FR2786200A1 - Genes de biosynthese et de transfert des 6-desoxy-hexoses chez saccharopolyspora erythraea et chez streptomyces antibioticus et leur utilisation - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet la séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 (SEQ ID Ndegre 1) correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et la séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 (SEQ ID Ndegre 6) correspondant à la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine., et a pour objet la séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 (séquence de SEQ ID Ndegre 15) correspondant à une région du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine (séquence de SEQ ID Ndegre 15).

Description

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Gènes de biosynthèse et de transfert des 6-desoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et chez Streptomyces antibioticus et leur utilisation.

La présente invention décrit des gènes impliqués dans la biosynthèse et le transfert des 6-désoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et leur utilisation dans la production d'analogues de l'érythromycine par manipulation génétique.

L'érythromycine A est un antibiotique macrolide cliniquement important produit par la bactérie gram-positive Sac. erythraea. Les gènes de la biosynthèse de l'érythromycine sont organisés en un cluster de gènes ery qui inclut aussi le gène d'auto-résistance à l'érythromycine ermE.

Le cluster ery contient les trois grands gènes eryAI, eryAII et eryAIII (locus eryA) codant pour trois polypeptides composant la polykétide synthétase (dénommée PKS) flanqués par deux régions comprenant les gènes impliqués dans les stades ultérieurs de conversion du noyau lactone (6-désoxyérythronolide B) en érythromycine A.

Pendant le processus de biosynthèse de l'érythromycine A représenté à la figure 1, la biosynthèse des 6-désoxyhexoses comprend l'ensemble des réactions enzymatiques conduisant du glucose-1-phosphate au sucre activé final dTDP-L-mycarose ou dTDP-D-désosamine. Le dTDP-L-mycarose ou la dTDP-D-désosamine ainsi produits sont ensuite utilisés comme substrats pour le transfert des deux désoxyhexoses sur le noyau lactone. La formation de l'érythromycine requiert l'attachement du mycarose via l'hydroxyle en position C-3 du noyau lactone et l'attachement de la désosamine via l'hydroxyle en position C-5. L'ensemble des gènes eryB impliqués dans la biosynthèse ou le transfert du mycarose et l'ensemble des gènes eryC impliqués dans la biosynthèse ou le transfert de la désosamine n'ont pas encore été clairement identifiés.

Le cluster ery d'une longueur de 56 kb comprend 21 phases ouvertes de lecture ou "open reading frames" (ORFs) dont la numérotation a été établie par Haydock et al. (1991) et Donadio et al. (1993). Le locus eryA comprend les ORFs 10,

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11 et 12.

Des travaux précoces d'interruption ou de remplacement de gène dans la partie gauche du cluster ery a permis une première identification du gène eryCI (ORF1) (Dhillon et al., 1989), puis du gène eryBI (ORF2), du locus eryH (ORFs 3,4 et 5) dont l'inactivation conduit à la production de 6-désoxyérythronolide B, d'un locus eryBII (ORFs 7 et 8) et le gène eryCII (Weber et al., 1990).

Parmi les activités enzymatiques impliquées dans les modifications ultérieures du noyau lactone ont été identifiées le gène eryF (ORF4) responsable de l'hydroxylation en C6 (Weber et al., 1991) et le gène eryK (ORF20) responsable de l'hydroxylation en C12 (Stassi et al., 1993).

D'autre part, le gène eryG (ORF6) responsable de la O-méthylation du mycarose en cladinose (position 3"OH) a été identifié (Weber et al., 1989). L'érythromycine A est ainsi formée via l'érythromycine B ou l'érythromycine C à partir de l'érythromycine D selon le schéma proposé (figure 1).

La caractérisation fonctionnelle des gènes eryB et eryC situés sur la partie droite de cluster ery (ORFs 13 à 19) n'a pas encore été établie de façon précise, malgré les informations parcellaires communiquées dans différents articles de revues (Donadio et al., 1993 ; Liu et Thorson, 1994 ; Katz et Donadio, 1995).

En raison de l'intérêt commercial des antibiotiques macrolides, l'obtention de nouveaux dérivés, notamment l'obtention d'analogues de l'érythromycine ayant des propriétés avantageuses, est intensivement recherchée. Les modifications peuvent être désirées dans la partie aglycone (macrolactone) ou/et dans son hydroxylation secondaire ainsi que dans la partie sucre (cladinose et/ou désosamine) de l'érythromycine.

Les méthodes courantes telles que les modifications chimiques sont difficiles et limitées vis-à-vis du type de produit que l'on peut obtenir à partir de l'érythromycine.

Par exemple, Sakakibara et al. (1984) passent en revue des modifications chimiques réalisées à partir de l'érythromycine A ou B, aussi bien dans la partie sucre que dans la macro-

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lactone.

Des modifications de la macrolactone de l'érythromycine A par manipulation génétique du microorganisme Sac. erythraea ont été décrites dans la demande de brevet internationale WO 93/13663 ainsi que l'obtention de nouvelles molécules polykétides par altérations génétiques spécifiques du locus eryA du chromosome codant pour la PKS. Par exemple la 7-hydroxyérythromycine A, la 6-désoxy-7-hydroxyérythromycine A ou le 3-oxo-3-désoxy-5-désoaminyl-érythronolide A ont été ainsi obtenus.

La présente invention concerne la caractérisation fonctionnelle de dix gènes de Sac. erythraea impliqués dans la biosynthèse ou l'attachement du mycarose et de la désosamine (eryBII, eryCIII et eryCII situés en aval du locus eryA et eryBIV, eryBV, eryCVI, eryBVI, eryCIV, eryCV et eryBVII situés en amont), leur utilisation dans la production d'analogues de l'érythromycine ainsi qu'un procédé de préparation de ceux-ci.

La présente invention a donc pour objet une séquence d'ADN simple ou double brin isolée, représentée à la figure 2 (séquence directe et complémentaire de SEQ ID N 1) correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et a particulièrement pour objet une séquence d'ADN ci-dessus comprenant : - la séquence eryBII correspondant à l'ORF7 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) et codant pour une désosaminyltransférase et - la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase.

La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 2 est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue par exemple par sous-clonage de fragments de restriction d'un

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fragment d'ADN génomique de Sac. erythraea, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin.

L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 choisie parmi la séquence eryBII correspondant à l'ORF7 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.

L'invention a tout particulièrement pour objet la séquence d'ADN isolée eryCIII représentée à la figure 2 correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) et codant pour une désosaminyltransférase.

La séquence eryBII correspondant à l'ORF7 code pour un polypeptide ayant 333 acides aminés (séquence de SEQ ID N 2), la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 code pour un polypeptide ayant 421 acides aminés (séquence de SEQ ID N 5) et la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 code pour un polypeptide ayant 361 acides aminés (séquence de SEQ ID N 3).

La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par introduction d'une délétion interne au gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale.

Par séquences qui hybrident et ayant la même fonction, on inclut les séquences d'ADN qui hybrident avec l'une des séquences d'ADN ci-dessus sous des conditions standards de stringence élevée ou moyenne décrites par Sambrook et al.

(1989) et qui codent pour une protéine ayant la même fonction enzymatique. Par même fonction enzymatique, on entend une activité enzymatique donnée sur des substrats de même nature,

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par exemple un dTDP-6-désoxyhexose ou une macrolactone nue ou glycosylée. Les conditions de forte stringence comprennent par exemple une hybridation à 65 C pendant 18 heures dans une solution 5 x SSPE, 10 x Denhardt, 100 g/ml DNAss, 1 % SDS suivie de 2 lavages pendant 20 minutes avec une solution 2 x SSC, 0,05 % SDS à 65 C suivis d'un dernier lavage pendant 45 minutes dans une solution 0,1 x SSC, 0,1 % SDS à 65 C. Les conditions de stringence moyenne comprennent par exemple un dernier lavage pendant 20 minutes dans une solution 0,2 x SSC, 0,1 % SDS à 65 C.

Par séquences qui présentent des homologies significatives et ayant la même fonction, on inclut les séquences ayant une identité de séquence nucléotidique d'au moins 60 % avec l'une des séquences ADN ci-dessus et qui codent pour une protéine ayant la même fonction enzymatique.

L'invention a aussi pour objet un polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN ci-dessus et a spécialement pour objet un polypeptide correspondant à une ORF représentée à la figure 2, choisie parmi l'ORF7 (ayant la séquence de SEQ ID N 2), l'ORF8 (ayant la séquence de SEQ ID N 5) ou l'ORF9 (ayant la séquence de SEQ ID N 3) et les analogues de ce polypeptide.

Par analogues, on inclut les peptides ayant une séquence en acides aminés modifiée par substitution, délétion ou addition d'un ou plusieurs acides aminés pour autant que ces produits conservent la même fonction enzymatique. Les séquences modifiées peuvent être par exemple préparées en utilisant la technique de mutagénèse dirigée connue de l'homme du métier.

L'invention a plus spécialement pour objet le polypeptide correspondant à l'ORF 8 représentée à la figure 2 (ayant la séquence de SEQ ID N 5) et ayant une activité désosaminyltransférase, dénommé EryCIII.

L'invention décrit une protéine recombinante EryCIII de Sac. erythraea obtenue par expression dans une cellule hôte selon les méthodes connues de génie génétique et de culture cellulaire.

L'obtention de la protéine recombinante purifiée a

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permis de confirmer la caractérisation de la fonction glycosyltranférase associée au produit du gène eryCIII dans un test in vitro qui met en évidence le transfert du sucre activé dTDP-D-désosamine sur le noyau lactone.

L'invention a aussi pour objet la thymidine 5'-(trihydrogène diphosphate),P'-[3,4,6-tridésoxy-3-(diméthylamino)D-.xylo.-hexopyranosyl] ester (dTDP-D-désosamine) et les sels d'addition avec les bases, dont un exemple de préparation est décrit plus loin dans la partie expérimentale.

L'invention a aussi pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6) correspondant à la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine et a particulièrement pour objet une séquence d'ADN ci-dessus comprenant : - la séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454) et codant pour une mycarosyltransférase, - la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220) et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039) et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) et codant pour une dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase et - la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.

La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 3 est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue, par exemple, par sous-clonage de fragments de restriction de

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cosmides contenant une banque d'ADN génomique de Sac. erythraea, selon des conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin.

L'invention a plus particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 choisie parmi la séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.

L'invention a tout particulièrement pour objet la séquence d'ADN isolée eryBV représentée à la figure 3 correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454) et codant pour une mycarosyltransférase.

La séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 code pour un polypeptide ayant 322 acides aminés (SEQ ID N 7), la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 code pour un polypeptide ayant 415 acides aminés (SEQ ID N 8), la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 code pour un polypeptide ayant 237 acides aminés (SEQ ID N 9), la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 code pour un polypeptide ayant 510 acides aminés (SEQ ID N 10), la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 code pour un polypeptide ayant 401 acides aminés (SEQ ID N 14), la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 code pour un polypeptide ayant 489 acides aminés (SEQ ID N 11) et la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 code pour un

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polypeptide ayant 193 acides aminés (SEQ ID N 12).

La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par introduction d'une délétion interne au gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale.

Les séquences d'ADN qui hybrident ainsi que les séquences d'ADN qui présentent des homologies significatives et ayant la même fonction ont la même signification que celle indiquée précédemment.

L'invention a aussi pour objet un polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN ci-dessus et a spécialement pour objet un polypeptide correspondant à une ORF représentée à la figure 3, choisie parmi l'ORF13 (ayant la séquence de SEQ ID N 7), l'ORF14 (ayant la séquence de SEQ ID N 8), l'ORF15 (ayant la séquence de SEQ ID N 9), l'ORF16 (ayant la séquence de SEQ ID N 10), l'ORF17 (ayant la séquence de SEQ ID N 14), l'ORF18 (ayant la séquence de SEQ ID N 11) ou l'ORF19 (ayant la séquence de SEQ ID N 12) et les analogues de ce peptide.

Les analogues du polypeptide ont la même signification que celle indiquée précédemment.

L'invention a plus spécialement pour objet le polypeptide correspondant à l'ORF14 représentée à la figure 3 (ayant la séquence de SEQ ID N 8) et ayant une activité mycarosyltransférase, dénommé EryBV.

La connaissance de chaque séquence d'ADN eryB ou eryC de l'invention indiquée ci-dessus et montrée à la figure 2 ou à la figure 3 permet de reproduire la présente invention par exemple par des méthodes connues de synthèse chimique ou par criblage d'une banque génomique à l'aide de sondes d'oligonucléotides de synthèse par les techniques connues d'hybridation ou par amplification par PCR.

Les polypeptides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes connues, par exemple par synthèse chimique ou par la méthodologie de l'ADN recombinant par expression dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les

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séquences eryBII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), eryCIII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou eryCII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) représentées à la figure 2, eryBIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), eryBV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), eryCVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), eryBVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), eryCIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), eryCV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou eryBVII (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) représentées à la figure 3, pour synthétiser des métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea.

Par métabolites secondaires hybrides, on entend soit des analogues de l'érythromycine, c'est-à-dire des dérivés de l'érythromycine ayant une ou plusieurs modifications portant sur la partie sucre et possédant une activité antibiotique, soit des précurseurs de l'érythromycine tels que le 6désoxyérythronolide B ou l'érythronolide B auxquels sont attachés un ou plusieurs résidus sucre modifiés ou non et ne possédant pas d'activité antibiotique. Le résidu sucre modifié peut être par exemple, le 4-céto-L-mycarose.

La synthèse de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea par utilisation de séquences d'ADN eryB ou eryC de l'invention peut être réalisée par exemple, par l'inactivation d'un ou plusieurs gènes eryB ou eryC ci-dessus et l'introduction d'un ou plusieurs gènes exogènes ou de leurs dérivés obtenus par exemple par mutagénèse, ayant des séquences nucléotidiques codant pour des enzymes ayant la même fonction chez des souches productrices d'autres macrolides, par exemple la tylosine, la picromycine ou la méthymycine. En particulier, l'introduction de gènes exogènes peut être effectuée par intégration d'une séquence d'ADN obtenue selon la méthodologie du "DNA shuffling" (Stemmer, 1994) ou par la construction d'une séquence d'ADN chimère,par

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exemple à partir d'une séquence eryB ou eryC de l'invention intervenant dans le transfert d'un résidu sucre, par exemple la séquence eryCIII ou eryBV, et de gènes homologues isolés à partir de souches productrices de macrolides, par exemple Streptomyces fradiae, Streptomyces olivaceus, Streptomyces venezuelae ou Streptomyces antibioticus.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), eryCIII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou eryCII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) représentées à la figure 2, eryBIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), eryBV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), eryCVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), eryBVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), eryCIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), eryCV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou eryBVII (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) représentée à la figure 3 ou d'un fragment de cette séquence, comme sondes d'hybridation.

Les séquences d'ADN eryB ou eryC de l'invention peuvent être utilisées pour constituer des sondes d'hybridation d'au moins 19 nucléotides, permettant d'isoler des gènes homologues dans des souches productrices de macrolides en utilisant les méthodes classiques d'hybridation d'acides nucléiques immobilisées sur des filtres ou d'amplification par PCR, selon les conditions décrites par Sambrook et al.

(1989) .

L'invention concerne particulièrement l'utilisation de la séquence d'ADN eryCIII représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) comme sonde d'hybridation pour isoler des gènes homologues responsables de la glycosylation de la macrolactone chez une souche productrice de macrolide.

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L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation ci-dessus, dans laquelle les gènes homologues sont les gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine chez S. antibioticus.

L'invention décrit, à titre d'exemple, l'utilisation de la séquence du gène eryCIII comme sonde d'hybridation pour isoler des gènes homologues dans une souche productrice d'oléandomycine. La sonde eryCIII utilisée a permis d'isoler les gènes oleG1 et oleG2 codant pour des glycosyltransférases chez S. antibioticus impliquées dans le transfert de la désosamine et de l'oléandrose sur le noyau lactone.

La caractérisation fonctionnelle des gènes oleG1 et oleG2 a permis de définir l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine chez S. antibioticus.

L'invention a donc pour objet une séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15) correspondant à une région du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine comprenant : - la séquence correspondant à l'ORF oleP1 du nucléotide 184 au nucléotide 1386, - la séquence correspondant à l'ORF oleGl du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 codant pour une activité glycosyltransférase, - la séquence correspondant à l'ORF oleG2 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999 codant pour une activité glycosyltransférase, - la séquence correspondant à l'ORF oleM du nucléotide 3992 au nucléotide 4720 (= séquence de SEQ ID N 20) et - la séquence correspondant à l'ORF oleY du nucléotide 4810 au nucléotide 5967.

La séquence d'ADN ci-dessus montrée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15) est une séquence d'ADN génomique qui peut être obtenue par exemple à partir d'un cosmide couvrant la partie droite du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine par hybridation avec une sonde eryCIII, selon les conditions opératoires dont une description détaillée est donnée plus loin.

L'invention a plus particulièrement pour objet une

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séquence d'ADN isolée représentée à la figure 22 choisie parmi la séquence correspondant à l'ORF oleGl (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 codant pour une activité glycosyltransférase et la séquence correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) codant pour une activité glycosyltransférase.

L'invention a tout particulièrement pour objet une séquence d'ADN isolée ci-dessus correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) codant pour une activité désosaminyltransférase, ainsi qu'une séquence d'ADN isolée ci-dessus correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) codant pour une activité oléandrosyltransférase.

La séquence correspondant à l'ORF oleG1 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 17) et la séquence correspondant à l'ORF oleG2 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 18) .

La mise en évidence des activités enzymatiques respectives indiquées ci-dessus a été réalisée par altération du gène correspondant telle qu'illustrée plus loin dans la partie expérimentale.

L'invention a aussi pour objet le polypeptide codé par la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleGl et ayant une activité désosaminyltransférase (séquence de SEQ ID N 17) et le polypeptide codé par la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG2 et ayant une activité oléandrosyltransférase (séquence de SEQ ID N 18).

Les polypeptides ci-dessus dénommés respectivement OleGl et OleG2 peuvent être obtenus par les méthodes connues indiquées ci-dessus.

L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea dans lequel : - on isole une séquence ADN contenant au moins une séquence eryB ou une séquence eryC du cluster de gènes de la bio-

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synthèse de l'érythromycine représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1) ou à la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6), - on crée une modification dans la dite séquence et on obtient une séquence altérée, - on intègre la séquence altérée dans le chromosome de la souche hôte et on obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant la formation du métabolite secondaire hybride et - on isole le métabolite secondaire hybride.

La modification de la séquence d'ADN peut être réalisée par exemple par une addition et/ou par une délétion de séquences d'ADN d'au moins un nucléotide, dans une séquence eryB ou eryC de l'invention qui code pour l'une des enzymes correspondantes indiquées ci-dessus.

L'intégration de la séquence altérée dans la souche hôte peut être réalisée par exemple par la méthodologie de la recombinaison homologue qui peut être effectuée selon le schéma montré à la figure 4 et conduit à la génération de mutants chromosomiques de souches Sac. erythraea que l'on cultive ensuite selon les méthodes générales connues de culture cellulaire.

L'invention a particulièrement pour objet le procédé cidessus dans lequel la séquence ADN code pour l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.

L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé ci-dessus dans lequel l'altération de la séquence résulte dans l'inactivation d'au moins l'une des enzymes

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indiquées ci-dessus.

L'inactivation d'au moins l'une des enzymes est mise en évidence, d'une part par l'absence de production d'érythromycine, d'autre part par l'accumulation de précurseurs de l'érythromycine tels que le 6-désoxyérythronolide B, l'érythronolide B ou le 3-a-mycarosyl érythronolide B et/ou l'accumulation de métabolites secondaires hybrides tels que définis précédemment dans les surnageants de cultures des souches modifiées correspondantes.

L'invention concerne tout particulièrement le procédé ci-dessus dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-cétoL-6-désoxyhexose 4-réductase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une mycarosyltransférase ou dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase.

L'invention concerne aussi le procédé ci-dessus dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est un analogue de l'érythromycine choisi parmi la 4"-céto-érythromycine, la 4'-hydroxy-érythromycine ou la 3"-C désméthyl-2",3"-ène- érythromycine ou dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est le désosaminyl érythronolide B.

Des exemples de mise en oeuvre du procédé de l'invention sont donnés dans la partie expérimentale. L'accumulation de métabolites secondaires hybrides dans des souches de Sac. erythraea modifiées est également décrite plus loin.

L'invention concerne aussi une souche de Sac. erythraea modifiée dans laquelle au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou

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- dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase est inactivée et produisant au moins un métabolite secondaire hybride.

L'invention concerne particulièrement la souche de Sac. erythraea modifiée BII92 dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase est inactivée et produisant la 3"-C désméthyl-2",3"-ène-érythromycine C, la souche de Sac. erythraea modifiée BIV87 dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 4-réductase est inactivée et produisant la 4"céto-érythromycine, la souche de Sac. erythraea modifiée CIV89 dans laquelle une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase est inactivée et produisant la 4'-hydroxyérythromycine D ainsi que la souche de Sac. erythraea modifiée BV88 dans laquelle une mycarosyltransférase est inactivée et produisant du désoaminyl érythronolide B. Des constructions détaillées des souches ci-dessus sont données plus loin dans la partie expérimentale.

L'invention concerne aussi un procédé de préparation de précurseurs de l'oléandomycine chez S. antibioticus dans lequel - on crée une altération de la séquence du gène choisie parmi la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) et la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG2 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 2722 au nucléotide 3999) dans le chromosome d'une souche hôte et obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant l'accumulation des précurseurs de l'oléandomycine et - on isole ces précurseurs.

L'altération de la séquence d'ADN peut être réalisée par exemple par interruption du gène cible dans la souche S. antibioticus, par exemple par intégration d'un plasmide par la méthodologie de la recombinaison homologue et conduit à la génération de mutants chromosomiques de la souche sauvage.

L'invention concerne particulièrement un procédé ci-

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dessus dans lequel l'altération est créée dans la séquence d'ADN correspondant à l'ORF oleG1 (séquence de SEQ ID N 15 du nucléotide 1437 au nucléotide 2714) et dont il résulte au moins l'élimination de l'activité désoaminyltransférase et l'accumulation du précurseur de l'oléandomycine 8,8a-désoxyoléandolide.

L'accumulation d'un précurseur non glycosylé de l'oléandomycine 8,8a-désoxyoléandolide observée par interruption du gène oleG1 est due à un effet polaire transcriptionnel inactivant le gène oleG2.

Un exemple de mise en oeuvre du procédé ci-dessus est donné plus loin dans la partie expérimentale.

Matériels et méthodes générales.

1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de croissance.

La souche Sac. erythraea utilisée pour la réalisation de l'invention est un variant phénotypique spontané dit "red variant" (Hessler et al., 1997) de la souche sauvage Sac. erythraea NRRL 2338 dont la croissance est effectuée en routine soit sur milieu solide R2T2 (milieu R2T décrit par Weber et al., 1985 sans peptone), R2T20 (Yamamoto et al., 1986) ou Ml-102 sur agar (Kaneda et al., 1962), soit en milieu liquide TSB (Oxoid) à 30 C.

La souche Streptomyces lividans 1326 (John Innes Culture Collection) décrite par Hopwood et al. (1983), utilisée pour la préparation de plasmides dépourvus d'origine de réplication d'Escherichia coli tels que pIJ702 et pIJ486, a été maintenue sur milieu solide R2YE (R5) et al., 1985).

La croissance des souches E. coli XL1-blue (Stratagene), JM110 (Stratagene) et DH5a.MCR (GibcoBRL), utilisées pour les préparations de plasmides, a été effectuée en routine en milieu liquide 2 x YT ou LB ou en milieu solide LB sur agar, tels que décrits par Sambrook et al. (1989). La souche E. coli XL1-blue est utilisée pour les clonages en routine.

La souche JM110 est utilisée pour des clonages où l'on utilise des sites de restriction tels que BclI. La souche DH5a.MCR est utilisée pour la préparation de plasmides

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destinés à être introduits chez Sac. erythraea pour une transformation optimale.

La sélection des plasmides dans E. coli a été effectuée sur ampicilline (Sigma) à 100 g/ml.

Les souches Bacillus subtilis ATCC 6633 ou Bacillus pumilus ATCC 14884 ont été utilisées comme souches indicatrices pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme.

Les plasmides Litmus28, pUC18 et pUC19 (New England Biolabs) ont été utilisés en routine pour les sous-clonages.

Le vecteur pIJ702 (Katz et al., 1983) a été obtenu du John Innés Institute. Le vecteur pIJ486 (Ward et al., 1986) a été obtenu de C.J. Thompson (Université de Bâle, Suisse). Le phagmide pTZ18R a été obtenu de Pharmacia Biotech. Le vecteur navette coli-streptomyces pUWL218 (Wehmeier, 1995) utilisé pour l'intégration chromosomique dans Sac. erythraea a été obtenu de W. Piepersberg (Université de Wuppertal, Allemagne).

2. Manipulation de l'ADN et séquençage.

Les méthodes générales de biologie moléculaire utilisées sont décrites par Sambrook et al., 1989.

Les réactifs d'origine commerciale ont été utilisés incluant les enzymes de restriction (New England Biolabs et Boehringer Mannheim), le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I (Boehringer Mannheim). La trousse "DNA ligation system" (Amersham) a été utilisée pour effectuer les ligations et la trousse Plasmid Midi kit (Quiagen) ou RPM kit (Bio101 Inc. ) pour purifier l'ADN plasmidique.

La préparation de l'ADN du bactériophage X a été réalisée selon Ausubel et al. (1995) et l'isolement de l'ADN chromosomique de Sac. erythraea selon Hopwood et al. (1985).

La transformation de S. lividans et l'isolement des plasmides ont été effectués selon Hopwood et al. (1985).

3. Préparation de l'érythronolide B et du 3-a-mycarosyl érythronolide B.

L'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B ont été purifiés à partir d'extraits de culture du mutant eryCI (clone WHB2221 décrit par Dhillon et al., 1989) par chromatographie sur gel d'aminopropyl (LichroprepNH2 25-40 ,

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Merck) avec un gradient d'élution par des mélanges chlorure de butyle/chlorure de méthylène successifs (100: 0, 80:20, 50 :50 et 20 :80) suivid'un gradient d'élution linéaire par le mélange chlorure de butyle/méthanol variant de 99 :1 90:10.

Les fractions contenant les produits attendus sont amenées à sec sous vide puis analysées par chromatographie en couche mince (ccm). L'érythronolide B est ensuite cristallisé dans un mélange acétate d'éthyle/hexane puis recristallisé dans l'éthanol. Le 3-a-mycarosyl érythronolide B est cristallisé deux fois dans un mélange acétate d'éthyle/hexane.

Milieux cités.

1. R2T2 : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 103 g ; K2S04 0,25g ; extrait de levure 6,5 g ; tryptone 5,0 g ; bactoagar 22,0 g ; eau distillée qsp 860 ml. La solution est stéri- lisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 20 ml de glucose à 50 % ; 25 ml de Tris-HCl 1M, pH7,0 ; 5 ml de KH2PO4 à 0,5 % ; 2,5 ml de NaOH 1N ; 50 ml de CaCl2 1M ; 50 ml de MgC12,6H20 1M et 2 ml de solution de "trace elements" (Hopwood et al., 1985).

2. R2T20 : Pour un litre de solution aqueuse : milieu R2T2 contenant 206 g de sucrose.

3. Ml-102 (Kaneda et al., 1962) : Pour 1 litre de solution aqueuse : glucose 5 g ; brun commercial 10 g ; tryptone 5 g ; extrait de levure 2,5 g ; Versène 36 mg ; eau courante 1000 ml ; final ajusté à 7,0 à 7,2 avec KOH. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C.

4. R2YE(R5) (Hopwood et al., 1985) : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 103 g ; K2S04 0,25 g ; MgCl2,6H20 10,12 g ; casaminoacides 0,1 g ; de "trace elements" 2 ml ; extrait de levure 5 g ; TES 5,72 g ; bactoagar 15 g ; eau distillée qsp 940 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 10 ml de KH2PO4 0,5 % ; ml de

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CaCl2 1M ; 15 ml de L-proline à 20 % ; ml de glucose à 50 % et 1 ml de CuCl2 10mM.

5. 2 x TY : Pour 1 litre de solution aqueuse : tryptone 10 g ; de levure 10 g ; NaCl 5 g.

6. Tampon PT : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 100 g ; K2S04 0,25 g ; MgCl26H20 5,1 g ; de "trace elements" 2 ml ; distillée qsp 875 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C. Au moment de l'utilisation, les solutions stériles suivantes sont ajoutées : 5 ml de CaCl2 et 20 ml de TES 5,3 %.

7. Sucrose-succinate (Caffrey et al., 1992) : Pour 1 litre de solution aqueuse : sucrose 0,2 M ; succinique 20 mM ; de potassium 20 mM (pH 6,6) ; sulfate de magnésium 5 mM ; de potassium 100 mM ; solution de "trace elements" 2 ml. La solution est stérilisée par autoclavage pendant 30 minutes à 120 C.

Les figures ci-annexées illustrent certains aspects de l'invention.

La figure 1 représente la voie de biosynthèse de l'érythromycine A.

La figure 2 représente la séquence nucléotidique (séquence directe et complémentaire de SEQ ID N 1) de la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine comprenant les ORFs 7,8 et 9 et leurs séquences protéiques déduites.

La figure 3 représente la séquence nucléotidique (séquence de SEQ ID N 6) de la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine comprenant les ORFs 13 à 19 et leurs séquences protéiques déduites.

La figure 4 représente le schéma de substitution de gène par recombinaison homologue.

La figure 5A représente l'organisation de la partie gauche du cluster des gènes de la biosynthèse de l'érythromy- cine chez Sac. erythraea dont les ORFs 1 à 9 sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction des plasmides pK62, pBCKl, pKB22, pBK44, pBIISB, pEco2 et pK23,

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générés à partir du clone génomique XSE5.5. (Abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Bc,BclI ; Bg, BglII ; E, EcoRI ; K, KpnI ; M, MluI ; P, PstI ; S, SacI ; Sa, SalI.)
La figure 5B représente l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'érythro- mycine chez Sac. erythraea dont les ORFs 13 à 21 sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction des plasmides pBK6-12, pCN9, pNC028, pNB49, pNC062, pPSP4, pNC062X et pBAB18. (Abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Ba,BalI ; Bc, BclI ; C, ClaI ; E, EcoRI ; K, KpnI ; N, NcoI ; Ns, NsiI ; P, PstI ; Pv,PvuII ; S, SacI ; Sc, ScaI ; Sh, SphI ; Sp, SpeI ; X, XbaI ; Xh, XhoI).

La figure 6A représente le schéma de construction du plasmide pBII.

La figure 6B représente une carte de restriction du plasmide pUWL218.

La figure 6C représente une carte de restriction du plasmide pBII#.

La figure 7A représente le schéma de construction du plasmide pdel88.

La figure 7B représente le schéma de construction du plasmide pdel88A.

La figure 7C représente le schéma de construction du plasmide pOBB.

La figure 7D représente le schéma de construction et une carte de restriction du plasmide pCIII.

La figure 8A représente le schéma de construction du plasmide pCIlA.

La figure 8B représente une carte de restriction du plasmide pORTl.

La figure 8C représente une carte de restriction du plasmide pCIlA.

La figure 9A représente le schéma de construction du plasmide pBIVA.

La figure 9B représente une carte de restriction du plasmide pBIV.

La figure 10A représente le schéma de construction du plasmide pBV#.

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La figure 10B représente une carte de restriction du plasmide pBV#.

La figure 11A représente le schéma de construction du plasmide pPSTI.

La figure 11B représente une carte de restriction du plasmide pPSTI.

La figure 12A représente le schéma de construction du plasmide pXhoI.

La figure 12B représente une carte de restriction du plasmide pXhoI.

La figure 13A représente le schéma de construction du plasmide pCIVA.

La figure 13B représente une carte de restriction du plasmide pCIVA.

La figure 14A représente le schéma de construction du plasmide pCV#.

La figure 14B représente une carte de restriction du plasmide pCV#.

La figure 15 représente l'analyse par Southern blot des souches mutantes BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement à la souche sauvage "red variant" notée Wt. Pour chaque mutant, l'enzyme de restriction utilisée est indiquée en-dessous de chaque blot et la taille des bandes détectées devant chaque blot est estimée par rapport aux marqueurs de poids moléculaire #-HindIII et X-BstEII (non détectables par auto-radiographie).

La figure 16 représente l'analyse par PCR des souches mutantes BII91, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement à la souche sauvage "red variant" notée Wt et aux plasmides pBII#, pCIUA, pCIlA, pBIVA, pBV#, PCIVA et pCV# utilisés respectivement pour obtenir le mutant par recombinaison homologue. Les tailles des bandes détectées par coloration au bromure d'éthydium sont estimées par rapport aux marqueurs de poids moléculaire #X174-HaeIII ou X-BstEII.

La figure 17 représente l'analyse par CCM des métabolites produits par les souches mutantes BII92, CIII68, CII62, BIV87, BV88, CIV89 et CV90, comparativement aux produits standards érythromycine A (Er A), érythronolide B (EB) et

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3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB).

La figure 18 représente l'analyse par SDS-PAGE de la purification de la protéine EryCIII successivement après extraction à l'urée 7M (ligne 2), chromatographie Q Sépharose (ligne 3), chromatographie Superdex (ligne 4), chromatographie Q source (ligne 6) avec des marqueurs standard de poids moléculaire (lignes 1 et 5);
La figure 19 représente l'analyse par CMM du test d'activité biologique de la protéine EryCIII, par incubation avec d-TDP-D-désosamine (ligne 2) ou avec d-TDP-D-désosamine et 3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB) (ligne 3) comparativement au contrôle MEB (ligne 1) et au contrôle érythromycine A (ligne 4). Les pointillés marquent les zones montrant une activité antibiotique par autobiogramme sur B. pumilus.

La figure 20 représente la localisation des six cosmides (cosAB35, cosAB76, cosAB87, cosAB67, cosAB63 et cosAB61) couvrant l'ensemble du cluster des gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine. Les fragments de restriction BamHI (noté B) hybridant avec les sondes notées str M, D, E et les fragments BamHI (3,5 kb et 2,7 kb) hybridant avec la sonde eryCIII sont montrés.

La figure 21 représente l'organisation de la partie droite du cluster des gènes de la biosynthèse de l'oléandromycine chez S. antibioticus dont les différentes ORFs (notées olePl, oleGl, oleG2, oleM, oleY, oleP et oleB) sont indiquées par des flèches ainsi qu'une carte de restriction du plasmide pC035-S et l'insert du plasmide pC03 généré à partir du pC035-S. La double flèche indique l'insert correspondant à la séquence de la figure 22 (abréviations des enzymes de restriction : B, BamHI ; Bg,BglII ; K, KpnI ; S, SacI ; Sh, SphI ; l'étoile indique qu'il ne s'agit pas d'un site unique) .

La figure 22représente la séquence nucléotidique (séquence de SEQ ID N 15) de la région couvrant les gènes olePl, oleGl, oleG2, oleM et oleY de la biosynthèse de l'oléandomycine et leurs séquences protéiques déduites.

EXEMPLE 1 : clonage et séquençage de la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.

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Un fragment d'ADN génomique de Sac. erythraea NRRL 2338 ayant > 20 kb en aval du gène ermE couvrant notamment les ORFs 3 à 9 et correspondant au clone XSE5.5 ainsi que la séquence nucléotidique d'un fragment de 4,5 kb correspondant à la région du cluster ery comprise entre 3,7 kb et 8,0 kb à partir de l'extrémité 3' du gène ermE et comprenant les ORFs 3,4, 5 et 6 ont été décrits par Haydock et al. (1991).

En tenant compte de la carte de restriction montrée par Haydock et al. (1991), des sous-clones ont été dérivés du clone XSE5.5 par sous-clonage de fragments de restriction dans pUC19. Les plasmides pKB22, pBK44, pBIISB et pEco2 ont été ainsi générés selon la figure 5A de la façon suivante :
A partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction KpnI, les plasmides pK62 et pK66 ont été directement construits par sous-clonage du fragment KpnI de 5,8 kb dans pUC19, le plasmide pK66 correspondant au même fragment KpnI sous-cloné avec une orientation inversée de l'insert par rapport au vecteur. Le plasmide pKB22 contenant un insert de 2,9 kb a été ensuite dérivé du plasmide pK66 par excision du fragment BamHI-BglII (2,9 kb) couvrant l'ORF8 ainsi qu'une partie des ORFs 7 et 9 par digestion avec les enzymes de restriction BamHI et BglII. De la même façon, le plasmide pKB44 contenant un insert de 2,9 kb a été obtenu à partir du plasmide pK62 par excision du fragment BamHI-BglII (2,9 kb) couvrant le gène eryG correspondant aux ORFs 5 et 6 et le gène eryF correspondant à l'ORF4.

Le plasmide pBIISB a été dérivé du plasmide pBK44 par sous-clonage dans pUC19 du fragment SalI de 600 pb obtenu à partir du plasmide pBK44 digéré par l'enzyme de restriction SalI (figure 5A) .

A partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, le plasmide pEco2 a été directement construit par sous-clonage du fragment EcoRI (2,2 kb) dans pUC19.

Les sous-clones pKB22, pBK44, pBIISB et pEco2 ainsi obtenus ont été ensuite séquences. L'analyse a été faite sur des échantillons d'ADN plasmidique, préalablement purifié sur une colonne de Quiagen 100 (Quiagen), sur le séquenceur

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automatique ABI prism 377. Les réactions de séquençage ont été réalisées par la méthode de Sanger (1977) en utilisant les amorces M13 conventionnelles ou des amorces synthétiques et des didésoxynucléosides triphosphate fluorescents et la polymérase Taq FS (Perkin Elmer) en présence de 5 % de diméthylsulfoxide, les amorces synthétiques utilisées ayant les séquences suivantes : C3R2 TCCTCGATGGAGACCTGCC (SEQ ID N 22) B2R1 GAGACCATGCCCAGGGAGT (SEQ ID N 23) C3S2 TCTGGGAGCCGCTCACCTT (SEQ ID N 24) C2R1 GACGAGGCCGAAGAGGTGG (SEQ ID N 25) C2S GCACACCGGAATGGATGCG (SEQ ID N 26) fullC3S CCGTCGAGCTCTGAGGTAA (SEQ ID N 27) fullC3R GCCCGAGCCGCACGTGCGT (SEQ ID N 28) et C4 TGCACGCGCTGCTGCCGACC (SEQ ID N 29).

L'assemblage des données de séquence a été réalisé avec le logiciel AutoassemblerTM pakage (Applied Biosystem). Les séquences ont été analysées en utilisant l'ensemble des logiciels GCG (Devereux 1984).

Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir la séquence nucléotidique de 3412 bp de la figure 2 (séquence directe et complémentaire de SEQ ID N 1) dans laquelle trois ORFs (7,8 et 9) ont été identifiées respectivement du nucléotide 8957 au nucléotide 7959, du nucléotide 10219 au nucléotide 8957 et du nucléotide 11315 au nucléotide 10233 (numérotés dans la figure 2 à partir du site BamHI situé à l'extrémité 5' du gène ermE) (respectivement séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046, du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 et du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et correspondant respectivement aux gènes eryBII, eryCIII et eryCII selon Liu et Thorson (1994) dont les caractérisations fonctionnelles n'avaient pas encore été identifiées. Les trois ORFs 7,8 et 9 ont la même orientation, la lecture se faisant à partir de la région 3' du gène eryAIII.

Des échantillons de E. coli XL1-blue contenant la région codante des ORFs ci-dessus ont été déposés à la CNCM le 16 juillet 1997 :

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- le plasmide pK62 comprenant la séquence codante pour l'ORF7, l'ORF8 et une partie de l'ORF9 sous le numéro 1-1897, - le plasmide pEco2 comprenant la séquence codante pour l'ORF9 et une partie de l'ORF8 sous le numéro 1-1899.

EXEMPLE 2 : du plasmide pBIlA.

Un plasmide d'intégration, dénommé pBIlA et portant une délétion dans le gène eryBII codant pour l'ORF7, a été construit selon le schéma de la figure 6A.

Le fragment BclI-BamHI de 598 pb a été délété dans le plasmide pK62 obtenu à l'exemple 1 par digestion avec les enzymes BclI et BamHI. Le plasmide pBCKl résultant a été ensuite digéré avec les enzymes de restriction MluI et BglII de façon à déléter un fragment ayant 853 pb à l'intérieur de l'ORF7 du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 de la séquence de la figure 2. Après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, le plasmide contenant la délétion , a été religaturé et transformé dans E. coli XL1-blue. A partir du plasmide p19BII# ainsi généré, le fragment KpnI-HindIII (4,3 kb) qui porte la délétion a été sous-cloné dans le plasmide pUWL218 (figure 6B). La présence de la délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 dans le plasmide pBIlA ainsi généré (figure 6C) a été confirmée par séquençage.

Le plasmide pBII a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 3 : construction d'une souche Sac. erythraea ery BIIA (BII92).

La construction d'une souche Sac. erythraea dans laquelle le gène eryBII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBIlA préparé à l'exemple 2 et le processus d'intégration ont été réalisés de la façon suivante :
La préparation des protoplastes a été réalisée selon la méthode décrite par Weber et Losick (1988), en utilisant du PEG 3350 (Sigma) au lieu de PEG 1000 et un tampon P modifié (dénommé PT) contenant MgCl2,6H20 28 mM et sans P04H2K au lieu des tampons P, L ou T décrits, selon les conditions

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opératoires suivantes :
Les cellules (au moins 108 spores) de Sac. erythraea "red variant" (dont un échantillon a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1902) ont été mises à pousser dans 50 ml de milieu TBS pendant 3 à 5 jours à 30 C, puis lavées dans du sucrose à 10,3 %. Les cellules ont été remises en suspension dans 50 ml de tampon PT contenant 2 à 5 mg/ml de lysozyme (Sigma), puis incubées à 30 C pendant 1 à 2 heures en désagrégeant les amas de mycélium toutes les 15 minutes jusqu'à conversion d'au moins 50 % du mycélium en protoplastes. Les protoplastes ont été lavés avec 50 ml de tampon PT, remis en suspension dans 12,5 à 25 ml du même tampon, congelés lentement puis stockés à -80 C par aliquots de 200 /il.

Pour la transformation, un aliquot a été décongelé et 50 fil ont été prélevés puis transférés dans un tube de 15 ml.

Un à 10 g d'ADN plasmidique pBII, préparé à l'exemple 2 à partir de la souche E. coli DH5aMRC ont été mis en solution dans 5 à 10 /il de tampon TE (Tris HC1 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) puis déposés sur la paroi du tube incliné auquel a été ensuite ajouté 0,5 ml d'une solution de PEG 3350 dans le tampon PT préparée extemporanément à partir d'une solution aqueuse à 50 % que l'on dilue au demi dans le tampon 2 x PT.

Après dilution avec 3 à 5 ml de tampon PT puis centrifugation à 2500 rpm pendant 15 mn, le culot a été dissocié dans 0,5 ml de tampon PT et la suspension de protoplastes transformés ainsi obtenue a été immédiatement répartie sur 2 ou 3 boites R2T2 très sèches (3 h sous une hotte à flux laminaire). Les boites ont été ensuite incubées à 32 C pendant 16 à 24 h jusqu'à apparition du voile de régénération des protoplastes.

A partir d'une solution stock de thiostrepton (Sigma) à 50 mg/ml dans le DMSO, une quantité appropriée a été diluée dans 0,5 à 1 ml d'eau puis étalée sur les boites de façon à obtenir une concentration finale de 20 g de thiostrepton/ml de gélose. Après absorption complète de l'antibiotique, les boîtes ont été incubées à 32 C pendant 3 à 4 jours, ce qui permet la visualisation des transformants. Les boîtes ont encore été incubées plusieurs jours jusqu'à développement

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complet des spores.

La sélection des intégrants correspondant au premier événement de recombinaison (figure 4) a été réalisée par réplication des boîtes sporulées à l'aide de velours ou par étalement d'une suspension des spores sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton puis incubation à 32 C, ce qui permet la croissance des clones d'intégrants potentiels.

Pour la sélection de clones ayant subi un deuxième événement de recombinaison (figure 4), 5 à 10 clones résistants au thiostrepton obtenus ci-dessus ont été mis en culture dans 8 ml de milieu liquide TSB à 30 C pendant 3 à 4 jours. 50 à 100 fil ont été prélevés et remis en culture dans les mêmes conditions. Après 4 cycles successifs de dilution et culture destinés à favoriser la perte du marqueur de résistance au thiostrepton, des protoplastes ont été préparées à partir des cellules comme indiqué ci-dessus, de façon à chasser le plasmide. Les protoplastes ont ensuite été étalés sur des boîtes R2T2 de façon à obtenir des colonies individualisées dont la sensibilité au thiostrepton a été déterminée par réplique sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton.

Selon la position du deuxième événement de recombinaison par rapport au site de délétion (figure 4), on peut attendre que le phénotype des colonies sensibles au thiostrepton soit du type sauvage ou du type muté porteur de la délétion.

Parmi les colonies sensibles au thiostrepton, la sélection des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée par antibiogramme sur la souche B. pumilus ATCC 14884 sensible à l'érythromycine. La souche B. pumilus a été utilisée comme souche indicatrice pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme. Les colonies ont été étalées à l'anse de platine sur des boîtes R2T2, puis incubées pendant 3 à 4 jours à 30 C. Des zones d'agar où le mutant a poussé à confluence ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes A-Merck recouvertes d'une surcouche de 4 ml de 0,5 x A Merck (Antibiotic agar N 1 Merck) inoculée d'une suspension de spores de B. pumilus, puis incubées une nuit à 37 C.

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La présence de la délétion attendue dans le chromosome du mutant (délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléotide 8863 de la figure 2) a ensuite été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR de la façon suivante :
Pour l'analyse par Southern blot, le transfert d'ADN génomique, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction appropriée, sur des membranes GeenscreenPlus (Dupont NEN) a été réalisé dans NaOH 0,4 M selon Ausubel et al. (1995). Les hybridations ont été effectuées en utilisant comme sonde l'oligonucléotide marqué à son extrémité 5' en utilisant du [[gamma]32P]ATP (Amersham) et la polynucléotide kinase (Boehringer Mannheim) selon Sambroock et al. (1989), ayant la séquence suivante : B2-S TTGGCGAAGTCGACCAGGTC (SEQ ID N 30) correspondant à la région d'ADN du début du gène eryG située de la position 4118 à la position 4137 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X60379 et décrite par Haydock et al. (1991). Les hybridations ont été effectuées avec un tampon d'hybridation rapide (Amersham) et les conditions de lavage suivantes : 2 x 5 mn, 2 x SSC, 20 C ; 30 mn, 2 x SSC, 65 C ; 30 mn, 0,1 x SSC, 20 C.

Par hybridation Southern sur l'ADN génomique isolé selon Hopwood et al. (1985) puis digéré par l'enzyme de restriction KpnI, une bande de 5,8 kb à partir de la souche sauvage "red variant" et une bande de 4,9 kb à partir du mutant BII92 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 900 pb dans cette région du chromosome.

Pour l'analyse par PCR ,un échantillon de 100 /ni d'une culture de 3 jours en milieu TSB a été centrifugé. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 10 l de milieu TSB, puis utilisé pour l'amplification dans l'appareil genAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer Cetus). Après chauffage de l'échantillon pendant 3 mn à 94 C, les conditions d'amplification suivantes ont été utilisées : 94 C, 1 mn ; 55 C, 1 mn ; 72 C, 3 mn ; 30cycles ; polymérase Ampli Taq (Perkin Elmer) en présence de diméthylsufoxyde 10 % (v/v)

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suivis d'une élongation de 3 mn à 72 C . L'amplification a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide B2S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B2-R GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA (SEQ ID N 31) correspondant à la séquence du brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 8873 à la position 8892 de la séquence de la figure 2 à laquelle ont été ajoutés trois nucléotides à l'extrémité 5' et permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF7.

L'analyse par amplification par PCR sur des cellules entières a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande de 0,16 kb dans le mutant BII92 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBII#. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBII# (853 pb).

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BII92, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 4 : de la souche BII92 et identification des métabolites secondaires produits.

Des extraits de bouillon de culture de la souche ont été analysés par chromatographie en couche mince (ccm) avec l'érythromycine A, l'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B comme standards.

La souche BII92 a été cultivée en erlen de 50 ml dans les conditions permettant une production optimale d'érythromycine A et de ses dérivés qui consistent à effectuer une préculture cellulaire à 28 C pendant 48 heures dans le milieu EP1 (Solulys L-Corn steep liquor (Roquette frères) 5 g/1 ; farine de soja déshuilée (Cargill) 10 g/1 ; C03Ca 2 g/1 ; ClNa 5 g/1 ; pH = 6,8 ; qsp 15 g/1 ajouté après autoclavage), puis une culture pendant 72 heures après dilution à 7 % v/v avec le milieu EP2 (farine de soja déshuilée 10 g/1 ; C03Ca 0,2 g/1 ; C12Co-6H20 1 mg/1 ; pH = 6,8-7 ; glucose qsp 20 g/1 ajouté après autoclavage).

Le surnageant de culture a été ensuite extrait à pH 9-10

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avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques ont été séchées sur S04Mg, amenées à sec sous pression réduite puis analysées par ccm sur gel de silice 60 F254 (Merck) [dichlorométhane/méthanol (90: 10, v/v) ou éther isopropylique/méthanol/NH40H à 25 % (75: 35:2, v/v) ]. De façon alternative, l'analyse a été réalisée par ccm sur des plaques de gel de silice greffées de type NH2 F254 (Merk) [chlorure de butyle/méthanol (90:10, v/v)].

La révélation chimique des plaques a été effectuée par pulvérisation d'une solution de p-anisaldéhyde-acide sulfurique 98 %-éthanol (1: 1:9, v/v), suivie de chauffage pendant quelques minutes à 80 C. Les activités antibiotiques potentielles ont été analysées par bioautographie directe des plaques de ccm sur agar ensemencé de B. pumilus ATCC 14884.

Les résultats obtenus par révélation chimique (figure 17) montrent que la souche BII92 accumule préférentiellement l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB.

Des métabolites mineurs de faible mobilité manifestant une activité antibiotique ont également été détectés. Ces métabolites ont été extraits à l'acétate d'éthyle et identifiés par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) couplée à la spectrométrie de masse.

La RP-HPLC a été effectuée sur colonne (250 x 4,6mm) de Kromasil C18 5 en utilisant comme phase mobile le mélange acétonitrile/méthanol/acétate d'ammonium 0,065 M pH 6,7 (350: 150:500, v/v) sur un chromatographe Waters équipé d'un spectromètre de masse Finningan TSQ 7000.

A côté de traces d'érythromycine A, B, C et D, 4 métabolites mineurs dénommés Ml à M4 ont été détectés : - Ml donne un pic parent à m/z 704 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. La présence de désaminyl- érythronolide A (m/z 576) indique que la différence de m/z de 30 comparée à l'érythromycine A (m/z 734) ou de 16 comparée à l'érythromycine C (m/z 720) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour Ml est la 3"-C désméthyl- 2",3"-ène-érythromycine C.

- M2 donne un pic parent à m/z 706 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. La présence de désaminyl-

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érythronolide A (m/z 576) indique que la différence de m/z de 28 comparée à l'érythromycine A (m/z 734) ou de 14 comparée à l'érythromycine C (m/z 720) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M2 est la 3"-C désméthyl- érythromycine C.

- M3 donne un pic parent à m/z 690 et des produits de fragmentation à m/z 560 et m/z 158. La présence de désaminyl- érythronolide B (m/z 560) indique que la différence de m/z de 28 comparée à l'érythromycine B (m/z 718) ou de 14 comparée à l'érythromycine D (m/z 704) est portée par le résidu sucre neutre. La structure proposée pour M3 est la 3"-C désméthyl- érythromycine D.

- M4 donne un pic parent à m/z 720 et des produits de fragmentation à m/z 576 et m/z 158. Le profil est identique à celui de l'érythromycine C (m/z 720) avec la présence de désosaminylérythronolide A (m/z 576) et la perte du résidu sucre aminé (m/z 158), mais le métabolite M4 n'a pas le même temps de rétention en RP-HPLC que l'érythromycine. La structure proposée pour M4 est la 311-C désméthyl- érythromycine A.

La détection par SM-SM du métabolite mineur Ml ayant un sucre neutre insaturé (3"-C désméthyl-2",3"-ène-érythromycine C) indique que le gène eryBII code pour la dTDP-4-céto-L-6désoxyhexose 2,3-réductase dans la voie de biosynthèse du dTDP-mycarose.

La souche BII92 a été déposée à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1903.

EXEMPLE 5 : construction du plasmide pCIII#.

L'ORF8 pouvant être traductionnellement couplée à l'ORF7 située en aval, une délétion en phase a été introduite de façon à éviter un effet polaire. Un plasmide d'intégration, dénommé pCIII# porteur d'une telle délétion, a été construit selon le schéma de la figure 7(A-D).

Une délétion Sali de 663 pb a été introduite dans l'ORF8 du nucléotide 9384 au nucléotide 10046 de la séquence de la figure 2 en sous-clonant dans le plasmide pUC19 les deux fragments SalI (a : 794 pb et b : 631 pb montrés à la figure 5A ) isolés à partir du plasmide pBK44 obtenu à l'exemple 1

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pour générer le plasmide pdel88 (figure 7A). La présence de la délétion de 663 pb a été confirmée par séquençage. Le plasmide pdel88 a été ensuite soumis à deux sous-clonages additionnels de façon à élargir les régions chromosomiques utilisables pour la recombinaison homologue des deux cotés du site de délétion. Le fragment SacI (450 pb) du plasmide pdel88 a d'abord été remplacé par le fragment SacI (1,1 kb) du plasmide pEco2 obtenu à l'exemple 1 pour générer le plasmide pdel88A (figure 7B). Puis le fragment EcoRI (1,5 kb) portant la délétion dans l'ORF8 a été isolé du plasmide pdel88A et utilisé pour remplacer le fragment EcoRI (1,66 kb) porteur de l'ORF intacte dans le plasmide pOBB. Le plasmide pOBB, représenté à la figure 7C, correspond au plasmide pBK44 préparé à l'exemple 1 dans le site PstI duquel a été souscloné le fragment PstI de 4 kb du plasmide pIJ486 obtenu par digestion par l'enzyme de restriction PstI et porteur de l'origine de réplication streptomyces ainsi que du gène de résistance au thiostrepton. Le plasmide résultant pCIII porte des régions chromosomiques pour la recombinaison homologue de 1,27 kb et 1,38 kb respectivement en amont et en aval du site de délétion. Le plasmide pCIII# ainsi obtenu (figure 7D) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 6 : d'une souche Sac. erythraea eryCIIlA (CIII68).

Une souche dans laquelle le gène eryCIII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCIII obtenu à l'exemple 5 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCIII#.

La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3.

De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 663 pb du nucléotide 9384 au nucléotide 10046 de la séquence de la figure 2) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par amplification par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.

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Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C3-S ATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID N 32) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 10196 à la position 10219 de la séquence de la figure 2, une bande de 2,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 1,5 kb à partir du mutant CIII68 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 700 pb dans cette région du chromosome.

L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide C3-S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C3-R TCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID N 33) correspondant à la séquence située de la position 8954 à la position 8974 de la séquence de la figure 2 permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF8. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,2 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 0,6 kb dans le mutant CIII68 de façon identique au signal obtenu avec pCIII#. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 700 pb détectée par l'analyse de Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIII# (663 pb).

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CIII68, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 7 : de la souche CIII68 et identifi- cation des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche CIII68 et les analyses par ccm suivie de bioautographie ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.

Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CII68 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de petites quantités d'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.

La séquence eryCIII présente une forte homologie avec

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d'autres glycosyltransférases putatives telles que DauH (43 % d'identité au niveau protéique) et DnrS (47 % d'identité) impliquées dans la biosynthèse de la daunorubicine chez S. peucetius (Otten et al., 1995) et chez Streptomyces sp C5 (Dickens et al., 1996) ainsi que TylM2 (50 % d'identité) impliquée dans le transfert du mycaminose sur la tylactone dans la voie de biosynthèse de la tylosine chez S. fradiae (Gandecha et al., 1997).

Ces observations indiquent que gène eryCIII code pour la désosaminyltransférase dans la voie de biosynthèse de l'érythromycine.

EXEMPLE 8 : construction du plasmide pCIlA .

Un plasmide d'intégration, dénommé pCIlA et portant une délétion dans le gène eryBII codant pour l'ORF9, a été construit selon le schéma de la figure 8A.

Le plasmide pK23 (figure 5A) a été obtenu par sousclonage dans pUC19 du fragment KpnI de 10 kb isolé à partir de l'ADN du clone XSE5.5 digéré par l'enzyme de restriction KpnI.

Dans un premier temps, le vecteur navette pORTl, montré à la figure 8B, a été obtenu par sous-clonage du fragment PstI de 4kb isolé par digestion du plasmide pIJ486 avec l'enzyme de restriction PstI incluant le gène de résistance au thiostrepton et le réplicon Streptomyces, dans le site PstI de pUC19.

Une délétion hors phase de 304 pb a été introduite dans l'ORF9 du nucléotide 10881 au nucléotide 11184 de la séquence de la figure 2 en sous-clonant le fragment SacI-KpnI (1,1 kb) du plasmide pK23avec le fragment EcoRI-KpnI (1,7 kb) du plasmide pEco2 obtenu à l'exemple 1 dans le plasmide pORTl ci-dessus préalablement digéré avec les enzymes de restriction SacI et EcoRI. Le plasmide d'intégration pCIlA ainsi obtenu (figure 8C) a été ensuite transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 9 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCII# (CII62).

Une souche dans laquelle le gène eryCII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide

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pCII obtenu à l'exemple 8 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCIlA.

La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype eryont été réalisés comme à l'exemple 3.

De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 304 bp du nucléotide 10881 au nucléotide 11184 de la séquence de la figure 2) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.

Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction EcoRI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide C3-S ayant la séquence ci-dessus, une bande de 2,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 1,8 kb à partir du mutant CII62 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 400 pb dans cette région du chromosome.

L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C2-S GGAATTCATGACCACGACCGATC (SEQ ID N 34) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN de la fin du gène eryAIII située de la position 20258 à la position 20280 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X62569 et décrite par Bevitt et al., 1992 et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante C2-R CGCTCCAGGTGCAATGCCGGGTGCAGGC (SEQ ID N 35) correspondant à la séquence située de la position 10558 à la position 10585 de la séquence de la figure 2 permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF9. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 760 pb dans la souche sauvage et une bande d'environ 460 pb dans le mutant CII62 de façon identique au signal obtenu avec pCIlA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 400 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIlA (304 pb).

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CII62, a

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été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 10 : de la souche CII62 et identifi- cation des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche CII62 et les analyses par ccm suivie de bioautographie ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.

Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CII62 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de petites quantités d'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.

La séquence eryCII présente une forte homologie avec des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse de la daunosamine (DnrQ, 38 % d'identité au niveau protéique, Otten et al., 1995) et du mycaminose (protéine codée par l'ORF1*, 40 % d'identité au niveau protéique, Gandecha et al., 1997) qui ont également besoin de transférer un groupement céto en position 3 à partir d'un carbone adjacent.

Ces observations indiquent que le gène eryCII code pour la dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase dans la voie de biosynthèse de la dTDP-désosamine.

EXEMPLE 11 : clonage et séquençage de la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.

Des cosmides contenant la région eryAI-eryK du cluster de gènes ery tel que le cosmide Cos6B, ont été isolés par screening d'une banque d'ADN génomique de Sac. erythraea dans le vecteur cosmidique pWE15 (Stratagene) en utilisant comme sonde un fragment d'ADN de 13,2 kb comprenant la totalité du gène eryAI et correspondant à la région d'ADN comprise entre le site NcoI situé à la position 44382 de la séquence de la figure 3 et le site NcoI situé à la position 392 de la séquence X62569 (Bevitt et al., 1992). La sonde a été préparée de la façon suivante : Dans un premier temps, le fragment NcoI de 13,2 kb a été isolé à partir du plasmide pBK25 décrit par Bevitt et al., 1992 et sous-cloné dans le site SmaI de pUC18 après remplissage des extrémités NcoI avec le fragment de Klenow. A partir du plasmide pNC012 ainsi généré, le fragment de 13,2 kb a été isolé par digestion avec

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l'enzyme de restriction NcoI.

Le cosmide cos6B ainsi obtenu a été digéré par l'enzyme de restriction NcoI et les fragments résultants de 2,8 kb et 6,1 kb ont été clonés dans le site NcoI du vecteur Litmus28 générant respectivement les plasmides pNC028 et pNC062 montrés à la figure 5B.

Le plasmide pNC028 a été séquence par génération de sous-clones en utilisant l'exonucléase III selon le protocole du fournisseur de la trousse Erase-a-Base Kit (Promega) en digérant par les enzymes de restriction respectivement SacI/XbaI et NsiI/BamHI pour la direction inverse. La séquence a été complétée en utilisant comme amorces les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes 644 GATCACGCTCTTCGAGCGGCAG (SEQ ID N 36) 645 GAACTCGGTGGAGTCGATGTC (SEQ ID N 37) et 650 GTTGTCGATCAAGACCCGCAC (SEQ ID N 38)
Pour le séquençage du plasmide pNC062, des matrices ont été générées par sonication de l'ADN selon Bankier et al.

(1987) en utilisant pUC18 comme vecteur. La séquence a été complétée en utilisant comme amorces les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes : 646 CATCGTCAAGGAGTTCGACGGT (SEQ ID N 39) 647 TGCGCAGGTCCATGTTCACCACGTT (SEQ ID N 40) 648 GCTACGCCCTGGAGAGCCTG (SEQ ID N 41) 649 GTCGCGGTCGGAGAGCACGAC (SEQ ID N 42) et 874 GCCAGCTCGGCGACGTCCATC (SEQ ID N 43).

Les jonctions NcoI ont été séquencées en utilisant comme matrice l'ADN du cosmide cos6B obtenu ci-dessus dont les régions recouvrant les sites NcoI ont été séquencées en utilisant les amorces ayant les séquences 644 et 645 indiquées ci-dessus.

De plus, un fragment ClaI-NcoI de 0,9 kb, contenant le début de la séquence du gène eryAI et la partie 5' de l'ORF13, a été cloné dans pUC18. Ce fragment a été préparé de la façon suivante : Le plasmide pBK6-12 représenté à la figure 5B a d'abord été généré par sous-clonage dans le phagmide pTZ18R du fragment KpnI de 4,5 kb isolé à partir du plasmide pBK25 décrit par Bevitt et al., 1992. Le sous-clone

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pCN9 a ensuite été généré par sous-clonage du fragment ClaINcoI de 0,9 kb isolé à partir du plasmide pBK6-12 dans le site SmaI de pUC19, après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow. Le plasmide pCN9 ainsi obtenu (figure 5B) a été séquence. Des matrices ont été générées par sonication de l'ADN selon Bankier et al. (1987) en utilisant pUC18 comme vecteur. La séquence a été complétée en utilisant comme amorce l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : 875 CGACGAGGTCGTGCATCAG (SEQ ID N 44).

Le séquençage de l'ADN est réalisé par la méthode de Sanger (1977) en utilisant un séquenceur automatisé sur les matrices d'ADN double brin avec le séquenceur Applied Biosystem 373 A. L'assemblage des données de séquence a été réalisé avec le logiciel SAP (Staden, 1984). Les séquences ont été analysées en utilisant le logiciel GCG (Devereux, 1984) .

Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir la séquence nucléotidique de 8160 bp de la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6) dans laquelle sept ORFs (13-19) ont été identifiées respectivement du nucléotide 43841 au nucléotide 44806, du nucléotide 44809 au nucléotide 46053, du nucléotide 46109 au nucléotide 46819, du nucléotide 46907 au nucléotide 48436, du nucléotide 48436 au nucléotide 49638, du nucléotide 49679 au nucléotide 51145 et du nucléotide 51177 au nucléotide 51755 (numérotés dans la figure 3 à partir du site BamHI situé à l'extrémité 5' du gène ermE) (respectivement séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207, du nucléotide 1210 au nucléotide 2454, du nucléotide 2510 au nucléotide 3220, du nucléotide 3308 au nucléotide 4837, du nucléotide 4837 au nucléotide 6039, du nucléotide 6080 au nucléotide 7546 et du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et correspondant respectivement aux gènes eryBIV, eryBV, eryCVI, eryBVI, eryCIV, eryCV et eryBVII, selon Liu et Thorson (1994) dont les caractérisations fonctionnelles n'avaient pas encore été identifiées. Les sept ORFs (13-19) sont dans la même direction, la lecture se faisant à partir de la région 5' du gène eryAI.

Des échantillons de E. coli XLl-blue contenant la région

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codante des ORFs ci-dessus ont été déposés à la CNCM le 16 juillet 1997 : - le plasmide pBK6-12 comprenant la séquence codante pour l'ORF13 et pour une partie de l'ORF14 sous le numéro 1-1898 - le plasmide pNC028 comprenant la séquence codante pour les ORFs 14 et 15 ainsi que pour une partie des ORFs 13 et 16 sous le numéro 1-1901 et - le plasmide pNC062 comprenant la séquence codante pour les ORFs 17,18 et 19 ainsi que pour une partie de l'ORF16 sous le numéro 1-1900.

EXEMPLE 12 : du plasmide pBIVA.

L'ORF13 étant translationnellement couplé à l'ORF14 située en aval, une délétion en phase a dû être introduite.

Un plasmide d'intégration, dénommé pBIVA et portant cette délétion, a été construit selon le schéma de la figure 9A.

Le plasmide pPSP4 (figure 5B) a d'abord été construit par sous-clonage du fragment PvuII-SpeI (2,7 kb) isolé à partir du plasmide pBK6-12 obtenu à l'exemple 11 et du fragment SpeI-PstI (1,6 kb) isolé à partir du plasmide pNC028 obtenu à l'exemple 11 dans le vecteur pUC19 préalablement digéré à l'aide des enzymes de restriction SmaI et PstI.

* A partir du plasmide pPSP4, le plasmide pl9BIVA a été généré en délétant le fragment BclI-NcoI de 510 pb interne à l'ORF13 et en lui substituant 45 pb venant d'un adaptateur synthétique de 54 pb. Cet adaptateur a été généré par appariement des 2 oligonucléotides complémentaires ayant les séquences suivantes SEQ A AATTGATCAAGGTGAACACGGTCATGCGCAGGATCCTCGAGCGGAACTCCATGGGG (SEQ ID N 45) et SEQ B CCCCATGGAGTTCCGCTCGAGGATCCTGCGCATGACCGTGTTCACCTTGATCAATT (SEQ ID N 46) créant un site BclI et un site NcoI encadrant la séquence de 45 pb.

Pour l'appariement, les deux oligonucléotides ont été mis à une concentration finale 1,8 M dans le tampon d'hybridation NaCl 50 mM, Tris, HCl 20 mM pH 7,4, MgCl2,6H20

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2 mM, chauffés pendant 5 mn à 100 C puis refroidis lentement à température ambiante. Après digestion avec les enzymes de restriction NcoI et BclI, une ligature a été effectuée dans le plasmide pPSP4 dont le fragment BclI-NcoI de 510 pb avait préalablement été éliminé. A partir du plasmide pl9BIVA ainsi généré, le fragment SacI-EcoRI (2,2 kb) portant l'ORF13 modifiée a été sous-cloné dans le plasmide pUWL218 préalablement digéré avec les enzymes de restriction SacI et EcoRI. Le plasmide d'intégration pBIV ainsi obtenu (figure 9B) a été ensuite transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 13 : d'une souche Sac. erythraea eryBIVA (BIV87).

Une souche dans laquelle le gène eryBIV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBIV obtenu à l'exemple 12 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pBIV#.

La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3.

De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 510 bp du nucléotide 43872 au nucléotide 44382 de la séquence de la figure 3) et son remplacement par la séquence synthétique de 45 pb a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.

Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction XhoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide B4-R ayant la séquence suivante B4-R AACTCGGTGGAGTCGATGTCGTCGCTGCGGAA (SEQ ID N 47) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 44687 à la position 44718 de la séquence de la figure 3, une bande de 5,4 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 2,7 kb à partir du mutant BIV87 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence d'un site XhoI supplémentaire à une distance de 2,7 kb en amont du site XhoI situé à la position 47114 de la séquence de la figure 3 confirmant ainsi

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l'incorporation de l'adaptateur dans le chromosome de mutant, telle qu'attendue par l'incorporation de l'adaptateur synthétique ci-dessus utilisé pour générer le plasmide pBIVA.

L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B4-S CAATATAGGAAGGATCAAGAGGTTGAC (SEQ ID N 48) correspondant à la région d'ADN située de la position 43652 à la position 43678 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide B4-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF13. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 500 pb dans le mutant BIV87 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBIV87 (figure 16).

L'ensemble des résultats d'analyse par Southern et par PCR confirme la présence de la délétion de 510 pb et de l'adaptateur synthétique au niveau du chromosome du mutant.

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BIV87, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 14 : de la souche BIV87 et identifi- cation des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche BIV87 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.

Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche BIV87 accumule préférentiellement de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB.

Des métabolites mineurs de faibles mobilités manifestant une activité antibiotique ont également été détectés. Ces métabolites ont été extraits et analysés par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse comme décrit à l'exemple 4.

Les résultats de spectre de masse indiquent que des formes modifiées de l'érythromycine A, B, C et D ont été produites. Un métabolite majeur et 3 métabolites mineurs ont été détectés.

Le métabolite majeur M5 donne un pic parent à m/z 702

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avec des produits de déshydratation et de fragmentation à m/z 684, m/z 560 et m/z 158 et correspond à l'élimination de 2 atomes d'hydrogène dans l'érythromycine D (m/z 704, m/z 686).

La présence de désosaminyl érythronolide B (fragment m/z à 560) indique que la différence de masse est portée par le sucre neutre. La structure proposée pour ce métabolite est la 4"-céto érythromycine D.

Les métabolites mineurs donnent aussi un profil avec une différence de 2 dans les valeurs m/z respectivement : - M6 (m/z à 718, m/z 700, m/z 576, m/z 158) au lieu de m/z 720, m/z 702 pour l'érythromycine C ; - M7 (m/z à 732, m/z 714, m/z 576, m/z 158) au lieu de m/z 734, m/z 716 pour l'érythromycine A ; - M8 (m/z à 716, m/z 698, m/z 560, m/z 158) au lieu de m/z 718, m/z 700 pour l'érythromycine B.

Les structures proposées sont respectivement la 4"-céto érythromycine C pour M6, la 4"-céto érythromycine A pour M7 et la 4"-céto érythromycine B pour M8.

Ces observations indiquent que le gène eryBIV code pour la dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase dans la voie de biosynthèse du dTDP-mycarose.

La souche BIV87 a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1904 EXEMPLE 15 : construction du plasmide pBV#.

Un plasmide d'intégration, dénommé pBV# et portant une délétion dans le gène eryBV codant pour l'ORF14, a été construit selon le schéma de la figure 10A.

Une délétion de 726 pb a été générée dans l'ORF14 du nucléotide 44963 au nucléotide 45688 de la séquence de la figure 3 par ligature du fragment BclI-KpnI (1,1 kb) isolé à partir du plasmide pBK6-12, obtenu à l'exemple 11, au fragment KpnI-BamHI (1,1 kb) isolé à partir du plasmide pNC028, obtenu à l'exemple 11, dans le plasmide pUWL218 préalablement digéré par l'enzyme de restriction BamHI. Le plasmide d'intégration pBV# ainsi obtenu (figure 10B) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 16 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBVA

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(BV88).

Une souche dans laquelle le gène eryBV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBV# obtenu à l'exemple 15 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pBVA.

La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3.

De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 726 pb du nucléotide 44963 au nucléotide 45688 de la séquence de la figure 3) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.

Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : B5-R TCCGGAGGTGTGCTGTCGGACGGACTTGTCGGTCGGAAA (SEQ ID N 49) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 46060 à la position 46098 de la séquence de la figure 3, une bande de 2,7 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 2,0 kb à partir du mutant BV88 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 700 pb dans cette région du chromosome.

L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : B5-S AGGAGCACTAGTGCGGGTACTGCTGACGTCCTT (SEQ ID N 50) correspondant à la région d'ADN située de la position 44799 à la position 44831 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide B5-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF14. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,3 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 570 pb dans le mutant BV88 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBV88 (figure 16). Ces résultats confirment que la délétion de 710 pb détectée par analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBV# (726 pb).

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La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BV88, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 17 : de la souche BV88 et identification des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche BV88 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.

Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche BV88 accumule préférentiellement de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryB.

Des métabolites mineurs de faibles mobilités ont également été détectés puis extraits et identifiés par RPHPLC couplée à la spectrométrie de masse selon les conditions utilisées à l'exemple 4.

Le spectre de masse montre la présence d'un métabolite ayant un pic parent à m/z 560 et des produits de déshydratation et de fragmentation à m/z 542 et m/z 158 pour lequel la structure proposée est le désosaminyl érythronolide B.

La séquence eryBV présente une forte homologie avec d'autres glycosyltransférases ainsi qu'avec le gène eryCIII ci-dessus (60,7 % d'identité au niveau nucléotidique, 44 % au niveau protéique).

Ces observations indiquent que le gène eryBV code pour la mycarosyltransférase impliquée dans la biosynthèse de l'érythomycine.

EXEMPLE 18 : construction d'un plasmide pCVI# (pPSTI).

Un plasmide d'intégration, dénommé pPSTI et portant une délétion dans le gène eryCVI codant pour l'ORF15, a été construit selon le schéma de la figure 11A de la façon suivante :
Dans un premier temps, le plasmide pNB49 a été généré par traitement à l'exonucléase III du plasmide pNC028 obtenu à l'exemple 11 préalablement digéré par les enzymes de restriction NsiI et BamHI. Le plasmide pNB49 (figure 5B) contenant les nucléotides 44382 à 46562 de la séquence de la figure 3, a été ensuite digéré à l'aide de l'enzyme de restriction PstI puis traité par la nucléase Mung Bean (NE Biolabs) comme décrit par Sambrook et al. (1989). Après

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religature et transformation dans E. coli XL1-Blue, les colonies résistantes à l'ampicilline ont été sélectionnées par analyse de restriction avec l'enzyme PstI. La perte du site PstI a été confirmée par séquençage d'un clone en utilisant l'amorce M13 inverse et la délétion du nucléotide 46364 de la séquence de la figure 3 a été observée créant un changement de phase dans l'ORF15 dans le plasmide pNB49APst ainsi généré. Le plasmide pIJ702 digéré avec l'enzyme de restriction BglII a été ensuite ligaturé au site BglII du plasmide pNB49APst générant le plasmide pPSTI. L'orientation de pIJ702 dans pPSTI a été confirmée par la présence d'un fragment d'ADN ayant 0,9 kb après digestion avec l'enzyme de restriction SphI. Le plasmide d'intégration pPSTI (figure 11B) ainsi obtenu a été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 19 : d'une souche Sac. erythraea eryCVI# (PstlO).

Une souche dans laquelle le gène eryCVI porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pPSTI obtenu à l'exemple 18 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pPSTI.

La préparation des protoplastes et le processus d'intégration ont été réalisés comme à l'exemple 3.

La sélection des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée comme à l'exemple 3 en utilisant une souche B. subtilis sensible à l'érythromycine au lieu d'une souche B. pumilus comme souche indicatrice. La souche B. subtilis ATCC 6633 a été utilisée pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques sur des boîtes d'agar en milieu Ml-102 inoculées avec le mutant à analyser et incubées pendant 3 jours à 30 C. Des zones d'agar recouvertes de bactéries ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes 2 x TY recou- vertes d'une surcouche de 5 ml d'agar en milieu TY contenant 200 /il d'une culture de B. subtilis ATCC 6633, puis incubées une nuit à 37 C.

L'absence de production d'érythromycine a été évaluée également en présence de précurseurs ajoutés tels que

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l'érythronolide B ou le 3-a-mycarosyl érythronolide B par application de 10 l d'une solution 10 mM de chaque métabolite sur les zones d'agar découpées suivie d'une incubation à 30 C pendant une nuit avant de recouvrir les boites de la culture de B. subtilis comme indiqué ci-dessus. La souche Sac. erythraea sauvage "red variant" a été utilisée comme contrôle.

Après la transformation des protoplastes avec le plasmide pPSTI et la sélection des colonies résistantes au thiostrepton, l'intégration dans le chromosome a été confirmée par analyse de Southern selon les méthodes générales décrites à l'exemple 3.

Un fragment d'ADN de 1269 pb correspondant à l'ORF14 généré par PCR en utilisant les oligonucléotides synthétiques ayant les séquences suivantes : 14-1 GGGGGATCCCATATGCGGGTACTGCTGACGTCCTTCG (SEQ ID N 51) et 14-2 GAAAAGATCTGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTC (SEQ ID N 52) a été utilisé comme sonde.

L'oligonucléotide 14-1 a été dessiné de façon à introduire un site BamHI et un site NdeI en amont de la séquence correspondant à la région d'ADN située de la position 44811 à la position 44833 de la séquence de la figure 3.

L'oligonucléotide 14-2 a été dessiné de façon à introduire un site BglII en aval de la séquence correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 46027 à la position 46053 de la séquence de la figure 3.

L'ADN chromosomique préalablement digéré avec les enzymes de restriction ClaI et PstI a montré les bandes attendues de 4 kb et 7 kb à partir de l'intégrant alors que la souche sauvage présentait la bande de 3 kb attendue.

Après cultures répétées des intégrants, les colonies individualisées obtenues ont été analysées pour la sensibilité au thiostrepton et la production d'érythromycine, puis l'intégration de la délétion attendue (délétion du nucléotide 46364 de la séquence de la figure 3) dans le chromosome d'un clone mutant ayant le phénotype ery- (PstlO) a été confirmée par analyse de Southern. L'ADN chromosomique, isolé respectivement à partir de la souche sauvage et du mutant PstlO, a

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été digéré avec l'enzyme de restriction PstI. L'hybridation avec la sonde PstI-NcoI de 0,8kb (nucléotides 46368 à 47142 de la séquence de la figure 3) a donné le profil attendu avec une bande PstI de lkb correspondant aux nucléotides 46368 à 47397 de la séquence de la figure 3 à partir de la souche sauvage et avec une bande >20 kb à partir du mutant. La perte du site PstI à la position 46368 ci-dessus a aussi été montrée après double digestion par les enzymes PstI et NcoI, résultant en une bande PstI-NcoI de 0,8 kb (nucléotide 46368 à 47142) à partir de la souche sauvage et une bande NcoI de 2,8 kb (nucléotide 44382 à 47142) avec le mutant.

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée PstlO, a ensuite été cultivée pour identifier les métabolites produits.

EXEMPLE 20 : fermentation de la souche PstlO et identification des métabolites secondaires produits.

La souche PstlO a été cultivée dans le milieu sucrosesuccinate décrit par Caffrey et al. (1992) pendant 3 jours à 30 C. Le surnageant de culture a été ensuite extrait à pH 9 avec de l'acétate d'éthyle.Les phases organiques obtenues ont été séchées sur S04Mg2 puis amenées à sec sous pression réduite. Le résidu a été dissous dans le mélange acétonitrile-eau (1:1, v/v), puis a ensuite été analysé par spectrométrie de masse sur un spectromètre BioQ (Micromass, Manchester, UK) ou Finningan LCQ (Finningag, CA).

La production d'érythomycine A (m/z 734 et m/z 716) n'a pas été observée mais la présence d'érythronolide B (MK+ : m/z 441 et MNa+ : m/z 425) ainsi que de 3-a-mycarosyl érythronolide B (MK+ : m/z 585 et MNa+ : m/z 569) mise en évidence caractérise la souche PstlO comme un mutant eryC.

La séquence eryCVI présente une forte homologie avec d'autres méthyltransférases telles que SnoX impliquée dans la biosynthèse de la nogalamycine chez S. nogalater (numéro d'accession EMBL S52403) (55,5 % d'identité au niveau protéique), TylMl impliquée dans la biosynthèse de la tylosine chez S. fradiae (numéro d'accession EMBL X81885) (65 % d'identité au niveau protéique) et SrmX impliquée dans la biosynthèse de la spiramycine chez S. ambofaciens (numéro

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d'accession EMBL S25204) (52,8 % d'identité au niveau protéique).

Ces observations indiquent que le gène eryCVI code pour la dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase impliquée dans la voie de biosynthèse de la dTDP-D-désosamine.

EXEMPLE 21 : d'un plasmide pBVI (pXhoI).

Un plasmide d'intégration, dénommé pXhoI et portant une délétion dans le gène eryBVI codant pour l'ORF16, a été construit selon le schéma de la figure 12A de la façon suivante :
Le fragment NcoI-XhoI (3,1 kb) du plasmide pNC062 obtenu à l'exemple 11 et contenant les nucléotides 47142 à 50254 de la séquence de la figure 3 a été sous-cloné dans les sites NcoI et XhoI du plasmide Litmus 28. Le plasmide pNC062X (figure 5B) ainsi généré a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI puis traité avec l'ADN polymérase T4 (Boehringer Mannheim). Après religature et transformation dans E. coli XL1-Blue, la perte du site PstI au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par séquençage et une délétion de 60 pb du nucléotide 47337 au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3 ont été observés. Le plasmide pIJ702 digéré avec l'enzyme de restriction BglII a été ensuite ligaturé au site BglII de cette contruction. L'orientation de pIJ702 dans la construction a été confirmée par la présence d'un fragment d'ADN ayant 4,3 kb après digestion avec l'enzyme de restriction XhoI. Le plasmide d'intégration pXhoI (figure 12B) ainsi obtenu a été utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 22 : construction d'une souche Sac. erythraea eryBVI (Xho91).

Une souche dans laquelle le gène eryBVI porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pXhoI obtenu à l'exemple 21 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pXhoI.

La préparation des protoplastes et le processus d'intégration ont été réalisés comme à l'exemple 3.

La sélection et l'analyse des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée selon les conditions décrites à l'exemple

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19.

L'intégration dans le chromosome et la présence de la délétion attendue ont été confirmées par analyse de Southern selon les méthodes générales décrites à l'exemple 19.

Après la transformation des protoplastes avec le plasmide pXhoI et la sélection des colonies résistantes au thiostrepton, l'intégration dans le chromosome a été confirmée par analyse de Southern. En utilisant comme sonde le fragment PstI de 3,3 kb du plasmide pNC062, l'ADN chromosomique d'un intégrant préalablement digéré avec les enzymes de restriction PstI et BglII a montré les bandes 3 kb et 6 kb attendues.

Après cultures répétées des intégrants, les colonies individualisées obtenues ont été analysées pour la sensibilité au thiostrepton et la production d'érythromycine, puis l'intégration de la délétion attendue (délétion de 60 pb du nucléotide 47338 au nucléotide 47397 de la séquence de la figure 3) dans le chromosome d'un clone mutant ayant le phénotype ery- (XhoI) a été confirmée par analyse de Southern. L'ADN chromosomique, isolé respectivement à partir de la souche sauvage et du mutant XhoI, a été digéré avec l'enzyme de restriction PstI. L'hybridation avec la sonde PstI-NcoI de 0,8 kb (nucléotides 46368 à 47142 de la séquence de la figure 3) a donné le profil attendu avec une bande PstI de 1 kb correspondant aux nucléotides 46368 à 47397 de la séquence de la figure 3 à partir de la souche sauvage et avec une bande de 4 kb à partir du mutant indiquant que le site PstI à la position 47397 ci-dessus a été perdu.

La perte du site PstI à la position 47397 a aussi été confirmée par PCR. L'ADN chromosomique a été soumis à une amplification par PCR en utilisant les amorces correspondant respectivement à la séquence du nucléotide 47300 au nucléotide 57320 et à la séquence du nucléotide 47661 au nucléotide 47636 de la séquence d la figure 3. Un fragment attendu de 306 pb a été ainsi amplifié à partir de la souche sauvage générant après digestion avec l'enzyme de restriction PstI deux bandes d'environ 100 et 300 pb. A partir du mutant Xho91, un fragment de 300 pb a été amplifié, résultant de la

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délétion de 60 pb. Ce fragment a été ensuite isolé et a été trouvé résistant à la digestion par l'enzyme PstI.

La souche recombinante ainsi obtenue et désignée Xho9l, a ensuite été cultivée pour identifier les métabolites produits.

EXEMPLE 23 : fermentation de la souche Xho91 et identification des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche Xho91 et l'analyse du surnageant de culture par spectrométrie de masse ont été réalisées selon les conditions décrites à l'exemple 20.

La production d'érythomycine A (m/z 734 et m/z 716) n'a pas été observée mais la présence d'une quantité majoritaire d'érythronolide B (MK+ : m/z 441 ; MNa+ . m/z 425 ; M-H20 H+ : m/z 385) ainsi que la présence de désosaminyl érythronolide B (m/z 560) mises en évidence caractérisent la souche PstlO comme un mutant eryB.

Les résultats de spéctrométrie de masse ont été confirmés par spectrométrie de masse en haute résolution sur un spectromètre Brucker FT-ICR (Brucker, FRG).

La séquence eryBVI présente une forte homologie avec DnmT impliquée dans la biosynthèse de la daunorubicine chez S. peucetius (numéro d'accession EMBL U77891) (43,9 % d'identité au niveau protéique).

Ces observations indiquent que le gène eryBVI code pour la dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase impliquée dans la biosynthèse du dTDP-mycarose, comme suggéré par Scotti et Hutchinson, 1996.

EXEMPLE 24 : construction du plasmide pCIVA.

Un plasmide d'intégration, dénommé pCIV# et portant une délétion dans le gène eryCIV codant pour l'ORF17, a été construit selon le schéma de la figure 13A de la façon suivante :
Le plasmide pNC062 obtenu à l'exemple 11 a été digéré à l'aide des enzymes de restriction BalI et Bell de façon à éliminer un fragment ayant 949 pb à l'intérieur de l'ORF17 du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3. Après remplissage des extrémités à l'aide du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, le plasmide a été

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religaturé et transformé dans E. coli XL1-blue. A partir du plasmide pBCB17 ainsi généré, le fragment de 2,68 kb portant la délétion a été isolé par digestion à l'aide des enzymes XbaI et SphI, puis sous-cloné dans les sites correspondant du plasmide pUWL218. La présence de la délétion de 949 pb du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par séquençage. Le plasmide d'intégration pCIV ainsi obtenu (figure 13B) a ensuite été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 25 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCIVA (CIV89) .

Une souche, dans laquelle le gène eryCIV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCIVA obtenu à l'exemple 24, a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCIVA.

La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3.

De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 949 bp du nucléotide 48650 au nucléotide 49598 de la séquence de la figure 3 a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites à l'exemple 3.

Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C4-R AGCGGCTTGATCGTGTTGGACCAGTAC (SEQ ID N 53) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 49996 à la position 50022 de la séquence de la figure 3, une bande de 6,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 5,2 kb à partir du mutant CIV89 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence dans le mutant d'une délétion d'environ 1 kb dans cette région du chromosome.

L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante :

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C4-S GGCCTATGTGGACTACGTGTTGAACGT (SEQ ID N 54) correspondant à la région d'ADN située de la position 48169 à la position 48195 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide C4-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF17. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande de 1,8 kb dans la souche sauvage et une bande de 900 pb dans le mutant CIV89 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pCIVA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pCIV (949 pb).

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CIV89, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 26 : fermentation de la souche CIV89 et identification des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche CIV89 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.

Les résultats de ccm (figure 17) montrent que la souche CIV89 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.

Des métabolites mineurs de faibles mobilités ont été également détectés, puis extraits et analysés par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse selon les conditions utilisées à l'exemple 4.

Un métabolite mineur donne un pic parent à m/z 720 et des produits de déshydration et de fragmentation à m/z 702, m/z 576 et m/z 174. Le pic 174 peut correspondre à la 4-hydroxydésosamine et le pic 576 au 4'-hydroxydésosaminyl érythronolide B.

Ces résultats suggèrent que la différence de m/z de 16 comparée à l'érythromycine D (pic parent m/z 704) est portée par le sucre aminé. La structure proposée pour ce métabolite est la 4'-hydroxy érythromycine D.

Ces observations indiquent que l'enzyme est impliquée

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dans le retrait du groupement hydroxyle dans la voie de biosynthèse de l'érythromycine et que le gène eryCIV code pour la dTDP-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase.

La souche CIV89 a été déposée à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro 1-1905.

EXEMPLE 27 : du plasmide pCV# .

Un plasmide d'intégration, dénommé pCV# et portant une délétion dans le gène eryCV codant pour l'ORF18, a été construit selon le schéma de la figure 14A de la façon suivante :
Le fragment BalI-BamHI (3,48 kb), obtenu à partir du plasmide pNC062 préparé à l'exemple 11 par digestion avec les enzymes de restriction BalI et BamHI, a été sous-cloné dans les sites SmaI-BamHI du vecteur pUC19. Du plasmide résultant pBAB18 (figure 5B), le fragment interne ScaI (lkb) a été ensuite délété par digestion avec l'enzyme ScaI pour générer une délétion de 1044 pb du nucléotide 49998 au nucléotide 51041 de la séquence de la figure 3 dans l'ORF18. Du plasmide pBABACV ainsi obtenu, le fragment portant la délétion a ensuite été réisolé à partir du polylinker de pUC19 par digestion avec les enzymes de restriction HindIII et EcoRI, puis sous-cloné dans le plasmide pUWL218. Le plasmide d'intégration pCV# ainsi obtenu (figure 14B) a été transféré dans la souche E. coli DH5aMRC, puis utilisé pour transformer Sac. erythraea.

EXEMPLE 28 : construction d'une souche Sac. erythraea eryCVA (CV90).

Une souche dans laquelle le gène eryCV porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pCV# obtenu à l'exemple 27 a été préparée par transformation des protoplastes de Sac. erythraea avec le plasmide pCV#.

La préparation des protoplastes, le processus d'intégration et la sélection des mutants ayant le phénotype ery- ont été réalisés comme à l'exemple 3.

De plus, la présence de la délétion attendue dans le chromosome (délétion de 1044 pb du nucléotide 49998 au nucléotide 51041) a été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR selon les conditions décrites

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à l'exemple 3.

Par hybridation Southern sur l'ADN génomique digéré par l'enzyme de restriction NcoI, en utilisant comme sonde l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C5-R AACGCCTCGTCCTGCAGCGGAGACACGAACA (SEQ ID N 55) correspondant au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 51229 à la position 51259 de la séquence de la figure 3, une bande de 6,2 kb à partir de la souche sauvage et une bande de 5,1 kb à partir du mutant CV90 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent chez le mutant la présence d'une délétion d'environ 1,1 kb dans cette région du chromosome.

L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : C5-S TTCGCTCCCCGATGAACACAACTCGTA (SEQ ID N 56) correspondant à la région d'ADN située de la position 49668 à la position 49694 de la séquence de la figure 3 et l'oligonucléotide C5-R ayant la séquence indiquée ci-dessus, permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF18. L'analyse par amplification par PCR a permis de détecter une bande d'environ 1,6 kb dans la souche sauvage et une bande d'environ 500 pb dans le mutant CV90 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pCV#. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 1,1 kb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide PCV# (1044 pb).

La souche recombinante ainsi obtenue, désignée CV90, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.

EXEMPLE 29 : fermentation de la souche CV90 et identification des métabolites secondaires produits.

La culture de la souche CV90 et les analyses par ccm ont été réalisées selon les conditions indiquées à l'exemple 4.

Les résultats de ccm (figure 17) montre que la souche CV90 accumule préférentiellement du 3-a-mycarosyl érythronolide B ainsi que de l'érythronolide B comme attendu d'un mutant eryC.

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La séquence des résidus 38-50 (VTGAGDGDADVQA) Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gin Ala (SEQ ID N 61) de la protéine codée par eryCV (séquence de SEQ ID N 11) est proche de la séquence consensus de liaison au NAD+ décrit par Wierenga et al., 1985 et par Scrutton et al., 1990.

Ces observations permettent de conclure que le gène eryCV code pour une réductase qui interviendrait comme une dTDP-4,6-désoxyhexose 3,4-réductase dans la voie de biosynthèse de la d-TDP-désosamine.

EXEMPLE 30 : surexpression du produit du gène eryCIII dans E. coli.

L'expression hétérologue du produit du gène eryCIII de Sac. erythraea correspondant à l'ORF8 décrite à l'exemple 1 et codant pour l'activité désosaminyltransférase identifiée à l'exemple 7 a été réalisée en utilisant E. coli comme souche hôte. La protéine ainsi produite sous forme de corps d'inclusion a été ensuite purifiée et son activité enzymatique déterminée in vitro.

1) Expression de la protéine EryCIII dans E. coli
L'expression a été réalisée en utilisant le vecteur pETlla (Stratagène) pour le clonage et l'expression de protéines recombinantes dans E. coli sous le contrôle du promoteur de l'ARN polymérase du bactériophage T7.

Dans un premier temps, le gène eryCIII a été amplifié à partir du plasmide pK62 décrit à l'exemple 1 de la façon suivante :
L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant la polymérase Native Pfu (Stratagène) et comme amorces l'oligonucléotide A homologue au brin codant du gène eryCIII ayant la séquence A GAAGGAGATATACATATGCGCGTCGTCTTCTCCTC (SEQ ID N 57) permettant d'introduire un site NdeI en amont de l'ATG initiateur de eryCIII et l'oligonucléotide B homologue au brin complémentaire du gène eryCIII ayant la séquence B CGGGATCCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCCTGC (SEQ ID N 58) permettant d'introduire un site BamHI en aval du codon stop du gène eryCIII.

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L'ADN amplifié a été ensuite digéré par les enzymes de restriction Ndel et BamHI, puis le fragment NdeI-BamHI de 1,2 kb obtenu contenant la totalité du gène eryCIII a été ligaturé dans le vecteur d'expression pETlla (Stratagène) qui contient le gène a-lactamase de résistance à l'ampicilline, l'origine de réplication ColEl et le promoteur du gène de l'ARN polymérase T7 situé en amont du site de clonage Ndel, préalablement digéré avec les enzymes de restriction Ndel et BamHI. Après ligation et transformation dans E. coli XL1- blue, le plasmide pCEIII ainsi obtenu a été confirmé par carte de restriction et séquençage.

La souche d'E. coli BL21 (DE3) de la trousse pET (Stratagène) qui contient dans son ADN chromosomique le gène lacIq et le promoteur lacUV5 en amont du gène de l'ARN polymérase T7, a ensuite été transformée par le plasmide pECIII.5.

La souche transformée obtenue, dénommée BL21/pECIII, a été cultivée en erlen de 50 ml à 37 C en milieu LB ensemencé à D0600=0,1 à partir d'une préculture, puis induite par l'isopropyl--D-thiogalactopyranoside (IPTG) 1mM à D0600=1.

Après 3 h 30 d'induction, 1 ml de culture a été prélevé et centrifugé, puis le culot bactérien obtenu a été dissout dans 240 l d'eau et 120 /il de tampon d'échantillon SDS 3X (Tris- HC1 1M pH = 6,8 : 1,9 ml ; 3 ml ; -mercaptoéthanol 1,5 ml ; 20 % , 3 ml ; de bromophénol 1 % pH = 7 : 0,3 ml ; H20 qsq 10 ml). A partir de 15 l de la solution obtenue, les protéines totales extraites ont été analysées par SDS-PAGE sur un gel à 10 % de polyacrylamide avec une coloration au bleu de Comassie.

La surexpression d'une protéine ayant un poids moléculaire apparent d'environ 46 Kd correspondant au PM attendu pour la protéine EryCIII a été observée comparative- ment aux protéines totales d'une souche témoin transformée par le plasmide pETlla.

2) Purification de la protéine EryCIII
La souche transformée BL21/pECIII ci-dessus a été cultivée en fermenteur de 6 litres en milieu minimum contenant du glycérol comme source de carbone (Korz et al.,

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1995) à 25 C jusqu'à D0600=12, puis induite par l'IPTG pendant 18 h jusqu'à D0600=54. A partir du bouillon récolté, le culot bactérien contenant des corps d'inclusion a été isolé par centrifugation à 5000 g pendant 30 mn.

L'induction de la protéine EryCIII a été contrôlée par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 20 %) et avec une coloration au bleu de Comassie après lyse sur un aliquot dans le tampon SDS 1 %, à 100 C pendant 5 min, soit directement sur le bouillon récolté, soit sur le culot bactérien après une première lyse par sonication dans un tampon phosphate.

190 g de culot bactérien correspondant à 1 litre de bouillon récolté ont été remis en suspension dans 2,5 volumes de tampon KH2P04/K2HP04 20 mM pH 7,2 contenant de l'EDTA 2,5 mM et du DTT 2,5 mM. Les cellules ont été ensuite lysées en utilisant un appareil Rannie (Mini-Lab, type 8-30H, APV Homogenisers As, Denmark) avec trois passages sous une pression de 1000 bars. Après centrifugation à 46. 000 g pendant 3 heures, le culot obtenu a été mis en suspension dans 2,5 volumes d'urée 2M puis centrifugé dans les mêmes conditions.

Le culot ainsi lavé a été ensuite mis en suspension dans 2,5 volumes d'une solution d'urée 7M dans du tampon tris 50 mM pH 7,5 (tampon A) de façon à solubiliser la protéine EryCIII. Après centrifugation dans les mêmes conditions, le surnageant recueilli obtenu contient 2,1 g de protéines totales déterminées par la méthode de Bradford en utilisant une trousse du commerce (Pierce).

L'extrait dans l'urée 7M a été ensuite chargé à la vitesse de 0,5 mètres/h et à 4-8 C sur une colonne de 180 ml (5 cm x 9 cm) de Q sepharose (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le tampon A ci-dessus et avec une détection à 280 nm. La protéine EryCIII a été ensuite éluée avec le tampon A contenant NaCl 0,3M. Les fractions réunies, contenant la protéine EryCIII, mise en évidence par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 20 %) révélée par coloration au bleu de Comassie et 835 mg de protéines totales, ont été ensuite chargées sur une colonne de 5,5 litres (10 cm x 70 cm) de Superdex 200 Prep grade (Pharmacia)

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préalablement équilibrée avec le tampon A ci-dessus. Par élution de la colonne avec le tampon A et par détection à 280 nm, un pic de protéine a été obtenu dont les fractions contenant la protéine EryCIII mise en évidence par SDS-PAGE et 200 mg de protéines totales ont été réunies puis purifiées sur une colonne de 180 ml (5 cm x 9 cm) de Q Source (Pharmacia) préalablement équilibrée avec le tampon A. Par élution avec un gradient linéaire de NaCl variant de 0 à 0,3 M dans le tampon A, 30 ml de solution contenant 100 mg de protéine EryCIII dénaturée homogène en pureté évaluée par SDS-PAGE, avec une révélation au nitrate d'argent, ont été obtenus.

La figure 18 montre l'évolution de la pureté de la protéine EryCIII suivie par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 15 %) pour un dépôt de 500 ng de protéines totales et une révélation au nitrate d'argent successivement après extraction à l'urée 7M (ligne 2), chromatographie Q sepharose (ligne 3), chromatographie Superdex (ligne 4), chromatographie Q source (ligne 6) par rapport aux marqueurs de poids moléculaire (lignes 1 et 5).

La protéine EryCIII a été ensuite renaturée par dilution de l'éluat homogène avec une solution de tampon A contenant du DTT 10 mM pour obtenir une concentration finale en protéine de 0,1 mg/ml. La solution diluée a été ensuite dialysée contre du tampon Tris 50 mM ; NaCl 0,15 M ; % n-octyl--D-glucopyranosyl (NOG) ; DTT 10 mM, pH 8,3 puis concentrée à 4 mg/ml par ultrafiltration sur une membrane PLGC04310 (Millipore) ayant un seuil de coupure de 10.000.

La protéine EryCIII purifiée a été ensuite conservée à l'état congelé à -20 C en aliquots de 500 l.

3) Caractérisation de la protéine EryCIII
La caractérisation de la protéine EryCIII ainsi obtenue a été examinée pour les propriétés suivantes : a) Homogénéité.

L'électrophorèse par SDS-PAGE (gradient de polyacrylamide : 10 à 15 %) en utilisant l'appareil Phast System (Pharmacia) et une révélation au nitrate d'argent montre une pureté supérieure à 99 % pour un dépôt de 2000 ng.

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b) Poids moléculaire par électrophorèse et spectrométrie de masse.

Par électrophorèse, un PM apparent de 46 kDa a été déterminé en accord avec le PM calculé de 45929.

L'analyse par RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse (HPLC : ESI-SM) donne une masse de 45934 uma. c) Séquence en acide aminés N-terminale
La séquence N-terminale a été déterminée par microséquençage sur un microséquenceur de protéine Model A492 couplé à un analyseur HPLC de PTH-aminoacides (Applied Biosystems).

Aucune séquence secondaire n'a été décelée pour les 10 premiers résidus qui est en accord avec la séquence en acides aminés décrite à la figure 2 (séquence de SEQ ID N 5). d) Activité biologique
L'activité désosaminyl transférase de la protéine EryCIII a été déterminée in vitro par la mise en évidence de la formation d'érythromycine D à partir de dTDP-D-désosamine, dont la préparation est décrite plus loin et de 3-a-mycarosyl érythronolide B (MEB) dont la préparation est décrite cidessus dans Matériels et Méthodes générales.

Le milieu de réaction contient 150 nmoles de dTDP-Ddésosamine, 137,4 nmoles de MEB et 1 mg de protéine EryCIII en utilisant les conditions opératoires suivantes :
Dans un tube en verre à vis, on introduit successivement 4,78 ml de tampon Tris 50 mM pH 7,3 (tampon B) ; 20/il de dTDP-D-désosamine, sel de triéthylamine (150 nmoles) en solution dans le tampon B contenant EDTA 1 mM et PEFABLOC 0, 4 mM (Merck) ; 100 /il de MEB (137,4 nmoles) en solution dans le tampon B et 1 mg de protéine EryCIII correspondant à 250 l d'un aliquot de solution congelée obtenue ci-dessus.

Après homogénisation au Vortex, le tube bouché est placé pendant 5 h dans un bain thermostaté à 30 C, puis on ajuste le pH à 9-10 avec NaOH 32 % puis extrait le mélange réactionnel 3 fois avec 5 ml d'acétate d'éthyle. L'extrait obtenu, amené à sec sous pression réduite, puis repris par 100 l de chlorure de méthylène est ensuite analysé par ccm

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dans les conditions indiquées à l'exemple 4 en utilisant comme éluant le mélange chlorure de méthylène/méthanol (90 : 10,v/v).

Un essai témoin (t = 0) dont l'incubation est arrêtée immmédiatement par l'ajout de NaOH, est effectué dans les mêmes conditions.

Les résultats obtenus par révélation chimique montrent l'apparition d'un produit moins mobile ayant un Rf voisin de l'érythromycine D attendue et pour lequel une faible activité antibiotique est détectée par autobiogramme direct des plaques sur B. pumilus. Aucune activité biologique n'est observée pour l'essai témoin (figure 19).

Ces résultats confirment que la protéine EryCIII produite dans E. coli et purifiée ci-dessus a l'activité désoaminyl transférase attendue et a été correctement renaturée.

EXEMPLE 31 : utilisation de la séquence du gène eryCIII comme sonde pour isoler les gènes oleG1 et oleG2 codant pour des glycosyltransférases chez S. antibioticus.

1) clonage des gènes oleG1 et oleG2
La séquence du gène eryCIII de Sac. erythraea correspondant à l'ORF8 décrite à l'exemple 1 codant pour l'activité désosaminyltransférase a été utilisée pour préparer une sonde d'hybridation et a permis d'isoler des gènes homologues dans la souche S. antibioticus ATCC 11891 productrice d'oléandomycine par hybridation Southern.

L'intégralité du gène eryCIII a été amplifiée par PCR à partir de 6 ng du plasmide pK62 obtenu à l'exemple 1 en suivant les conditions opératoires décrites à l'exemple 3 en utilisant la polymérase native pfu (Stratagene) et comme amorces l'oligonucléotide ayant la séquence suivante : eryCIII-1 CGGGTACCATGCGCGTCGTCTTCTCCTCCATG (SEQ ID N 59) comportant un site de restriction KpnI dans sa région 5' et dont la partie 3' correspond au brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 10196 à la position 10219 de la séquence de la figure 2 et l'oligonucléotide eryCIII2 ayant la séquence suivante : eryCIII-2 CGGGTACCTCATCGTGGTTCTCTCCTTCC (SEQ ID N 60)

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comportant un site KpnI dans sa région 5' et dont la partie 3' correspond à la région d'ADN située de la position 8954 à la position 8974 de la séquence de la figure 2.

La bande d'environ 1,2 kb obtenue par amplification a été ensuite digérée par l'enzyme de restriction KpnI et clonée dans le plasmide pUC19 préalablement digéré par l'enzyme KpnI. Le plasmide pCIIIPCRl ainsi obtenu a été ensuite utilisé pour réisoler le fragment KpnI de 1,2 kb correspondant à l'intégralité du gène eryCIII montré à la figure 2. Le fragment ainsi isolé a été ensuite marqué au 32p par la technique "random priming" décrite par Sambrook et al., 1989 et utilisé comme sonde eryCIII pour analyser par hybridation Southern des clones cosmides obtenus à partir d'une banque d'ADN génomique de S. antibioticus ATCC 11891 et préparés de la façon suivante (figure 20) :
Une série de six cosmides (cosAB35, cosAB76, cosAB87, cosAB67, cosAB63 et cosAB61) se chevauchant et couvrant environ 100 kb de la région correspondant au cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine a été isolée en suivant la méthode décrite par Swan et al., 1994 en utilisant comme sondes le fragment SmaI de 2 kb interne à la troisième sousunité de la polykétide synthase de Sac. erythraea dans le cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine (Cortes et al., 1990) suivie d'une marche sur le chromosome. Les sondes strD, strE et strM codant respectivement pour la dTDPglucose synthase, la dTDP-glucose 4,6-déshydratase et la dTDP-6-désoxyglucose 3,5-épimérase de S. griseus (Stockmann et Piepersberg, 1992) hybrident avec les cosmides cosAB61 et cosAB63 (fig. 20). De façon analogue, par hybridation Southern avec la sonde eryCIII préparée ci-dessus effectuée selon les conditions standard décrites par Hopwood et al., 1985, le cosmide cosAB35 (Swan et al., 1994) donne des signaux positifs dans deux fragments de restriction BamHI de 3,5kb et de 2,7 kb représentés à la figure 20. Le sousclonage et le séquençage ultérieurs montrent que ces deux fragments sont séparés par un fragment BamHI de 0,6 kb non détecté par hybridation.

Un fragment SstI de 10,8 kb d'ADN génomique de

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S. antibioticus ATCC 11891 représenté à la figure 21, correspondant à la partie droite du cluster de gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine comprise entre le site SstI en position 11081 du gène OLE-ORF3 des PKS de la séquence EMBL n L09654) et le site SstI en position 5 de la séquence EMBL n L36601 situé à 1,4 kb en amont du gène oleB et hybridant avec la sonde eryCIII préparée ci-dessus, a été isolé à partir du cosmide cosAB35 et sous-cloné dans le vecteur plasmidique pSL1180 (Pharmacia Biotech). Le clone pC035-S ainsi obtenu a été utilisé pour générer des matrices simple brin par sous-clonage de différents fragments d'ADN dans les bactériophages M13mpl8 et MP13mpl9 (New England Biolabs), puis la séquence nucléotidique de ces fragments a été déterminée selon la méthode de Sanger et al. (1977) en utilisant une polymérase T7 modifiée (Sequenase version 2.0; U. S. Biochemicals) en présence d'a[35S]dCTP (Amersham) et de 7-déaza-dGTP, selon les recommandations du fournisseur afin de limiter les problèmes de compression de bandes. Les amorces conventionnelles fournies avec la trousse Sequenase ainsi que les amorces synthétiques (17mer) internes ont été utilisées.

L'assemblage des données de séquence a été réalisé en utilisant le programme Fragment Assembly (Genetic Computer Group, University of Wisconsin) et l'identification des phases ouvertes de lecture en utilisant le programme CODONPREFERENCE (Devereux et al., 1984).

Les séquences nucléotidiques obtenues ont permis d'établir la séquence nucléotidique de 6093 bp représentée à la figure 22 (séquence de SEQ ID N 15), comprise entre les sites SphI* et KpnI montrés à la figure 21, dans laquelle cinq ORFs ont été identifiées respectivement du nucléotide 184 au nucléotide 1386 (ORF dénommée oleP1), du nucléotide 1437 au nucléotide 2714 (ORF dénommée oleG1), du nucléotide 2722 au nucléotide 3999 (ORF dénommée oleG2), du nucléotide 3992 au nucléotide 4729 (ORF dénommée oleM) et du nucléotide 4810 au nucléotide 5967 (ORF dénommée oleY). Les cinq ORFs sont transcrites dans la même direction.

Des échantillons de E. coli contenant le plasmide

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pC035-S comprenant la région codante des ORFs olePl, oleGl, oleG2, oleM et oleY ont été déposés à la CNCM le 8 avril 1998 sous le numéro 1-2003.

Le gène oleG1 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 17). Cependant, la présence d'un codon CGC codant pour une arginine très conservée dans cette classe de glycosyltransférase chez les Streptomycètes situé immédiatement en amont du codon GTG, indiquerait que le codon initiateur pourrait être le codon CTG en position 1431 de la séquence SEQ ID N 17.

Le gène oleG2 code pour un polypeptide ayant 426 acides aminés (séquence de SEQ ID N 18).

La comparaison des séquences en acides aminés déduites des ORFs oleG1 et oleG2 ci-dessus avec les protéines de bases de données à l'aide du programme Blast (Altschul et al., 1990) a montré des similarités avec des glycosyl transférases de différentes sources, notamment environ 72 % de similarité et 53 % d'identité avec la déosaminyltransférase EryCIII décrite à l'exemple 30.

L'identification de la fonction du gène oleG1 ou du gène oleG2 a été ensuite réalisée par interruption du gène cible dans la souche de S. antibioticus ATCC 11891 et par identification d'un précurseur non glycosylé de l'oléandomycine produit par la souche mutante en utilisant les méthodes décrites dans les exemples 3 à 4.

2) génération d'une souche de S. antibioticus oleG1# (A35G1).

Une souche dans laquelle le gène oleG1 est interrompu a été préparée par intégration d'un plasmide pC03 dans les régions homologues de l'ADN chromosomique de la souche de S. antibioticus ATCC 11891 productrice d'oléandomycine.

Dans un premier temps, le fragment BamHI de 0,6 kb interne au gène oleGl, obtenu par digestion du plamide pC035-S préparé ci-dessus, avec l'enzyme de restriction BamHI (figure 21), a été sous-cloné dans le site BamHI du plasmide pOJ260 NRRL B-14785.

Le plasmide pC03 ainsi généré a été ensuite transféré dans la souche E. coli TG1 rec01504::Tn5 (Kolodner et al., 1985), puis utilisé pour transformer les protoplastes de

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S. antibioticus. La sélection des transformants a été réalisée par résistance à l'apramycine (Apramycine pour injection, Rhône Mérieux).

La préparation des protoplastes a été réalisée à partir de la souche S. antibioticus ATCC 11891 en suivant les conditions décrites par Hopwood et al., 1985.

La transformation a été réalisée en utilisant 50 1 d'aliquot de protoplastes, 5 g d'ADN plasmidique pC03 et en remplaçant le thiostrepton par de l'apramycine à la concentration finale de 25 g/ml.

La sélection des intégrants effectuée par résistance à l'apramycine a permis d'isoler un clone dénommé A35G1.

L'altération attendue dans la région correspondante du chromosome de S. antibioticus a été confirmée par analyse génomique par Southern blot. L'ADN chromosomique isolé puis digéré par l'enzyme de restriction PstI à partir de la souche S. antibioticus sauvage ou du mutant A35G1 a été analysé par Southern en utilisant comme sonde d'hybridation le fragment BamHI de 0,6 kb indiqué ci-dessus. Le remplacement du fragment PstI de 4,7 kb ainsi détecté dans la souche sauvage par deux fragments PstI de 2,4 et 6,5 kb dans le mutant A35G1 confirme l'intégration du plasmide pC03 dans le chromosome de la souche A35G1 au niveau de l'ORF oleGl.

La souche recombinante A35G1 ainsi obtenue a été ensuite cultivée pour identifier les précurseurs produits par la souche.

3) fermentation de la souche A35G1 et identification des précurseurs de l'oléandomycine produits.

La souche A35G1 a été cultivée pendant 72 h en erlen de 50 ml dans le milieu EP2 à partir d'une préculture de 48 h en milieu EP1 dans les conditions décrites à l'exemple 4.

Les extraits de bouillon avec de l'acétate d'éthyle ont été ensuite analysés selon les méthodes utilisées dans les exemples 3 et 4. a) L'essai biologique par antibiogramme a été réalisé de la façon suivante :
Après croissance de la souche B. pumilus sur milieu TSB pendant une nuit à 37 C, la culture a été diluée à 1/100 dans

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du milieu contenant 50 % (w/v) de glycérol, puis la suspension cellulaire obtenue a été conservée à -20 C avant utilisation.

L'essai biologique a ensuite été effectué en introduisant 150 /il de la suspension cellulaire décongelée dans 100 ml de milieu TSB contenant 1 % d'agar et maintenu à 55 C. Le mélange a été ensuite versé dans des boites de pétri. Après refroidissement, des cylindres oxford contenant 50 à 200 /il d'extraits à l'acétate d'éthyle ont été placés sur les boites d'agar, maintenus 2 h à 4 C, puis incubés pendant une nuit à 37 C.

Les extraits ne montrent pas d'effet inhibiteur sur la croissance de B. pumilus ATCC 14884. b) L'analyse par ccm par révélation chimique a été effectuée selon les conditions décrites à l'exemple 4 en utilisant comme standards l'érythromycine A, l'érythronolide B ainsi que le 6-désoxyérythronolide B.

L'analyse par ccm montre que la souche A35G1 ne produit pas d'oléandomycine mais accumule préférentiellement un produit pourpre ayant une mobilité plus grande que l'érythronolide B et voisine du 6-désoxyérythronolide B et que l'on peut attendre de la partie aglycone 8,8a-désoxyoléandolide. c) L'analyse par chromatographie RP-HPLC couplée à la spectrométrie de masse a été réalisée selon les conditions décrites à l'exemple 4. Deux métabolites majeurs, dénommmés M9 et M10, ont été détectés (élution à 6,12 mn et 17,23 mn respectivement). Les deux produits donnent un pic parent m/z 373 et des profils de fragmentation analogues qui peuvent être en accord avec la structure [8,8a-désoxyoléandolide]H+.

Cependant seul le temps de rétention du métabolite M10 est en accord avec la structure proposée alors que le métabolite M9 pourrait correspondre à une structure isomère ou au noyau lactone ouvert.

Des expériences de complémentation des souches mutantes de Sac. erythraea CIII68 décrite à l'exemple 6 et BV88 décrite à l'exemple 16 ont été également réalisées en utilisant des constructions plasmidiques permettant

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d'exprimer respectivement chacun des gènes oleG1 et oleG2.

Ces observations et l'absence de détection d'oléandrosyl 8,8a-désoxyoléandolide ou de désosaminyl 8,8a-désoxyoléandolide indiquent que le gène oleGl code pour la désoaminosyltransférase et le gène oleG2 code pour l'oléandrosyltransférase respectivement impliquées dans la biosynthèse de l'oléandomycine.

PREPARATION DE L'EXEMPLE 30 : Thymidine 5'-(trihydrogen- diphosphate),P'- [3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylohexopyranosyl]ester,N,N-diéthyléthanamine STADE A : chlorhydrate 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-Dxylohexopyranose
On ajoute sous agitation et à température ambiante 146,6 g d'érythromycine A, à 1,5 litres d'acide chlorhydrique 6N. On porte la solution obtenue au reflux pendant 2 h. On refroidit à la température ambiante, filtre et lave à l'eau le résidu obtenu. On extrait la phase aqueuse au chlorure de méthylène, puis à l'éther sulfurique. On ajoute à la phase aqueuse 10 g de noir L2S et chasse les traces d'éther sous pression réduite. On filtre, et concentre. On effectue un second envoi dans les mêmes conditions. On rassemble les deux essais, dissout dans l'éthanol (150 cm3), ajoute 150 cm3 d'éther éthylique. On essore, lave et sèche les cristaux obtenus. On obtient 42 g de produit recherché. F = 158-160 C.

STADE B : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyranose,l,2-diacétate
On ajoute sous agitation à 20 C, 60 cm3 de triéthylamine dans un mélange renfermant 15,27 g de produit du stade A et 150 cm3 de chlorure de méthylène. On ajoute à 20 C une solution renfermant 20 cm3 d'anhydride acétique et 80 cm3 de chlorure de méthylène. On agite à la température ambiante pendant 20 heures. On filtre, lave et concentre. On empâte dans l'éther sulfurique. On concentre le filtrat sous pression réduite. On chromatographie le résidu obtenu en éluant avec le mélange acétate d'éthyle-triéthylamine (95-5).

On obtient 18,6 g de produit recherché que l'on utilise tel quel dans le stade suivant.

STADE C : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyra-

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nose,2-acétate
On porte à 50 C un mélange renfermant 18,6 g du produit du stade B et 50 cm3 de DMF et ajoute 6,62 g d'acétate d'hydrazine NH2NH2, ACOH. On agite le mélange réactionnel et le verse sur une solution saturée de carbonate acide de sodium. On extrait la phase aqueuse à l'acétate d'éthyle. On rassemble les phases organiques, sèche, filtre et concentre.

On distille sous pression réduite pour éliminer le DMF par entraînement azéotrophirque avec le toluène. On obtient 11,28 g de produit que l'on chromatographie sur silice en éluant avec le mélange acétate d'éthyle-triéthylamine (90-10). On obtient 6,5 g de produit recherché que l'on utilise tel quel dans le stade suivant.

STADE D : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyranose,2-acétate bis(phénylméthyl)phosphate
On ajoute à -70 C, 5,7 cm3 d'une solution de n-butyllithium dans l'hexane dans une solution renfermant 1,738 g du produit du stade précédent et 40 cm3 de THF. On ajoute à -70--75 C 10 g de dibenzylphosphochlorure préparé extemporanément (J. Chem. Soc. 1958, p. 1957),

en solution dans 20 cm3 de THF. On maintient l'agitation pendant 1 h 30 entre-70 et -74 C. On verse sur une solution saturée de carbonate acide de sodium, extrait à l'acétate d'éthyle. On sèche la phase organique sur sulfate de sodium, filtre et concentre. On chromatographie le produit obtenu sur silice en éluant avec le mélange acétone-chlorure de méthylène (5-5). On obtient 1,070 g du produit recherché.

STADE E : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylohexopyranose,l-(dihydrogen phosphate),N,N-diéthyléthanamine
On place sous agitation et sous courant d'hydrogène pendant 30 minutes à la température ambiante, un mélange renfermant 1,070 g du produit du stade précédent, 20 cm3 d'acétate d'éthyle, 10 cm3 de méthanol, 0,622 cm3 de triéthy-

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lamine et 200 mg de palladium sur charbon. On filtre, lave au méthanol et à l'acétate d'éthyle et concentre le filtrat. On obtient 1 g d'une huile à laquelle on ajoute 10 cm3 de méthanol. On agite la solution obtenue pendant 20 heures. On chasse le méthanol sous pression réduite à 30 C. On obtient 680 g de produit recherché.

STADE F : 3,4,6-tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylohexopyranose,l-(dihydrogen phosphate)
On dissout 420 mg du produit isolé sous forme de sels de triéthylamine, obtenu au stade précédent, dans 1,6 cm3 de méthanol. On ajoute 3,2 cm3 d'éther sulfurique. On ajoute ensuite 6,4 cm3 d'éther sulfurique. On obtient 250 mg de produit recherché fondant à 242-244 C.

STADE G : Thymidine 5'-(trihydrogen diphosphate),P'-[3,4,6tridéoxy-3-(diméthylamino)-D-xylo-hexopyranosyl]ester,N,Ndiéthyléthanamine
On mélange 228 mg du produit de la préparation 1,6 cm3 de pyridine et 544 mg de thymidine 5'-monophosphate morpholidate-4-morpholine-NN'-dicyclohexylcarboxamidine. On chasse la pyridine sous pression réduite au rotorvapor en maintenant la température à 30 C ou en dessous. On ajoute 6 cm3 de pyridine que l'on chasse sous pression réduite. On répète l'opération 2 fois. On ajoute 6 cm3 de pyridine, 105 mg de 1H-tétrazole.

On agite pendant 3 jours à la température ambiante. On chasse la pyridine sous pression réduite. On reprend dans l'eau, filtre, concentre et obtient un produit que l'on purifie par chromatographie. On obtient ainsi le produit recherché. rf = 0,12 éluant CH2C12, MeOH, H20 (60-35-6).

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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM : Hoechst Marion Roussel (B) RUE : 1, Terrasse Bellini (C) VILLE : PUTEAUX(E) PAYS : FRANCE (F) CODE POSTAL : (G) TELEPHONE : (H) TELECOPIE : (ii) TITRE DE L' INVENTION : Gènes de biosynthese et de transfert des
6-desoxyhexoses chez Saccharopolyspora erythraea et chez
Streptomyces antibioticus et leur utilisation.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : erythraea (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:complément (48..1046) (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese du mycarose" /gene= "eryBII"

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(ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:complement (2322..3404) (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese de la desosamine" /gene= "eryCII" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 1: GCTTCACGCT CACCAGCCGT ATCCTTTCTC GGTTCCTCTT GTGCTCACTG CAACCAGGCT 60 TCCGGCGCCG CGCCGCCGGA GGCCACCGCG GGGAAGATCT CGTCCAGTTC GGACAGCGCC 120 TGCTCGTCCA GGGTCATCGC GGACGCCTTC AGCGCGGAGT CGAGCTGCTC GGGGGTTCGC 180 GGGCCGATGA CGGCGCCGGC GATGCCGGGC CGGGACAGCA CCCATGCGAG CCCCACCTCG 240 GCCGGGTCTT CGCCGAGGTT GCGGCAGAAC TTCTCGTAGG CCTCGATCGC CGGGCGCAGG 300 GACGGCAACA GCACCTGCGC ACGGCCCTGC GCCGACTTCA CCGCGGTGCC CGCGGCCAGC 360 TTCTCCAGCG CTCCGCTGAG CAGGCCGCCG TGCAGCGGCG ACCAGGCGAA GACGCCGAGC 420 CCGTAGGCCT GCGCGGCGGG CAGCACCTCC AGCTCGGCGT GCCGGACCGC CAGGTTGTAC 480 AGGCACTGGT GGGAGACCAT GCCCAGGGAG TGGCGGCGGG CGGCGTTCTC CTGCGCGGCG 540 GCGATGTGCC AGCCCGCGAA GTTCGACGAG CCGACGTAGG AGACCTTGCC GCTGGCGACG 600 AGGCTGTCCA TGGCCTGCCA CACCTCGTCC CACGGCGCGG ACCGGTCGAT GTGGTGCATC 660 TGGTAGACGT CGATGTGGTC GACGCCCAGC CTGCGCAGCG ATCCCTCGCA GGAGGCGATG 720 ATGTGCCGCG CCGACAGCCC GCTGTCGTTG ACGCGCTCGC TCATCTCGCC GCCGACCTTG 780 GTCGCCAGCA CGGTGTCCTC GCGCCGTCCG CCGCCCTGGG CCAGCCACCT GCCCACCAGC 840 TCCTCGGTGT GGCCCTTGTA GAGCCGCCAG CCGTACATGT CGGCGGTGTC GAGGCAGTTG 900 ATGCCGCGGT CCCGGGCGTG GTCCATCAGG CGCAGCGCGT CGTCGTCCTC GACGCGTCCG 960 CTGAAGTTCA CCGTGCCGAG CCAGAGCCTG CTGGTGAGCA GCGCGGAACG CCCGAGCCGC 1020 ACGTGCGTCG CGGCGTCGGT GGTCATCGTG GTTCTCTCCT TCCTGCGGCC AGTTCCTCGC 1080

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AGATGCCGAC GACCTCGGCC GGTGACGGCT CCGCGAGCAT GTCGTCGCGC ATCCGCGCCG 1140 CGCCGGCGCG GTGGGCCGGG TCGTCGAGGA CCCGCTTCAC CGACTCCCGG AGCTGGTCGG 1200 GGGTCAGCTC GGGCACGGGC AGCGCGATCC CCGCCCCGAA TTCCTGCGTG CGCTGCGCGC 1260 GCACGCCGGT GTCCCAGCCG TCGGGCAGGA TCACCTGCGG CACGCCGTGG ATCGCCGCGG 1320 TGTGCCAGCT CCCGGGTCCG CCGTGGTGCA CCGTCGCCGC GCAGGTCGGC AGCAGCGCGT 1380 GCATCGGGAC GAAGCCGACC GTGCGGACGT TGTCCGGGAT GTTCGCGACG CCTTCTAGCT 1440 GCTGCGCGTC GAAGGTCGCG ATGATCTCGG CGTCGACGTC GCCGACGGCA CCCAGCAGCT 1500 CCTCGATGGA GACCTGCCCG ATGCTGTTCT CGCGGCTGGA GATCCCGAGC GTGAGGCACA 1560 CGCGGCGGCG CTCGGGCTCG TCGTGCAGCC ATTCCGGCAC CACGGACGGC CCGTTGTAGT 1620 CGACGTAGCG CATCCCGACG GTCTTCAGGC CGGTGTCGAG CCTGATCGCG GCCGGGGCGG 1680 GGTCGATCGT CCACTGCCCG ACGACCACCT CCTCGTCGAA GGCCGGGCCG CCGTACTTCT 1740 CCAGCGTCCA GGTGAGCCAC TCGGCGAGCG GGTCCTCCCG GTGCTCCTCC GGCTGGTCGG 1800 GCAGCAGGCC GAGGAAGTTC TGCCGCGCCC GGGTGGTGAT GTCGGGTCCC CACAGCAGCC 1860 GCGCGTGCGG CGTTCCGGTC ACCGCCGCCG CGATGGGCGC GGCGAAGGTG AGCGGCTCCC 1920 AGATGACCAG GTCGGGCCGC CACTTCCGGC AGAACGAGAC CATGCCTTCG ATGAGCGTGT 1980 CCGGGCTCAT CAGGGCGTAG AAGGTCGGGG TGAGCACGGT CTGCATGCCC AGCAGGTGCT 2040 CCCAGGTCAA GGTGGCGGGG TCCCGCTCGC TGAAGTCCAG GCTCCGGACG TAGTCGATGA 2100 TGTCGTGGCC CGCGTGGGTC ATGAAGTCCA CGAGGTCGAC GTCGGTGCCG ACCGGGACGG 2160 CGGTCAGCCC GGCCGCGGTG ATGTCCTCGG TGAGCGCCGG GGACGCGACC ACGCGGACCT 2220 CGTGCCCCGC CGCGCGGAAC GCCCATGCGA GGGGGACGAG GCCGAAGAGG TGGCTCTTGC 2280 TGGCCATGGA GGAGAAGACG ACGCGCATCG CGGTTACCTC AGAGCTCGAC GGGGCAGCGG 2340 TTGGTTCCCC GCAGGACGGG TGATCGGCGG CGCCGGACGA CCGGGCCGCT GGGCGTGAGT 2400 CCGGGCAGCG CCTTGGCCGC GGCCCGCAGT GCGGCGGTGG CGAGCGCGGT GACCAGCTCC 2460

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TCCAGCCTGC CGGGGTGGCC GCGATGTGCC GACAGCGCGC GGTCGGCGTC GGGGCGGTCC 2520 ACGTCGAGGC GGTCGGGCTC GGCGAAGACC TCCGGGTCGC GGTTGGCCGC CGCGACGACG 2580 ACCACGACCT CCTCGCCTTC GCCGATCACG TGCTCGCCGA GCCGCACCTC TGCGGTGGCC 2640 GTGCGCCGCT CCAGGTGCAA TGCCGGGTGC AGGCGCAGCA CCTCGGCGAC GGTTCGCTGC 2700 GCGGCGGCGG GGTCGTCGGC GATCCGTTCG GCCAGCCCCG GTTCGGCCGA GACGGCCAGG 2760 ACCGCGTCGA CCACGGTGTT CGCGGTCATC TCGGCCCCGG CGAACAGGGC GCGCAGTGCG 2820 GGGTCGGCGG GCAGTGCCGC GACCGCTGCT TCGGTCACCG CGAGCTGCTG CGGGCTGAGC 2880 TGGGCGTCCA GGCTGACGCG GGCGTCCCAC GCGGCGCCGC GCAGCACTCC GGCTGCGCCG 2940 AGCACGGCGG TCATGCCCTG CACCGGTACC TGCCAGGCGA AGTCGCCGAC CAGGTCCAGC 3000 CGCGCGCCCG CGCCGGGGAG CAGACCGGCG AAGCTCTCCG CCAGTTCCCC GACGTCGGGG 3060 ACCTCGCCTT CCCAGGACGC GGCGTGCACG TCCCGGAACG GCTGGGCCCA CTCGGCGGGT 3120 GGCGCGCCCG CGGCCCGCAT CCATTCCGGT GTGCGTCCGG TGGCGCGGGT GAACGCGGGG 3180 TCGTCGAGCA CCTGCCGGGC GGTGGCGTGG TCGGCCACCA CCCACGTCTC GGTGCGGCTG 3240 CGCCGCACAC CGGACTCGCG CATCGAGCGG TACCGGCGCT GCGGGTCGTC GTCGTGTCCG 3300 CACAGCAGCA TCGGGTAAGG GTCGCCGTTG CTGCCGTAAC CCCAGTGCAG GCCGCGGATC 3360 ATCTGGAGCT GCCTGCCCAG CCCGGCGCGA TCGGTCGTGG TCATGAATTC CCTCCGCCCA 3420 GCCAGGCGTC GATGTGCCG 3439 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 2 :

<Desc/Clms Page number 76>

Met Thr Thr Asp Ala Ala Thr His Val Arg Leu Gly Arg Ser Ala Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Val Asn Phe Ser Gly Arg Val
20 25 30 Glu Asp Asp Asp Ala Leu Arg Leu Met Asp His Ala Arg Asp Arg Gly
35 40 45 Ile Asn Cya Leu Asp Thr Ala Asp Met Tyr Gly Trp Arg Leu Tyr Lys
50 55 60 Gly His Thr Glu Glu Leu Val Gly Arg Trp Leu Ala Gin Gly Gly Gly
65 70 75 80 Arg Arg Glu Asp Thr Val Leu Ala Thr Lys Val Gly Gly Glu Met Ser
85 90 95 Glu Arg Val Asn Asp Ser Gly Leu Ser Ala Arg His Ile Ile Ala Ser
100 105 110 Cys Glu Gly Ser Leu Arg Arg Leu Gly Val Asp His Ile Asp Val Tyr
115 120 125 Gin Met His His Ile Asp Arg Ser Ala Pro Trp Asp Glu Val Trp Gin
130 135 140 Ala Met Asp Ser Leu Val Ala Ser Gly Lys Val Ser Tyr Val Gly Ser 145 150 155 160 Ser Asn Phe Ala Gly Trp His Ile Ala Ala Ala Gin Glu Asn Ala Ala
165 170 175 Arg Arg His Ser Leu Gly Met Val Ser His Gin Cys Leu Tyr Asn Leu
180 185 190 Ala Val Arg His Ala Glu Leu Glu Val Leu Pro Ala Ala Gin Ala Tyr
195 200 205 Gly Leu Gly Val Phe Ala Trp Ser Pro Leu His Gly Gly Leu Leu Ser
210 215 220 Gly Ala Leu Glu Lys Leu Ala Ala Gly Thr Ala Val Lys Ser Ala Gin 225 230 235 240

<Desc/Clms Page number 77>

Gly Arg Ala Gin Val Leu Leu Pro Ser Leu Arg Pro Ala Ile Glu Ala
245 250 255 Tyr Glu Lys Phe Cys Arg Asn Leu Gly Glu Asp Pro Ala Glu Val Gly
260 265 270 Leu Ala Trp Val Leu Ser Arg Pro Gly Ile Ala Gly Ala Val Ile Gly
275 280 285 Pro Arg Thr Pro Glu Gin Leu Asp Ser Ala Leu Lys Ala Ser Ala Met
290 295 300 Thr Leu Asp Glu Gin Ala Leu SerGlu Leu Asp Glu Ile Phe Pro Ala 305 310 315 320 Val Ala Ser Gly Gly Ala Ala Pro Glu Ala Trp Leu Gln
325 330 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 3 : Met Thr Thr Thr Asp Arg Ala Gly Leu Gly Arg Gin Leu Gin Met Ile 1 5 10 15 Arg Gly Leu His Trp Gly Tyr Gly Ser Asn Gly Asp Pro Tyr Pro Met
20 25 30 Leu Leu Cys Gly His Asp Asp Asp Pro Gin Arg Arg Tyr Arg Ser Met
35 40 45 Arg Glu Ser Gly Val Arg Arg Ser Arg Thr Glu Thr Trp Val Val Ala
50 55 60 Asp His Ala Thr Ala Arg Gin Val Leu Asp Asp Pro Ala Phe Thr Arg
65 70 75 80 Ala Thr Gly Arg Thr Pro Glu Trp Met Arg Ala Ala Gly Ala Pro Pro
85 90 95

<Desc/Clms Page number 78>

Ala Glu Trp Ala Gin Pro Phe Arg Asp Val His Ala Ala Ser Trp Glu
100 105 110 Gly Glu Val Pro Asp Val Gly Glu Leu Ala Glu Ser Phe Ala Gly Leu
115 120 125 Leu Pro Gly Ala Gly Ala Arg Leu Asp Leu Val Gly Asp Phe Ala Trp
130 135 140 Gin Val Pro Val Gin Gly Met Thr Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Val 145 150 155 160 Leu Arg Gly Ala Ala Trp Asp Ala Arg Val Ser Leu Asp Ala Gin Leu
165 170 175 Ser Pro Gin Gin Leu Ala Val Thr Glu Ala Ala Val Ala Ala Leu Pro
180 185 190 Ala Asp Pro Ala Leu Arg Ala Leu Phe Ala Gly Ala Glu Met Thr Ala
195 200 205 Asn Thr Val Val Asp Ala Val Leu Ala Val Ser Ala Glu Pro Gly Leu
210 215 220 Ala Glu Arg Ile Ala Asp Asp Pro Ala Ala Ala Gin Arg Thr Val Ala 225 230 235 240 Glu Val Leu Arg Leu His Pro Ala Leu His Leu Glu Arg Arg Thr Ala
245 250 255 Thr Ala Glu Val Arg Leu Gly Glu His Val Ile Gly Glu Gly Glu Glu
260 265 270 Val Val Val Val Val Ala Ala Ala Asn Arg Asp Pro Glu Val Phe Ala
275 280 285 Glu Pro Asp Arg Leu Asp Val Asp Arg Pro Asp Ala Asp Arg Ala Leu
290 295 300 Ser Ala His Arg Gly His Pro Gly Arg Leu Glu Glu Leu Val Thr Ala 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ala Ala Leu Arg Ala Ala Ala Lys Ala Leu Pro Gly Leu
325 330 335

<Desc/Clms Page number 79>

Thr Pro Ser Gly Pro Val Val Arg Arg Arg Arg Ser Pro Val Leu Arg
340 345 350 Gly Thr Asn Arg Cys Pro Val Glu Leu
355 360 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 1266paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : erythraea (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:complement (4..1266) (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese de la desosamine" /gene= "eryCIII" /note= "SEQ ID NO 1 DE 1046 A 2308" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 4 : TCATCGTGGT TCTCTCCTTC CTGCGGCCAG TTCCTCGCAG ATGCCGACGA CCTCGGCCGG 60 TGACGGCTCC GCGAGCATGT CGTCGCGCAT CCGCGCCGCG CCGGCGCGGT GGGCCGGGTC 120 GTCGAGGACC CGCTTCACCG ACTCCCGGAG CTGGTCGGGG GTCAGCTCGG GCACGGGCAG 180 CGCGATCCCC GCCCCGAATT CCTGCGTGCG CTGCGCGCGC ACGCCGGTGT CCCAGCCGTC 240 GGGCAGGATC ACCTGCGGCA CGCCGTGGAT CGCCGCGGTG TGCCAGCTCC CGGGTCCGCC 300 GTGGTGCACC GTCGCCGCGC AGGTCGGCAG CAGCGCGTGC ATCGGGACGA AGCCGACCGT 360 GCGGACGTTG TCCGGGATGT TCGCGACGCC TTCTAGCTGC TGCGCGTCGA AGGTCGCGAT 420 GATCTCGGCG TCGACGTCGC CGACGGCACC CAGCAGCTCC TCGATGGAGA CCTGCCCGAT 480

<Desc/Clms Page number 80>

GCTGTTCTCG CGGCTGGAGA TCCCGAGCGT GAGGCACACG CGGCGGCGCT CGGGCTCGTC 540 GTGCAGCCAT TCCGGCACCA CGGACGGCCC GTTGTAGTCG ACGTAGCGCA TCCCGACGGT 600 CTTCAGGCCG GTGTCGAGCC TGATCGCGGC CGGGGCGGGG TCGATCGTCC ACTGCCCGAC 660 GACCACCTCC TCGTCGAAGG CCGGGCCGCC GTACTTCTCC AGCGTCCAGG TGAGCCACTC 720 GGCGAGCGGG TCCTCCCGGT GCTCCTCCGG CTGGTCGGGC AGCAGGCCGA GGAAGTTCTG 780 CCGCGCCCGG GTGGTGATGT CGGGTCCCCA CAGCAGCCGC GCGTGCGGCG TTCCGGTCAC 840 CGCCGCCGCG ATGGGCGCGG CGAAGGTGAG CGGCTCCCAG ATGACCAGGT CGGGCCGCCA 900 CTTCCGGCAG AACGAGACCA TGCCTTCGAT GAGCGTGTCC GGGCTCATCA GGGCGTAGAA 960 GGTCGGGGTG AGCACGGTCT GCATGCCCAG CAGGTGCTCC CAGGTCAAGG TGGCGGGGTC 1020 CCGCTCGCTG AAGTCCAGGC TCCGGACGTA GTCGATGATG TCGTGGCCCG CGTGGGTCAT 1080 GAAGTCCACG AGGTCGACGT CGGTGCCGAC CGGGACGGCG GTCAGCCCGG CCGCGGTGAT 1140 GTCCTCGGTG AGCGCCGGGG ACGCGACCAC GCGGACCTCG TGCCCCGCCG CGCGGAACGC 1200 CCATGCGAGG GGGACGAGGC CGAAGAGGTG GCTCTTGCTG GCCATGGAGG AGAAGACGAC 1260 GCGCAT 1266 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 5 : Met Arg Val Val Phe Ser Ser Met Ala Ser Lys Ser His Leu Phe Gly 1 5 10 15 Leu Val Pro Leu Ala Trp Ala Phe Arg Ala Ala Gly His Glu Val Arg
20 25 30

<Desc/Clms Page number 81>

Val Val Ala Ser Pro Ala Leu Thr Glu Asp Ile Thr Ala Ala Gly Leu
35 40 45 Thr Ala Val Pro Val Gly Thr Asp Val Asp Leu Val Asp Phe Met Thr
50 55 60 His Ala Gly His Asp Ile Ile Asp Tyr Val Arg Ser Leu Asp Phe Ser
65 70 75 80 Glu Arg Asp Pro Ala Thr Leu Thr Trp Glu His Leu Leu Gly Met Gln
85 90 95 Thr Val Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ala Leu Met Ser Pro Asp Thr Leu
100 105 110 Ile Glu Gly Met Val Ser Phe Cys Arg Lys Trp Arg Pro Asp Leu Val
115 120 125 Ile Trp Glu Pro Leu Thr Phe Ala Ala Pro Ile Ala Ala Ala Val Thr
130 135 140 Gly Thr Pro His Ala Arg Leu Leu Trp Gly Pro Asp Ile Thr Thr Arg 145 150 155 160 Ala Arg Gin Asn Phe Leu Gly Leu Leu Pro Asp Gin Pro Glu Glu His
165 170 175 Arg Glu Asp Pro Leu Ala Glu Trp Leu Thr Trp Thr Leu Glu Lys Tyr
180 185 190 Gly Gly Pro Ala Phe Asp Glu Glu Val Val Val Gly Gin Trp Thr Ile
195 200 205 Asp Pro Ala Pro Ala Ala Ile Arg Leu Asp Thr Gly Leu Lys Thr Val
210 215 220 Gly Met Arg Tyr Val Asp Tyr Asn Gly Pro Ser Val Val Pro Glu Trp 225 230 235 240 Leu His Asp Glu Pro Glu Arg Arg Arg Val Cys Leu Thr Leu Gly Ile
245 250 255 Ser Ser Arg Glu Asn Ser Ile Gly Gin Val Ser Ile Glu Glu Leu Leu
260 265 270

<Desc/Clms Page number 82>

Gly Ala Val Gly Asp Val Asp Ala Glu Ile Ile Ala Thr Phe Asp Ala
275 280 285 Gin Gin Leu Glu Gly Val Ala Asn Ile Pro Asp Asn Val Arg Thr Val
290 295 300 Gly Phe Val Pro Met His Ala Leu Leu Pro Thr Cys Ala Ala Thr Val 305 310 315 320 Hia His Gly Gly Pro Gly Ser Trp His Thr Ala Ala Ile His Gly Val
325 330 335 Pro Gin Val Ile Leu Pro Asp Gly Trp Asp Thr Gly Val Arg Ala Gln
340 345 350 Arg Thr Gin Glu Phe Gly Ala Gly Ile Ala Leu Pro Val Pro Glu Leu
355 360 365 Thr Pro Asp Gin Leu Arg Glu Ser Val Lys Arg Val Leu Asp Asp Pro
370 375 380 Ala His Arg Ala Gly Ala Ala Arg Met Arg Asp Asp Met Leu Ala Glu 385 390 395 400 Pro Ser Pro Ala Glu Val Val Gly Ile Cys Glu Glu Leu Ala Ala Gly
405 410 415 Arg Arg Glu Pro Arg
420 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 8160 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (génomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : erythraea (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE :

<Desc/Clms Page number 83>

(B) EMPLACEMENT:242..1207 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese du mycarose" /gene= "eryBIV" /transl~except= (pos: 242.. 244, aa : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1210..2454 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese du mycarose" /gene= "eryBV" /transl~except= (pos: 1210.. 1212, aa : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:2510..3220 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese de la desosamine" /gene= "eryCVI" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:3308..4837 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese du mycarose" /gene= "eryBVI" /transl~except= (pos: 3308.. 3310, aa : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:6080..7546 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese de la desosamine" /gene= "eryCV" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:7578..8156 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la biosynthese du mycarose" /gene= "eryBVII" /transl~except= (pos: 7578.. 7580, aa : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: mat~peptide

<Desc/Clms Page number 84>

(B) EMPLACEMENT:242 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE :

* ID NO: 6 : TTTGACAGGT CCGCCACGCG TCCCCCTACT CGACGACCAC GCAATGGGCG AACAATATAG 60 GAAGGATCAA GAGGTTGACA TCGCCTCGTC GAGCCAACGA ACCTGTGAAC ATCTGCATGT 120 TGACAAGATC AACGGCGGCT ACCTACTGTG GTGGCCCAGT GACGGGTTGC CGCACATCGC 180 GCTGGGGAGA TTCTTTGAAT TTCGCCCGTA GCACCGACCT GGAAAGCGAG CAAATGCTCC 240 G GTG AAT GGG ATC AGT GAT TCC CCG CGT CAA TTG ATC ACC CTT CTG 286
Met Asn Gly Ile Ser Asp Ser Pro Arg Gin Leu Ile Thr Leu Leu
1 5 10 15 GGC GCT TCC GGC TTC GTC GGG AGC GCG GTT CTG CGC GAG CTG CGC GAC 334 Gly Ala Ser Gly Phe Val Gly Ser Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Asp
20 25 30 CAC CCG GTC CGG CTG CGC GCG GTG TCC CGC GGC GGA GCG CCC GCG GTT 382 His Pro Val Arg Leu Arg Ala Val Ser Arg Gly Gly Ala Pro Ala Val
35 40 45 CCG CCC GGC GCC GCG GAG GTC GAG GAC CTG CGC GCC GAC CTG CTG GAA 430 Pro Pro Gly Ala Ala Glu Val Glu Asp Leu Arg Ala Asp Leu Leu Glu
50 55 60 CCG GGC CGG GCC GCC GCC GCG ATC GAG GAC GCC GAC GTG ATC GTG CAC 478 Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ile Glu Asp Ala Asp Val Ile Val His
65 70 75 CTG GTG GCG CAC GCA GCG GGC GGT TCC ACC TGG CGC AGC GCC ACC TCC 526 Leu Val Ala His Ala Ala Gly Gly Ser Thr Trp Arg Ser Ala Thr Ser
80 85 90 95 GAC CCG GAA GCC GAG CGG GTC AAC GTC GGC CTG ATG CAC GAC CTC GTC 574 Asp Pro Glu Ala Glu Arg Val Asn Val Gly Leu Met His Asp Leu Val
100 105 110 GGC GCG CTG CAC GAT CGC CGC AGG TCG ACG CCG CCC GTG TTG CTC TAC 622 Gly Ala Leu His Asp Arg Arg Arg Ser Thr Pro Pro Val Leu Leu Tyr
115 120 125

<Desc/Clms Page number 85>

GCG AGC ACC GCA CAG GCC GCG AAC CCG TCG GCG GCC AGC AGG TAC GCG 670 Ala Ser Thr Ala Gin Ala Ala Asn Pro Ser Ala Ala Ser Arg Tyr Ala
130 135 140 CAG CAG AAG ACC GAG GCC GAG CGC ATC CTG CGC AAA GCC ACC GAC GAG 718 Gin Gin Lys Thr Glu Ala Glu Arg Ile Leu Arg Lys Ala Thr Asp Glu
145 150 155 GGC CGG GTG CGC GGC GTG ATC CTG CGG CTG CCC GCC GTC TAC GGC CAG 766 Gly Arg Val Arg Gly Val Ile Leu Arg Leu Pro Ala Val Tyr Gly Gin 160 165 170 175 AGC GGC CCG TCC GGC CCC ATG GGG CGG GGC GTG GTC GCA GCG ATG ATC 814 Ser Gly Pro Ser Gly Pro Met Gly Arg Gly Val Val Ala Ala Met Ile
180 185 190 CGG CGT GCC CTC GCC GGC GAG CCG CTC ACC ATG TGG CAC GAC GGC GGC 862 Arg Arg Ala Leu Ala Gly Glu Pro Leu Thr Met Trp His Asp Gly Gly
195 200 205 GTG CGC CGC GAC CTG CTG CAC GTC GAG GAC GTG GCC ACC GCG TTC GCC 910 Val Arg Arg Asp Leu Leu His Val Glu Asp Val Ala Thr Ala Phe Ala
210 215 220 GCC GCG CTG GAG CAC CAC GAC GCG CTG GCC GGC GGC ACG TGG GCG CTG 958 Ala Ala Leu Glu His His Asp Ala Leu Ala Gly Gly Thr Trp Ala Leu
225 230 235 GGC GCC GAC CGA TCC GAG CCG CTC GGC GAC ATC TTC CGG GCC GTC TCC 1006 Gly Ala Asp Arg Ser Glu Pro Leu Gly Asp Ile Phe Arg Ala Val Ser 240 245 250 255 GGC AGC GTC GCC CGG CAG ACC GGC AGC CCC GCC GTC GAC GTG GTC ACC 1054 Gly Ser Val Ala Arg Gin Thr Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Val Thr
260 265 270 GTG CCC GCG CCC GAG CAC GCC GAG GCC AAC GAC TTC CGC AGC GAC GAC 1102 Val Pro Ala Pro Glu His Ala Glu Ala Asn Asp Phe Arg Ser Asp Asp
275 280 285 ATC GAC TCC ACC GAG TTC CGC AGC CGG ACC GGC TGG CGC CCC CGG GTT 1150 Ile Asp Ser Thr Glu Phe Arg Ser Arg Thr Gly Trp Arg Pro Arg Val
290 295 300

<Desc/Clms Page number 86>

TCC CTC ACC GAC GGC ATC GAC CGG ACG GTG GCC GCC CTG ACC CCC ACC 1198 Ser Leu Thr Asp Gly Ile Asp Arg Thr Val Ala Ala Leu Thr Pro Thr
305 310 315 GAG GAG CAC TA GTG CGG GTA CTG CTG ACG TCC TTC GCG CAC CGC ACG 1245 Glu Glu His Met Arg Val Leu Leu Thr Ser Phe Ala His Arg Thr 320 1 5 10 CAC TTC CAG GGA CTG GTC CCG CTG GCG TGG GCG CTG CGC ACC GCG GGT 1293 His Phe Gin Gly Leu Val Pro Leu Ala Trp Ala Leu Arg Thr Ala Gly
15 20 25 CAC GAC GTG CGC GTG GCC GCC CAG CCC GCG CTC ACC GAC GCG GTC ATC 1341 His Asp Val Arg Val Ala Ala Gin Pro Ala Leu Thr Asp Ala Val Ile
30 35 40 GGC GCC GGT CTC ACC GCG GTA CCC GTC GGC TCC GAC CAC CGG CTG TTC 1389 Gly Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro Val Gly Ser Asp His Arg Leu Phe
45 50 55 60 GAC ATC GTC CCG GAA GTC GCC GCT CAG GTG CAC CGC TAC TCC TTC TAC 1437 Asp Ile Val Pro Glu Val Ala Ala Gin Val His Arg Tyr Ser Phe Tyr
65 70 75 CTG GAC TTC TAC CAC CGC GAG CAG GAG CTG CAC TCG TGG GAG TTC CTG 1485 Leu Asp Phe Tyr His Arg Glu Gin Glu Leu His Ser Trp Glu Phe Leu
80 85 90 CTC GGC ATG CAG GAG GCC ACC TCG CGG TGG GTA TAC CCG GTG GTC AAC 1533 Leu Gly Met Gin Glu Ala Thr Ser Arg Trp Val Tyr Pro Val Val Asn
95 100 105 AAC GAC TCC TTC GTC GCC GAG CTG GTC GAC TTC GCC CGG GAC TGG CGT 1581 Asn Asp Ser Phe Val Ala Glu Leu Val Asp Phe Ala Arg Asp Trp Arg
110 115 120 CCT GAC CTG GTG CTC TGG GAG CCG TTC ACC TTC GCC GGC GCC GTC GCG 1629 Pro Asp Leu Val Leu Trp Glu Pro Phe Thr Phe Ala Gly Ala Val Ala 125 130 135 140 GCC CGG GCC TGC GGA GCC GCG CAC GCC CGG CTG CTG TGG GGC AGC GAC 1677 Ala Arg Ala Cys Gly Ala Ala His Ala Arg Leu Leu Trp Gly Ser Asp
145 150 155

<Desc/Clms Page number 87>

CTC ACC GGC TAC TTC CGC GGC CGG TTC CAG GCG CAA CGC CTG CGA CGG 1725 Leu Thr Gly Tyr Phe Arg Gly Arg Phe Gin Ala Gin Arg Leu Arg Arg
160 165 170 CCG CCG GAG GAC CGG CCG GAC CCG CTG GGC ACG TGG CTG ACC GAG GTC 1773 Pro Pro Glu Asp Arg Pro Asp Pro Leu Gly Thr Trp Leu Thr Glu Val
175 180 185 GCG GGG CGC TTC GGC GTC GAA TTC GGC GAG GAC CTC GCG GTC GGG CAG 1821 Ala Gly Arg Phe Gly Val Glu Phe Gly Glu Asp Leu Ala Val Gly Gln
190 195 200 TGG TCG GTC GAC CAG TTG CCG CCG AGT TTC CGG CTG GAC ACC GGA ATG 1869 Trp Ser Val Asp Gin Leu Pro Pro Ser Phe Arg Leu Asp Thr Gly Met 205 210 215 220 GAA ACC GTT GTC GCG CGG ACC CTG CCC TAC AAC GGC GCG TCG GTG GTT 1917 Glu Thr Val Val Ala Arg Thr Leu Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Val Val
225 230 235 CCG GAC TGG CTC AAG AAG GGC AGT GCG ACT CGA CGC ATC TGC ATT ACC 1965 Pro Asp Trp Leu Lys Lys Gly Ser Ala Thr Arg Arg Ile Cys Ile Thr
240 245 250 GGA GGG TTC TCC GGA CTC GGG CTC GCC GCC GAT GCC GAT CAG TTC GCG 2013 Gly Gly Phe Ser Gly Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Asp Gin Phe Ala
255 260 265 CGG ACG CTC GCG CAG CTC GCG CGA TTC GAT GGC GAA ATC GTG GTT ACG 2061 Arg Thr Leu Ala Gin Leu Ala Arg Phe Asp Gly Glu Ile Val Val Thr
270 275 280 GGT TCC GGT CCG GAT ACC TCC GCG GTA CCG GAC AAC ATT CGT TTG GTG 2109 Gly Ser Gly Pro Asp Thr Ser Ala Val Pro Asp Asn Ile Arg Leu Val 285 290 295 300 GAT TTC GTT CCG ATG GGC GTT CTG CTC CAG AAC TGC GCG GCG ATC ATC 2157 Asp Phe Val Pro Met Gly Val Leu Leu Gin Asn Cys Ala Ala Ile Ile
305 310 315 CAC CAC GGC GGG GCC GGA ACC TGG GCC ACG GCA CTG CAC CAC GGA ATT 2205 His His Gly Gly Ala Gly Thr Trp Ala Thr Ala Leu His His Gly Ile
320 325 330

<Desc/Clms Page number 88>

CCG CAA ATA TCA GTT GCA CAT GAA TGG GAT TGC ATG CTA CGC GGC CAG 2253 Pro Gin Ile Ser Val Ala His Glu Trp Asp Cys Met Leu Arg Gly Gin
335 340 345 CAG ACC GCG GAA CTG GGC GCG GGA ATC TAC CTC CGG CCG GAC GAG GTC 2301 Gin Thr Ala Glu Leu Gly Ala Gly Ile Tyr Leu Arg Pro Asp Glu Val
350 355 360 GAT GCC GAC TCA TTG GCG AGC GCC CTC ACC CAG GTG GTC GAG GAC CCC 2349 Asp Ala Asp Ser Leu Ala Ser Ala Leu Thr Gin Val Val Glu Asp Pro 365 370 375 380 ACC TAC ACC GAG AAC GCG GTG AAG CTT CGC GAG GAG GCG CTG TCC GAC 2397 Thr Tyr Thr Glu Asn Ala Val Lys Leu Arg Glu Glu Ala Leu Ser Asp
385 390 395 CCG ACG CCG CAG GAG ATC GTC CCG CGA CTG GAG GAA CTC ACG CGC CGC 2445 Pro Thr Pro Gin Glu Ile Val Pro Arg Leu Glu Glu Leu Thr Arg Arg
400 405 410 CAC GCC GGC TAGCGGTTTC CGACCGACAA GTCCGTCCGA CAGCACACCT 2494 His Ala Gly
415 CCGGAGGGAG CAGGG ATG TAC GAG GGC GGG TTC GCC GAG CTT TAC GAC CGG 2545
Met Tyr Glu Gly Gly Phe Ala Glu Leu Tyr Asp Arg
1 5 10 TTC TAC CGC GGC CGG GGC AAG GAC TAC GCG GCC GAG GCC GCG CAG GTC 2593 Phe Tyr Arg Gly Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ala Gin Val
15 20 25 GCG CGG CTG GTC AGA GAC CGC CTG CCC TCG GCT TCC TCG CTG CTC GAC 2641 Ala Arg Leu Val Arg Asp Arg Leu Pro Ser Ala Ser Ser Leu Leu Asp
30 35 40 GTG GCC TGC GGG ACC GGC ACC CAC CTG CGC CGG TTC GCC GAC CTC TTC 2689 Val Ala Cys Gly Thr Gly Thr His Leu Arg Arg Phe Ala Asp Leu Phe
45 50 55 60 GAC GAC GTG ACC GGG CTG GAG CTG TCG GCG GCG ATG ATC GAG GTC GCC 2737 Asp Asp Val Thr Gly Leu Glu Leu Ser Ala Ala Met Ile Glu Val Ala
65 70 75

<Desc/Clms Page number 89>

CGG CCG CAG CTC GGC GGC ATC CCG GTG CTG CAG GGC GAC ATG CGC GAC 2785 Arg Pro Gin Leu Gly Gly Ile Pro Val Leu Gin Gly Asp Met Arg Asp
80 85 90 TTC GCG CTG GAT CGC GAG TTC GAC GCC GTC ACC TGC ATG TTC AGC TCC 2833 Phe Ala Leu Asp Arg Glu Phe Asp Ala Val Thr Cys Met Phe Ser Ser
95 100 105 ATC GGG CAC ATG CGC GAC GGC GCC GAG CTG GAC CAG GCG CTG GCG TCC 2881 Ile Gly His Met Arg Asp Gly Ala Glu Leu Asp Gin Ala Leu Ala Ser
110 115 120 TTC GCC CGC CAC CTC GCC CCC GGC GGC GTC GTG GTG GTC GAA CCG TGG 2929 Phe Ala Arg His Leu Ala Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp 125 130 135 140 TGG TTC CCG GAG GAC TTC CTC GAC GGC TAC GTG GCC GGT GAC GTG GTG 2977 Trp Phe Pro Glu Asp Phe Leu Asp Gly Tyr Val Ala Gly Asp Val Val
145 150 155 CGC GAC GGC GAC CTG ACG ATC TCG CGC GTC TCG CAC TCC GTG CGC GCC 3025 Arg Asp Gly Asp Leu Thr Ile Ser Arg Val Ser His Ser Val Arg Ala
160 165 170 GGC GGC GCG ACC CGG ATG GAG ATC CAC TGG GTC GTG GCC GAC GCG GTG 3073 Gly Gly Ala Thr Arg Met Glu Ile His Trp Val Val Ala Asp Ala Val
175 180 185 AAC GGT CCG CGG CAC CAC GTG GAG CAC TAC GAG ATC ACG CTC TTC GAG 3121 Asn Gly Pro Arg His His Val Glu His Tyr Glu Ile Thr Leu Phe Glu
190 195 200 CGG CAG CAG TAC GAG AAG GCC TTC ACC GCG GCC GGT TGC GCT GTG CAG 3169 Arg Gin Gin Tyr Glu Lys Ala Phe Thr Ala Ala Gly Cys Ala Val Gin 205 210 215 220 TAC CTG GAG GGC GGA CCC TCC GGA CGC GGG TTG TTC GTC GGT GTG CGC 3217 Tyr Leu Glu Gly Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Arg
225 230 235 GGA TGACCCGTGC GTTCGCGTTT TCCGTTCCTG GCACAGGTGA TCCGCTCCAC 3270 Gly

<Desc/Clms Page number 90>

GGGCCCTTTC CCCGCCGTGA CCGGACCCTT ACAGTGA GTG CGG GTC TTG ATC GAC 3325
Met Arg Val Leu Ile Asp
1 5 AAC GCC CGG CGG CAG CAA GCG GAG CCG TCG ACG ACA CCG CAG GGA GAG 3373 Asn Ala Arg Arg Gin Gin Ala Glu Pro Ser Thr Thr Pro Gin Gly Glu
10 15 20 TCG ATG GGT GAT CGG ACC GGC GAC CGG ACG ATT CCG GAA TCC TCG CAG 3421 Ser Met Gly Asp Arg Thr Gly Asp Arg Thr Ile Pro Glu Ser Ser Gln
25 30 35 ACC GCA ACG CGT TTC CTG CTC GGC GAC GGC GGA ATC CCC ACC GCC ACG 3469 Thr Ala Thr Arg Phe Leu Leu Gly Asp Gly Gly Ile Pro Thr Ala Thr
40 45 50 GCG GAA ACC CAC GAC TGG CTG ACC CGC AAC GGC GCC GAG CAG CGG CTC 3517 Ala Glu Thr His Asp Trp Leu Thr Arg Asn Gly Ala Glu Gin Arg Leu
55 60 65 70 GAG GTG GCG CGC GTG CCG TTC AGC GCC ATG GAC CGC TGG TCG TTC CAG 3565 Glu Val Ala Arg Val Pro Phe Ser Ala Met Asp Arg Trp Ser Phe Gln
75 80 85 CCC GAG GAC GGC AGG CTC GCC CAC GAG TCC GGG CGC TTC TTC TCC ATC 3613 Pro Glu Asp Gly Arg Leu Ala His Glu Ser Gly Arg Phe Phe Ser Ile
90 95 100 GAG GGC CTG CAC GTG CGG ACG AAC TTC GGC TGG CGG CGG GAC TGG ATC 3661 Glu Gly Leu His Val Arg Thr Asn Phe Gly Trp Arg Arg Asp Trp Ile
105 110 115 CAG CCC ATC ATC GTG CAG CCC GAG ATC GGC TTC CTC GGC CTC ATC GTC 3709 Gin Pro Ile Ile Val Gin Pro Glu Ile Gly Phe Leu Gly Leu Ile Val
120 125 130 AAG GAG TTC GAC GGT GTG CTG CAC GTG CTG GCG CAG GCC AAG GCC GAG 3757 Lys Glu Phe Asp Gly Val Leu His Val Leu Ala Gin Ala Lys Ala Glu 135 140 145 150 CCG GGC AAC ATC AAC GCC GTC CAG CTC TCC CCG ACC CTG CAG GCG ACC 3805 Pro Gly Asn Ile Asn Ala Val Gin Leu Ser Pro Thr Leu Gin Ala Thr
155 160 165

<Desc/Clms Page number 91>

CGC AGC AAC TAC ACC GGC GTC CAC CGC GGC TCG AAG GTC CGG TTC ATC 3853 Arg Ser Asn Tyr Thr Gly Val His Arg Gly Ser Lys Val Arg Phe Ile
170 175 180 GAG TAC TTC AAC GGC ACG CGC CCG AGC CGG ATC CTC GTC GAC GTG CTC 3901 Glu Tyr Phe Asn Gly Thr Arg Pro Ser Arg Ile Leu Val Asp Val Leu
185 190 195 CAG TCC GAG CAG GGC GCG TGG TTC CTG CGC AAG CGC AAC CGG AAC ATG 3949 Gin Ser Glu Gin Gly Ala Trp Phe Leu Arg Lys Arg Asn Arg Asn Met
200 205 210 GTC GTC GAG GTG TTC GAC GAC CTG CCC GAG CAC CCG AAC TTC CGG TGG 3997 Val Val Glu Val Phe Asp Asp Leu Pro Glu His Pro Asn Phe Arg Trp 215 220 225 230 CTG ACC GTC GCG CAG CTG CGG GCG ATG CTG CAC CAC GAC AAC GTG GTG 4045 Leu Thr Val Ala Gin Leu Arg Ala Met Leu His His Asp Asn Val Val
235 240 245 AAC ATG GAC CTG CGC ACC GTG CTG GCC TGC GTC CCG ACC GCC GTG GAG 4093 Asn Met Asp Leu Arg Thr Val Leu Ala Cys Val Pro Thr Ala Val Glu
250 255 260 CGG GAC CGG GCC GAC GAC GTG CTC GCG CGC CTG CCC GAG GGC TCG TTC 4141 Arg Asp Arg Ala Asp Asp Val Leu Ala Arg Leu Pro Glu Gly Ser Phe
265 270 275 CAG GCC CGG CTG CTG CAC TCG TTC ATC GGC GCG GGC ACC CCG GCC AAC 4189 Gin Ala Arg Leu Leu His Ser Phe Ile Gly Ala Gly Thr Pro Ala Asn
280 285 290 AAC ATG AAC AGC CTG CTG AGC TGG ATC TCC GAC GTG CGC GCC AGG CGC 4237 Asn Met Asn Ser Leu Leu Ser Trp Ile Ser Asp Val Arg Ala Arg Arg 295 300 305 310 GAG TTC GTG CAG CGC GGC CGC CCG CTG CCC GAC ATC GAG CGC AGC GGG 4285 Glu Phe Val Gin Arg Gly Arg Pro Leu Pro Asp Ile Glu Arg Ser Gly
315 320 325 TGG ATC CGC CGC GAC GAC GGC ATC GAG CAC GAG GAG AAG AAG TAC TTC 4333 Trp Ile Arg Arg Asp Asp Gly Ile Glu His Glu Glu Lys Lys Tyr Phe
330 335 340

<Desc/Clms Page number 92>

GAC GTC TTC GGC GTC ACG GTG GCG ACC AGC GAC CGC GAG GTC AAC TCG 4381 Asp Val Phe Gly Val Thr Val Ala Thr Ser Asp Arg Glu Val Asn Ser
345 350 355 TGG ATG CAG CCG CTG CTC TCG CCC GCC AAC AAC GGC CTG CTC GCC CTG 4429 Trp Met Gin Pro Leu Leu Ser Pro Ala Asn Asn Gly Leu Leu Ala Leu
360 365 370 CTG GTC AAG GAC ATC GGC GGC ACG TTG CAC GCG CTC GTG CAG CTG CGC 4477 Leu Val Lys Asp Ile Gly Gly Thr Leu His Ala Leu Val Gin Leu Arg 375 380 385 390 ACC GAG GCG GGC GGG ATG GAC GTC GCC GAG CTG GCG CCT ACG GTG CAC 4525 Thr Glu Ala Gly Gly Met Asp Val Ala Glu Leu Ala Pro Thr Val His
395 400 405 TGC CAG CCC GAC AAC TAC GCC GAC GCG CCC GAG GAG TTC CGA CCG GCC 4573 Cys Gin Pro Asp Asn Tyr Ala Asp Ala Pro Glu Glu Phe Arg Pro Ala
410 415 420 TAT GTG GAC TAC GTG TTG AAC GTG CCG CGC TCG CAG GTC CGC TAC GAC 4621 Tyr Val Asp Tyr Val Leu Asn Val Pro Arg Ser Gin Val Arg Tyr Asp
425 430 435 GCA TGG CAC TCC GAG GAG GGC GGC CGG TTC TAC CGC AAC GAG AAC CGG 4669 Ala Trp His Ser Glu Glu Gly Gly Arg Phe Tyr Arg Asn Glu Asn Arg
440 445 450 TAC ATG CTG ATC GAG GTG CCC GCC GAC TTC GAC GCC AGT GCC GCT CCC 4717 Tyr Met Leu Ile Glu Val Pro Ala Asp Phe Asp Ala Ser Ala Ala Pro 455 460 465 470 GAC CAC CGG TGG ATG ACC TTC GAC CAG ATC ACC TAC CTG CTC GGG CAC 4765 Asp His Arg Trp Met Thr Phe Asp Gin Ile Thr Tyr Leu Leu Gly His
475 480 485 AGC CAC TAC GTC AAC ATC CAG CTG CGC AGC ATC ATC GCG TGC GCC TCG 4813 Ser His Tyr Val Asn Ile Gin Leu Arg Ser Ile Ile Ala Cys Ala Ser
490 495 500 GCC GTC TAC ACC AGG ACC GCC GGA TGAAACGCGC GCTGACCGAC CTGGCGATCT 4867 Ala Val Tyr Thr Arg Thr Ala Gly
505 510 TCGGCGGCCC CGAGGCATTC CTGCACACCC TCTACGTGGG CAGGCCGACC GTCGGGGACC 4927

<Desc/Clms Page number 93>

GGGAGCGGTT CTTCGCCCGC CTGGAGTGGG CGCTGAACAA CAACTGGCTG ACCAACGGCG 4987 GACCACTGGT GCGCGAGTTC GAGGGCCGGG TCGCCGACCT GGCGGGTGTC CGCCACTGCG 5047 TGGCCACCTG CAACGCGACG GTCGCGCTGC AACTGGTGCT GCGCGCGAGC GACGTGTCCG 5107 GCGAGGTCGT CATGCCTTCG ATGACGTTCG CGGCCACCGC GCACGCGGCG AGCTGGCTGG 5167 GGCTGGAACC GGTGTTCTGC GACGTGGACC CCGAGACCGG CCTGCTCGAC CCCGAGCACG 5227 TCGCGTCGCT GGTGACACCG CGGACGGGCG CGATCATCGG CGTGCACCTG TGGGGCAGGC 5287 CCGCTCCGGT CGAGGCGCTG GAGAAGATCG CCGCCGAGCA CCAGGTCAAA CTCTTCTTCG 5347 ACGCCGCGCA CGCGCTGGGC TGCACCGCCG GCGGGCGGCC GGTCGGCGCC TTCGGCAACG 5407 CCGAGGTGTT CAGCTTCCAC GCCACGAAGG CGGTCACCTC GTTCGAGGGC GGCGCCATCG 5467 TCACCGACGA CGGGCTGCTG GCCGACCGCA TCCGCGCCAT GCACAACTTC GGGATCGCAC 5527 CGGACAAGCT GGTGACCGAT GTCGGCACCA ACGGCAAGAT GAGCGAGTGC GCCGCGGCGA 5587 TGGGCCTCAC CTCGCTCGAC GCCTTCGCCG AGACCAGGGT GCACAACCGC CTCAACCACG 5647 CGCTCTACTC CGACGAGCTC CGCGACGTGC GCGGCATATC CGTGCACGCG TTCGATCCTG 5707 GCGAGCAGAA CAACTACCAG TACGTGATCA TCTCGGTGGA CTCCGCGGCC ACCGGCATCG 5767 ACCGCGACCA GTTGCAGGCG ATCCTGCGAG CGGAGAAGGT TGTGGCACAA CCCTACTTCT 5827 CCCCCGGGTG CCACCAGATG CAGCCGTACC GGACCGAGCC GCCGCTGCGG CTGGAGAACA 5887 CCGAACAGCT CTCCGACCGG GTGCTCGCGC TGCCCACCGG CCCCGCGGTG TCCAGCGAGG 5947 ACATCCGGCG GGTGTGCGAC ATCATCCGGC TCGCCGCCAC CAGCGGCGAG CTGATCAACG 6007 CGCAATGGGA CCAGAGGACG CGCAACGGTT CGTGACGACC TGCGCCACAA GTGCCAGGAG 6067 GTTCGCTCCC CG ATG AAC ACA ACT CGT ACG GCA ACC GCC CAG GAA GCG 6115
Met Asn Thr Thr Arg Thr Ala Thr Ala Gin Glu Ala 1 5 10 GGG GTC GCC GAC GCG GCG CGC CCG GAC GTC GAC CGG CGG GCG GTC GTG 6163 Gly Val Ala Asp Ala Ala Arg Pro Asp Val Asp Arg Arg Ala Val Val
15 20 25

<Desc/Clms Page number 94>

CGG GCG CTG AGC TCG GAG GTC TCC CGC GTC ACC GGC GCC GGT GAC GGT 6211 Arg Ala Leu Ser Ser Glu Val Ser Arg Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly
30 35 40 GAC GCC GAC GTG CAG GCC GCC CGG CTC GCC GAC CTC GCC GCG CAC TAC 6259 Asp Ala Asp Val Gin Ala Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ala Ala His Tyr
45 50 55 60 GGG GCG CAC CCG TTC ACG CCG CTG GAG CAG ACG CGT GCG CGG CTC GGC 6307 Gly Ala His Pro Phe Thr Pro Leu Glu Gin Thr Arg Ala Arg Leu Gly
65 70 75 CTG GAC CGC GCG GAG TTC GCC CAC CTG CTC GAC CTG TTC GGC CGC ATC 6355 Leu Asp Arg Ala Glu Phe Ala His Leu Leu Asp Leu Phe Gly Arg Ile
80 85 90 CCG GAC CTG GGC ACC GCG GTG GAG CAC GGT CCG GCG GGC AAG TAC TGG 6403 Pro Asp Leu Gly Thr Ala Val Glu His Gly Pro Ala Gly Lys Tyr Trp
95 100 105 TCC AAC ACG ATC AAG CCG CTG GAC GCC GCA GGC GCA CTG GAC GCG GCG 6451 Ser Asn Thr Ile Lys Pro Leu Asp Ala Ala Gly Ala Leu Asp Ala Ala
110 115 120 GTC TAC CGC AAG CCT GCC TTC CCC TAC AGC GTC GGC CTG TAC CCC GGG 6499 Val Tyr Arg Lys Pro Ala Phe Pro Tyr Ser Val Gly Leu Tyr Pro Gly 125 130 135 140 CCG ACG TGC ATG TTC CGC TGC CAC TTC TGC GTG CGG GTG ACC GGT GCC 6547 Pro Thr Cys Met Phe Arg Cys His Phe Cys Val Arg Val Thr Gly Ala
145 150 155 CGC TAC GAG GCC GCA TCG GTC CCG GCG GGC AAC GAG ACG CTG GCC GCG 6595 Arg Tyr Glu Ala Ala Ser Val Pro Ala Gly Asn Glu Thr Leu Ala Ala
160 165 170 ATC ATC GAC GAG GTG CCC ACG GAC AAC CCG AAG GCG ATG TAC ATG TCG 6643 Ile Ile Asp Glu Val Pro Thr Asp Asn Pro Lys Ala Met Tyr Met Ser
175 180 185 GGC GGG CTC GAG CCG CTG ACC AAC CCC GGT CTC GGC GAG CTG GTG TCG 6691 Gly Gly Leu Glu Pro Leu Thr Asn Pro Gly Leu Gly Glu Leu Val Ser
190 195 200

<Desc/Clms Page number 95>

CAC GCC GCC GGG CGC GGT TTC GAC CTC ACC GTC TAC ACC AAC GCC TTC 6739 His Ala Ala Gly Arg Gly Phe Asp Leu Thr Val Tyr Thr Asn Ala Phe 205 210 215 220 GCC CTC ACC GAG CAG ACG CTG AAC CGC CAG CCC GGC CTG TGG GAG CTG 6787 Ala Leu Thr Glu Gin Thr Leu Asn Arg Gin Pro Gly Leu Trp Glu Leu
225 230 235 GGC GCG ATC CGC ACG TCC CTC TAC GGG CTG AAC AAC GAC GAG TAC GAG 6835 Gly Ala Ile Arg Thr Ser Leu Tyr Gly Leu Asn Asn Asp Glu Tyr Glu
240 245 250 ACG ACC ACC GGC AAG CGC GGC GCT TTC GAA CGC GTC AAG AAG AAC CTG 6883 Thr Thr Thr Gly Lys Arg Gly Ala Phe Glu Arg Val Lys Lys Asn Leu
255 260 265 CAG GGC TTC CTG CGG ATG CGC GCC GAG CGG GAC GCG CCG ATC CGG CTC 6931 Gin Gly Phe Leu Arg Met Arg Ala Glu Arg Asp Ala Pro Ile Arg Leu
270 275 280 GGC TTC AAC CAC ATC ATC CTG CCG GGA CGG GCC GAC CGG CTC ACC GAC 6979 Gly Phe Asn His Ile Ile Leu Pro Gly Arg Ala Asp Arg Leu Thr Asp 285 290 295 300 CTC GTC GAC TTC ATC GCC GAG CTC AAC GAG TCC AGC CCG CAA CGG CCG 7027 Leu Val Asp Phe Ile Ala Glu Leu Asn Glu Ser Ser Pro Gin Arg Pro
305 310 315 CTG GAC TTC GTG ACG GTG CGC GAG GAC TAC AGC GGC CGC GAC GAC GGC 7075 Leu Asp Phe Val Thr Val Arg Glu Asp Tyr SerGly Arg Asp Asp Gly
320 325 330 CGG CTG TCG GAC TCC GAG CGC AAC GAG CTG CGC GAG GGC CTG GTG CGG 7123 Arg Leu Ser Asp Ser Glu Arg Asn Glu Leu Arg Glu Gly Leu Val Arg
335 340 345 TTC GTC GAC TAC GCC GCC GAG CGG ACC CCG GGC ATG CAC ATC GAC CTG 7171 Phe Val Asp Tyr Ala Ala Glu Arg Thr Pro Gly Met His Ile Asp Leu
350 355 360 GGC TAC GCC CTG GAG AGC CTG CGG CGG GGT GTG GAC GCC GAG CTG CTG 7219 Gly Tyr Ala Leu Glu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala Glu Leu Leu 365 370 375 380

<Desc/Clms Page number 96>

CGC ATC CGG CCG GAG ACG ATG CGT CCC ACC GCG CAC CCC CAG GTC GCG 7267 Arg Ile Arg Pro Glu Thr Met Arg Pro Thr Ala His Pro Gin Val Ala
385 390 395 GTG CAG ATC GAC CTG CTC GGC GAC GTC TAC CTC TAC CGC GAG GCG GGC 7315 Val Gin Ile Asp Leu Leu Gly Asp Val Tyr Leu Tyr Arg Glu Ala Gly
400 405 410 TTC CCG GAG CTG GAG GGC GCC ACC CGC TAC ATC GCG GGC CGG GTC ACC 7363 Phe Pro Glu Leu Glu Gly Ala Thr Arg Tyr Ile Ala Gly Arg Val Thr
415 420 425 CCG TCG ACC AGC CTG CGC GAG GTG GTG GAG AAC TTC GTG CTG GAG AAC 7411 Pro Ser Thr Ser Leu Arg Glu Val Val Glu Asn Phe Val Leu Glu Asn
430 435 440 GAG GGC GTG CAG CCC CGC CCC GGC GAC GAG TAC TTC CTC GAC GGC TTC 7459 Glu Gly Val Gin Pro Arg Pro Gly Asp Glu Tyr Phe Leu Asp Gly Phe 445 450 455 460 GAC CAG TCG GTG ACC GCA CGG CTC AAC CAG CTC GAA CGA GAC ATC GCC 7507 Asp Gin Ser Val Thr Ala Arg Leu Asn Gin Leu Glu Arg Asp Ile Ala
465 470 475 GAC GGG TGG GAG GAC CAC CGC GGC TTC CTG CGC GGA AGG TGAACCGGAG 7556 Asp Gly Trp Glu Asp His Arg Gly Phe Leu Arg Gly Arg
480 485 TTGCGAGTAC GTGAGCTGGC G GTG GCG GGC GGT TTC GAG TTC ACC CCC GAC 7607
Met Ala Gly Gly Phe Glu Phe Thr Pro Asp
1 5 10 CCG AAG CAG GAC CGG CGG GGC CTG TTC GTG TCT CCG CTG CAG GAC GAG 7655 Pro Lys Gin Asp Arg Arg Gly Leu Phe Val Ser Pro Leu Gin Asp Glu
15 20 25 GCG TTC GTG GGC GCG GTG GGC CAT CGG TTC CCC GTC GCC CAG ATG AAC 7703 Ala Phe Val Gly Ala Val Gly His Arg Phe Pro Val Ala Gin Met Asn
30 35 40 CAC ATC GTC TCC GCC CGG GGC GTG CTG CGC GGG CTG CAC TTC ACC ACC 7751 His Ile Val Ser Ala Arg Gly Val Leu Arg Gly Leu His Phe Thr Thr
45 50 55

<Desc/Clms Page number 97>

ACC CCG CCG GGG CAG TGC AAG TAC GTC TAC TGC GCG CGC GGC CGG GCG 7799 Thr Pro Pro Gly Gin Cys Lys Tyr Val Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ala
60 65 70 CTC GAC GTC ATC GTC GAC ATC CGG GTC GGC TCG CCG ACG TTC GGG AAG 7847 Leu Asp Val Ile Val Asp Ile Arg Val Gly Ser Pro Thr Phe Gly Lys
75 80 85 90 TGG GAC GCG GTG GAG ATG GAC ACC GAG CAC TTC CGG GCG GTC TAC TTC 7895 Trp Asp Ala Val Glu Met Asp Thr Glu His Phe Arg Ala Val Tyr Phe
95 100 105 CCC AGG GGC ACC GCG CAC GCC TTC CTC GCG CTT GAG GAC GAC ACC CTG 7943 Pro Arg Gly Thr Ala His Ala Phe Leu Ala Leu Glu Asp Asp Thr Leu
110 115 120 ATG TCG TAC CTG GTC AGC ACG CCG TAC GTG GCC GAG TAC GAG CAG GCG 7991 Met Ser Tyr Leu Val Ser Thr Pro Tyr Val Ala Glu Tyr Glu Gin Ala
125 130 135 ATC GAC CCG TTC GAC CCC GCG CTG GGT CTG CCG TGG CCC GCG GAC CTG 8039 Ile Asp Pro Phe Asp Pro Ala Leu Gly Leu Pro Trp Pro Ala Asp Leu
140 145 150 GAG GTC GTG CTC TCC GAC CGC GAC ACG GTG GCC GTG GAC CTG GAG ACC 8087 Glu Val Val Leu Ser Asp Arg Asp Thr Val Ala Val Asp Leu Glu Thr 155 160 165 170 GCC AGG CGG CGA GGG ATG CTG CCC GAC TAC GCC GAC TGC CTC GGC GAG 8135 Ala Arg Arg Arg Gly Met Leu Pro Asp Tyr Ala Asp Cys Leu Gly Glu
175 180 185 GAG CCC GCC AGC ACC GGC AGG TGAC 8160 Glu Pro Ala Ser Thr Gly Arg
190 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 7 :

<Desc/Clms Page number 98>

Met Asn Gly Ile Ser Asp Ser Pro Arg Gin Leu Ile Thr Leu Leu Gly
1 5 10 15 Ala Ser Gly Phe Val Gly Ser Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Asp His
20 25 30 Pro Val Arg Leu Arg Ala Val Ser Arg Gly Gly Ala Pro Ala Val Pro
35 40 45 Pro Gly Ala Ala Glu Val Glu Asp Leu Arg Ala Asp Leu Leu Glu Pro
50 55 60 Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ile Glu Asp Ala Asp Val Ile Val His Leu
65 70 75 80 Val Ala His Ala Ala Gly Gly Ser Thr Trp Arg Ser Ala Thr Ser Asp
85 90 95 Pro Glu Ala Glu Arg Val Asn Val Gly Leu Met His Asp Leu Val Gly
100 105 110 Ala Leu His Asp Arg Arg Arg Ser Thr Pro Pro Val Leu Leu Tyr Ala
115 120 125 Ser Thr Ala Gin Ala Ala Asn Pro Ser Ala Ala Ser Arg Tyr Ala Gin
130 135 140 Gin Lys Thr Glu Ala Glu Arg Ile Leu Arg Lys Ala Thr Asp Glu Gly 145 150 155 160 Arg Val Arg Gly Val Ile Leu Arg Leu Pro Ala Val Tyr Gly Gin Ser
165 170 175 Gly Pro Ser Gly Pro Met Gly Arg Gly Val Val Ala Ala Met Ile Arg
180 185 190 Arg Ala Leu Ala Gly Glu Pro Leu Thr Met Trp His Asp Gly Gly Val
195 200 205 Arg Arg Asp Leu Leu His Val Glu Asp Val Ala Thr Ala Phe Ala Ala
210 215 220 Ala Leu Glu His His Asp Ala Leu Ala Gly Gly Thr Trp Ala Leu Gly 225 230 235 240

<Desc/Clms Page number 99>

Ala Asp Arg Ser Glu Pro Leu Gly Asp Ile Phe Arg Ala Val Ser Gly
245 250 255 Ser Val Ala Arg Gin Thr Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Val Thr Val
260 265 270 Pro Ala Pro Glu His Ala Glu Ala Asn Asp Phe Arg Ser Asp Asp Ile
275 280 285 Asp Ser Thr Glu Phe Arg Ser Arg Thr Gly Trp Arg Pro Arg Val Ser
290 295 300 Leu Thr Asp Gly Ile Asp Arg Thr Val Ala Ala Leu Thr Pro Thr Glu 305 310 315 320 Glu His (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 8 : Met Arg Val Leu Leu Thr Ser Phe Ala His Arg Thr His Phe Gin Gly
1 5 10 15 Leu Val Pro Leu Ala Trp Ala Leu Arg Thr Ala Gly His Asp Val Arg
20 25 30 Val Ala Ala Gin Pro Ala Leu Thr Asp Ala Val Ile Gly Ala Gly Leu
35 40 45 Thr Ala Val Pro Val Gly Ser Asp His Arg Leu Phe Asp Ile Val Pro
50 55 60 Glu Val Ala Ala Gin Val His Arg Tyr Ser Phe Tyr Leu Asp Phe Tyr
65 70 75 80 His Arg Glu Gin Glu Leu His Ser Trp Glu Phe Leu Leu Gly Met Gln
85 90 95

<Desc/Clms Page number 100>

Glu Ala Thr Ser Arg Trp Val Tyr Pro Val Val Asn Asn Asp Ser Phe
100 105 110 Val Ala Glu Leu Val Asp Phe Ala Arg Asp Trp Arg Pro Asp Leu Val
115 120 125 Leu Trp Glu Pro Phe Thr Phe Ala Gly Ala Val Ala Ala Arg Ala Cys
130 135 140 Gly Ala Ala His Ala Arg Leu Leu Trp Gly Ser Asp Leu Thr Gly Tyr 145 150 155 160 Phe Arg Gly Arg Phe Gin Ala Gin Arg Leu Arg Arg Pro Pro Glu Asp
165 170 175 Arg Pro Asp Pro Leu Gly Thr Trp Leu Thr Glu Val Ala Gly Arg Phe
180 185 190 Gly Val Glu Phe Gly Glu Asp Leu Ala Val Gly Gin Trp Ser Val Asp
195 200 205 Gin Leu Pro Pro Ser Phe Arg Leu Asp Thr Gly Met Glu Thr Val Val
210 215 220 Ala Arg Thr Leu Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Val Val Pro Asp Trp Leu 225 230 235 240 Lys Lys Gly Ser Ala Thr Arg Arg Ile Cys Ile Thr Gly Gly Phe Ser
245 250 255 Gly Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Asp Gin Phe Ala Arg Thr Leu Ala
260 265 270 Gin Leu Ala Arg Phe Asp Gly Glu Ile Val Val Thr Gly Ser Gly Pro
275 280 285 Asp Thr Ser Ala Val Pro Asp Asn Ile Arg Leu Val Asp Phe Val Pro
290 295 300 Met Gly Val Leu Leu Gin Asn Cys Ala Ala Ile Ile His His Gly Gly 305 310 315 320 Ala Gly Thr Trp Ala Thr Ala Leu His His Gly Ile Pro Gin Ile Ser
325 330 335

<Desc/Clms Page number 101>

Val Ala His Glu Trp Asp Cys Met Leu Arg Gly Gin Gin Thr Ala Glu
340 345 350 Leu Gly Ala Gly Ile Tyr Leu Arg Pro Asp Glu Val Asp Ala Asp Ser
355 360 365 Leu Ala Ser Ala Leu Thr Gin Val Val Glu Asp Pro Thr Tyr Thr Glu
370 375 380 Asn Ala Val Lys Leu Arg Glu Glu Ala Leu Ser Asp Pro Thr Pro Gin 385 390 395 400 Glu Ile Val Pro Arg Leu Glu Glu Leu Thr Arg Arg His Ala Gly
405 410 415 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 9 : Met Tyr Glu Gly Gly Phe Ala Glu Leu Tyr Asp Arg Phe Tyr Arg Gly
1 5 10 15 Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Ala Glu Ala Ala Gin Val Ala Arg Leu Val
20 25 30 Arg Asp Arg Leu Pro Ser Ala Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly
35 40 45 Thr Gly Thr His Leu Arg Arg Phe Ala Asp Leu Phe Asp Asp Val Thr
50 55 60 Gly Leu Glu Leu Ser Ala Ala Met Ile Glu Val Ala Arg Pro Gin Leu
65 70 75 80 Gly Gly Ile Pro Val Leu Gin Gly Asp Met Arg Asp Phe Ala Leu Asp
85 90 95 Arg Glu Phe Asp Ala Val Thr Cys Met Phe Ser Ser Ile Gly His Met
100 105 110

<Desc/Clms Page number 102>

\rg Asp Gly Ala Glu Leu Asp Gin Ala Leu Ala Ser Phe Ala Arg His
115 120 125 .eu Ala Pro Gly Gly Val Val Val Val Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu
130 135 140 sp Phe Leu Asp Gly Tyr Val Ala Gly Asp Val Val Arg Asp Gly Asp L45 150 155 160 .eu Thr Ile Ser Arg Val Ser His Ser Val Arg Ala Gly Gly Ala Thr
165 170 175 Arg Met Glu Ile His Trp Val Val Ala Asp Ala Val Asn Gly Pro Arg
180 185 190 lis His Val Glu His Tyr Glu Ile Thr Leu Phe Glu Arg Gin Gin Tyr
195 200 205 ;lu Lys Ala Phe Thr Ala Ala Gly Cys Ala Val Gin Tyr Leu Glu Gly
210 215 220 ;ly Pro Ser Gly Arg Gly Leu Phe Val Gly Val Arg Gly !25 230 235 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 10: [et Arg Val Leu Ile Asp Asn Ala Arg Arg Gin Gin Ala Glu Pro Ser 1 5 10 15 'hr Thr Pro Gin Gly Glu Ser Met Gly Asp Arg Thr Gly Asp Arg Thr
20 25 30 le Pro Glu Ser Ser Gin Thr Ala Thr Arg Phe Leu Leu Gly Asp Gly
35 40 45 ly Ile Pro Thr Ala Thr Ala Glu Thr His Asp Trp Leu Thr Arg Asn
50 55 60

<Desc/Clms Page number 103>

Gly Ala Glu Gin Arg Leu Glu Val Ala Arg Val Pro Phe Ser Ala Met
65 70 75 80 Asp Arg Trp Ser Phe Gin Pro Glu Asp Gly Arg Leu Ala His Glu Ser
85 90 95 Gly Arg Phe Phe Ser Ile Glu Gly Leu His Val Arg Thr Asn Phe Gly
100 105 110 Trp Arg Arg Asp Trp Ile Gin Pro Ile Ile Val Gin Pro Glu Ile Gly
115 120 125 Phe Leu Gly Leu Ile Val Lys Glu Phe Asp Gly Val Leu His Val Leu
130 135 140 Ala Gin Ala Lys Ala Glu Pro Gly Asn Ile Asn Ala Val Gin Leu Ser 145 150 155 160 Pro Thr Leu Gin Ala Thr Arg Ser Asn Tyr Thr Gly Val His Arg Gly
165 170 175 Ser Lys Val Arg Phe Ile Glu Tyr Phe Asn Gly Thr Arg Pro Ser Arg
180 185 190 Ile Leu Val Asp Val Leu Gin Ser Glu Gin Gly Ala Trp Phe Leu Arg
195 200 205 Lys Arg Asn Arg Asn Met Val Val Glu Val Phe Asp Asp Leu Pro Glu
210 215 220 His Pro Asn Phe Arg Trp Leu Thr Val Ala Gin Leu Arg Ala Met Leu 225 230 235 240 His His Asp Asn Val Val Asn Met Asp Leu Arg Thr Val Leu Ala Cys
245 250 255 Val Pro Thr Ala Val Glu Arg Asp Arg Ala Asp Asp Val Leu Ala Arg
260 265 270 Leu Pro Glu Gly Ser Phe Gin Ala Arg Leu Leu His Ser Phe Ile Gly
275 280 285 Ala Gly Thr Pro Ala Asn Asn Met Asn Ser Leu Leu Ser Trp Ile Ser
290 295 300

<Desc/Clms Page number 104>

Asp Val Arg Ala Arg Arg Glu Phe Val Gin Arg Gly Arg Pro Leu Pro 305 310 315 320 Asp Ile Glu Arg Ser Gly Trp Ile Arg Arg Asp Asp Gly Ile Glu His
325 330 335 Glu Glu Lys Lys Tyr Phe Asp Val Phe Gly Val Thr Val Ala Thr Ser
340 345 350 Asp Arg Glu Val Asn Ser Trp Met Gin Pro Leu Leu Ser Pro Ala Asn
355 360 365 Asn Gly Leu Leu Ala Leu Leu Val Lys Asp Ile Gly Gly Thr Leu His
370 375 380 Ala Leu Val Gin Leu Arg Thr Glu Ala Gly Gly Met Asp Val Ala Glu 385 390 395 400 Leu Ala Pro Thr Val His Cys Gin Pro Asp Asn Tyr Ala Asp Ala Pro
405 410 415 Glu Glu Phe Arg Pro Ala Tyr Val Asp Tyr Val Leu Asn Val Pro Arg
420 425 430 Ser Gin Val Arg Tyr Asp Ala Trp His Ser Glu Glu Gly Gly Arg Phe
435 440 445 Tyr Arg Asn Glu Asn Arg Tyr Met Leu Ile Glu Val Pro Ala Asp Phe
450 455 460 Asp Ala Ser Ala Ala Pro Asp His Arg Trp Met Thr Phe Asp Gin Ile 465 470 475 480 Thr Tyr Leu Leu Gly His Ser His Tyr Val Asn Ile Gin Leu Arg Ser
485 490 495 Ile Ile Ala Cys Ala Ser Ala Val Tyr Thr Arg Thr Ala Gly
500 505 510 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION :

<Desc/Clms Page number 105>

linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 11: Met Asn Thr Thr Arg Thr Ala Thr Ala Gin Glu Ala Gly Val Ala Asp 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Asp Val Asp Arg Arg Ala Val Val Arg Ala Leu Ser
20 25 30 Ser Glu Val Ser Arg Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val
35 40 45 Gin Ala Ala Arg Leu Ala Asp Leu Ala Ala His Tyr Gly Ala His Pro
50 55 60 Phe Thr Pro Leu Glu Gin Thr Arg Ala Arg Leu Gly Leu Asp Arg Ala
65 70 75 80 Glu Phe Ala His Leu Leu Asp Leu Phe Gly Arg Ile Pro Asp Leu Gly
85 90 95 Thr Ala Val Glu His Gly Pro Ala Gly Lys Tyr Trp Ser Asn Thr Ile
100 105 110 Lys Pro Leu Asp Ala Ala Gly Ala Leu Asp Ala Ala Val Tyr Arg Lys
115 120 125 Pro Ala Phe Pro Tyr Ser Val Gly Leu Tyr Pro Gly Pro Thr Cys Met
130 135 140 Phe Arg Cys His Phe Cys Val Arg Val Thr Gly Ala Arg Tyr Glu Ala 145 150 155 160 Ala Ser Val Pro Ala Gly Asn Glu Thr Leu Ala Ala Ile Ile Asp Glu
165 170 175 Val Pro Thr Asp Asn Pro Lys Ala Met Tyr Met Ser Gly Gly Leu Glu
180 185 190 Pro Leu Thr Asn Pro Gly Leu Gly Glu Leu Val Ser His Ala Ala Gly
195 200 205 Arg Gly Phe Asp Leu Thr Val Tyr Thr Asn Ala Phe Ala Leu Thr Glu
210 215 220

<Desc/Clms Page number 106>

Gin Thr Leu Asn Arg Gin Pro Gly Leu Trp Glu Leu Gly Ala Ile Arg 225 230 235 240 Thr Ser Leu Tyr Gly Leu Asn Asn Asp Glu Tyr Glu Thr Thr Thr Gly
245 250 255 Lys Arg Gly Ala Phe Glu Arg Val Lys Lys Asn Leu Gin Gly Phe Leu
260 265 270 Arg Met Arg Ala Glu Arg Asp Ala Pro Ile Arg Leu Gly Phe Asn His
275 280 285 Ile Ile Leu Pro Gly Arg Ala Asp Arg Leu Thr Asp Leu Val Asp Phe
290 295 300 Ile Ala Glu Leu Asn Glu Ser Ser Pro Gin Arg Pro Leu Asp Phe Val 305 310 315 320 Thr Val Arg Glu Asp Tyr Ser Gly Arg Asp Asp Gly Arg Leu Ser Asp
325 330 335 Ser Glu Arg Asn Glu Leu Arg Glu Gly Leu Val Arg Phe Val Asp Tyr
340 345 350 Ala Ala Glu Arg Thr Pro Gly Met His Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Leu
355 360 365 Glu Ser Leu Arg Arg Gly Val Asp Ala Glu Leu Leu Arg Ile Arg Pro
370 375 380 Glu Thr Met Arg Pro Thr Ala His Pro Gin Val Ala Val Gin Ile Asp 385 390 395 400 Leu Leu Gly Asp Val Tyr Leu Tyr Arg Glu Ala Gly Phe Pro Glu Leu
405 410 415 Glu Gly Ala Thr Arg Tyr Ile Ala Gly Arg Val Thr Pro Ser Thr Ser
420 425 430 Leu Arg Glu Val Val Glu Asn Phe Val Leu Glu Asn Glu Gly Val Gln
435 440 445 Pro Arg Pro Gly Asp Glu Tyr Phe Leu Asp Gly Phe Asp Gin Ser Val
450 455 460

<Desc/Clms Page number 107>

Thr Ala Arg Leu Asn Gin Leu Glu Arg Asp Ile Ala Asp Gly Trp Glu 465 470 475 480 Asp His Arg Gly Phe Leu Arg Gly Arg
485 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQID NO: 12 : Met Ala Gly Gly Phe Glu Phe Thr Pro Asp Pro Lys Gin Asp Arg Arg
1 5 10 15 Gly Leu Phe Val Ser Pro Leu Gin Asp Glu Ala Phe Val Gly Ala Val
20 25 30 Gly His Arg Phe Pro Val Ala Gin Met Asn His Ile Val Ser Ala Arg
35 40 45 Gly Val Leu Arg Gly Leu His Phe Thr Thr Thr Pro Pro Gly Gin Cys
50 55 60 Lys Tyr Val Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ala Leu Asp Val Ile Val Asp
65 70 75 80 Ile Arg Val Gly Ser Pro Thr Phe Gly Lys Trp Asp Ala Val Glu Met
85 90 95 Asp Thr Glu His Phe Arg Ala Val Tyr Phe Pro Arg Gly Thr Ala His
100 105 110 Ala Phe Leu Ala Leu Glu Asp Asp Thr Leu Met Ser Tyr Leu Val Ser
115 120 125 Thr Pro Tyr Val Ala Glu Tyr Glu Gin Ala Ile Asp Pro Phe Asp Pro
130 135 140 Ala Leu Gly Leu Pro Trp Pro Ala Asp Leu Glu Val Val Leu Ser Asp 145 150 155 160

<Desc/Clms Page number 108>

Arg Asp Thr Val Ala Val Asp Leu Glu Thr Ala Arg Arg Arg Gly Met
165 170 175 Leu Pro Asp Tyr Ala Asp Cys Leu Gly Glu Glu Pro Ala Ser Thr Gly
180 185 190 Arg (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1206 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : ADN(génomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : erythraea (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1..1203 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "implique dans la byosynthese de la desosamine" /gene= "eryCIV" /note= "SEQ ID NO 6 DE 4837 A 6039" (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: mat~peptide (B) EMPLACEMENT:! (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 13 : ATG AAA CGC GCG CTG ACC GAC CTG GCG ATC TTC GGC GGC CCC GAG GCA 48 Met Lys Arg Ala Leu Thr Asp Leu Ala Ile Phe Gly Gly Pro Glu Ala
1 5 10 15 TTC CTG CAC ACC CTC TAC GTG GGC AGG CCG ACC GTC GGG GAC CGG GAG 96 Phe Leu His Thr Leu Tyr Val Gly Arg Pro Thr Val Gly Asp Arg Glu
20 25 30

<Desc/Clms Page number 109>

CGG TTC TTC GCC CGC CTG GAG TGG GCG CTG AAC AAC AAC TGG CTG ACC 144 Arg Phe Phe Ala Arg Leu Glu Trp Ala Leu Asn Asn Asn Trp Leu Thr
35 40 45 AAC GGC GGA CCA CTG GTG CGC GAG TTC GAG GGC CGG GTC GCC GAC CTG 192 Asn Gly Gly Pro Leu Val Arg Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Asp Leu
50 55 60 GCG GGT GTC CGC CAC TGC GTG GCC ACC TGC AAC GCG ACG GTC GCG CTG 240 Ala Gly Val Arg His Cys Val Ala Thr Cys Asn Ala Thr Val Ala Leu
65 70 75 80 CAA CTG GTG CTG CGC GCG AGC GAC GTG TCC GGC GAG GTC GTC ATG CCT 288 Gin Leu Val Leu Arg Ala Ser Asp Val Ser Gly Glu Val Val Met Pro
85 90 95 TCG ATG ACG TTC GCG GCC ACC GCG CAC GCG GCG AGC TGG CTG GGG CTG 336 Ser Met Thr Phe Ala Ala Thr Ala His Ala Ala Ser Trp Leu Gly Leu
100 105 110 GAA CCG GTG TTC TGC GAC GTG GAC CCC GAG ACC GGC CTG CTC GAC CCC 384 Glu Pro Val Phe Cys Asp Val Asp Pro Glu Thr Gly Leu Leu Asp Pro
115 120 125 GAG CAC GTC GCG TCG CTG GTG ACA CCG CGG ACG GGC GCG ATC ATC GGC 432 Glu His Val Ala Ser Leu Val Thr Pro Arg Thr Gly Ala Ile Ile Gly
130 135 140 GTG CAC CTG TGG GGC AGG CCC GCT CCG GTC GAG GCG CTG GAG AAG ATC 480 Val His Leu Trp Gly Arg Pro Ala Pro Val Glu Ala Leu Glu Lys Ile 145 150 155 160 GCC GCC GAG CAC CAG GTC AAA CTC TTC TTC GAC GCC GCG CAC GCG CTG 528 Ala Ala Glu His Gin Val Lys Leu Phe Phe Asp Ala Ala His Ala Leu
165 170 175 GGC TGC ACC GCC GGC GGG CGG CCG GTC GGC GCC TTC GGC AAC GCC GAG 576 Gly Cys Thr Ala Gly Gly Arg Pro Val Gly Ala Phe Gly Asn Ala Glu
180 185 190 GTG TTC AGC TTC CAC GCC ACG AAG GCG GTC ACC TCG TTC GAG GGC GGC 624 Val Phe Ser Phe His Ala Thr Lys Ala Val Thr Ser Phe Glu Gly Gly
195 200 205

<Desc/Clms Page number 110>

GCC ATC GTC ACC GAC GAC GGG CTG CTG GCC GAC CGC ATC CGC GCC ATG 672 Ala Ile Val Thr Asp Asp Gly Leu Leu Ala Asp Arg Ile Arg Ala Met
210 215 220 CAC AAC TTC GGG ATC GCA CCG GAC AAG CTG GTG ACC GAT GTC GGC ACC 720 His Asn Phe Gly Ile Ala Pro Asp Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Thr 225 230 235 240 AAC GGC AAG ATG AGC GAG TGC GCC GCG GCG ATG GGC CTC ACC TCG CTC 768 Asn Gly Lys Met Ser Glu Cys Ala Ala Ala Met Gly Leu Thr Ser Leu
245 250 255 GAC GCC TTC GCC GAG ACC AGG GTG CAC AAC CGC CTC AAC CAC GCG CTC 816 Asp Ala Phe Ala Glu Thr Arg Val His Asn Arg Leu Asn His Ala Leu
260 265 270 TAC TCC GAC GAG CTC CGC GAC GTG CGC GGC ATA TCC GTG CAC GCG TTC 864 Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Asp Val Arg Gly Ile Ser Val His Ala Phe
275 280 285 GAT CCT GGC GAG CAG AAC AAC TAC CAG TAC GTG ATC ATC TCG GTG GAC 912 Asp Pro Gly Glu Gin Asn Asn Tyr Gin Tyr Val Ile Ile Ser Val Asp
290 295 300 TCC GCG GCC ACC GGC ATC GAC CGC GAC CAG TTG CAG GCG ATC CTG CGA 960 Ser Ala Ala Thr Gly Ile Asp Arg Asp Gin Leu Gin Ala Ile Leu Arg 305 310 315 320 GCG GAG AAG GTT GTG GCA CAA CCC TAC TTC TCC CCC GGG TGC CAC CAG 1008 Ala Glu Lys Val Val Ala Gin Pro Tyr Phe Ser Pro Gly Cys His Gln
325 330 335 ATG CAG CCG TAC CGG ACC GAG CCG CCG CTG CGG CTG GAG AAC ACC GAA 1056 Met Gin Pro Tyr Arg Thr Glu Pro Pro Leu Arg Leu Glu Asn Thr Glu
340 345 350 CAG CTC TCC GAC CGG GTG CTC GCG CTG CCC ACC GGC CCC GCG GTG TCC 1104 Gin Leu Ser Asp Arg Val Leu Ala Leu Pro Thr Gly Pro Ala Val Ser
355 360 365 AGC GAG GAC ATC CGG CGG GTG TGC GAC ATC ATC CGG CTC GCC GCC ACC 1152 Ser Glu Asp Ile Arg Arg Val Cys Asp Ile Ile Arg Leu Ala Ala Thr
370 375 380

<Desc/Clms Page number 111>

AGC GGC GAG CTG ATC AAC GCG CAA TGG GAC CAG AGG ACG CGC AAC GGT 1200 Ser Gly Glu Leu Ile Asn Ala Gin Trp Asp Gin Arg Thr Arg Asn Gly 385 390 395 400 TCG TGA 1206 Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : acide aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 14 : Met Lys Arg Ala Leu Thr Asp Leu Ala Ile Phe Gly Gly Pro Glu Ala
1 5 10 15 Phe Leu His Thr Leu Tyr Val Gly Arg Pro Thr Val Gly Asp Arg Glu
20 25 30 Arg Phe Phe Ala Arg Leu Glu Trp Ala Leu Asn Asn Asn Trp Leu Thr
35 40 45 Asn Gly Gly Pro Leu Val Arg Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Asp Leu
50 55 60 Ala Gly Val Arg His Cys Val Ala Thr Cys Asn Ala Thr Val Ala Leu
65 70 75 80 Gin Leu Val Leu Arg Ala Ser Asp Val Ser Gly Glu Val Val Met Pro
85 90 95 Ser Met Thr Phe Ala Ala Thr Ala His Ala Ala Ser Trp Leu Gly Leu
100 105 110 Glu Pro Val Phe Cys Asp Val Asp Pro Glu Thr Gly Leu Leu Asp Pro
115 120 125 Glu His Val Ala Ser Leu Val Thr Pro Arg Thr Gly Ala Ile Ile Gly
130 135 140

<Desc/Clms Page number 112>

Val His Leu Trp Gly Arg Pro Ala Pro Val Glu Ala Leu Glu Lys Ile 145 150 155 160 Ala Ala Glu His Gin Val Lys Leu Phe Phe Asp Ala Ala His Ala Leu
165 170 175 Gly Cys Thr Ala Gly Gly Arg Pro Val Gly Ala Phe Gly Asn Ala Glu
180 185 190 Val Phe Ser Phe His Ala Thr Lys Ala Val Thr Ser Phe Glu Gly Gly
195 200 205 Ala Ile Val Thr Asp Asp Gly Leu Leu Ala Asp Arg Ile Arg Ala Met
210 215 220 His Asn Phe Gly Ile Ala Pro Asp Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Thr 225 230 235 240 Asn Gly Lys Met Ser Glu Cys Ala Ala Ala Met Gly Leu Thr Ser Leu
245 250 255 Asp Ala Phe Ala Glu Thr Arg Val His Asn Arg Leu Asn His Ala Leu
260 265 270 Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Asp Val Arg Gly Ile Ser Val His Ala Phe
275 280 285 Asp Pro Gly Glu Gin Asn Asn Tyr Gin Tyr Val Ile Ile Ser Val Asp
290 295 300 Ser Ala Ala Thr Gly Ile Asp Arg Asp Gin Leu Gin Ala Ile Leu Arg 305 310 315 320 Ala Glu Lys Val Val Ala Gin Pro Tyr Phe Ser Pro Gly Cys His Gln
325 330 335 Met Gin Pro Tyr Arg Thr Glu Pro Pro Leu Arg Leu Glu Asn Thr Glu
340 345 350 Gin Leu Ser Asp Arg Val Leu Ala Leu Pro Thr Gly Pro Ala Val Ser
355 360 365 Ser Glu Asp Ile Arg Arg Val Cys Asp Ile Ile Arg Leu Ala Ala Thr
370 375 380

<Desc/Clms Page number 113>

Ser Gly Glu Leu Ile Asn Ala Gin Trp Asp Gin Arg Thr Arg Asn Gly 385 390 395 400 Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 6093paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (génomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : antibioticus (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:184..1386 (D) AUTRES INFORMATIONS:/gene= "olePl" (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:1437..2714 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "glycosylation de
8,8a-desoxyoleandolide" /gene= "oleGl" /transl~except= (pos: 1437.. 1439, aa : Met)(ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:2722..3999 (D) AUTRES INFORMATIONS:/function= "glycosylation de
8,8a-desoxyoleandolide" /gene= "oleG2" (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:4810..5967 (D) AUTRES INFORMATIONS:/gene= "oleY" (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: mat~peptide

<Desc/Clms Page number 114>

(B) EMPLACEMENT:184 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 15 : GCATGCCCCG CTTTCCTCCC CCTCTCCGAA CGCATCGACG ACCCGATCCC CCTCAGGGAC 60 CGGTGAAGGA GCGTGTTGCA CTCATGCAGG ACATGCAAGG CGTACAGCCC GAACCAGCCA 120 GTGTCGAACA CGCGGCGGAC GCAGCTCGAA CAGAGCGAAC GGCGCACGGA AGCCGCCCAG 180 GAG ATG GAG GAC AGC GAA CTG GGG CGC CGC CTG CAG ATG CTC CGC GGC 228
Met Glu Asp Ser Glu Leu Gly Arg Arg Leu Gin Met Leu Arg Gly 1 5 10 15 ATG CAG TGG GTC TTC GGC GCC AAC GGC GAT CCG TAC GCC CGG CTG CTG 276 Met Gin Trp Val Phe Gly Ala Asn Gly Asp Pro Tyr Ala Arg Leu Leu
20 25 30 TGT GGC ATG GAG GAT GAC CCG TCA CCT TTC TAC GAC GCG ATA CGG ACC 324 Cys Gly Met Glu Asp Asp Pro Ser Pro Phe Tyr Asp Ala Ile Arg Thr
35 40 45 CTG GGC GAG CTG CAC CGG AGC AGG ACC GGA GCC TGG GTC ACC GCC GAC 372 Leu Gly Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Gly Ala Trp Val Thr Ala Asp
50 55 60 CCC GGG CTC GGG GGC CGC ATC CTC GCC GAC CGG AAG GCT CGG TGC CCG 420 Pro Gly Leu Gly Gly Arg Ile Leu Ala Asp Arg Lys Ala Arg Cys Pro
65 70 75 GAA GGC TCG TGG CCG GTG CGG GCG AAG ACC GAC GGG CTG GAG CAG TAC 468 Glu Gly Ser Trp Pro Val Arg Ala Lys Thr Asp Gly Leu Glu Gin Tyr
80 85 90 95 GTG CTG CCC GGG CAC CAG GCG TTC CTG CGG CTG GAG CGC GAG GAG GCC 516 Val Leu Pro Gly His Gin Ala Phe Leu Arg Leu Glu Arg Glu Glu Ala
100 105 110 GAG CGA CTG CGG GAG GTC GCG GCG CCG GTG CTG GGG GCC GCG GCG GTC 564 Glu Arg Leu Arg Glu Val Ala Ala Pro Val Leu Gly Ala Ala Ala Val
115 120 125 GAC GCG TGG CGC CCG CTG ATC GAC GAG GTC TGC GCG GGG CTC GCG AAG 612 Asp Ala Trp Arg Pro Leu Ile Asp Glu Val Cys Ala Gly Leu Ala Lys
130 135 140

<Desc/Clms Page number 115>

GGG CTG CCG GAC ACG TTC GAC CTG GTC GAG GAG TAC GCG GGG CTG GTG 660 Gly Leu Pro Asp Thr Phe Asp Leu Val Glu Glu Tyr Ala Gly Leu Val
145 150 155 CCG GTC GAG GTG CTG GCG CGG ATC TGG GGC GTC CCG GAG GAG GAC CGC 708 Pro Val Glu Val Leu Ala Arg Ile Trp Gly Val Pro Glu Glu Asp Arg 160 165 170 175 GCC CGG TTC GGG CGT GAC TGC CGG GCG CTC GCT CCC GCG CTG GAC AGC 756 Ala Arg Phe Gly Arg Asp Cys Arg Ala Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ser
180 185 190 CTC CTG TGT CCC CAG CAG TTG GCG CTG AGC AAG GAC ATG GCG TCC GCC 804 Leu Leu Cys Pro Gin Gin Leu Ala Leu Ser Lys Asp Met Ala Ser Ala
195 200 205 CTG GAG GAC CTG CGT CTC CTC TTC GAC GGC CTC GAC GCG ACG CCG CGC 852 Leu Glu Asp Leu Arg Leu Leu Phe Asp Gly Leu Asp Ala Thr Pro Arg
210 215 220 CTC GCC GGC CCC GCC GAC GGT GAC GGA ACG GCC GTG GCC ATG CTC ACC 900 Leu Ala Gly Pro Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ala Val Ala Met Leu Thr
225 230 235 GTT CTG CTC TGC ACG GAG CCG GTG ACC ACG GCG ATC GGG AAC ACC GTG 948 Val Leu Leu Cys Thr Glu Pro Val Thr Thr Ala Ile Gly Asn Thr Val 240 245 250 255 CTC GGG CTC CTT CCC GGG CAG TGG CCC GTG CCC TGC ACC GGC CGG GTG 996 Leu Gly Leu Leu Pro Gly Gin TrpPro Val Pro Cys Thr Gly Arg Val
260 265 270 GCT GCC GGG CAG GTT GCC GGG CAG GCG CTG CAC CGG GCG GTG TCG TAC 1044 Ala Ala Gly Gin Val Ala Gly Gin Ala Leu His Arg Ala Val Ser Tyr
275 280 285 CGT ATC GCG ACG CGG TTC GCC CGG GAG GAC CTG GAG TTG GCG GGC TGC 1092 Arg Ile Ala Thr Arg Phe Ala Arg Glu Asp Leu Glu Leu Ala Gly Cys
290 295 300 GAG GTC AAG TCC GGT GAC GAG GTG GTG GTC CTG GCC GGA GCG ATC GGC 1140 Glu Val Lys Ser Gly Asp Glu Val Val Val Leu Ala Gly Ala Ile Gly
305 310 315

<Desc/Clms Page number 116>

CGG AAC GGA CCG TCC GCA GCC GCC CCG CCT GCC CCA CCG GGC CCA GCG 1188 Arg Asn Gly Pro Ser Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gly Pro Ala 320 325 330 335 GCC CCG CCC GCC CCG TCG GTC TTC GGT GCC GCC GCC TTC GAG AAC GCG 1236 Ala Pro Pro Ala Pro Ser Val Phe Gly Ala Ala Ala Phe Glu Asn Ala
340 345 350 CTG GCC GAA CCC CTC GTC CGG GCT GTG ACG GGA GCG GCC CTC CAG GCC 1284 Leu Ala Glu Pro Leu Val Arg Ala Val Thr Gly Ala Ala Leu Gin Ala
355 360 365 CTC GCG GAG GGG CCC CCC CGG CTG ACG GCG GCG GGA CCC GTC GTA CGA 1332 Leu Ala Glu Gly Pro Pro Arg Leu Thr Ala Ala Gly Pro Val Val Arg
370 375 380 CGG CGG CGT TCC CCT GTC GTC GGC GGG CTG CAC CGG GCT CCG GTG GCC 1380 Arg Arg Arg Ser Pro Val Val Gly Gly Leu His Arg Ala Pro Val Ala
385 390 395 GCC GCA TGAGCATCGC GTCGAACGGC GCGCGCTCGG CCCCCCGCCG GCCCCTGCGC 1436 Ala Ala 400 GTG ATG ATG ACC ACC TTC GCG GCC AAC ACG CAC TTC CAG CCG CTG GTT 1484 Met Met Met Thr Thr Phe Ala Ala Asn Thr His Phe Gin Pro Leu Val
1 5 10 15 CCC CTG GCC TGG GCA CTG CGG ACA GCC GGG CAC GAG GTG CGC GTG GTG 1532 Pro Leu Ala Trp Ala Leu Arg Thr Ala Gly His Glu Val Arg Val Val
20 25 30 AGC CAG CCC TCG CTG AGC GAC GTG GTG ACG CAG GCG GGG CTC ACC TCG 1580 Ser Gin Pro Ser Leu Ser Asp Val Val Thr Gin Ala Gly Leu Thr Ser
35 40 45 GTC CCG GTG GGC ACC GAG GCT CCG GTC GAG CAG TTC GCG GCG ACC TGG 1628 Val Pro Val Gly Thr Glu Ala Pro Val Glu Gin Phe Ala Ala Thr Trp
50 55 60 GGC GAC GAT GCC TAC ATC GGC GTC AAC AGC ATC GAC TTC ACC GGC AAC 1676 Gly Asp Asp Ala Tyr Ile Gly Val Asn Ser Ile Asp Phe Thr Gly Asn
65 70 75 80

<Desc/Clms Page number 117>

GAC CCC GGC CTG TGG ACG TGG CCG TAC CTC CTG GGC ATG GAG ACC ATG 1724 Asp Pro Gly Leu Trp Thr Trp Pro Tyr Leu Leu Gly Met Glu Thr Met
85 90 95 CTG GTG CCG GCC TTC TAC GAG TTG CTG AAC AAC GAG TCC TTC GTG GAC 1772 Leu Val Pro Ala Phe Tyr Glu Leu Leu Asn Asn Glu Ser Phe Val Asp
100 105 110 GGC GTA GTC GAG TTC GCC CGT GAC TGG CGG CCC GAC CTG GTG ATC TGG 1820 Gly Val Val Glu Phe Ala Arg Asp Trp Arg Pro Asp Leu Val Ile Trp
115 120 125 GAG CCG CTG ACG TTC GCC GGC GCG GTG GCG GCG CGC GTC ACC GGC GCG 1868 Glu Pro Leu Thr Phe Ala Gly Ala Val Ala Ala Arg Val Thr Gly Ala
130 135 140 GCC CAC GCC CGG CTG CCG TGG GGG CAG GAG ATC ACC CTG CGC GGG CGG 1916 Ala His Ala Arg Leu Pro Trp Gly Gin Glu Ile Thr Leu Arg Gly Arg 145 150 155 160 CAG GCG TTC CTC GCC GAG CGT GCC CTG CAA CCG TTC GAG CAC CGG GAG 1964 Gin Ala Phe Leu Ala Glu Arg Ala Leu Gin Pro Phe Glu His Arg Glu
165 170 175 GAT CCC ACG GCC GAG TGG CTG GGC CGC ATG CTC GAC CGG TAC GGC TGC 2012 Asp Pro Thr Ala Glu Trp Leu Gly Arg Met Leu Asp Arg Tyr Gly Cys
180 185 190 TCG TTC GAC GAG GAG ATG GTC ACC GGG CAG TGG ACC ATC GAC ACG CTG 2060 Ser Phe Asp Glu Glu Met Val Thr Gly Gin Trp Thr Ile Asp Thr Leu
195 200 205 CCG CGC AGC ATG CGG CTG GAG CTG TCC GAG GAG CTG CGC ACC CTG GAC 2108 Pro Arg Ser Met Arg Leu Glu Leu Ser Glu Glu Leu Arg Thr Leu Asp
210 215 220 ATG CGG TAC GTG CCG TAC AAC GGA CCG GCG GTC GTA CCC CCC TGG GTG 2156 Met Arg Tyr Val Pro Tyr Asn Gly Pro Ala Val Val Pro Pro Trp Val 225 230 235 240 TGG GAA CCG TGC GAG CGG CCC CGG GTC TGT CTG ACG ATC GGC ACC TCC 2204 Trp Glu Pro Cys Glu Arg Pro Arg Val Cys Leu Thr Ile Gly Thr Ser
245 250 255

<Desc/Clms Page number 118>

CAG CGT GAC TCC GGC CGG GAC CAT GTC CCC CTC GAC CAC CTG CTC GAC 2252 Gin Arg Asp Ser Gly Arg Asp His Val Pro Leu Asp Hia Leu Leu Asp
260 265 270 TCC CTC GCC GAC GTG GAC GCG GAG ATC GTG GCC ACG CTC GAC ACC ACC 2300 Ser Leu Ala Asp Val Asp Ala Glu Ile Val Ala Thr Leu Asp Thr Thr
275 280 285 CAG CAG GAG CGC CTG CGG GGC GCG GCC CCC GGC AAC GTC CGG CTG GTG 2348 Gin Gin Glu Arg Leu Arg Gly Ala Ala Pro Gly Asn Val Arg Leu Val
290 295 300 GAC TTC GTC CCG CTG CAC GCG CTG ATG CCG ACC TGC TCG GCG ATC GTG 2396 Asp Phe Val Pro Leu His Ala Leu Met Pro Thr Cys Ser Ala Ile Val 305 310 315 320 CAC CAC GGT GGT CCG GGC ACG TGG TCG ACG GCG GCG CTC CAC GGC GTC 2444 Hia His Gly Gly Pro Gly Thr Trp Ser Thr Ala Ala Leu His Gly Val
325 330 335 CCG CAG ATC ATC CTG GAC ACC TCG TGG GAC ACA CCG GTG CGG GCG CAG 2492 Pro Gin Ile Ile Leu Asp Thr Ser Trp Asp Thr Pro Val Arg Ala Gin
340 345 350 CGC ATG CAG CAA CTC GGG GCG GGC CTG TCG ATG CCG GTG GGG GAA CTG 2540 Arg Met Gin Gin Leu Gly Ala Gly Leu Ser Met Pro Val Gly Glu Leu
355 360 365 GGC GTC GAG GCG CTG CGG GAC CGG GTC CTG CGG CTG CTG GGG GAG CCG 2588 Gly Val Glu Ala Leu Arg Asp Arg Val Leu Arg Leu Leu Gly Glu Pro
370 375 380 GAG TTC CGC GCG GGC GCC GAG CGG ATC CGG GCC GAG ATG CTC GCG ATG 2636 Glu Phe Arg Ala Gly Ala Glu Arg Ile Arg Ala Glu Met Leu Ala Met 385 390 395 400 CCC GCC CCC GGT GAC GTC GTA CCG GAC CTG GAA CGA CTC ACC GCG GAG 2684 Pro Ala Pro Gly Asp Val Val Pro Asp Leu Glu Arg Leu Thr Ala Glu
405 410 415 CAT GCC ACC GGC GCG ATG GCG GGA AGG CGG TGAGACG ATG CGC GTA CTG 2733 His Ala Thr Gly Ala Met Ala Gly Arg Arg Met Arg Val Leu
420 425 1

<Desc/Clms Page number 119>

CTG ACC TGC TTC GCC AAC GAC ACC CAC TTC CAC GGG CTG GTG CCG CTG 2781 Leu Thr Cys Phe Ala Asn Asp Thr His Phe His Gly Leu Val Pro Leu
5 10 15 20 GCG TGG GCG CTG CGG GCC GCC GGG CAC GAA GTC CGC GTG GCC AGT CAG 2829 Ala Trp Ala Leu Arg Ala Ala Gly Hia Glu Val Arg Val Ala Ser Gin
25 30 35 CCC GCC CTG TCC GAC ACG ATC ACC CAA GCG GGA CTG ACC GCG GTG CCC 2877 Pro Ala Leu Ser Asp Thr Ile Thr Gin Ala Gly Leu Thr Ala Val Pro
40 45 50 GTG GGC CGG GAC ACC GCC TTC CTG GAG CTG ATG GGG GAG ATC GGC GCG 2925 Val Gly Arg Asp Thr Ala Phe Leu Glu Leu Met Gly Glu Ile Gly Ala
55 60 65 GAC GTC CAG AAG TAC TCC ACC GGC ATC GAC CTG GGC GTC CGC GCG GAG 2973 Asp Val Gin Lys Tyr Ser Thr Gly Ile Asp Leu Gly Val Arg Ala Glu
70 75 80 CTG ACG AGC TGG GAG TAC CTG CTC GGC ATG CAC ACG ACC CTG GTG CCC 3021 Leu Thr Ser Trp Glu Tyr Leu Leu Gly Met His Thr Thr Leu Val Pro
85 90 95 100 ACG TTC TAC TCG CTG GTC AAC GAC GAG CCG TTC GTC GAC GGG CTC GTC 3069 Thr Phe Tyr Ser Leu Val Asn Asp Glu Pro Phe Val Asp Gly Leu Val
105 110 115 GCG CTG ACC CGG GCC TGG CGG CCC GAC CTC ATC CTG TGG GAG CAC TTC 3117 Ala Leu Thr Arg Ala Trp Arg Pro Asp Leu Ile Leu Trp Glu His Phe
120 125 130 AGC TTC GCC GGG GCG TTG GCG GCG CGG GCC ACC GGC ACG CCC CAC GCC 3165 Ser Phe Ala Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ala Thr Gly Thr Pro His Ala
135 140 145 CGC GTG CTG TGG GGG TCG GAC CTC ATC GTC CGG TTC CGC CGG GAC TTC 3213 Arg Val Leu Trp Gly Ser Asp Leu Ile Val Arg Phe Arg Arg Asp Phe
150 155 160 CTC GCG GAG CGG GCG AAC CGG CCC GCC GAG CAC CGC GAG GAC CCC ATG 3261 Leu Ala Glu Arg Ala Asn Arg Pro Ala Glu His Arg Glu Asp Pro Met 165 170 175 180

<Desc/Clms Page number 120>

GCG GAG TGG CTG GGC TGG GCG GCC GAA CGG CTG GGC TCC ACC TTC GAC 3309 Ala Glu Trp Leu Gly Trp Ala Ala Glu Arg Leu Gly Ser Thr Phe Asp
185 190 195 GAG GAG CTG GTG ACC GGG CAG TGG ACG ATC GAC CCG CTG CCG CGG AGC 3357 Glu Glu Leu Val Thr Gly Gin Trp Thr Ile Asp Pro Leu Pro Arg Ser
200 205 210 ATG CGG CTG CCC ACC GGG ACG ACG ACG GTG CCG ATG CGG TAC GTG CCG 3405 Met Arg Leu Pro Thr Gly Thr Thr Thr Val Pro Met Arg Tyr Val Pro
215 220 225 TAC AAC GGG CGG GCC GTG GTC CCC GCA TGG GTC CGG CAG CGT GCG CGG 3453 Tyr Asn Gly Arg Ala Val Val Pro Ala Trp Val Arg Gin Arg Ala Arg
230 235 240 CGG CCC CGG ATC TGC CTG ACG CTC GGT GTG TCG GCC CGG CAG ACC CTG 3501 Arg Pro Arg Ile Cys Leu Thr Leu Gly Val Ser Ala Arg Gin Thr Leu 245 250 255 260 GGC GAC GGC GTG TCG CTG GCG GAG GTG CTG GCC GCG CTG GGC GAC GTG 3549 Gly Asp Gly Val Ser Leu Ala Glu Val Leu Ala Ala Leu Gly Asp Val
265 270 275 GAC GCG GAG ATC GTG GCC ACG CTG GAC GCC TCC CAG CGC AAG CTC CTG 3597 Asp Ala Glu Ile Val Ala Thr Leu Asp Ala Ser Gin Arg Lys Leu Leu
280 285 290 GGG CCG GTG CCG GAC AAC GTC CGG CTG GTG GAC TTC GTG CCC CTG CAC 3645 Gly Pro Val Pro Asp Asn Val Arg Leu Val Asp Phe Val Pro Leu His
295 300 305 GCC CTG ATG CCG ACC TGT TCG GCG ATC GTG CAC CAC GGC GGC GCC GGT 3693 Ala Leu Met Pro Thr Cys Ser Ala Ile Val His His Gly Gly Ala Gly
310 315 320 ACC TGG CTG ACG GCC GCC GTC CAC GGC GTC CCG CAG ATC GTC CTC GGT 3741 Thr Trp Leu Thr Ala Ala Val His Gly Val Pro Gin Ile Val Leu Gly 325 330 335 340 GAC CTC TGG GAC AAC CTG CTG CGC GCC CGG CAG ACA CAG GCC GCG GGC 3789 Asp Leu Trp Asp Asn Leu Leu Arg Ala Arg Gin Thr Gin Ala Ala Gly
345 350 355

<Desc/Clms Page number 121>

GCG GGC CTG TTC ATC CAT CCG TCC GAG GTC ACC GCG GCC GGG CTC GGT 3837 Ala Gly Leu Phe Ile His Pro Ser Glu Val Thr Ala Ala Gly Leu Gly
360 365 370 GAG GGC GTG CGC CGG GTG CTG ACG GAC CCT TCC ATC CGG GCC GCC GCA 3885 Glu Gly Val Arg Arg Val Leu Thr Asp Pro Ser Ile Arg Ala Ala Ala
375 380 385 CAG CGC GTC CGG GAC GAG ATG AAT GCA GAG CCG ACG CCG GGC GAG GTC 3933 Gin Arg Val Arg Asp Glu Met Asn Ala Glu Pro Thr Pro Gly Glu Val
390 395 400 GTC ACG GTG CTG GAG CGG CTC GCC GCG AGC GGC GGA CGC GGA CGA GGA 3981 Val Thr Val Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly 405 410 415 420 GGC GGG AAC CAT GCG GGC TGACACGGAG CCGACCACCG GGTACGAGGA 4029 Gly Gly Asn His Ala Gly
425 CGAGTTCGCC GAGATCTACG ACGCCGTGTA CCGGGGCCGG GGCAAGGACT ACGCCGGCGA 4089 GGCGAAGGAC GTGGCGGACC TCGTGCGCGA CCGGGTGCCG GACGCGTCCT CCCTCCTGGA 4149 CGTGGCCTGC GGCACGGGCG CGCACCTGCG GCACTTCGCC ACGCTCTTCG ACGACGCCCG 4209 CGGTCTCGAA CTGTCCGCGA GCATGCTGGA CATCGCCCGC TCCCGCATGC CGGGCGTGCC 4269 GCTGCACCAA GGGGACATGC GATCCTTCGA CCTGGGGCCA CGCGTCTCCG CGGTCACCTG 4329 CATGTTCAGC TCCGTCGGCC ACCTGGCCAC CACCGCCGAA CTCGACGCGA CGCTGCGGTG 4389 CTTCGCCCGG CACACCCGGC CCGGCGGCGT GGCCGTCATC GAACCGTGGT GGTTCCCGGA 4449 GACCTTCACC GACGGCTACG TGGCGGGTGA CATCGTACGC GTCGACGGCC GGACCATCTC 4509 CCGGGTGTCC CACTCGGTAC GGGACGGCGG CGCCACCCGC ATGGAGATCC ACTACGTGAT 4569 CGCCGACGCC GAGCACGGTC CCCGGCACCT GGTCGAGCAC CACCGCATCA CGCTGTTCCC 4629 GCGGCATGCG TACACGGCCG CGTACGAGAA GGCGGGCTAC ACCGTCGAGT ACCTCGACGG 4689 CGGGCCCTCG GGCCGGGGGC TGTTCGTCGG CACCCGGACG TGAACCCGCC CGCGCACCGC 4749 CCGATCACCC TGCTCAACGC CGTTCACACG GATCACCGGA CCACGCGAAG GACCTTTCAC 4809

<Desc/Clms Page number 122>

ATG TCG TAC GAC GAC CAC GCG GTG CTG GAA GCG ATA CTG CGG TGC GCC 4857 Met Ser Tyr Asp Asp His Ala Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg Cys Ala
1 5 10 15 GGA GGT GAC GAG CGC TTC CTG CTG AAC ACC GTC GAG GAA TGG GGA GCC 4905 Gly Gly Asp Glu Arg Phe Leu Leu Asn Thr Val Glu Glu Trp Gly Ala
20 25 30 GCC GAG ATC ACC GCG GCG CTC GTG GAC GAG TTG CTG TTC CGC TGC GAG 4953 Ala Glu Ile Thr Ala Ala Leu Val Asp Glu Leu Leu Phe Arg Cys Glu
35 40 45 ATC CCG CAG GTG GGC GGT GAG GCG TTC ATC GGC CTG GAC GTC CTG CAC 5001 Ile Pro Gin Val Gly Gly Glu Ala Phe Ile Gly Leu Asp Val Leu His
50 55 60 GGC GCC GAC CGG ATC AGC CAT GTG CTG CAG GTG ACG GAC GGC AAG CCG 5049 Gly Ala Asp Arg Ile Ser His Val Leu Gin Val Thr Asp Gly Lys Pro
65 70 75 80 GTC ACG TCG GCG GAA CCG GCC GGC CAG GAA CTG GGC GGC CGT ACC TGG 5097 Val Thr Ser Ala Glu Pro Ala Gly Gin Glu Leu Gly Gly Arg Thr Trp
85 90 95 AGT TCA CGC TCA GCG ACC CTC CTG CGG GAG CTG TTC GGC CCG CCG TCC 5145 Ser Ser Arg Ser Ala Thr Leu Leu Arg Glu Leu Phe Gly Pro Pro Ser
100 105 110 GGC CGC ACC GCG GGG GGC TTC GGC GTC TCC TTC CTG CCC GAC CTG CGC 5193 Gly Arg Thr Ala Gly Gly Phe Gly Val Ser Phe Leu Pro Asp Leu Arg
115 120 125 GGC CCG CGG ACC ATG GAG GGC GCG GCC CTG GCC GCC CGC GCC ACC AAC 5241 Gly Pro Arg Thr Met Glu Gly Ala Ala Leu Ala Ala Arg Ala Thr Asn
130 135 140 GTG GTG CTG CAC GCG ACG ACC AAC GAG ACG CCC CCA CTG GAC CGG CTG 5289 Val Val Leu His Ala Thr Thr Asn Glu Thr Pro Pro Leu Asp Arg Leu 145 150 155 160 GCC CTG CGC TAC GAG TCC GAC AAG TGG GGC GGC GTC CAC TGG TTC ACC 5337 Ala Leu Arg Tyr Glu Ser Asp Lys Trp Gly Gly Val His Trp Phe Thr
165 170 175

<Desc/Clms Page number 123>

GGC CAC TAC GAC CGG CAC CTG CGG GCC GTG CGC GAC CAG GCG GTG CGG 5385 Gly His Tyr Asp Arg His Leu Arg Ala Val Arg Asp Gin Ala Val Arg
180 185 190 ATC CTG GAG ATC GGC ATC GGC GGC TAC GAC GAC CTG CTG CCG AGC GGC 5433 Ile Leu Glu Ile Gly Ile Gly Gly Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly
195 200 205 GCC TCA CTG AAG ATG TGG AAG CGC TAC TTC CCG CGC GGC CTG GTC TTC 5481 Ala Ser Leu Lys Met Trp Lys Arg Tyr Phe Pro Arg Gly Leu Val Phe
210 215 220 GGC GTG GAC ATC TTC GAC AGT CGG CGT GCG ACC AGC CGC GTG TCA AGA 5529 Gly Val Asp Ile Phe Asp Ser Arg Arg Ala Thr Ser Arg Val Ser Arg 225 230 235 240 CGC TCC GCG GCC CGG CAG GAC GAC CCG GAG TTC ATG CGC CGC GTC GCC 5577 Arg Ser Ala Ala Arg Gin Asp Asp Pro Glu Phe Met Arg Arg Val Ala
245 250 255 GAG GAG CAC GGG CCG TTC GAC GTC ATC ATC GAC GAC GGC AGC CAC ATC 5625 Glu Glu His Gly Pro Phe Asp Val Ile Ile Asp Asp Gly Ser His Ile
260 265 270 AAC GCA CAC ATG CGG ACG TCG TTC TCG GTG ATG TTC CCC CAC CTG CGC 5673 Asn Ala His Met Arg Thr Ser Phe Ser Val Met Phe Pro His Leu Arg
275 280 285 AAC GGC GGC TTC TAC GTC ATC GAG GAC ACC TTC ACC TCC TAC TGG CCC 5721 Asn Gly Gly Phe Tyr Val Ile Glu Asp Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Pro
290 295 300 GGG TAC GGA GGG CCA TCC GGA GCC CGG TGC CCG TCC GGA ACA ACC GCG 5769 Gly Tyr Gly Gly Pro Ser Gly Ala Arg Cys Pro Ser Gly Thr Thr Ala 305 310 315 320 CTG GAG ATG GTC AAG GGA CTG ATC GAC TCG GTG CAC TAC GAG GAG CGG 5817 Leu Glu Met Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Val His Tyr Glu Glu Arg
325 330 335 CCG GAC GGC GCG GCC ACG GCC GAC TAC ATC GCC AGG AAC CTC GTC GGG 5865 Pro Asp Gly Ala Ala Thr Ala Asp Tyr Ile Ala Arg Asn Leu Val Gly
340 345 350

<Desc/Clms Page number 124>

CTG CAC GCC TAC CAA ACG ACC TCG TCT TCC TCG AGA AGG GCG ATC AAC 5913 Leu His Ala Tyr Gin Thr Thr Ser Ser Ser Ser Arg Arg Ala Ile Asn
355 360 365 AAG GAG GGC GGC ATC CCC CAC ACC GTG CCC CGG GAG CCG TTC TGG AAC 5961 Lys Glu Gly Gly Ile Pro His Thr Val Pro Arg Glu Pro Phe Trp Asn
370 375 380 GAC AAC TAGCCACGGC CGCAACCAGA GCCGGAAACC GCACCACTGT CCGCGCCACC 6017 Asp Asn 385 TCGGAACCAC CTCCAGCAAA GGACACACCG CTGTGACCGA TACGCACACC GGACCGACAC 6077 CGGCCGACGC GGTACC 6093 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 401 acides amin s (B) TYPE : acide amin (D) CONFIGURATION : lin aire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 16 : Met Glu Asp Ser Glu Leu Gly Arg Arg Leu Gin Met Leu Arg Gly Met 1 5 10 15 Gin Trp Val Phe Gly Ala Asn Gly Asp Pro Tyr Ala Arg Leu Leu Cys
20 25 30 Gly Met Glu Asp Asp Pro Ser Pro Phe Tyr Asp Ala Ile Arg Thr Leu
35 40 45 Gly Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Gly Ala Trp Val Thr Ala Asp Pro
50 55 60 Gly Leu Gly Gly Arg Ile Leu Ala Asp Arg Lys Ala Arg Cys Pro Glu
65 70 75 80 Gly Ser Trp Pro Val Arg Ala Lys Thr Asp Gly Leu Glu Gin Tyr Val
85 90 95

<Desc/Clms Page number 125>

Leu Pro Gly His Gin Ala Phe Leu Arg Leu Glu Arg Glu Glu Ala Glu
100 105 110 Arg Leu Arg Glu Val Ala Ala Pro Val Leu Gly Ala Ala Ala Val Asp
115 120 125 Ala Trp Arg Pro Leu Ile Asp Glu Val Cys Ala Gly Leu Ala Lys Gly
130 135 140 Leu Pro Asp Thr Phe Asp Leu Val Glu Glu Tyr Ala Gly Leu Val Pro 145 150 155 160 Val Glu Val Leu Ala Arg Ile Trp Gly Val Pro Glu Glu Asp Arg Ala
165 170 175 Arg Phe Gly Arg Asp Cys Arg Ala Leu Ala Pro Ala Leu Asp Ser Leu
180 185 190 Leu Cys Pro Gin Gin Leu Ala Leu Ser Lys Asp Met Ala Ser Ala Leu
195 200 205 Glu Asp Leu Arg Leu Leu Phe Asp Gly Leu Asp Ala Thr Pro Arg Leu
210 215 220 Ala Gly Pro Ala Asp Gly Asp Gly Thr Ala Val Ala Met Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu Leu Cys Thr Glu Pro Val Thr Thr Ala Ile Gly Asn Thr Val Leu
245 250 255 Gly Leu Leu Pro Gly Gin Trp Pro Val Pro Cys Thr Gly Arg Val Ala
260 265 270 Ala Gly Gin Val Ala Gly Gin Ala Leu His Arg Ala Val Ser Tyr Arg
275 280 285 Ile Ala Thr Arg Phe Ala Arg Glu Asp Leu Glu Leu Ala Gly Cys Glu
290 295 300 Val Lys Ser Gly Asp Glu Val Val Val Leu Ala Gly Ala Ile Gly Arg 305 310 315 320 Asn Gly Pro Ser Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Pro Gly Pro Ala Ala
325 330 335

<Desc/Clms Page number 126>

Pro Pro Ala Pro Ser Val Phe Gly Ala Ala Ala Phe Glu Asn Ala Leu
340 345 350 Ala Glu Pro Leu Val Arg Ala Val Thr Gly Ala Ala Leu Gin Ala Leu
355 360 365 Ala Glu Gly Pro Pro Arg Leu Thr Ala Ala Gly Pro Val Val Arg Arg
370 375 380 Arg Arg Ser Pro Val Val Gly Gly Leu His Arg Ala Pro Val Ala Ala 385 390 395 400 Ala (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides amin s (B) TYPE : acide amin (D) CONFIGURATION : lin aire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 17 : Met Met Met Thr Thr Phe Ala Ala Asn Thr His Phe Gin Pro Leu Val 1 5 10 15 Pro Leu Ala Trp Ala Leu Arg Thr Ala Gly His Glu Val Arg Val Val
20 25 30 Ser Gin Pro Ser Leu Ser Asp Val Val Thr Gin Ala Gly Leu Thr Ser
35 40 45 Val Pro Val Gly Thr Glu Ala Pro Val Glu Gin Phe Ala Ala Thr Trp
50 55 60 Gly Asp Asp Ala Tyr Ile Gly Val Asn Ser Ile Asp Phe Thr Gly Asn
65 70 75 80 Asp Pro Gly Leu Trp Thr Trp Pro Tyr Leu Leu Gly Met Glu Thr Met
85 90 95 Leu Val Pro Ala Phe Tyr Glu Leu Leu Asn Asn Glu Ser Phe Val Asp
100 105 110

<Desc/Clms Page number 127>

Gly Val Val Glu Phe Ala Arg Asp Trp Arg Pro Asp Leu Val Ile Trp
115 120 125 Glu Pro Leu Thr Phe Ala Gly Ala Val Ala Ala Arg Val Thr Gly Ala
130 135 140 Ala His Ala Arg Leu Pro Trp Gly Gin Glu Ile Thr Leu Arg Gly Arg 145 150 155 160 Gin Ala Phe Leu Ala Glu Arg Ala Leu Gin Pro Phe Glu His Arg Glu
165 170 175 Asp Pro Thr Ala Glu Trp Leu Gly Arg Met Leu Asp Arg Tyr Gly Cys
180 185 190 Ser Phe Asp Glu Glu Met Val Thr Gly Gin Trp Thr Ile Asp Thr Leu
195 200 205 Pro Arg Ser Met Arg Leu Glu Leu Ser Glu Glu Leu Arg Thr Leu Asp
210 215 220 Met Arg Tyr Val Pro Tyr Asn Gly Pro Ala Val Val Pro Pro Trp Val 225 230 235 240 Trp Glu Pro Cys Glu Arg Pro Arg Val Cys Leu Thr Ile Gly Thr Ser
245 250 255 Gin Arg Asp Ser Gly Arg Asp His Val Pro Leu Asp His Leu Leu Asp
260 265 270 Ser Leu Ala Asp Val Asp Ala Glu Ile Val Ala Thr Leu Asp Thr Thr
275 280 285 Gin Gin Glu Arg Leu Arg Gly Ala Ala Pro Gly Asn Val Arg Leu Val
290 295 300 Asp Phe Val Pro Leu His Ala Leu Met Pro Thr Cys Ser Ala Ile Val 305 310 315 320 His His Gly Gly Pro Gly Thr Trp Ser Thr Ala Ala Leu His Gly Val
325 330 335 Pro Gin Ile Ile Leu Asp Thr Ser Trp Asp Thr Pro Val Arg Ala Gln
340 345 350

<Desc/Clms Page number 128>

Arg Met Gin Gin Leu Gly Ala Gly Leu Ser Met Pro Val Gly Glu Leu
355 360 365 Gly Val Glu Ala Leu Arg Asp Arg Val Leu Arg Leu Leu Gly Glu Pro
370 375 380 Glu Phe Arg Ala Gly Ala Glu Arg Ile Arg Ala Glu Met Leu Ala Met 385 390 395 400 Pro Ala Pro Gly Asp Val Val Pro Asp Leu Glu Arg Leu Thr Ala Glu
405 410 415 His Ala Thr Gly Ala Met Ala Gly Arg Arg
420 425 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides amin s (B) TYPE : acide amin (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : prot ine(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 18 : Met Arg Val Leu Leu Thr Cys Phe Ala Asn Asp Thr His Phe His Gly 1 5 10 15 Leu Val Pro Leu Ala Trp Ala Leu Arg Ala Ala Gly His Glu Val Arg
20 25 30 Val Ala Ser Gin Pro Ala Leu Ser Asp Thr Ile Thr Gin Ala Gly Leu
35 40 45 Thr Ala Val Pro Val Gly Arg Asp Thr Ala Phe Leu Glu Leu Met Gly
50 55 60 Glu Ile Gly Ala Asp Val Gin Lys Tyr Ser Thr Gly Ile Asp Leu Gly
65 70 75 80 Val Arg Ala Glu Leu Thr Ser Trp Glu Tyr Leu Leu Gly Met His Thr
85 90 95 Thr Leu Val Pro Thr Phe Tyr Ser Leu Val Asn Asp Glu Pro Phe Val
100 105 110

<Desc/Clms Page number 129>

Asp Gly Leu Val Ala Leu Thr Arg Ala Trp Arg Pro Asp Leu Ile Leu
115 120 125 Trp Glu His Phe Ser Phe Ala Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ala Thr Gly
130 135 140 Thr Pro His Ala Arg Val Leu Trp Gly Ser Asp Leu Ile Val Arg Phe 145 150 155 160 Arg Arg Asp Phe Leu Ala Glu Arg Ala Asn Arg Pro Ala Glu His Arg
165 170 175 Glu Asp Pro Met Ala Glu Trp Leu Gly Trp Ala Ala Glu Arg Leu Gly
180 185 190 Ser Thr Phe Asp Glu Glu Leu Val Thr Gly Gin Trp Thr Ile Asp Pro
195 200 205 Leu Pro Arg Ser Met Arg Leu Pro Thr Gly Thr Thr Thr Val Pro Met
210 215 220 Arg Tyr Val Pro Tyr Asn Gly Arg Ala Val Val Pro Ala Trp Val Arg 225 230 235 240 Gin Arg Ala Arg Arg Pro Arg Ile Cys Leu Thr Leu Gly Val Ser Ala
245 250 255 Arg Gin Thr Leu Gly Asp Gly Val Ser Leu Ala Glu Val Leu Ala Ala
260 265 270 Leu Gly Asp Val Asp Ala Glu Ile Val Ala Thr Leu Asp Ala Ser Gln
275 280 285 Arg Lys Leu Leu Gly Pro Val Pro Asp Asn Val Arg Leu Val Asp Phe
290 295 300 Val Pro Leu His Ala Leu Met Pro Thr Cys Ser Ala Ile Val His His 305 310 315 320 Gly Gly Ala Gly Thr Trp Leu Thr Ala Ala Val His Gly Val Pro Gln
325 330 335 Ile Val Leu Gly Asp Leu Trp Asp Asn Leu Leu Arg Ala Arg Gin Thr
340 345 350

<Desc/Clms Page number 130>

Gin Ala Ala Gly Ala Gly Leu Phe Ile His Pro Ser Glu Val Thr Ala
355 360 365 Ala Gly Leu Gly Glu Gly Val Arg Arg Val Leu Thr Asp Pro Ser Ile
370 375 380 Arg Ala Ala Ala Gin Arg Val Arg Asp Glu Met Asn Ala Glu Pro Thr 385 390 395 400 Pro Gly Glu Val Val Thr Val Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gly Gly
405 410 415 Arg Gly Arg Gly Gly Gly Asn His Ala Gly
420 425 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 386acides amin s (B) TYPE : amin (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 19 : Met Ser Tyr Asp Asp His Ala Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg Cys Ala 1 5 10 15 Gly Gly Asp Glu Arg Phe Leu Leu Asn Thr Val Glu Glu Trp Gly Ala
20 25 30 Ala Glu Ile Thr Ala Ala Leu Val Asp Glu Leu Leu Phe Arg Cys Glu
35 40 45 Ile Pro Gin Val Gly Gly Glu Ala Phe Ile Gly Leu Asp Val Leu His
50 55 60 Gly Ala Asp Arg Ile Ser His Val Leu Gin Val Thr Asp Gly Lys Pro
65 70 75 80 Val Thr Ser Ala Glu Pro Ala Gly Gin Glu Leu Gly Gly Arg Thr Trp
85 90 95 Ser Ser Arg Ser Ala Thr Leu Leu Arg Glu Leu Phe Gly Pro Pro Ser
100 105 110

<Desc/Clms Page number 131>

Gly Arg Thr Ala Gly Gly Phe Gly Val Ser Phe Leu Pro Asp Leu Arg
115 120 125 Gly Pro Arg Thr Met Glu Gly Ala Ala Leu Ala Ala Arg Ala Thr Asn
130 135 140 Val Val Leu His Ala Thr Thr Asn Glu Thr Pro Pro Leu Asp Arg Leu 145 150 155 160 Ala Leu Arg Tyr Glu Ser Asp Lys Trp Gly Gly Val His Trp Phe Thr
165 170 175 Gly His Tyr Asp Arg His Leu Arg Ala Val Arg Asp Gin Ala Val Arg
180 185 190 Ile Leu Glu Ile Gly Ile Gly Gly Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly
195 200 205 Ala Ser Leu Lys Met Trp Lys Arg Tyr Phe Pro Arg Gly Leu Val Phe
210 215 220 Gly Val Asp Ile Phe Asp Ser Arg Arg Ala Thr Ser Arg Val Ser Arg 225 230 235 240 Arg Ser Ala Ala Arg Gin Asp Asp Pro Glu Phe Met Arg Arg Val Ala
245 250 255 Glu Glu His Gly Pro Phe Asp Val Ile Ile Asp Asp Gly Ser His Ile
260 265 270 Asn Ala His Met Arg Thr Ser Phe Ser Val Met Phe Pro His Leu Arg
275 280 285 Asn Gly Gly Phe Tyr Val Ile Glu Asp Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Pro
290 295 300 Gly Tyr Gly Gly Pro Ser Gly Ala Arg Cys Pro Ser Gly Thr Thr Ala 305 310 315 320 Leu Glu Met Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Val His Tyr Glu Glu Arg
325 330 335 Pro Asp Gly Ala Ala Thr Ala Asp Tyr Ile Ala Arg Asn Leu Val Gly
340 345 350

<Desc/Clms Page number 132>

Leu His Ala Tyr Gin Thr Thr Ser Ser Ser Ser Arg Arg Ala Ile Asn
355 360 365 Lys Glu Gly Gly Ile Pro His Thr Val Pro Arg Glu Pro Phe Trp Asn
370 375 380 Asp Asn 385 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucl otide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : ADN(g nomique) (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME : antibioticus (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE : CDS (B) EMPLACEMENT:1..738 (D) AUTRES INFORMATIONS:/gene= "oleM" /note= "SEQ ID NO 15 DE 3992 A 4729" (ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: mat~peptide (B) EMPLACEMENT:1 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 20 : ATG CGG GCT GAC ACG GAG CCG ACC ACC GGG TAC GAG GAC GAG TTC GCC 48 Met Arg Ala Asp Thr Glu Pro Thr Thr Gly Tyr Glu Asp Glu Phe Ala 1 5 10 15 GAG ATC TAC GAC GCC GTG TAC CGG GGC CGG GGC AAG GAC TAC GCC GGC 96 Glu Ile Tyr Asp Ala Val Tyr Arg Gly Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Gly
20 25 30 GAG GCG AAG GAC GTG GCG GAC CTC GTG CGC GAC CGG GTG CCG GAC GCG 144 Glu Ala Lys Asp Val Ala Asp Leu Val Arg Asp Arg Val Pro Asp Ala
35 40 45

<Desc/Clms Page number 133>

TCC TCC CTC CTG GAC GTG GCC TGC GGC ACG GGC GCG CAC CTG CGG CAC 192 Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly Thr Gly Ala His Leu Arg His
50 55 60 TTC GCC ACG CTC TTC GAC GAC GCC CGC GGT CTC GAA CTG TCC GCG AGC 240 Phe Ala Thr Leu Phe Asp Asp Ala Arg Gly Leu Glu Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80 ATG CTG GAC ATC GCC CGC TCC CGC ATG CCG GGC GTG CCG CTG CAC CAA 288 Met Leu Asp Ile Ala Arg Ser Arg Met Pro Gly Val Pro Leu His Gln
85 90 95 GGG GAC ATG CGA TCC TTC GAC CTG GGG CCA CGC GTC TCC GCG GTC ACC 336 Gly Asp Met Arg Ser Phe Asp Leu Gly Pro Arg Val Ser Ala Val Thr
100 105 110 TGC ATG TTC AGC TCC GTC GGC CAC CTG GCC ACC ACC GCC GAA CTC GAC 384 Cys Met Phe Ser Ser Val Gly His Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Asp
115 120 125 GCG ACG CTG CGG TGC TTC GCC CGG CAC ACC CGG CCC GGC GGC GTG GCC 432 Ala Thr Leu Arg Cys Phe Ala Arg His Thr Arg Pro Gly Gly Val Ala
130 135 140 GTC ATC GAA CCG TGG TGG TTC CCG GAG ACC TTC ACC GAC GGC TAC GTG 480 Val Ile Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu Thr Phe Thr Asp Gly Tyr Val 145 150 155 160 GCG GGT GAC ATC GTA CGC GTC GAC GGC CGG ACC ATC TCC CGG GTG TCC 528 Ala Gly Asp Ile Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Ile Ser Arg Val Ser
165 170 175 CAC TCG GTA CGG GAC GGC GGC GCC ACC CGC ATG GAG ATC CAC TAC GTG 576 His Ser Val Arg Asp Gly Gly Ala Thr Arg Met Glu Ile His Tyr Val
180 185 190 ATC GCC GAC GCC GAG CAC GGT CCC CGG CAC CTG GTC GAG CAC CAC CGC 624 Ile Ala Asp Ala Glu His Gly Pro Arg His Leu Val Glu His His Arg
195 200 205 ATC ACG CTG TTC CCG CGG CAT GCG TAC ACG GCC GCG TAC GAG AAG GCG 672 Ile Thr Leu Phe Pro Arg His Ala Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Ala
210 215 220

<Desc/Clms Page number 134>

GGC TAC ACC GTC GAG TAC CTC GAC GGC GGG CCC TCG GGC CGG GGG CTG 720 Gly Tyr Thr Val Glu Tyr Leu Asp Gly Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu 225 230 235 240 TTC GTC GGC ACC CGG ACG 738 Phe Val Gly Thr Arg Thr
245 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides amin s (B) TYPE : amin (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 21 : Met Arg Ala Asp Thr Glu Pro Thr Thr Gly Tyr Glu Asp Glu Phe Ala 1 5 10 15 Glu Ile Tyr Asp Ala Val Tyr Arg Gly Arg Gly Lys Asp Tyr Ala Gly
20 25 30 Glu Ala Lys Asp Val Ala Asp Leu Val Arg Asp Arg Val Pro Asp Ala
35 40 45 Ser Ser Leu Leu Asp Val Ala Cys Gly Thr Gly Ala His Leu Arg His
50 55 60 Phe Ala Thr Leu Phe Asp Asp Ala Arg Gly Leu Glu Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80 Met Leu Asp Ile Ala Arg Ser Arg Met Pro Gly Val Pro Leu His Gln
85 90 95 Gly Asp Met Arg Ser Phe Asp Leu Gly Pro Arg Val Ser Ala Val Thr
100 105 110 Cys Met Phe Ser Ser Val Gly His Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu Asp
115 120 125 Ala Thr Leu Arg Cys Phe Ala Arg His Thr Arg Pro Gly Gly Val Ala
130 135 140

<Desc/Clms Page number 135>

Val Ile Glu Pro Trp Trp Phe Pro Glu Thr Phe Thr Asp Gly Tyr Val 145 150 155 160 Ala Gly Asp Ile Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Ile Ser Arg Val Ser
165 170 175 His Ser Val Arg Asp Gly Gly Ala Thr Arg Met Glu Ile His Tyr Val
180 185 190 Ile Ala Asp Ala Glu His Gly Pro Arg His Leu Val Glu His His Arg
195 200 205 Ile Thr Leu Phe Pro Arg His Ala Tyr Thr Ala Ala Tyr Glu Lys Ala
210 215 220 Gly Tyr Thr Val Glu Tyr Leu Asp Gly Gly Pro Ser Gly Arg Gly Leu 225 230 235 240 Phe Val Gly Thr Arg Thr
245 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : nucléotide(C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 22 : TCCTCGATGG AGACCTGCC 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique

<Desc/Clms Page number 136>

(A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 23 : GAGACCATGC CCAGGGAGT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 19paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 24 : TCTGGGAGCC GCTCACCTT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 25 : GACGAGGCCG AAGAGGTGG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 19 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION: linéaire

<Desc/Clms Page number 137>

(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc * "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 26 : GCACACCGGA ATGGATGCG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 27 : CCGTCGAGCT CTGAGGTAA 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 28 : GCCCGAGCCG CACGTGCGT 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 29 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS: simple

<Desc/Clms Page number 138>

(D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 29 : TGCACGCGCT GCTGCCGACC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 30 : TTGGCGAAGT CGACCAGGTC 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGQNUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 31 : GCCGCTCGGC ACGGTGAACT TCA 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases

<Desc/Clms Page number 139>

(B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 32 : ATGCGCGTCG TCTTCTCCTC CATG 24 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 33 : TCATCGTGGT TCTCTCCTTC C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 34 : GGAATTCATG ACCACGACCG ATC 23 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35 :

<Desc/Clms Page number 140>

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 35 : CGCTCCAGGT GCAATGCCGG GTGCAGGC 28 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 36 : ATCACGCTC TTCGAGCGGC AG 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : simple(D) CONFIGURATION : linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 37 : ;AACTCGGTG GAGTCGATGT C 21

<Desc/Clms Page number 141>

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 38 : GTTGTCGATC AAGACCCGCA C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39 : :ATCGTCAAG GAGTTCGACG GT 22 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 40 : 'GCGCAGGTC CATGTTCACC ACGTT 25

<Desc/Clms Page number 142>

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 41 : GCTACGCCCT GGAGAGCCTG 20 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 42 : 3TCGCGGTCG GAGAGCACGA C 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 43 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 21 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 43 : GCCAGCTCGG CGACGTCCAT C 21

<Desc/Clms Page number 143>

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 44 : CGACGAGGTC GTGCATCAG 19 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 45 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 45 : AATTGATCAA GGTGAACACG GTCATGCGCA GGATCCTCGA GCGGAACTCC ATGGGG 56 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 46 : CCCCATGGAG TTCCGCTCGA GGATCCTGCG CATGACCGTG TTCACCTTGA TCAATT 56

<Desc/Clms Page number 144>

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 47 : \ACTCGGTGG AGTCGATGTC GTCGCTGCGG AA 32 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 48 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 48 : :AATATAGGA AGGATCAAGA GGTTGAC 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 49 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 39 paires de bases (B) TYPE : nucléotide(C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 49 : 'CCGGAGGTG TGCTGTCGGA CGGACTTGTC GGTCGGAAA 39

<Desc/Clms Page number 145>

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 50 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 50 : AGGAGCACTA GTGCGGGTAC TGCTGACGTC CTT 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 51 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc= "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 51 : GGGGGATCCC ATATGCGGGT ACTGCTGACG TCCTTCG 37 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 52 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 52 : GAAAAGATCT GCCGGCGTGG CGGCGCGTGA GTTCCTC 37 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 53 :

<Desc/Clms Page number 146>

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 53 : AGCGGCTTGA TCGTGTTGGA CCAGTAC 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 54 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : /desc= "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 54 : GGCCTATGTG GACTACGTGT TGAACGT 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 55 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 31 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION : = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 55 : AACGCCTCGT CCTGCAGCGG AGACACGAAC A 31 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 56 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

<Desc/Clms Page number 147>

(A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc - "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 56 : TTCGCTCCCC GATGAACACA ACTCGTA 27 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 57 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 57 : GAAGGAGATA TACATATGCG CGTCGTCTTC TCCTC 35 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 58 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 58 : CGGGATCCTC ATCGTGGTTC TCTCCTTCCT GC 32 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 59 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : 32paires de bases

<Desc/Clms Page number 148>

(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc : "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 59 : CGGGTACCAT GCGCGTCGTC TTCTCCTCCA TG 32 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 60: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "OLIGONUCLEOTIDE" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 60 : CGGGTACCTC ATCGTGGTTC TCTCCTTCC 29 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 61 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT:1..13 (D) AUTRES INFORMATIONS:/note= "SEQ ID NO 11 DE 38 A 50" (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 61 :
Val Thr Gly Ala Gly Asp Gly Asp Ala Asp Val Gin Ala 1 5 10

Claims (32)

1. REVENDICATIONS 1) Séquence d'ADN simple ou double brin isolée, représentée à la figure 2 (séquence directe ou complémentaire de SEQ ID N 1) correspondant à la région eryG-eryAIII du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.
2. 2) Séquence d'ADN selon la revendication 1 comprenant : - la séquence eryBII correspondant à l'ORF7 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) et codant pour une désosaminyltransférase et - la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase.
3. 3) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 2 choisie parmi la séquence eryBII correspondant à l'ORF7 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), la séquence eryCIII correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou la séquence eryCII correspondant à l'ORF9 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
4. 4) Séquence d'ADN isolée eryCIII représentée à la figure 2 correspondant à l'ORF8 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) et codant pour une désosaminyl transférase.
5. 5) Polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN selon l'une des revendications 1 à 4.
6. 6) Polypeptide selon la revendication 5 correspondant à une ORF représentée à la figure 2, choisie parmi l'ORF7 (ayant la séquence de SEQ ID N 2), l'ORF8 (ayant la séquence de SEQ ID N 5) ou l'ORF9 (ayant la séquence de SEQ ID N 3) et les

   <Desc/Clms Page number 150>

   analogues'de ce polypeptide.
7. 7) Polypeptide selon la revendication 5 correspondant à l'ORF8 représentée à la figure 2 (ayant la séquence de SEQ ID N 5) et ayant une activité désosaminyltransférase, dénommée EryCIII.
8. 8) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 (séquence de SEQ ID N 6) correspondant à la région eryAI-eryK du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine.
9. 9) Séquence d'ADN selon la revendication 8 comprenant : - la séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454) et codant pour une mycarosyltransférase, - la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220) et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837) et codant pour une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039) et codant pour une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) et codant pour une dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase et - la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et codant pour une dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
10. 10) Séquence d'ADN isolée représentée à la figure 3 choisie parmi la séquence eryBIV correspondant à l'ORF13 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), la séquence eryBV correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), la séquence eryCVI correspondant à l'ORF15 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), la séquence eryBVI correspondant à l'ORF16 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléo-

    <Desc/Clms Page number 151>

    tide 3308'au nucléotide 4837), la séquence eryCIV correspondant à l'ORF17 (séquence de SEQ ID N 6 du @@cléotide 4837 au nucléotide 6039), la séquence eryCV correspondant à l'ORF18 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou la séquence eryBVII correspondant à l'ORF19 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) et les séquences qui hybrident et/ou présentent des homologies significatives avec cette séquence ou des fragments de celle-ci et ayant la même fonction.
11. 11) Séquence d'ADN isolée eryBV représentée à la figure 3 correspondant à l'ORF14 (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454) et codant pour une mycarosyltransférase.
12. 12) Polypeptide codé par l'une des séquences d'ADN selon l'une des revendications 8 à 11.
13. 13) Polypeptide selon la revendication 12 correspondant à une ORF représentée à la figure 3, choisie parmi l'ORF13 (ayant la séquence de SEQ ID N 7), l'UKF14 (ayant la séquence de SEQ ID N 8), l'ORF15 (ayant la séquence de SEQ ID N 9), l'ORF16 (ayant la séquence de SEQ ID N 10), l'ORF17 (ayant la séquence de SEQ ID N 14), l'ORF18 (ayant la séquence de SEQ ID N 11) ou l'ORF19 (ayant la séquence de SEQ ID N 12) et les analogues de ce peptide.
14. 14) Polypeptide selon la revendication 12 correspondant à l'ORF14 représentée à la figure 3 (ayant la séquence de SEQ ID N 8) et ayant une activité mycarosyltransférase, dénommé EryBV.
15. 15) Utilisation d'au moins l'une des séquences d'AnN choisie parmi les séquences eryBll (séquence complément.aire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotidc 1040), eryCIII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou eryCll (séquence complémentaire c'.e SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) représentées à la figure 2, eryBlV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), eryBV (séquence de SEQ Tn N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), eryCVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), eryBVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide

    <Desc/Clms Page number 152>

    4837), eryCIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), eryCV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou eryBVII (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) représentée à la figure 3, pour synthétiser des métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea.
16. 16) Utilisation d'au moins l'une des séquences d'ADN choisie parmi les séquences eryBII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 48 au nucléotide 1046), eryCIII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308) ou eryCII (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 2322 au nucléotide 3404) représentées à la figure 2, eryBIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 242 au nucléotide 1207), eryBV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 1210 au nucléotide 2454), eryCVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 2510 au nucléotide 3220), eryBVI (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 3308 au nucléotide 4837), eryCIV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 4837 au nucléotide 6039), eryCV (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 6080 au nucléotide 7546) ou eryBVII (séquence de SEQ ID N 6 du nucléotide 7578 au nucléotide 8156) représentée à la figure 3 ou d'un fragment de cette séquence, comme sondes d'hybridation.
17. 17) Utilisation de la séquence d'ADN eryCIII représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1 du nucléotide 1046 au nucléotide 2308 = séquence complémentaire de SEQ ID N 4) comme sonde d'hybridation pour isoler des gènes homologues responsables de la glycosylation de la macrolactone chez une souche productrice de macrolide.
18. 18) Utilisation selon la revendication 17 dans laquelle les gènes homologues sont les gènes de la biosynthèse de l'oléandomycine chez S. antibioticus.
19. 19) Procédé de préparation de métabolites secondaires hybrides chez Sac. erythraea dans lequel : - on isole une séquence ADN contenant au moins une séquence eryB ou une séquence eryC du cluster de gènes de la biosynthèse de l'érythromycine représentée à la figure 2 (séquence complémentaire de SEQ ID N 1) ou à la figure 3

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    (séquence de SEQ ID N 6), - on crée une modification dans la dite séquence et on obtient une séquence altérée, - on intègre la séquence altérée dans le chromosome de la souche hôte et on obtient une souche modifiée, - on cultive la souche modifiée dans des conditions permettant la formation du métabolite secondaire hybride et - on isole le métabolite secondaire hybride.
20. 20) Procédé selon la revendication 19 dans lequel la séquence ADN code pour l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
21. 21) Procédé selon la revendication 19 dans lequel l'altération de la séquence résulte dans l'inactivation d'au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase.
22. 22) Procédé selon la revendication 21 dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase.
23. 23) Procédé selon la revendication 21 dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase.
24. 24) Procédé selon la revendication 21 dans lequel l'enzyme

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    inactivée est une mycarosyltransférase.
25. 25) Procédé selon la revendication 21 dans lequel l'enzyme inactivée est une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase.
26. 26) Procédé selon la revendication 19 dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est un analogue de l'érythromycine choisi parmi la 4"-céto-érythromycine, la 4'-hydroxy-érythromycine ou la 3"-C-désméthyl-2",3"-ène- érythromycine.
27. 27) Procédé selon la revendication 19 dans lequel le métabolite secondaire hybride isolé est le désosaminyl érythronolide B.
28. 28) Souche de Sac. erythraea modifiée dans laquelle au moins l'une des enzymes choisie parmi une - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase, - désosaminyltransférase, - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,4-isomérase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase, - mycarosyltransférase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3-N-méthyltransférase, - dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-déshydratase, - dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase, - dTDP-D-4,6-didésoxyhexose 3,4-réductase ou - dTDP-4-céto-D-6-désoxyhexose 3,5 épimérase est inactivée et produisant au moins un métabolite secondaire hybride.
29. 29) Souche de Sac. erythraea modifiée (BII92) dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 2,3-réductase est inactivée et produisant la 3"-C-désméthyl-2",3"-ène-érythromycine C.
30. 30) Souche de Sac. erythraea modifiée (BIV87) dans laquelle une dTDP-4-céto-L-6-désoxyhexose 4-réductase est inactivée et produisant la 4"-céto-érythromycine.
31. 31) Souche de Sac. erythraea modifiée (CIV89) dans laquelle une dTDP-D-6-désoxyhexose 3,4-déshydratase est inactivée et produisant la 4'-hydroxyérythromycine D.
32. 32) Souche de Sac. erythraea modifiée (BV88) dans laquelle une mycarosyltransférase est inactivée et produisant du désoaminyl érythronolide B.