tylosine chez S. fradiae (Gandecha et al., 1997).
Ces observations indiquent que gène eryCIII code pour la désosaminyltransférase dans la voie de biosynthèse de ltérythromycine.
EXEMPLE 8 : construction du plasmide pCII
Un plasmide d'intégration, dénommé pCII et portant une délétion dans le gène eryBII codant pour l'ORF9, a été construit selon le schéma de la figure 8A.
Le plasmide pK23 (figure 5A) a été obtenu par sousclonage dans pUC19 du fragment KpnI de 10 kb isolé à partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction KpnI .
Dans un premier temps, le vecteur navette pORT1, montré à la figure 8B, a été obtenu par sous-clonage du fragment
PstI de 4kb isolé par digestion du plasmide pIJ486 avec l'enzyme de restriction PstI incluant le gène de résistance au thiostrepton et le réplicon Streptomyces, dans le site
PstI de pUC19.
Une délétion hors phase de 304 pb a été introduite dans l'oRF9 du nucléotide 10881 au nucléotide 11184 de la séquence de la figure 2 en sous-clonant le fragment SacI-KpnI (1,1 kb) du plasmide pK23 avec le fragment EcoRI-KpnI (1,7 kb) du plasmide pEco2 obtenu à l'exemple 1 dans le plasmide pORT1 ci-dessus préalablement digéré avec les enzymes de restriction SacI et EcoRI. Le plasmide d'intégration pCII ainsi obtenu (figure 8C) a été ensuite transféré dans la souche E.
coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 9 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCII (CII62).
Une souche dans laquelle le gène eryCII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCII obtenu à l'exemple 8 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCII.
La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery ont été réalisés comme à l'exemple 3.
De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 304 bp du nucléotide 10881 au nucléotide 11184 de la séquence de la figure 2) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.
Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide C3-S ayant la séquence ci-dessus, une bande de 2,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 1,8 kb à partir du mutant CII62 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 400 pb dans cette région du chromosome.
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C2-S 5' CGAATTCATGACCACGACCGATC 3' correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN de la fin du gène eryAIII située de la position 20258 à la position 20280 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X62569 et décrite par Bevitt et al., 1992 et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C2-R 5' CGCTCCAGGTGCAATGCCGGGTGCAGGC 3' correspondant à la séquence située de la position 10558 à la position 10585 de la séquence de la figure 2 permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF9. L'analyse par amplification par
PCR a permis de détecter une bande d'environ 760 pb dans la souche sauvage et une bande d'environ 460 pb dans le mutant CII 62 de façon identique au signal obtenu avec pCII. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 400 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pCII (304 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CII62, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 10 : fermentation de la souche CII 62 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche CII62 et les analyses par ccm suivie de bioautographie ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.
Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CI 162 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de petites quantités d'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.
La séquence eryCII présente une forte homologie avec des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse de la daunosamine (DnrQ, 38 % d'identité au niveau protéique, Otten et al., 1995) et du mycaminose (protéine codée par l'0RFl*, 40 % d'identité au niveau protéique, Gandecha et al., 1997) qui ont également besoin de transférer un groupement céto en position 3 à partir d'un carbone adjacent.
Ces observations indiquent que le gène eryCII code pour la dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase dans la voie de biosynthèse de la dTDP-désosamine.
EXEMPLE 11 : clonage et séquençage de la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.
Des cosmides contenant la région eryAI-eryK du cluster de gènes ery tel que le cosmide Cos6B, ont été isolés par screening d'une banque d'ADN génomique de Sac. erythraea dans le vecteur cosmidique pWE15 (Stratagene) en utilisant comme sonde un fragment d'ADN de 13,2 kb comprenant la totalité du gène eryAI et correspondant à la région d'ADN comprise entre le site NcoI situé à la position 44382 de la séquence de la figure 3 et le site NcoI situé à la position 392 de la séquence X62569 (Bevitt et al., 1992). La sonde a été préparée de la façon suivante : Dans un premier temps, le fragment NcoI de 13,2 kb a été isolé à partir du plasmide pBK25 décrit par Bevitt et al., 1992 et sous-cloné dans le site SmaI de pUC18 après remplissage des extrémités NcoI avec le fragment de Klenow. A partir du plasmide pNCOl2 ainsi généré, le fragment de 13,2 kb a été isolé par digestion avec l'enzyme de restriction NcoI.
Le cosmide cos6B ainsi obtenu a été digéré par l'enzyme de restriction NcoI et les fragments résultants de 2,8 kb et 6,1 kb ont été clonés dans le site NcoI du vecteur Litmus28 générant respectivement les plasmides pNCO28 et pNCO62 montrés à la figure 5B.
Le plasmide pNCO28 a été séquencé par génération de sous-clones en utilisant l'exonucléase III selon le protocole du fournisseur de la trousse Erase-a-Base Kit (Promega) en digérant par les enzymes de restriction respectivement
SacI/XbaI et NsiI/BamHI pour la direction inverse. La séquence a été complétée en utilisant comme amorces les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes 644 5' GATCACGCTCTTCGAGCGGCAG 3' 645 5' GAACTCGGTGGAGTCGATGTC 3' et 650 5' GTTGTCGATCAAGACCCGCAC 3'
Pour le séquençage du plasmide pNcO62, des matrices ont été générées par sonication de l'ADN selon Bankier et al.
(1987) en utilisant pUC18 comme vecteur. La séquence a été complétée en utilisant comme amorces les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes 646 5' CATCGTCAAGGAGTTCGACGGT 3' 647 5' TGCGCAGGTCCATGTTCACCACGTT 3' 648 5' GCTACGCCCTGGAGAGCCTG 3' 649 5' GTCGCGGTCGGAGAGCACGAC 3' et 874 5' GCCAGCTCGGCGACGTCCATC 3'.
Les jonctions NcoI ont été séquencées en utilisant comme matrice l'ADN du cosmide cos6B obtenu ci-dessus dont les régions recouvrant les sites NcoI ont été séquencées en utilisant les amorces ayant les séquences 644 et 645 indiquées ci-dessus.
De plus, un fragment ClaI-NcoI de 0,9 kb, contenant le début de la séquence du gène eryAI et la partie 5' de l'ORFî3, a été cloné dans pUC18. Ce fragment a été préparé de la façon suivante : Le plasmide pBK6-12 représenté à la figure 5B a d'abord été généré par sous-clonage dans le phagmide pTZ18R du fragment KpnI de 4,5 kb isolé à partir du plasmide pBK25 décrit par Bevitt et al., 1992. Le sous-clone pCN9 a ensuite été généré par sous-clonage du fragment ClaI
NcoI de 0,9 kb isolé à partir du plasmide pBK6-12 dans le site SmaI de pUC19, après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow. Le plasmide pCN9 ainsi obtenu (figure 5B) a été séquencé. Des matrices ont été générées par sonication de l'ADN selon Bankier et al. (1987) en utilisant pUC18 comme vecteur. La séquence a été complétée en utilisant comme amorce l'oligonucléotide ayant la séquence suivante 875 5' CGACGAGGTCGTGCATCAG 3'.
Le séquençage de l'ADN est réalisé par la méthode de
Sanger (1977) en utilisant un séquenceur automatisé sur les matrices d'ADN double brin avec le séquenceur Applied
Biosystem 373 A. L'assemblage des données de séquence a été réalisé avec le logiciel SAP (Staden, 1984). Les séquences ont été analysées en utilisant le logiciel GCG (Devereux, 1984).
Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir une séquence nucléotidique de 8159 bp (figure 3) dans laquelle sept ORFs (13-19) ont été identifiées respectivement du nucléotide 43841 au nucléotide 44806, du nucléotide 44809 au nucléotide 46053, du nucléotide 46109 au nucléotide 46819, du nucléotide 46907 au nucléotide 48436, du nucléotide 48436 au nucléotide 49638, du nucléotide 49679 au nucléotide 51145 et du nucléotide 51177 au nucléotide 51755 (numérotés à partir du site BamHI situé à l'extrémité 5' du gène ermE) et correspondant respectivement aux gènes eryBIV, eryBv, erycvl, eryBVI, eryCIV, eryCV et eryBVII, selon Liu et Thorson (1994) dont les caractérisations fonctionnelles n'avaient pas encore été identifiées. Les sept ORFs (13-19) sont dans la même direction, la lecture se faisant à partir de la région 5' du gène eryAI.
Des échantillons de E. coli XL1-blue contenant la région codante des ORFs ci-dessus ont été déposés à la CNCM le 16 juillet 1997 - le plasmide pBK6-12 comprenant la séquence codante pour l'ORF13 et pour une partie de 1'ORF14 sous le numéro I-1898 - le plasmide pNCO28 comprenant la séquence codante pour les
ORFs 14 et 15 ainsi que pour une partie des ORFs 13 et 16 sous le numéro I-1901 et - le plasmide pNCO62 comprenant la séquence codante pour les
ORFs 17, 18 et 19 ainsi que pour une partie de l'ORFl6 sous le numéro I-1900.
EXEMPLE 12 : construction du plasmide psIV.
L'ORF13 étant translationnellement couplé à l'ORF14 située en aval, une délétion en phase a dû être introduite.
Un plasmide d'intégration, dénommé pBIV et portant cette délétion, a été construit selon le schéma de la figure 9A.
Le plasmide pPSP4 (figure 5B) a d'abord été construit par sous-clonage du fragment PvuII-SpeI (2,7 kb) isolé à partir du plasmide pBK6-12 obtenu à l'exemple 11 et du fragment SpeI-PstI (1,6 kb) isolé à partir du plasmide pNC028 obtenu à l'exemple 11 dans le vecteur pUCl9 préalablement digéré à l'aide des enzymes de restriction SmaI et PstI.
A partir du plasmide pPSP4, le plasmide pl9BIVA a été généré en délétant le fragment BclI-NcoI de 510 pb interne à l'ORF13 et en lui substituant 45 pb venant d'un adaptateur synthétique de 54 pb. Cet adaptateur a été généré par appariement des 2 oligonucléotides complémentaires ayant les séquences suivantes
SEQ A 5' AATTGATCAAGGTGAACACGGTCATGCGCAGGATCCTCGAGCGGAACTCCATGGGG 3' et
SEQ B 5' CCCCATGGAGTTCCGCTCGAGGATCCTGCGCATGACCGTGTTCACCTTGATCAATT 3' créant un site BclI et un site NcoI encadrant la séquence de 45 pb.
Pour l'appariement, les deux oligonucléotides ont été mis à une concentration finale 1,8 pM dans le tampon d'hybridation NaCl 50 mM, Tris, Hcl 20 mM pH 7,4, MgC12,6H20 2 mM, chauffés pendant 5 mn à 100"C puis refroidis lentement à température ambiante. Après digestion avec les enzymes de restriction NcoI et BclI, une ligature a été effectuée dans le plasmide pPSP4 dont le fragment BclI-NcoI de 510 pb avait préalablement été éliminé. A partir du plasmide pl9BIVA ainsi généré, le fragment SacI-EcoRI (2,2 kb) portant l'ORF13 modifiée a été sous-cloné dans le plasmide pUWL218 préalablement digéré avec les enzymes de restriction SacI et EcoRI. Le plasmide d'intégration pBIV ainsi obtenu (figure 9B) a été ensuite transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 13 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBIV (BIV87).
Une souche dans laquelle le gène eryBIV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBIV obtenu à l'exemple 12 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pBIVA.
* La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery ont été réalisés comme à l'exemple 3.
De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 510 bp du nucléotide 43872 au nucléotide 44382 de la séquence de la figure 3) et son remplacement par la séquence synthétique de 45 pb a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.
Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction XhoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide B4-R ayant la séquence suivante
B4-R 5' AACTCGGTGGAGTCGATGTCGTCGCTGCGGAA 3' correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 44687 à la position 44718 de la séquence de la figure 3, une bande de 5,4 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 2,7 kb à partir du mutant BIV87 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence d'un site XhoI supplémentaire à une distance de 2,7 kb en amont du site XhoI situé à la position 47114 de la séquence de la figure 3 confirmant ainsi l'incorporation de l'adaptateur dans le chromosome de mutant, telle qu'attendue par l'incorporation de l'adaptateur synthétique ci-dessus utilisé pour générer le plasmide pBIV.
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
B4-S 5' CAATATAGGAAGGATCAAGAGGTTGAC 3' correspondant à la région d'ADN située de la position 43652 à la position 43678 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide B4-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à 1'ORF13. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 500 pb dans le mutant
BIV87 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBIV87 (figure 16).
L'ensemble des résultats d'analyse par Southern et par
PCR confirme la présence de la délétion de 510 pb et de l'adaptateur synthétique au niveau du chromosome du mutant.
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BIV87, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 14 : fermentation de la souche BIV87 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche BIV87 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.
Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche BIV87 accumule préférentiellement de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB.
Des métabolites mineurs de faibles mobilités manifestant une activité antibiotique ont également été détectés. Ces métabolites ont été extraits et analysés par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse comme décrit à l'exemple 4.
Les résultats de spectre de masse indiquent que des formes modifiées de l'érythromycine A, B, C et D ont été produites. Un métabolite majeur et 3 métabolites mineurs ont été détectés.
Le métabolite majeur M5 donne un pic apparent à m/z 702 avec des produits de déshydratation et de fragmentation à m/z 684, m/z 560 et m/z 158 et correspond à l'élimination de 2 atomes d'hydrogène dans l'érythromycine D (m/z 704, m/z 686).
La présence de désosaminyl érythronolide B (fragment m/z à 560) indique que la différence de masse est portée par le sucre neutre. La structure proposée pour ce métabolite est la 4"-céto érythromycine D.
Les métabolites mineurs donnent aussi un profil avec une différence de 2 dans les valeurs m/z respectivement - M6 (m/z à 718, m/z 700, m/z 576, m/z 158) au lieu de m/z 720, m/z 702 pour 1'érythromycine C - M7 (m/z à 732, m/z 714, m/z 576, m/z 158) au lieu de m/z 734, m/z 716 pour l'érythromycine A ; - M8 (m/z à 716, m/z 698, m/z 560, m/z 158) au lieu de m/z 718, m/z 700 pour l'érythromycine B.
Les structures proposées sont respectivement la 4"-céto érythromycine C pour M6, la 4"-céto érythromycine A pour M7 et la 4"-céto érythromycine B pour M8.
Ces observations indiquent que le gène eryBIV code pour la dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase dans la voie de biosynthèse du dTDP-mycarose.
La souche BIV87 a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro I-1904
EXEMPLE 15 : construction du plasmide pBV.
Un plasmide d'intégration, dénommé pBVA et portant une délétion dans le gène eryBV codant pour l'ORFî4, a été construit selon le schéma de la figure 10A.
Une délétion de 726 pb a été générée dans l'ORFl4 du nucléotide 44963 au nucléotide 45688 de la séquence de la figure 3 par ligature du fragment BclI-KpnI (1,1 kb) isolé à partir du plasmide pBK6-12, obtenu à l'exemple 11, au fragment KpnI-BamHI (1,1 kb) isolé à partir du plasmide pNCO28, obtenu à l'exemple 11, dans le plasmide pUWL218 préalablement digéré par l'enzyme de restriction BamHI. Le plasmide d'intégration pBVA ainsi obtenu (figure 10B) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 16 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBV (BV88).
Une souche dans laquelle le gène eryBV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBVA obtenu à l'exemple 15 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pBV.
La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery ont été réalisés comme à l'exemple 3.
De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 726 pb du nucléotide 44963 au nucléotide 45688 de la séquence de la figure 3) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.
Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B5-R 5' TCCGGAGGTGTGCTGTCGGACGGACTTGTCGGTCGGAAA 3' correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 46060 à la position 46098 de la séquence de la figure 3, une bande de 2,7 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 2,0 kb à partir du mutant BV88 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 700 pb dans cette région du chromosome.
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B5-S 5' AGGAGCACTAGTGCGGGTACTGCTGACGTCCTT 3' correspondant à la région d'ADN située de la position 44799 à la position 44831 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide B5-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORFl4. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,3 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 570 pb dans le mutant BV88 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBV88 (figure 16). Ces résultats confirment que la délétion de 710 pb détectée par analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBVA (726 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BV88, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 17 : fermentation de la souche BV88 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche BV88 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.
Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche
BV88 accumule préférentiellement de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB.
Des métabolites mineurs de faibles mobilités ont également été détectés puis extraits et identifiés par RP
HPLC couplée à la spectrométrie de masse selon les conditions utilisées à l'exemple 4.
Le spectre de masse montre la présence d'un métabolite ayant un pic apparent à m/z 560 et des produits de déshydratation et de fragmentation à m/z 542 et m/z 158 pour lequel la structure proposée est le désosaminyl érythronolide B.
La séquence eryBV présente une forte homologie avec d'autres glycosyltransférases ainsi qu'avec le gène eryCIII ci-dessus (60,7 % d'identité au niveau nucléotidique, 44 % au niveau protéique).
Ces observations indiquent que le gène eryBV code pour la mycarosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de l'érythomycine.
EXEMPLE 18 : construction d'un plasmide pCVIA (pPSTI).
Un plasmide d'intégration, dénommé pPSTI et portant une délétion dans le gène eryCVI codant pour l'ORF15, a été construit selon le schéma de la figure llA de la façon suivante
Dans un premier temps, le plasmide pNB49 a été généré par traitement à l'exonucléase III du plasmide pNCO28 obtenu à l'exemple 11 préalablement digéré par les enzymes de restriction NsiI et BamHI. Le plasmide pNB49 (figure 5B) contenant les nucléotides 44382 à 46562 de la séquence de la figure 3, a été ensuite digéré à l'aide de l'enzyme de restriction PstI puis traité par la nucléase Mung Bean (NE
Biolabs) comme décrit par Sambrook et al. (1989). Après religature et transformation dans E. coli XL1-Blue, les colonies résistantes à l'ampicilline ont été sélectionnées par analyse de restriction avec l'enzyme PstI. La perte du site PstI a été confirmée par séquençage d'un clone en utilisant l'amorce M13 inverse et la délétion du nucléotide 46364 de la séquence de la figure 3 a été observée créant un changement de phase dans 1'ORF15 dans le plasmide pNB49APst ainsi généré. Le plasmide pIJ702 digéré avec l'enzyme de restriction BglII a été ensuite ligaturé au site BglII du plasmide pNB49APst générant le plasmide pPSTI. L'orientation de pIJ702 dans pPSTI a été confirmée par la présence d'un fragment d'ADN ayant 0,9 kb après digestion avec l'enzyme de restriction SphI. Le plasmide d'intégration pPSTI (figure llB) ainsi obtenu a été transféré dans la souche E. coli
DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 19 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCVI (PstlO).
Une souche dans laquelle le gène eryCVI porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pPSTI obtenu à l'exemple 18 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pPSTI.
La préparation des protoplastes et le processus d'intégration ont été réalisés comme à l'exemple 3.
La sélection des mutants ayant le phénotype ery a été réalisée comme à l'exemple 3 en utilisant une souche
B. subtilis sensible à l'érythromycine au lieu d'une souche
B. pumilus comme souche indicatrice. La souche B. subtilis
ATCC 6633 a été utilisée pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques sur des boites d'agar en milieu M1-102 inoculées avec le mutant à analyser et incubées pendant 3 jours à 300C. Des zones d'agar recouvertes de bactéries ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes 2 x TY recouvertes d'une surcouche de 5 ml d'agar en milieu TY contenant 200 1 d'une culture de B. subtilis ATCC 6633, puis incubées une nuit à 370C.
L'absence de production d'érythromycine a été évaluée également en présence de précurseurs ajoutés tels que l'érythronolide B ou le 3-a-mycarosyl érythronolide B par application de 10 Zl d'une solution 10 mM de chaque métabolite sur les zones d'agar découpées suivie d'une incubation à 300C pendant une nuit avant de recouvrir les boites de la culture de B. subtilis comme indiqué ci-dessus. La souche
Sac. erythraea sauvage "red variant" a été utilisée comme contrôle.
Après la transformation des protoplastes avec le plasmide pPSTI et la sélection des colonies résistantes au thiostrepton, l'intégration dans le chromosome a été confirmée par analyse de Southern selon les méthodes générales décrites à l'exemple 3.
Un fragment d'ADN de 1269 pb correspondant à l'oRFl4 généré par PCR en utilisant les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes 14-1 5' GGGGGATCCCATATGCGGGTACTGCTGACGTCCTTCG 3' et 14-2 5' GAAAAGATCTGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTC 3' a été utilisé comme sonde.
L'oligonucléotide 14-1 a été dessiné de façon à introduire un site BamHI et un site NdeI en amont de la séquence correspondant à la région d'ADN située de la position 44811 à la position 44833 de la séquence de la figure 3.
L'oligonucléotide 14-2 a été dessiné de façon à introduire un site BglII en aval de la séquence correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 46027 à la position 46053 de la séquence de la figure 3.
L'ADN chromosomique préalablement digéré avec les enzymes de restriction ClaI et PstI a montré les bandes attendues de 4 kb et 7 kb à partir de l'intégrant alors que la souche sauvage présentait la bande de 3 kb attendue.
Après cultures répétées des intégrants, les colonies individualisées obtenues ont été analysées pour la sensibilité au thiostrepton et la production d'érythromycine, puis l'intégration de la délétion attendue (délétion du nucléotide 46364 de la séquence de la figure 3) dans le chromosome d'un clone mutant ayant le phénotype ery (PstlO) a été confirmée par analyse de Southern. L'ADN chromosomique, isolé respectivement à partir de la souche sauvage et du mutant PstlO, a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI. L'hybridation avec la sonde PstI-NcoI de 0,8kb (nucléotides 46368 à 47142 de la séquence de la figure 3) a donné le profil attendu avec une bande PstI de lkb correspondant aux nucléotides 46368 à 47397 à partir de la souche sauvage et avec une bande > 20 kb à partir du mutant. La perte du site PstI à la position 46368 a aussi été montrée après double digestion par les enzymes
PstI et NcoI, résultant en une bande PstI-NcoI de 0,8 kb (nucléotide 46368 à 47142) à partir de la souche sauvage et une bande NcoI de 2,8 kb (nucléotide 44382 à 47142) avec le mutant.
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée PstlO, a ensuite été cultivée pour identifier les métabolites produits.
EXEMPLE 20 : fermentation de la souche PstlO et identification des métabolites secondaires produits.
La souche PstlO a été cultivée dans le milieu sucrosesuccinate décrit par Caf frey et al. (1992) pendant 3 jours à 300C. Le surnageant de culture a été ensuite extrait à pH 9 avec de l'acétate d'éthyle.Les phases organiques obtenues ont été séchées sur 504Mg2 puis amenées à sec sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans le mélange acétonitrile-eau (1:1, v/v), puis a ensuite été analysé par spectrométrie de masse sur un spectromètre BioQ (Micromass,
Manchester, UK) ou Finningan LCQ (Finningag, cA).
La production d'érythomycine A (m/z 734 et m/z 716) n'a pas été observée mais la présence d'érythronolide B (MK : m/z 441 et MNa+ : m/z 425) ainsi que de 3-a-mycarosyl érythronolide B (MK+ : m/z 585 et MNa+ : m/z 569) mise en évidence caractérise la souche PstlO comme un mutant eryC.
La séquence eryCVI présente une forte homologie avec d'autres méthyltransférases telles que SnoX impliquée dans la biosynthèse de la nogalamycine chez S. nogalater (numéro d'accession EMBL S52403) (55,5 % d'identité au niveau protéique), tylM1 impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez S. fradiae (numéro d'accession EMBL X81885) (65 % d'identité au niveau protéique) et SrmX impliquée dans la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens (numéro d'accession EMBL S25204) (52,8 % d'identité au niveau protéique).
Ces observations indiquent que le gène eryCVI code pour la dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase impliquée dans la voie de biosynthèse de la dTDP-D-désosamine.
EXEMPLE 21 : construction d'un plasmide OBVIA (pXhoI).
Un plasmide d'intégration, dénommé pXhoI et portant une délétion dans le gène eryBVI codant pour l'ORFl6, a été construit selon le schéma de la figure 12A de la façon suivante
Le fragment NcoI-XhoI (3,1 kb) du plasmide pNcO62 obtenu à l'exemple 11 et contenant les nucléotides 47142 à 50254 de la séquence de la figure 3 a été sous-cloné dans les sites
NcoI et XhoI du plasmide Litmus 28. Le plasmide pNCO62X (figure 5B) ainsi généré a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI puis traité avec 1'ADN polymérase T4 (Boehringer Mannheim). Après religature et transformation dans E. coli XL1-Blue, la perte du site PstI au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par séquençage et une délétion de 60 pb du nucléotide 47337 au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3 ont été observés. Le plasmide pIJ702 digéré avec l'enzyme de restriction BglII a été ensuite ligaturé au site BglII de cette contruction. L'orientation de pIJ702 dans la construction a été confirmée par la présence d'un fragment d'ADN ayant 4,3 kb après digestion avec l'enzyme de restriction
XhoI. Le plasmide d'intégration pXhoI (figure 12B) ainsi obtenu a été utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 22 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBVI (Xho91).
Une souche dans laquelle le gène eryBVI porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pXhoI obtenu à l'exemple 21 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pXhoI.
La préparation des protoplastes et le processus d'intégration ont été réalisés comme à l'exemple 3.
La sélection et l'analyse des mutants ayant le phénotype ery a été réalisée selon les conditions décrites à l'exemple 19.
L'intégration dans le chromosome et la présence de la délétion attendue ont été confirmées par analyse de Southern selon les méthodes générales décrites à l'exemple 19.
Après la transformation des protoplastes avec le plasmide pXhoI et la sélection des colonies résistantes au thiostrepton, l'intégration dans le chromosome a été confirmée par analyse de Southern. En utilisant comme sonde le fragment PstI de 3,3 kb du plasmide pNCO62, 1'ADN chromosomique d'un intégrant préalablement digéré avec les enzymes de restriction PstI et BglII a montré les bandes 3 kb et 6 kb attendues.
Après cultures répétées des intégrants, les colonies individualisées obtenues ont été analysées pour la sensibilité au thiostrepton et la production d'erythromycine, puis l'intégration de la délétion attendue (délétion de 60 pb du nucléotide 47338 au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3) dans le chromosome d'un clone mutant ayant le phénotype ery (XhoI) a été confirmée par analyse de
Southern. L'ADN chromosomique, isolé respectivement à partir de la souche sauvage et du mutant XhoI, a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI. L'hybridation avec la sonde
PstI-NcoI de 0,8 kb (nucléotides 46368 à 47142 de la séquence de la figure 3) a donné le profil attendu avec une bande PstI de 1 kb correspondant aux nucléotides 46368 à 47397 à partir de la souche sauvage et avec une bande de 4 kb à partir du mutant indiquant que le site PstI à la position 47397 a été perdu.
La perte du site PstI à la position 47397 a aussi été confirmée par PCR. L'ADN chromosomique a été soumis à une amplification par PCR en utilisant les amorces correspondant respectivement à la séquence du nucléotide 47300 au nucléotide 57320 et à la séquence du nucléotide 47661 au nucléotide 47636 de la séquence d la figure 3. Un fragment attendu de 306 pb a été ainsi amplifié à partir de la souche sauvage générant après digestion avec l'enzyme de restriction PstI deux bandes d'environ 100 et 300 pb. A partir du mutant Xho91, un fragment de 300 pb a été amplifié, résultant de la délétion de 60 pb. Ce fragment a été ensuite isolé et a été trouvé résistant à la digestion par l'enzyme PstI.
La souche recombinante ainsi obtenue et désignée Xho91, a ensuite été cultivée pour identifier les métabolites produits.
EXEMPLE 23 : fermentation de la souche Xho91 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche Xho91 et l'analyse du surnageant de culture par spectrométrie de masse ont été réalisées selon les conditions décrites à l'exemple 20.
La production d'érythomycine A (m/z 734 et m/z 716) n'a pas été observée mais la présence d'une quantité majoritaire d'érythronolide B (MK+ : m/z 441 ; MNa+ : m/z 425 ; M-H2O
H+ : m/z 385) ainsi que la présence de désosaminyl érythronolide B (m/z 560) mises en évidence caractérisent la souche PstlO comme un mutant eryB.
Les résultats de spéctrométrie de masse ont été confirmés par spectrométrie de masse en haute résolution sur un spectromètre Brucker FT-ICR (Brucker, FRG).
La séquence eryBVI présente une forte homologie avec dnmT impliquée dans la biosynthèse de la daunorubicine chez
S. peucetius (numéro d'accession EMBL U77891) (43,9 % d'identité au niveau protéique).
Ces observations indiquent que le gène eryBVI code pour la dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase impliquée dans la biosynthèse du dTDP-mycarose, comme suggéré par
Scotti et Hutchinson, 1996.
EXEMPLE 24 : construction du plasmide pCIVA.
Un plasmide d'intégration, dénommé pCIV et portant une délétion dans le gène eryCIV codant pour l'ORFl7, a été construit selon le schéma de la figure 13A de la façon suivante
Le plasmide pNC062 obtenu à l'exemple 11 a été digéré à l'aide des enzymes de restriction BalI et BclI de façon à éliminer un fragment ayant 949 pb à l'intérieur de l'ORF17 du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3. Après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, le plasmide a été religaturé et transformé dans E. coli XL1-blue. A partir du plasmide pBCB17 ainsi généré, le fragment de 2,68 kb portant la délétion a été isolé par digestion à l'aide des enzymes
XbaI et SphI, puis sous-cloné dans les sites correspondant du plasmide pUWL218. La présence de la délétion de 949 pb du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par séquençage. Le plasmide d'intégration pCIV ainsi obtenu (figure 13B) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.
EXEMPLE 25 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCIV (CIV89).
Une souche, dans laquelle le gène eryCIV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCIV obtenu à l'exemple 24, a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide PRIVA.
La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery ont été réalisés comme à l'exemple 3.
De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 949 bp du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.
Par hybridation Southern sur 1'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C4-R 5' AGCGGCTTGATCGTGTTGGACCAGTAC 3' correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 49996 à la position 50022 de la séquence de la figure 3, une bande de 6,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 5,2 kb à partir du mutant
CIV89 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence dans le mutant d'une délétion d'environ 1 kb dans cette région du chromosome.
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C4-S 5' GGCCTATGTGGACTACGTGTTGAACGT 3' correspondant à la région d'ADN située de la position 48169 à la position 48195 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide C4-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'0RF17. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande de 1,8 kb dans la souche sauvage et une bande de 900 pb dans le mutant CIV89 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pCIV. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIVA (949 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CIV89, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 26 : fermentation de la souche CIV89 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche CIV89 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.
Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche
CIV89 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.
Des métabolites mineurs de faibles mobilités ont été également détectés, puis extraits et analysés par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse selon les conditions utilisées à l'exemple 4.
Un métabolite mineur donne un pic apparent à m/z 720 et des produits de déshydration et de fragmentation à m/z 702, m/z 576 et m/z 174. Le pic 174 peut correspondre à la 4-hydroxydésosamine et le pic 576 au 4'-hydroxydésosaminyl érythronolide B.
Ces résultats suggèrent que la différence de m/z de 16 comparée à l'érythromycine D (pic apparent m/z 704) est portée par le sucre aminé. La structure proposée pour ce métabolite est la 4'-hydroxy érythromycine D.
Ces observations indiquent que l'enzyme est impliquée dans le retrait du groupement hydroxyle dans la voie de biosynthèse de l'érythromycine et que le gène eryCIV code pour la dTDP-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase.
La souche CIV89 a été déposée à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro I-1905.
EXEMPLE 27 : construction du plasmide pCVA
Un plasmide d'intégration, dénommé pCVA et portant une délétion dans le gène eryCV codant pour l'oRFî8, a été construit selon le schéma de la figure 14A de la façon suivante
Le fragment BalI-BamHI (3,48 kb), obtenu à partir du plasmide pNCO62 préparé à l'exemple 11 par digestion avec les enzymes de restriction BalI et BamHI, a été sous-cloné dans les sites SmaI-BamHI du vecteur pUC19. Du plasmide résultant pBAB18 (figure 5B), le fragment interne ScaI (lkb) a été ensuite délété par digestion avec l'enzyme ScaI pour générer une délétion de 1044 pb du nucléotide 49998 au nucléotide 51041 de la séquence de la figure 3 dans l'ORFl8. Du plasmide pBABACV ainsi obtenu, le fragment portant la délétion a ensuite été réisolé à partir du polylinker de pUC19 par digestion avec les enzymes de restriction HindIII et EcoRI, puis sous-cloné dans le plasmide pUWL2l8. Le plasmide d'intégration pCVA ainsi obtenu (figure 14B) a été transféré dans la souche E. coli DHSaMRC, puis utilisé pour transformer
Sac. erythraea.
EXEMPLE 28 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCV (cl90) .
Une souche dans laquelle le gène eryCV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCVA obtenu à l'exemple 27 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCV.
La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery ont été réalisés comme à l'exemple 3.
De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 1044 pb du nucléotide 49998 au nucléotide 51041) a été confirmée par analyse génomique par
Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.
Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C5-R 5' AACGCCTCGTCCTGCAGCGGAGACACGAACA 3' correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 51229 à la position 51259 de la séquence de la figure 3, une bande de 6,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 5,1 kb à partir du mutant CV90 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 1,1 kb dans cette région du chromosome.
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante
C5-S 5' TTCGCTCCCCGATGAACACAACTCGTA 3' correspondant à la région d'ADN située de la position 49668 à la position 49694 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide C5-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'oRFl8. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,6 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 500 pb dans le mutant CV90 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pCV. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 1,1 kb détectée par l'analyse
Southern est identique à celle portée par le plasmide PCVA (1044 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CV90, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 29 : fermentation de la souche CV90 et identification des métabolites secondaires produits.
La culture de la souche CV90 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.
Les résultats de ccm (figure 17) montre que la souche
CV90 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.
La séquence des résidus 38-50 de la protéine codée par eryCv (VTGAGDGDADVQA) est proche de la séquence consensus de liaison au NAD+ décrit par Wierenga et al., 1985 et par
Scrutton et al., 1990.
Ces observations permettent de conclure que le gène eryCV code pour une réductase qui interviendrait comme une dTDP-4,6-désoxyhexose 3,4-réductase dans la voie de biosynthèse de la d-TDP-désosamine.
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Claims (30)

  1. REVENDICATIONS 1) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.
  2. 2) Séquence d'ADN selon la revendication 1 comprenant - la séquence eryBII correspondant à 1'ORF7 et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - la séquence eryCIII correspondant à 1'ORF8 et codant pour une désosaminyltransférase et - la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase.
  3. 3) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 choisie parmi la séquence eryBII correspondant à 1'ORF7, la séquence eryCIII correspondant à 1'ORF8 ou la séquence eryCII correspondant à l'oRF9 et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
  4. 4) Séquence d'ADN isolée eryCIII représentée à la figure 2 correspondant à 1'ORF8 et codant pour une désosaminyl transférase.
  5. 5) Polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN selon l'une des revendications 1 à 4.
  6. 6) Polypeptide selon la revendication 5 correspondant à une
    ORF choisie parmi 1'ORF7, 1'ORF8 ou l'ORF9 représentée à la figure 2 et les analogues de ce polypeptide.
  7. 7) Polypeptide selon la revendication 5 correspondant à 1'ORF8 représentée à la figure 2 et ayant une activité désosaminyl transférase.
  8. 8) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 correspondant à la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.
  9. 9) Séquence d'ADN selon la revendication 8 comprenant - la séquence eryBIV correspondant à l'ORFl3 et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - la séquence eryBV correspondant à l'oRFl4 et codant pour une mycarosyltransférase, - la séquence eryCVI correspondant à l'ORFl5 et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - la séquence eryBVI correspondant à l'ORFl6 et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose3,4-déshydratase, - la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 et codant pour une dTDP-D-4, 6-didésoxyhexose 3,4-réductase et - la séquence eryBVII correspondant à l'ORFl9 et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
  10. 10) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 choisie parmi la séquence eryBIV correspondant à l'ORFl3, la séquence eryBV correspondant à l'ORF14, la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15, la séquence eryBVI correspondant à l'ORFl6, la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17, la séquence eryCV correspondant à 1'ORF18 ou la séquence eryBVII correspondant à l'ORFl9 et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
  11. 11) Séquence d'ADN isolée eryBV représentée à la figure 3 correspondant à l'ORFl4 et codant pour une mycarosyltransférase.
  12. 12) Polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN selon l'une des revendications 8 à 11.
  13. 13) Polypeptide selon la revendication 12 correspondant à une
    ORF choisie parmi l'ORFl3, l'ORFl4, l'ORFl5, l'ORF16, l'ORF17, l'ORFl8 ou l'ORF19 représentée à la figure 3 et les analogues de ce peptide.
  14. 14) Polypeptide selon la revendication 12 correspondant à l'oRFl4 représentée à la figure 3 et ayant une activité mycarosyltransférase.
  15. 15) Utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII, eryCIII ou eryCII représentée à la figure 2, les séquences eryBIV, eryBV, erycVi, eryBVi, erycIV, eryCV ou eryBVII représentée à la figure 3, pour synthétiser des métabolites secondaires hybrides chez Sac.
    erythraea.
  16. 16) Utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII, eryCIII ou eryCII représentée à la figure 2, les séquences eryBIV, eryBV, eryCvi, eryBVI, eryCIV, eryCV ou eryBVII représentée à la figure 3 ou d'un fragment de cette séquence, comme sondes d'hybridation.
  17. 17) Procédé de préparation de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea dans lequel - on isole une séquence ADN contenant au moins une séquence eryB ou une séquence eryC du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine représentée à la figure 2 ou à la figure 3, - on crée une modification dans la dite séquence et on obtient une séquence altérée, - on intègre la séquence altérée dans le chromosome de la souche hôte et on obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant la formation du métabolite secondaire hybride et - on isole le métabolite secondaire hybride.
  18. 18) Procédé selon la revendication 17 dans lequel la séquence
    ADN code pour l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4 -céto-L-6 -désoxyhexose 4 -réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
  19. 19) Procédé selon la revendication 17 dans lequel l'altération de la séquence résulte dans l'inactivation d'au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
  20. 20) Procédé selon la revendication 19 dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase.
  21. 21) Procédé selon la revendication 19 dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase.
  22. 22) Procédé selon la revendication 19 dans lequel l'enzyme inactivée est une mycarosyltransférase.
  23. 23) Procédé selon la revendication 19 dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase.
  24. 24) Procédé selon la revendication 17 dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est un analogue de l'érythromycine choisi parmi la 4"-céto-érythromycine, la 4' -hydroxy-érythromycine ou la 3 "-C-désméthyl-2", 3 '1-ène- érythromycine.
  25. 25) Procédé selon la revendication 17 dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est le désosaminyl érythronolide B.
  26. 26) Souche de Sac. erythraea modifiée dans laquelle au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3 -N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase est inactivée et produisant au moins un métabolite secondaire hybride.
  27. 27) Souche de Sac. erythraea modifiée (BII92) dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase est inactivée et produisant la 3"-C-désméthyl-2",3"-ène-érythromycine C.
  28. 28) Souche de Sac. erythraea modifiée (BIV87) dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase est inactivée et produisant la 4 4-céto-érythromycine.
  29. 29) Souche de Sac. erythraea modifiée (CIV89) dans laquelle une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase est inactivée et produisant la 4'-hydroxyérythromycine D.
  30. 30) Souche de Sac. erythraea modifiée (BV88) dans laquelle une mycarosyltransférase est inactivée et produisant du désoaminyl érythronolide B.
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