KR20000016470A - 스트렙토마이세스 글라우체센스 지엘에이.오로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자의 분리 방법 및 이의 용도 - Google Patents

스트렙토마이세스 글라우체센스 지엘에이.오로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자의 분리 방법 및 이의 용도

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KR20000016470A
KR20000016470A KR1019980710054A KR19980710054A KR20000016470A KR 20000016470 A KR20000016470 A KR 20000016470A KR 1019980710054 A KR1019980710054 A KR 1019980710054A KR 19980710054 A KR19980710054 A KR 19980710054A KR 20000016470 A KR20000016470 A KR 20000016470A
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로제르트, 피셔 한스-위르겐
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Abstract

본 발명은 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자를 함유하는 재조합 DNA 분자; 이러한 분자의 PCR 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머; 분자 상에 위치된 유전자를 발현함으로써 수득가능한 단백질; 상기 DNA 분자를 함유하는 벡터 및 숙주 세포; 이러한 DNA 분자에 의해 암호화되는 단백질; 상기 숙주 세포에서 상기 벡터에 의해 발현되는 단백질; 특징적인 유전자를 적절한 숙주 유기체내로 도입하고/하거나 이들 유전자를 상기 숙주 유기체로부터 제거함으로써 아카르보스를 제조하는 방법; 아카르보스 생합성용 유전자의 유전자 집락을 완전한 것으로 만드는 방법; 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 유기체에서 유사한 유전자 집락을 분리하는 방법; 아카르보스의 수율을 증진시킬 목적으로 내인성 아카르보스 생합성 유전자의 프로모터를 돌연변이시키는 방법; 아카르보스를 제조하고 아카르보스 수율 측면에서 최적화시킨 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 돌연변이체를 제조하기 위한 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 용도에 관한 것이다.

Description

스트렙토마이세스 글라우체센스 지엘에이.오로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자의 분리 방법 및 이의 용도
본 발명은 α-아밀라제 억제인자, 소위 슈도-올리고사카라이드 합성용 효소를 암호화하는 유전자의 분리 방법에 관한 것이다. 이러한 관심있는 유전자는 특히, 스트렙토마이세스 균주인 스트렙토마이세스 글라우체센스(Streptomyces glaucescens) GLA.O(DSM 40716)로부터의 유전자이다. 또한, 본원에는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 보조하에 아카르보스(acarbose) 및 동종 물질을 생성시키기 위한 이들 유전자의 용도, 생산을 증대시키고 안정화시킬 목적으로 슈도-올리고사카라이드를 생산하는 다른 균주(예: 악티노플라네스 종(Actionoplanes sp) SE50/100)에서의 이들 유전자의 이종 발현, 및 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 악티노마이세탈레스(Actinomycetales)[예: 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라(Ampullariella) 및 스트렙토스포란쥼(Sterptosporangium) 균주], 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스(Streptomyces hygroscopicus var. limoneus) 및 스트렙토마이세스 글라우체센스 등의 기타 미생물 및 생물공학적으로 관련된 진균[예: 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 페니실륨 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)] 및 효모[예: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)]에서의 이들 유전자의 이종 발현이 기술되어 있다. 또한 본 발명은 기타 미생물에서 동종 유전자 및 이를 분리하는 방법에 관한 것이다.
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O는 두 가지 항생제, 즉 하이드록시스트렙토마이신[참조: Hutter(1967) Systematik der Streptomyceten(Taxonomy of the Streptomycetes), Basel, Karger Verlag] 및 테트라세노마이신[참조: Weber et al.(1979) Arch. Microbiol. 121: 111-116]을 생산한다. 이러한 스트렙토마이세스가 구조적으로 변화된 천연 생성물을 합성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 이들 화합물을 생산하는 조건은 종종 공지되어 있지 않거나 이들 물질이 극소량으로만 생산되어 검출되지 않는다.
α-아밀라제 억제인자인 아카르보스는 각종 악티노플라네스 균주(SE50, SE80 및 SE18)로부터 분리되어 왔다[참조: Schmidt et al.(1977) Naturwissenschaften 64:535-536]. 이러한 활성 물질이 악티노플라네스, 암풀라리엘라 및 스트렙토스포란쥼 속 유기체로부터 α-아밀라제 억제인자에 대해 스크리닝하는 것과 연관이 있는 것으로 밝혀졌다. 아카르보스는 아미노 당, 즉 4,6-디데옥시-4-아미노-D-글루코피라노스가 결합된 색다른 불포화 사이클리톨 단위로 구성되는 슈도테트라사카라이드이다. 부가의 α-1,4-글리코시드상에서 결합된 D-글루코피라노스 단위를 상기 아미노 당에 결합시킬 수 있다. 따라서, 아카르보스는 예를 들어, 2개의 추가의 D-글루코스 분자를 함유한다. 생산 균주는 상이한 길이의 당 측쇄를 보유하는 슈도-올리고사카라이드 생성물의 혼합물을 합성한다[참조: Schmidt et al.(1977) Naturwissenschaften 64: 535-536]. 아카르보스 사이클리톨 잔기는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스로부터 생산된 항생제 발리다마이신 A[참조: Iwasa et al.(1979) J. Antibiot. 32:596-602]의 한 성분인 화합물 발리에나민과 동일하다.
아카르보스는 악티노플라네스 균주를 사용한 발효에 의해 생산될 수 있으며 당뇨병 치료제로서 상당한 경제적 중요성을 성취하였다. 악티노플라네스가 α-아밀로스 억제제의 혼합물을 합성하기 하지만, 아카르보스의 속명으로 사용되는, 상대 분자량이 645.5인 화합물[2개의 글루코스 단위를 함유하는 아카르비오신(참조: Truscheit(1984) Ⅷth International Symposium on Medicinal Chemistry, Proc. Vol. 1. Swedish Academy of Pharmaceutical Sciences, Stockholm, Sweden)]일 뿐이다. 발효 조건은 아카르보스가 발효 주산물이 되도록 선별한다. 또 다른 방법은 아카르보스가 주산물로서 형성되는 특정한 균주 및 선별제를 사용하거나 선별적인 분리를 달성하기 위한 정제 공정을 사용하는 것이다[참조: Truscheit(1984) Ⅷth International Symposium on Medicinal Chemistry, Proc. Vol. 1. Swedish Academy of Pharmaceutical Sciences, Stockholm, Sweden]. 최종적으로 목적하는 생성물인 아카르보스를 수득하기 위하여 생성물 혼합물을 화학적으로 변형시킬 수도 있다.
스트렙토마이세스 속과는 대조적으로 악티노플라네스 속은 지금까지 유전적 관점에서 광범위하게 연구되어 온 적이 없었다. 스트렙토마이세스 속에 대해 정립된 방법이 악티노플라네스 속에도 전이될 수 없거나 항상 전이될 수 있는 것은 아니다. 목적있는 방식으로 아카르보스 생산을 최적화하기 위한 분자 생물학적 방법을 사용하기 위해서는, 아카르보스 생합성용 유전자를 분리한 다음, 이를 특성화해야 한다. 이러한 맥락에서, 악티노플라네스 종에 대한 숙주/벡터 시스템을 설정하기 위한 자체 시도에 대한 가능성이 제시되었다. 그러나, 이는 악티노플라네스에 대한 연구가 비교적 피상적이었다는 사실로 인해 매우 지루하고 시간과 노동이 많이 들어간다.
본원에 기술된 발명은 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자를 클로닝시키는 목적을 달성시켜 주는데, 이들 유전자는 유전학적으로 철저하게 연구되어온 스트렙토마이세테이고 놀랍게도 아카르보스 생산자인 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 클로닝되었다[참조: Crameri et al.(1983) J. Gen. Mecrobiol. 129:519-527; Hintermann et al.(1984) Mol. Gen. Genet. 196:513-520; Motamedi 및 Hutchinson(1987) PNAS USA 84:4445-4449; Geistlich et al.(1989) Mol. Microbiol. 3:1061-1069]. 전분 함유 배지에서, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O는 분자량이 645, 807 및 970인 슈도-올리고사카라이드를 생산한다.
따라서, 본 발명에 따른 주제의 한 파트는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 상응하는 생합성용 유전자를 분리하는 방법; 및 이러한 생합성용 유전자의 유전자 집락을 완전한 것으로 만들기 위해서, 인접한 DNA 영역을 분리하기 위한 이들 유전자의 용도이다.
슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자를 분리하고 이들 유전자의 특징을 확인하는 것은 슈도-올리고사카라이드 생합성과 이의 조절 기전을 보다 잘 이해하는데 있어서 상당히 중요하다. 이러한 지식을 사용하여, 기존에 정립된 분자 생물학적 방법을 통한 아카르보스 생산성 관점에서 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 균주의 생산성을 증가시킬 수 있다. 이에 덧붙여, 슈도-올리고사카라이드의 합성을 암호화하는 완전한 유전자 집락 또는 이러한 유전자 집락으로부터의 개별적인 유전자를 생물공학적으로 관련이 있는 다른 미생물에서 발현시켜 아카르보스와 같은 슈도-올리고사카라이드의 제조를 추가로 증가시키거나 또는 이러한 제조의 단순화를 추가로 증가시킬 수 있다. 이러한 생합성용 유전자를 특정하게 변형시켜 분자량이 645인 아카르보스만을 생산하는 균주를 제조할 수도 있다. 항생제 생합성용 유전자가 항상 집락에 존재하고 종종 매우 강력하게 보존되기 때문에[참조: Stockmann 및 Piepersberg(1992) FEMS Microbiol. Letters 90:185-190; Malpartida et al.(1987) Nature 314:642-644], 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 유전자를 예를 들어 악티노플라네스 종으로부터 아카르보스-암호화 유전자를 분리하기 위한 프로브로서 사용할 수도 있다. 조절성 유전자, 또는 생합성에서의 제한 단계를 암호화하는 유전자의 발현으로 인해, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O, 악티노플라네스 종 또는 상응하는 생산자 균주의 생산성이 증가될 수 있다. 생산성 증가는 또한, 생합성에서 억제 효과를 나타내는 아카르보스 생합성용 유전자를 바꾸어 놓음으로써(녹아웃시키거나 변이유발시킴) 달성할 수 있다.
이전에 분리된 적이 없는 항생제 생합성용 유전자를 클로닝시키는 한 가지 가능한 방법은 유전자-특이적 프로브를 사용하는 것이다[참조: Stockmann 및 Piepersberg(1992) FEMS Microbiol. Letters 90:185-190; Malpartida et al.(1987) Nature 314:642-644]. 이들 프로브는 P32-표지되거나 다른 몇몇 방식으로 표지된 DNA 단편일 수 있으며; 그 밖에도, 적절한 유전자는 주형으로서 분리된 염색체성 DNA와 변성 PCR 프라이머를 사용하여 연구될 균주로부터 직접적으로 증폭시킬 수 있다.
후자 방법이 본 연구에 사용되었다. 아카르보스와 같은 슈도-올리고사카라이드는 구조적 요소로서 4,6-데옥시글루코스 빌딩 블록을 함유한다. 효소 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제는 4,6-데옥시글루코스의 생합성에 관여하는 것으로 공지되어 있다[참조: Stockmann 및 Piepersberg(1992) FEMS Microbiol. Letters 90:185-190]. 데옥시슈가가 천연 생성물과 항생제에 자주 반복되는 구성분이기 때문에, 이러한 효소가 상응하는 항생제 생합성용 유전자를 분리하기 위한 특정 수단이 될 수도 있다. 이들 유전자가 항상 집락으로서 존재하기 때문에, 하나의 유전자를 초기에 분리하는 것으로 충분하므로; 이에 연속해서, 인접한 DNA 영역을 분리하고 이를 특성화하는 작업을 수행할 수 있다.
예를 들어, dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O에서 하이드록시스트렙토마이신을 생합성하는 특정 단계를 촉매한다[참조: Retzlaff et al.(1993) Industrial Microorganisms, Basic and applied molecular genetics ASM, Washington DC, USA]. 추가로 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제는 기타 미생물, 예를 들면, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)[참조: Pissowotzki et al.(1991) Mol. Gen. Genet. 231:113-123], 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)[참조: Merson-Davies 및 Cundcliffe(1994) Mol. Microbiol. 13:349-355] 및 스트렙토마이세스 비올라세오루버(Streptomyces violaceoruber)[참조: Bechthold et al.(1995) Mol. Gen. Genet. 248:610-620]로부터 분리하였다.
결과적으로, 이미 공지된 생합성용 유전자의 아미노산 서열로부터 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머에 대한 서열을 추론하는 것이 가능하였다. 이를 위하여, 이들 효소의 단백질 서열내에 보존된 영역을 선별하고 아미노산 서열을 유전자 암호에 따라서 핵산 서열로 해독한다. 이러한 단백질 서열은 EMBL 및 Genbank 데이터베이스로부터 취한다. 다음 서열을 사용한다: 스트렙토마이세스 그리세우스: 수탁번호 X62567 유전자: strE(1993. 10. 30.); 스트렙토마이세스 비올라세오루버: 수탁번호 L37334 유전자: graE(1995. 4. 10.); 사카로폴리스포라 에티트라애(Streptomyces etythraea): 수탁번호 L37354 유전자: gdh(1994. 11. 9.). 유전자 암호의 변성 결과로서 다수의 가능한 프라이머 서열이 수득된다. 스트렙토마이세스가 통상적으로 한 코돈의 세 번째 위치에 G 또는 C를 함유한다는 사실[참조: Wright 및 Bibb(1992) gene 113:55-65]은 합성될 프라이머의 수를 감소시킨다. 이어서, 이들 프라이머 혼합물을 사용하여 연구 조사될 균주로부터의 DNA를 사용하여 PCR 증폭을 수행할 수 있으며, 이러한 증폭은 이상적으로 증폭된 DNA 단편을 발생시킨다. 고도로 보존된 단백질의 경우에는, 이러한 단편이 상응하는 유전자의 핵산 서열에서 프라이머들 간의 거리로부터 예측될 수 있는 수준의 길이이다. 그러나, 이러한 성질에 관한 실험적 결과를 혼합해 보면 증폭물을 반드시 생성시키지는 않는 것으로 나타났다. 이러한 프라이머들은 너무나 특이성이 없기 때문에 상당한 수의 단편을 증폭시킬 수 있으며; 또 다르게는, 제조된 PCR 프라이머에 대한 염색체에 어떠한 상보적 결합 부위도 존재하지 않는다면 PCR 생성물이 전혀 수득되지 않는다.
스트렙토마이세스 균주인 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O를 연구 조사한 결과, 예상 길이가 550bp인 증폭된 DNA 단편(acbD*)이 발생되었다. 추가의 조사는 이러한 균주가 하이드록시스트렙토마이신 생합성용 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제 유전자를 함유하는 것 이외에도, 상기 균주가 놀랍게도 아카르보스와 같은 슈도-올리고사카라이드 생합성용의 제2의 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 2개의 유전자가 고도의 상동성을 나타내긴 하지만, 아미노산 수준에서 단지 65%만이 동일하다.
acbD*프로브(실시예 2 및 표 2A 참조)를 사용하여 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성에 관련된 각종 유전자(acbA, acbB, acdC, acbD, acbE 및 acdF)를 암호화하는 6.8kb PstI DNA 단편을 분리한다.
acbBCD 유전자(아미노트랜스퍼라제, acbB, dTDP-글루코스 신타제, acbC, dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제, acbD, 실시예 6 참조)를 결실시키면, 생산 배지에서 더 이상 어떠한 슈도-올리고사카라이드도 생산하지 않는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 돌연변이체가 생산된다. 따라서, 슈도-올리고사카라이드 합성에 있어서의 acbBCD 유전자의 관련성은 상응하는 위치를 결실시킴으로써 확인하였다.
2개의 유전자, 즉 dTDP-글루코스 신타제 및 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제는 슈도-올리고사카라이드의 데옥시슈가 생합성에 관여해야만 하며, 이는 철저하게 연구된 동종 효소(상기 참조)의 기능으로부터 추정될 수 있다. 아미노-트랜스퍼라제(acbB 유전자에 의해 암호화됨)가 아미노 그룹을 상기 당 잔기 또는 사이클리톨 잔기로 전이시키는데 관여하는 것으로 보인다. acbB의 단백질 서열을 분석함으로써, 피리독살 포스페이트 결합에 관련된 아미노산 모티프를 발견하였다. 이러한 모티프는 전형적인 부류 Ⅲ 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.11; EC 2.6.1.13; EC 2.6.1.18; EC 2.6.1.19; EC 2.6.1.62; EC 2.6.1.64; EC 5.4.3.8)이다. acbB의 정확한 효소적 기능은 단지 슈도-올리고사카라이드의 생합성에 관한 추가의 연구에 의해 추론할 수 있다. acbB는 나선-전환-나선 모티프를 보유하고 있는 DNA-결합 단백질(예: 바실러스 서브틸리스 DegA, P37947; Swiss-Prot 데이터베이스)과 상당히 유사한 전사-조절성 단백질을 암호화한다. 따라서, 바실러스 서브틸리스로부터의 전사 활성인자 CcpA는 예를 들어 글루코스의 존재하에서 α-아밀라제의 형성을 억제시킨다[참조: Henkin et al.(1991) Mol. Microbiol. 5:575-584]. 이러한 그룹의 대표적인 기타 예로는 특정한 당 빌딩 블록을 인식하고 대사성 경로의 생합성에 양성적 또는 음성적 영향을 미칠 수 있는 단백질이 있다. 슈도-올리고사카라이드의 생합성이 또한 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O에서 조절된다. 전분 함유 배지에서 슈도-올리고사카라이드의 합성을 입증하는 것은 이전에 가능하였다. 이러한 방법이, AcbE가 슈도-올리고사카라이드 합성을 조절하는데 관여할지도 모른다는 것을 지시하고 있긴 하지만, 이에 대한 정확한 기전은 여전히 공지되어 있지 않다. 그러나, 본 발명에서는 분자 생물학적 방법을 사용하여 유전자를 변형시켜 슈도-올리고사카라이드 생합성 속도를 증가시킬 수 있다. 더욱이, acbE가 결합되는 DNA 부위를 소위 겔 이동 검정을 통하여 동정할 수 있다[참조: Miwa et al.(1994) Microbiology 140:2576-2575]. 아카르보스 생합성 속도 증가는 슈도-올리고사카라이드 유전자의 전사에 관여하는 기타 조절성 DNA 영역과 프로모터를 동정한 다음, 변형시킨 후에 달성할 수 있다.
현재, acbF의 기능은 여전히 명료하게 공지되어 있지 않다. 상응하는 유전자 생성물은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)(MsmE; Q00749: Swissprot 데이터베이스)로부터의 당-결합성 단백질과 같은 당-결합성 단백질과의 상동성을 나타내는데, 이로써 상기 유전자 생성물이 슈도-올리고사카라이드의 생합성에 관련된 것으로 추정된다. acbA 유전자의 유전자 생성물은 공지된 세균성 ATP-결합성 단백질(예를 들면, 스트렙토마이세스 페우시투스(Streptomyces peucitus) DrrA, P32010: Swissprot 데이터베이스로부터 유래됨)과의 상동성을 나타낸다. AcbA 단백질은 전형적인 ATP/GTP 결합 모티프, 즉 소위 P 루프를 보유하고 있다. 이들 단백질은 생물학적 막에서의 대사물의 능동 수송과 관련이 있는, 소위 ABC 수송자의 중요한 성분을 구성하고 있다[참조: Higgins(1995) Cell 82:693-696]. 따라서, AcbA는 슈도-올리고사카라이드를 세포 밖으로 배출시키는데 관여하거나 말토스와 같은 α-아밀라제 억제인자를 생합성하기 위한 당 빌딩 블록을 가져오는데 연관이 있을 수 있다.
지금까지 분석되어 온 2차적 대사물을 생합성하기 위한 모든 스트렙토마이세테 유전자를 집락내에 배열한다. 이를 위해서는, 본원에 따른 아카르보스 생합성 유전자가 또한 이러한 유전자 집락내에 배열된다는 것이 전제되어야 한다. 따라서, 슈도-올리고사카라이드 생합성에 관련된 나머지 유전자는 본 발명에 따른 6.8kb PstI DNA 단편에 인접한 DNA 영역을 분리시킴으로써 분리시킬 수도 있다. 앞서 이미 언급한 바와 같이, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 미생물로부터 동종 유전자 집락을 분리하는 것도 용이하게 가능하다.
따라서, 본 발명은 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자, 특히 개별적인 유전자가 도 3에 도시된 바와 같은 전사 방향 및 순서로 배열되고/되거나 도 3에 도시된 바와 같은 제한효소 절단 부위 패턴을 나타내는 재조합 DNA 분자에 관한 것이며, 바람직하게는,
(a) 표 4에 따른 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나;
(b) 엄격한 조건하에서 (a)에 따른 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나;
(c) 유전자 암호의 변성으로 인해 (a) 및 (b)에 따른 DNA 분자와는 상이하지만 (a) 및 (b)에 따른 DNA 분자를 사용하여 상응하게 발현될 수 있는 단백질의 발현을 가능하게 하는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 1 내지 720의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 acbA 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자; 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 720 내지 2006의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 acbB 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자; 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 2268 내지 3332의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 acbC 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자; 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 3332 내지 4306의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 acbD 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자; 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 4380 내지 5414의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 acbE 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자; 및 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 5676 내지 6854의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 acbF 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 앞서 기술된 바와 같고 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 PCR 증폭시키기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머에 관한 것이며, 이러한 프라이머는 특히 표 1에 따른 서열을 갖는다.
추가로, 본 발명은 앞서 언급한 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 벡터, 특히 이러한 벡터가 발현 벡터이고 상기 DNA 분자가 프로모터 서열에 작동적으로 결합됨을 특징으로 하는 벡터에 관한 것이며, 여기서 상기 벡터는 바람직하게는 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 악티노마이세탈레스[예: 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 및 스트렙토스포란쥼 균주], 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스, 스트렙토마이세스 글라우체센스 및 생물공학적으로 관련된 진균[예: 아스퍼질러스 나이거 및 페니실륨 크리소게눔] 및 효모[예: 사카로마이세스 세레비지애]로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 숙주 유기체에서의 발현에 적합하며, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 또는 악티노플라네스 종이 매우 특별히 바람직하다. 상기 DNA 분자를 상기 벡터의 프로모터 서열에 작동적으로 결합하는 것은 단지 본 발명의 하나의 바람직한 양태이기 때문에, DNA 분자와 관련해서 내인성인 프로모터 서열, 예를 들면, 각 경우에 있어서 천연인 프로모터, 또는 아카르보스 수율을 최적화할 목적으로 돌연변이시킨 천연 프로모터를 사용하여 발현을 달성시키는 것도 가능하다. 이러한 천연 프로모터는 본 발명에 따른 DNA 분자의 일부이다.
또한, 본 발명은 천연 아카르보스 생합성 유전자를 아카르보스-생산 미생물에서 제거하거나 변형시키기 위한 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 바람직하게는 pGM160 및 EP 0 334 282 및 EP 0 158 872에 기술된 바와 같은 벡터로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
더욱이, 본 발명은 특히 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 악티노마이세탈레스[예: 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 및 스트렙토스포란쥼 균주], 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스, 스트렙토마이세스 글라우체센스 및 생물공학적으로 관련된 진균[예: 아스퍼질러스 나이거 및 페니실륨 크리소게눔] 및 효모[예: 사카로마이세스 세레비지애]로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는, 상기 언급한 DNA 분자 또는 벡터 중의 하나로 형질전환되는 숙주 세포에 관한 것이며; 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 매우 특히 바람직하다.
추가로, 본 발명은 특히 DNA 분자가,
(a) 표 4에 따른 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나;
(b) 엄격한 조건하에서 (a)에 따른 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나;
(c) 유전자 암호의 변성으로 인해 (a) 및 (b)에 따른 DNA 분자와는 상이하지만 (a) 및 (b)에 따른 DNA 분자를 사용하여 상응하게 발현될 수 있는 단백질의 발현을 가능하게 하는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는, 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자의 유전자를 발현시킴으로써 수득될 수 있는 단백질 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 앞서 기재된 DNA 분자에 의해 암호화되는 유전자를 발현시킴으로써 수득될 수 있는 분리된 단백질에 관한 것이다.
다음 설명은 본 발명의 맥락에서 동정된 개별적인 모든 유전자에 적용되며 이는 단지 명료하게 할 목적으로만 제시된 것이며; 본 발명은 추가로 앞서 기재된 바와 같은 재조합 DNA 분자에 의해 암호화되는 단백질, 특히 표 4에 따른 뉴클레오티드 1 내지 720, 720 내지 2006, 2268 내지 3332, 3332 내지 4306, 4380 내지 5414 또는 5676 내지 6854의 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 단백질에 관한 것이며, acbA 유전자, acbB 유전자, acbC 유전자, acbD 유전자, acbE 유전자 또는 acbF 유전자에 의해 암호화되고 표 4에 따른 아미노산 서열 또는 이의 일부를 포함하는 단백질이 매우 특히 바람직하다.
게다가, 본 발명은,
(a) 단백질을, 특히 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 악티노마이세탈레스[예: 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 또는 스트렙토스포란쥼 균주], 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스 또는 스트렙토마이세스 글라우체센스, 및 생물공학적으로 관련된 진균[예: 아스퍼질러스 나이거 및 페니실륨 크리소게눔] 및 효모[예: 사카로마이세스 세레비지애]으로 이루어진 그룹, 매우 특히 바람직하게는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 적합한 숙주 세포에서 발현시킨 다음,
(b) 분리시킴을 특징으로 하여, 본 발명에 따른 주제의 일부로서 앞서 기재된 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은,
(a) 표 4에 따른 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나, 엄격한 조건하에서 표 4에 따른 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나, 유전자 암호의 변성으로 인해 상기 DNA 분자와는 상이하지만 이들 DNA 분자를 사용하여 상응하게 발현될 수 있는 단백질의 발현을 가능하게 하는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 DNA 분자의 하나 이상의 유전자를 특히 바로 앞의 문단에서와 동일한 그룹 중에서 선택된 적합한 숙주 세포에서의 발현에 사용하고;
(b) 아카르보스를 상기 숙주 세포의 배양 상등액으로부터 분리시킴을 특징으로 하여, 아카르보스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은,
(a) 표 4에 따른 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나, 엄격한 조건하에서 표 4에 따른 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나, 유전자 암호의 변성으로 인해 상기 DNA 분자와는 상이하지만 이들 DNA 분자를 사용하여 상응하게 발현될 수 있는 단백질의 발현을 가능하게 하는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 DNA 분자의 하나 이상의 유전자를 아카르보스-생산 숙주 세포, 특히 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종에서 제거한 다음;
(b) 아카르보스를 상기 숙주 세포로부터 분리시킴을 특징으로 하여, 아카르보스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이와 관련하여, 하나 이상의 유전자의 제거는 표준 분자 생물학적 방법을 통하여, 예를 들어 상기 기재된 벡터(pGM160 등)를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 제거시킬 유전자는 조절 기능을 지니는 것으로 추정되는 acbE 유전자일 수 있다. 마찬가지로, 유일한 발효 생성물로서 순수한 아카르보스를 수득하고 더 이상 동종 슈도-올리고사카라이드(상기 참조)의 혼합물을 수득하지 않을 목적으로 유전자를 제거할 수 있다. 상기 유전자의 제거는 이러한 목적을 위해 상기 언급한 벡터를 사용하여 달성하는 것이 바람직하다.
더욱이, 본 발명은 앞서 언급한 2가지 아카르보스의 제조 방법을 서로 조합하여 하나 이상의 상기 유전자를 인공적으로 발현시키고 하나 이상의 상기 유전자를 제거시킴을 특징으로 하여, 아카르보스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 아카르보스의 수율을 증진시키기 위하여 각각의 유전자 프로모터를 돌연변이시킴으로써 내인성 아카르보스 생합성 유전자의 유전자 발현을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 맥락에서, 공지된 동종 재조합 방법을 사용하여 돌연변이를 증진시키고자 하는 생산 균주내로 도입할 수 있다. 이들 돌연변이는 전이, 결실 및/또는 부가일 수 있다. "부가"는 예를 들어, 하나의 단일 뉴클레오티드 또는 수개의 뉴클레오티드의 부가 또는 양성적 조절 효과를 지니고 있고 아카르보스 생합성용 내인성 유전자의 발현을 증진시켜주는 하나 이상의 DNA 서열의 부가를 의미한다. 반대의 경우, 즉 내인성 아카르보스 생합성 유전자를 억제하기 위하여 음성적 조절 효과를 지니고 있는 DNA 서열의 부가도 역시 부가의 바람직한 형태이다. "전이"는, 예를 들어, 음성적으로 또는 양성적으로 작용되는 조절성 요소의 효과를 저하시키거나 증폭시키는 뉴클레오티드 교환일 수 있다. "결실"을 사용하여 음성적 또는 양성적으로 작용되는 조절성 요소를 제거할 수 있다. 이러한 공정의 내인성 유전자는 바람직하게는 악티노마이세탈레스[예: 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 또는 스트렙토스포란쥼 균주], 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스 또는 스트렙토마이세스 글라우체센스에 존재하고, 매우 특히, 이들 유전자는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종에 존재한다.
또한, 본 발명은 아카르보스를 수득하기 위한 스트렙토마이세스 GLA.O의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 "전통적인 경로"에 의해 스트렙토마이세스 GLA.O의 돌연변이체를 제조하기 위한 상기 균주의 용도에 관한 것이며, 이러한 돌연변이체로 인해 아카르보스를 보다 더 많이 생산할 수 있다. 이러한 성질의 개선된 천연 생성물 생산자의 제조 방법은 장시간 동안 공지되어 왔고 종종 전통적인 돌연변이 및 선별 단계를 사용한다.
더욱이, 본 발명은,
(a) 표 4에 따른 DNA 분자로부터 유도되는 하이브리드화 프로브를 제조하고,
(b) 이들 하이브리드화 프로브를, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 수득된 DNA 라이브러리의 게놈성 스크리닝에 사용한 다음,
(c) 발견되는 콜로니를 분리한 다음, 이를 특성화함을 특징으로 하여, 아카르보스 및 표 4에 따른 동종 폴리사카라이드를 생합성하기 위하여 유전자 집락을 완전한 것으로 만드는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 표 4에 따른 재조합 DNA 분자에 기인하여,
(a) PCR 프라이머를 제조하고,
(b) 이들 PCR 프라이머를 사용하여 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 게놈성 DNA의 DNA 단편을 축적시키는데, 이들 프라이머를 사용된 벡터 시스템의 서열로부터 하이브리드화되는 프라이머와 결합시키며,
(c) 이와 같이 축적된 단편들을 분리시킨 다음, 이를 특성화함을 특징으로 하여, 아카르보스 및 표 4에 따른 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 유전자 집락을 완전한 것으로 만드는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 청구범위의 제4항에 따른 재조합 DNA 분자에 기인하여,
(a) 하이브리드화 프로브를 제조하고,
(b) 이들 하이브리드화 프로브를 상응하는 미생물로부터 수득된 DNA 라이브러리의 게놈성 또는 cDNA 스크리닝에 사용한 다음,
(c) 발견되는 콜로니를 분리한 다음, 이를 특성화함을 특징으로 하여, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 아카르보스-생산 미생물로부터 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 유전자 집락을 분리하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 청구범위의 제4항에 따른 재조합 DNA 분자에 기인하여,
(a) PCR 프라이머를 제조하고,
(b) 이들 PCR 프라이머를 사용하여 상응하는 미생물로부터 게놈성 DNA 또는 cDNA의 DNA 단편을 축적시키며,
(c) 이와 같이 축적된 단편들을 분리시킨 다음, 이를 특성화하고,
(d) 경우에 따라, 앞서 기술된 바와 같은 방법에 사용함을 특징으로 하여, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 아카르보스-생산 미생물로부터 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 유전자 집락을 분리하는 방법에 관한 것이다.
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 아카르보스-생산 미생물로부터 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위하여 유전자 집락을 분리하는 당해 방법은 미생물이 악티노마이세탈레스[예: 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 및 스트렙토스포란쥼 균주], 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스 및 스트렙토마이세스 글라우체센스로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 한다.
추가로, 본 발명은 아카르보스를 분리하기 위한 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 다음 실시예, 표 및 도면의 보조하에 보다 상세히 기술할 것이지만 이에 제한되지는 않는다.
제조업자의 지시에 따라서 맥커레이 및 나겔(Duren, Germany) 분리용 키트(NucleobondR)를 사용하여 모든 플라스미드 분리를 수행한다. 분자 생물학적 과정은 표준 프로토콜[참조: Sambrock et al.(1989) Molecular cloning: A Laboratory Manul, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, USA)에 따라서 또는 각각의 제조업자의 지시에 따라서 수행한다. DNA 및 단백질 서열은 제네틱스 컴퓨터 그룹 소프트웨어, 버전 8(프로그램: FastA, TFastA, BlastX, Motifs, GAP and CODONPREFERENCE) 및 SwissProt(release 32), EMBL(release 46) 및 Prosite(release 12.2) 데이터베이스를 사용하여 검사한다. 스트렙토마이세스 글라우체센스 및 악티노플라네스의 분자 생물학적 조작(DNA 분리 및 DNA 형질전환)은 문헌[Hopwood et al.: Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, UK, 1985, 및 Motame di 및 Hutchinson: Cloning and heterologous expression of a gene cluster for the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antibiotic of Streptomyces glaucescene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4445-4449(1987)]에 기재된 바와 같이 수행한다.
일반적으로, 하이브리드화는 베링거 만하임(Boehringer Mannheim)로부터의 "비-방사능 DNA 표지화 키트"(Cat No. 1175033)를 사용하여 수행한다. DNA는 베링거 만하임로부터의 "발광성 검출 키트"(Cat No. 1363514)를 사용하여 가시화한다. 본원에 제시된 모든 실시예에서, 하이브리드화는 다음과 같은 엄격한 조건하에서 수행한다: 68℃, 16시간, 5xSSC, 0.1% N-라우릴사르코신, 0.02% SDS, 1% 블록킹 시약(베링거 만하임). SSC는 0.15M NaCl/0.015M 나트륨 시트레이트를 의미한다. 본원에 제시된 "엄격한 조건"의 정의는 "엄격한 조건"을 지칭하는 본원의 모든 국면에 적용된다. 이와 관련하여, 이러한 엄격성을 달성하는 방식, 즉 인용된 하이브리드화 조건은 제한하고자 제시된 것은 아닌데, 이는 당해 분야의 숙련인이 예를 들어, 다른 온도와 조합하여 다른 하이브리드화 용액을 사용함으로써 동일한 엄격한 조건을 달성하기 위하여 다른 조건을 마찬가지로 선택할 수 있기 때문이다.
실시예 1:
PCR 프라이머의 합성 및 서열 및 에스. 글라체센스 GL A.O로부터 단편의 증폭
각 경우에 있어서 다음 반응 혼합물 100㎕ 중의 프라이머 1 및 프라이머 2 100pmol을 사용하여 엄격한 조건하에서 PCR을 수행한다:
PCR 완충액110㎕
PCR 프라이머 각 경우에 2.5㎕
dNTP 각 경우에 0.2mM
BSA(10mg/ml) 1㎕
주형 DNA 1㎍(㎕)
Taq 폴리머라제2(5단위/ml) 1.5㎕
H2O 100㎕가 되게 하는 양
1: 프로메가(Promega)
2: 베링거 만하임
샘플에 광유 75㎕를 바르고 퍼킨 엘머 TC1 DNA 열 사일러를 사용하여 증폭을 수행한다.
파라미터:
주기 온도 지속기간
1 96℃ 5분
74℃ 5분
30 95℃ 1.5분
74℃ 1.5분
1 74℃ 5분
표 1에는 상이한 스트렙토마이세테스로부터 dTDP-글루코스 데하이드라타제를 증폭시키는데 사용되어야 하는 변성 프라이머의 서열이 열거되어 있다
dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제를 증폭시키기 위한 프라이머 서열
프라이머 1 CSGGSGSSGCSGGSTTCATSGG(서열 1)
프라이머 2 GGGWVCTGGYVSGGSCCGTAGTTG(서열 2)
상기 표 1에서, S는 G 또는 C이고, W는 A 또는 T이며, V는 A 또는 G이고 Y는 T 또는 C이다.
실시예 2:
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 분리된 PCR 단편의 DNA 서열
문헌[참조: Sanger et al., PNAS USA, 74:5463-5467(1977)]의 디데옥시 쇄 종결 방법에 의해 서열화를 수행한다. 이러한 반응은 제조업자의 지시에 따라서 파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech; Freiburg, Germany)으로부터의 자가 판독 서열화 KitR를 사용하여 수행한다. 파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech; Freiburg, Germany)으로부터의 ALF DNA SequencerR를 분리 및 검출에 사용한다.
PCR 단편(Sure Clone KitR, Pharmacia Biotech, Frieburg)을 이. 콜라이 벡터 pUC 18내로 연속적으로 클로닝시키고 이러한 단편을 서열화하는 것은 상기 단편이 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제를 암호화하였다는 가정을 뒷받침해준다. 그러나, 둘다 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제와는 고도의 상동성을 나타내긴 하지만 PCR 단편이 acbD*및 HstrE*로 명명된다는 점에서 동일하지는 않는 2가지 상이한 유전자를 분리하였다.
이와 같이 분리된 PCR 단편의 서열은 표 2A 및 2B에 제시되어 있으며 HstrE*와 acbD*의 추론된 아미노산 서열의 상동성 비교는 표 2C에 제시되어 있다. 2개의 단백질은 단지 65% 정도의 동일성만을 나타낸다.
acbD*의 DNA 서열(프라이머-결합 부위는 밑줄쳐 있다; 서열 3)
HstrE*의 DNA 서열(프라이머-결합 부위는 밑줄쳐 있다; 서열 4)
PCR 생성물 HstrE*및 acbD*의 추론된 아미노산 서열의 상동성 비교(프로그램: GAP)
성질 196.3 길이 182
비율 1.091 간격 0
유사성 퍼센트 77.654 동일성 퍼센트 65.363
PCRstrE.Pep×PCRacbD.Pep
각 경우 윗줄: 서열 5각 경우 밑줄: 서열 6
실시예 3:
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 염색체성 DNA를 사용한 서던 분석 및 분리되고 표지된 PCR 단편
세포를 R2YENG 배지에서 성장시키고 30시간 후에 DNA 분리를 위해 수거한다. 염색체성 DNA를 문헌[Hopwood et al.: Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, UK]에 기재된 바와 같이 에스. 글라우체센스 GLA.O로부터 분리한다.
acbD*및 HstrE*PCR 단편으로 이루어진 표지된 프로브를 사용하여, PstI, BgIII 및 BamHI로 분해시킨 에스. 글라우체센스 GLA.O 생산자 균주 염색체성 DNA를 사용하여 서던 블롯 분석을 수행한다. 2개의 PCR 단편을 제조업자(베링거 만하임; Mannheim)의 지시에 따라서 디곡시게닌(digoxygenin)으로 표지시키고, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 생산자 균주 염색체성 DNA의 분해물을 아가로스 겔 상에서 분리한다. 이러한 DNA를 모세관 전이에 의해 나일론 막에 옮기고 표지된 프로브와 동종인 DNA 영역을 하이브리드화한 후 연속적으로 가시화한다.
상기 2개의 유전자는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 하이드록시스트렙토마이신 생합성으로부터의 유전자 단편인 HstrE*에 의해 표지되는 단편과 상이한 DNA 영역(도 1 및 도 2)이 표지된다. 이러한 DNA 서열이 공개되지 않았지만, HstrE*로부터 추정된 단백질 서열과 스트렙토마이세스 그리세우스 N2-3-11 스트렙토마이신 생합성으로부터의 StrE[참조: Pissowotzki et al.(1991) Mol. Gen. Genet. 231:113-123]과의 고도의 상동성(82% 동일성) 및 HstrE*-표지된 DNA 단편(도 1)과 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 하이드록시스트렙토마이신 유전자 집락의 공개된 제한 지도[참조: Retzlaff et al.(1993) Industrial Microorganisms. Basic and applied molecular genetics ASM, Washington DC, USA]와의 일치성이 상기와 같은 결론을 가능케 해준다. acbD* 프로브에 의해 표지되는 단편(도 2)은 지금까지 연구된 적이 없는 DNA 영역에 속한다. 이러한 영역은 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 효소를 암호화한다.
실시예 4:
6.8kb PstI 단편의 클로닝
특히, acbD*PCR 단편은 6.8kb PstI DNA 단편을 표지시킨다(도 2). 이러한 DNA 단편을 다음과 같이 분리한다. 겔 영역을 면도날로 절단하고 DNA를 파마시아 바이오텍으로부터의 분리용 키트를 사용하여 상기 겔로부터 분리시킨 다음, 제한 효소 PstI로 절단시킨 플라스미드 pUC19내로 클로닝시킨다(플라스미드 pacb1). 이어서, 이러한 후자 플라스미드를 이. 콜라이 균주 DH5α내로 형질전환시킨다. 개별적인 클론을 이들 플레이트로부터 아배양하고 이들 클론을 사용하여 플라스미드 DNA 분리를 수행한다. 상기 언급한 프라이머 1 및 2(표 1)를 사용한 PCR 증폭을 상기 클론(250)으로부터의 DNA를 사용하여 수행한다. 이러한 방식으로, 6.8kb PstI 단편을 함유하는 적절한 이. 콜라이 클론을 분리한다.
실시예 5:
분리된 6.8kb PstI DNA 단편의 서열화
DNA를 각종 제한 효소로 분해하고 개개의 DNA 단편을 pUC19내로 클로닝시킨다. 이어서, 표 4에 제시된 완전한 단편의 DNA 서열(서열 7)을 결정한다. 반대편 쇄에 대한 상보적 스크리닝을 함으로써 6.8kb PstI 단편의 DNA 서열을 부분적으로만 확인한다. 각종 단백질을 암호화하는 몇몇 개방 판독 프레임이 발견되었다(프로그램: CODONPREFERENCE 및 BlastX). 총 6개의 암호화 영역, 즉 ATP-결합성 단백질 acbA와 고도의 상동성을 지니는 유전자, 아미노트랜스퍼라제 acbB, dTDP-글루코스 신타제 acbC, dTDP-글루코스 데하이드라타제 acbD, Lacl 단백질 계열 acbE와 상동성을 지니는 조절성 유전자, 및 당-결합성 단백질 acbF와 유사성을 지닌 단백질이 발견되었다. acbA와 acbF의 서열은 단지 부분적으로만 결정되었다. 데이터베이스로부터의 기타 단백질과의 상동성, 및 추정상 단백질의 성질이 표 3에 요약되어 있다. 도 3은 본원에서 언급한 가장 중요한 제한 절단 부위와 동정된 개방 판독 프레임의 배열을 함유하는, 상기 단편의 제한 지도를 요약 형태로 도시한 것이다.
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터의 6.8kb PstI 단편에 대한 동정된 개방 판독 프레임의 분석
ORF 아미노산 MW FastA§ 동일성% 수탁번호§
acbA 239 * MalK 이. 콜라이 29% P02914
acbB 429 45618 DgdA, 부르콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 32% P16932
acbC 355 37552 StrD, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 60% P08075
acbD 325 35341 StrE, 스트렙토마이세스 그리세우스 62% P29782
acbE 345 36549 DegA, 바실러스 서브틸리스 31% P37947
acbF 396 * MalE, 이. 콜라이 22% P02928
* 불안전한 개방판독 프레임;§Swiss-Prot 데이터베이스(release 32)
실시예 6:
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 염색체로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자 acbBCD의 결실
동정된 DNA 단편이 슈도-올리고사카라이드 생합성 유전자를 암호화한다는 증거는 다음과 같이 제시된다. 3.4kb 유전자 영역(EcoRI/SstI 단편 b, 도 3)을 에리트로마이신 내성 유전자(1.6kb)로 대체하고, 6.8kb PstI 단편(pacb1)으로부터의 DNA 영역을 플랭킹하는 것과 함께 상기 유전자를 온도-민감성 플라스미드 pGM160에 클로닝시킨다. 이러한 플라스미드를 다음에 기술된 바와 같이 작제한다: 플라스미드 pacb1로부터의 2.2kb EcoRI/HindIII 단편(c, 도 3)을 pGEM7zf[Promega, Madison, WI, USA; 플라스미드 pacb2]내로 클로닝시키고, pacb1로부터의 1kb SstI 단편(a, 도 3)을 pUC19(플라스미드 pacb3)내로 클로닝시킨다. 이어서, 다음 단편을 사용하여 결합을 수행한다. 플라스미드 pGM160[참조: Muth et al.(1989) Mol. Gen. Genet. 219:341-348]을 BamH/HindIII로 절단하고; 플라스미드 pacb2를 XbaI/BamHI로 절단하며(c, 도 3); 플라스미드 pacb3을 EcoRI/HindIII로 절단하고(a, 도 3); 플라스미드 pIJ4026[참조: Bibb et al.(1985) Gene 38:215-226]을 EcoRI/XbaI로 절단하여 1.6kb ermE 내성 유전자를 분리한다.
상기 단편들을 혼합물에서 결합하고 이. 콜라이 DH5α내로 형질전환시킨 다음, 앰피실린에 대하여 선별한다. 이로써 생성된 플라스미드, 즉 pacb4를 이. 콜라이 DH5α로부터 분리하고, 제한 분해를 통해 이의 정확성에 대해 시험한 다음, 원형질체 형질전환에 의해 에스. 글라우체센스 GLA.O내로 전이시킨다. 상기 형질전환체를 R2YENG 한천 중에서 27℃하에 티오스트렙톤으로 선별한다. 이어서, 이러한 형질전환체를 복제가 불가능한 39℃의 온도에서 배양하고 상기 플라스미드를 동종 재조합을 통해 게놈내로 통합시킨다(티오스트렙톤(25㎍/ml) 및 에리트로마이신(50㎍/ml)으로 선별). 이들 조건하에서, 성장할 수 있는 유일한 클론은 플라스미드가 게놈내로 통합되어지는 클론이다. 상응하는 클론을 분리하고, 포자 형성을 유발시키며(배지 1, 하기 참조), 에리트로마이신 함유 한천(배지 1) 상에 도말한다. 개개의 클론을 상기 플레이트로부터 다시 한번 분리하고 티오스트렙톤 함유 배지와 에리트로마이신 함유 배지 모두 위에 스트리킹한다. 에리트로마이신에 대해서는 내성이지만 티오스트렙톤에 대해서는 더 이상 내성이 아닌 클론을 분석한다. 이들 클론에서는, acbBCD 유전자가 emrE로 대체되었다. 몇몇 클론을 검사하고 균주 에스. 글라우체센스 GLA.O △acb를 추가로 조사하기 위해 참조 균주(에리트로마이신-내성, 티오스트렙톤-민감성)로서 최종적으로 선별한다.
배지 1
효모 추출물 4g/L
맥아 추출물 10g/L
글루코스 4g/L
한천 15g/L
pH 7.2
상응하는 균주가 여전히 아카르보스를 생산하는지를 검사하기 위해 추가로 실험한다. 몇몇 클론을 성장시켜 생검정에서 α-아밀라제 억제인자의 형성에 대해 조사한다. 그러나, 어떠한 활성도 발견되지 않았다. 서던 하이브리드화를 통하여 돌연변이체를 연속적으로 추가로 특징 확인한다. ermE 유전자의 통합이 예정된 부위에서 일어났다. 도 4는 야생형 및 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O △acb 결실 돌연변이체를 사용하여 수행된 서던 하이브리드화를 도시하고 있다. pacb3으로부터의 SstI 단편을 프로브로서 사용한다. 야생형과 돌연변이체로부터 염색체성 DNA를 분리하고, 효소 PstI 및 PstI/HindIII로 분해한다. 결실 돌연변이체에 대해 수득된 단편 패턴은 예정된 재조합 사건에 상응한다. 야생형은 변화되지 않은 6.8kb PstI 단편을 나타내는 반면, 돌연변이체는 1.8kb 정도가 잘려진 단편을 나타낸다(도 4의 레인 1과 3을 비교하기 바란다). ermE 내성 유전자의 통합으로 인해, 내부 HindIII 절단 부위가 PstI 단편내로 도입되었다(도 4의 레인 2와 4를 비교하기 바란다).
실시예 7:
아카르보스에 의한 α-아밀라제의 억제
전분을 검출하기 위한 효소적 시험(TC-Starch, Boehringer-Mannheim, Cat No. 297748)을 사용하여, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 분리된 화합물이 α-아밀라제를 억제한다는 것을 입증할 수 있다. 시험 원리: 전분을 아밀로글루코시다제에 의해 D-글루코스로 절단한다. 이어서, 상기 글루코스를 헥소키나제를 사용하여 글루코스-6-포스페이트로 전환시키고 이를 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제를 사용하여 D-글루코네이트-6-포스페이트로 전환시킨다. 이러한 반응으로 인해 NADPH가 생성되고, 이의 형성은 광도계를 사용하여 결정할 수 있다. 아카르보스는 α-아밀라제를 억제함으로써 D-글루코스의 형성과 궁극적으로는 NADPH의 형성을 억제한다.
실시예 8:
에스. 글라우체센스 GLA.O를 성장시키고 아카르보스를 생산하기 위한 배지
측면 배플이 장착되고 배지 2를 100ml 함유하는 500ml들이 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중의 120rpm의 오비탈 진탕기 상에서 27℃하에 발효를 수행한다. 2일 또는 3일 후에 발효를 종결한다. 슈도-올리고사카라이드를 실시예 9에 기재된 바와 같이 플레이트 확산 시험에서 검출한다. 배지 3을 사용하는 경우에는 어떠한 α-아밀라제 억제인자도 생성되지 않았다. 이는 슈도-올리고사카라이드의 생산이 글루코스에 의해 억제된다는 것을 의미한다. 말토스 및 슈크로스와 같은 기타 당, 또는 복합 당 공급원(맥아 추출물)이 에스. 글라우체센스 GLA.O를 사용하여 슈도-올리고사카라이드를 생산하는데 고려할 수도 있다.
배지 2:
콩가루 20g/L
전분 20g/L
pH 7.2
배지 3:
콩가루 20g/L
글루코스 20g/L
pH 7.2
실시예 9:
뮤코르 미하이(Mucor miehei)을 사용한 바이오테스트
균주 뮤코르 미하이의 포자 현탁액을 한천에 따라 붓고(배지 5)(105포자/ml), 이 혼합물 10ml를 각 경우에 페트리 디쉬에 붓는다. 시험용 종이 디스크(직경 6mm)에 아카르보스[lacuna] 10㎕(1mg/ml) 또는 에스. 글라우체센스 배양물로부터의 샘플을 부하하고 시험용 플레이트에 놓아둔다. 이어서, 상기 플레이트를 37℃에서 배양한다. 억제 징후가 전분 함유 배지 5에서 나타났다. 전분 대신 글루코스(배지 4)를 사용하여 제조한 플레이트를 대조군으로서 사용한다. 이러한 배지 상에서는, 활성 화합물이 부하된 필터 디스크 주변에 어떠한 억제 징후도 형성되지 않았다.
배지 4 및 5:
KH2PO4×3H2O 0.5g
MgSO4×7H2O 0.2g
NaCl 0.1g
황산암모늄 5g
효모 질소 기재 1.7g
글루코스(4) 또는 전분(5) 5g
한천 15g
실시예 10:
에스. 글라우체센스 GLA.O의 형질전환
스트렙토마이세스 글라우체센스 균주의 원형질체를 문헌[참조: Motamedi 및 Hutchinson(1987) PNAS USA 84:4445-4449]에 기재된 바와 같이 분리하고, 이와 같이 분리된 플라스미드 DNA를 문헌[참조: Hopwood et al.(1985) Genetic Manipulations of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, UK]에 기재된 바와 같이 PEG 형질전환을 통하여 세포내로 전이시킨다. 상기 원형질체를 30℃에서 R2YENG 배지 상에서 재생시킨다[참조: Motamedi 및 Hutchinson(1987) PNAS USA 84:4445-4449]. 18시간 후, 한천 플레이트에 티오스트렙톤 함유 용액을 덮고 30℃에서 배양한다(티오스트렙톤의 최종 농도: 20㎍/ml).
실시예 11:
스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터의 슈도-올리고사카라이드의 분리, HPLC 분석 및 질량 분광측정법 분리
배양 브로쓰를 여과에 의해 마이셀륨으로부터 분리시킨다. 이어서, 이러한 방식으로 수득된 배양 여액을 XAD16 칼럼 위에 부하한 후, 상기 칼럼을 물로 세척하고 활성 성분을 30% 메탄올로 용출시킨다. 이러한 용출물을 수성 상 아래로 농축시키고 후자를 에틸 아세테이트로 추출하여 친지성 불순물을 제거한다. 이어서, 수성 상을 농축시키고 활성 성분을 바이오겔(biogel) P2 칼럼을 사용하여 5% 메탄올 중에서 추가로 정제한다. 개개의 분획을 분획 수집기에 수집한다. 뮤코르 미하이 바이오테스트를 사용하여 개개의 분획을 분석한다. 활성 용출액을 추가로 정제하기 위하여 바이오겔 P2 상의 5% 메탄올 중에서 재크로마토그래피한다. 이러한 방식으로 분리된 물질을 HPLC 및 MS에 의해 조사한다.
HPLC
칼럼: NucleosilR100C-18
용출제: 0.1% 인산 = A/아세토니트릴=B
구배: 15분내에 0에서 100% B
검출: 215nm
유량: 2ml/min
주입 용적: 10 내지 20㎕
HPLC를 사용하여, 에스. 글라우체센스 GLA.O로부터의 슈도-올리고사카라이드 제제와 본래의 아카르보스를 구별하는 것은 가능하지 않았다. 두 성분의 보유 시간과 UV 흡광 스펙트럼 모두가 상기 용출제 시스템에서 동일하였다. 슈도-올리고사카라이드 혼합물은 이들 조건하에서 분획화되지 않았다.
질량 분광측정 분석(MS)
본래의 아카르보스와 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 분리된 슈도-올리고사카라이드의 분자량과 단편화 패턴을 전기분무 MS에 의해 결정한다. 바이엘(Bayer: Glucobay)로부터 시판되고 있는 아카르보스를 분석한 결과, 645.5(아카르보스)에서 질량 피크를 나타내었다. 에스. 글라우체센스 GLA.O로부터의 정제된 샘플은 상이한 슈도-올리고사카라이드의 혼합물을 함유하며, 이들의 당 측쇄는 상이한 길이, 즉 969(아카르보스 + 2 글루코스 단위), 807(아카르보스 + 1 글루코스 단위), 645(본래의 아카르보스에 상응함)이다. 에스. 글라우체센스 GLA.O로부터 분리되고 분자량이 645인 화합물과 아카르보스를 단편화하는 경우, 동일한 분자 단편, 즉 145(4-아미노-4,6-데옥시글루코스), 303(아카르비오신) 및 465(하나의 글루코스 단위를 함께 갖는 303)이 형성된다.
악티노플라네스 종 SE50도 또한 상이한 길이의 당 측쇄를 갖는 아카르보스 분자의 혼합물을 생산한다[참조: Truscheit(1984) Ⅷth International Symposium on Medicinal Chemistry, Proc. Vol. 1. Swedish Academy of Pharmaceutical Sciences, Stockholm, Sweden]. 당 측쇄의 길이는 발효 파라미터와 영양 용액내의 기질 선택에 의해 영향을 받을 수 있다.
실시예 12:
악티노플라네스 종 SE50/110(ATCC 31044)를 사용한 서던 하이브리드화
염색체성 DNA를 균주 악티노플라네스 종 SE50/110로부터 분리하고 제한 효소(PstI 및 BamHI)로 분해한다. 이어서, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터의 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제 acbD의 암호화 영역을 포괄하는 프로브를 사용하여 서던 하이브리드화를 수행한다(단편 d, 도 3). 상기 프로브는 악티노플라네스 종 SE50/110으로부터의 별개의 밴드와 하이브리드화한다(도 5, 레인 1 및 2). 이는 악티노플라네스 종 SE50/110과 기타 균주주로부터 상응하는 단편을 분리할 수 있다는 가능성을 제공해준다. 이들 DNA 영역이 실제로 아카르보스의 생합성에 관련되는지의 여부는 계속되는 연구에서 입증해야할 문제로 여전히 남아 있다. 또 다르게는, PCR 프라이머 1 및 2(표 1)를 악티노플라네스 종으로부터 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제를 증폭시키는데 사용할 수도 있다.
주:
도 1은 에스. 글라우체센스 GLA.O를 사용한 서던 하이브리드화를 도시한 것이다. 레인 1: PstI, 레인 2: BamHI, 레인 3: BglII. 표지된 PCR 단편 HstrE*를 프로브로서 사용한다. 하이드록시스트렙토마이신의 생합성에 관련된 DNA 단편을 표지한다.
도 2는 에스. 글라우체센스 GLA.O를 사용한 서던 하이브리드화를 도시한 것이다. 레인 1: PstI, 레인 2: BamHI, 레인 3: BglII. 표지된 PCR 단편 acbD*를 프로브로서 사용한다. 슈도-올리고사카라이드의 생합성에 관련된 DNA 단편을 표지한다.
도 3은 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터의 6.8kb PstI 단편의 제한 지도를 도시한 것이다. 개방 판독 프레임과 각각이 전사되는 방향이 화살표로 지시된다. 단편 a, b, c 및 d는 본 명세서에서 보다 상세히 설명되는 DNA 영역과 동일하다.
도 4는 스트렙토마이세스 글라우체센스 △acb를 사용한 서던 하이브리드화를 도시한 것이다. 레인 1: PstI, 레인 2: PstI/HindIII 및 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 레인 3: PstI, 레인 4: PstI/HindIII. 표지된 1.0kb SstI 단편 a(도 3)을 프로브로서 사용한다.
도 5는 악티노플라네스 종 SE50/100을 사용한 서던 하이브리드화를 도시한 것이다. 레인 1: PstI, 레인 2: BamHI 및 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 레인 3: PstI. 표지된 1.0kb SmaI/EcoRI 단편 d(dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제, 도 3)를 프로브로서 사용한다. 화살표는 표지된 DNA 단편을 지시한다(BamHI: 2.1 및 0.7kb, PstI: ∼11 내지 12kb).
표 4는 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터의 6.8kb PstI 단편의 DNA 서열(서열 7)을 나타낸 것이다. 동정된 개방 판독 프레임의 추론된 아미노산 서열(서열 8 내지 13)이 DNA 서열로 제시된다. 출발 및 종결 코돈과 잠재적 리보솜 결합 부위가 밑줄쳐 있다.
acbA: 서열 8
acbB: 서열 9
acbC: 서열 10
acbD: 서열 11
acbE: 서열 12
acbF: 서열 13
서열 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인:
(A) 성명: 훽스트 아크티엔게젤샤프트
(B) 거리:
(C) 시: 프랑크푸르트
(D) 주: -
(E) 국가: 독일
(F) 우편번호: 65926
(G) 전화: 069-305-3005
(H) 팩스: 069-35-7175
(I) 텔렉스: -
(ii) 발명의 명칭: 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O로부터 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자의 분리 방법 및 이의 용도
(iii) 서열수: 13
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25(EPO)
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 22개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(ix) 특성:
(A) 명칭/키(key): 엑손
(B) 존재 위치: 1..22
(xi) 서열 기술:
CSGGSGSSGC SGGSTTCATS GG 22
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 24개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 엑손
(B) 존재 위치: 1..24
(xi) 서열 기술:
GGGWVCTGGY VSGGSCCGTA GTTG 24
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 546개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 엑손
(B) 존재 위치: 1..546
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 541개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 엑손
(B) 존재 위치: 1..541
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 180개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: PCRstrE.Pep
(B) 존재 위치: 1..180
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 181개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: PCRabcD.Pep
(B) 존재 위치: 1..181
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 6854개 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: DNA(게놈)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: "아카르보스" 생합성 유전자 집락
(B) 존재 위치: 1..6854
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 240개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: abcA
(B) 존재 위치: 1..240
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 429개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: abcB
(B) 존재 위치: 1..429
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 355개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: abcC
(B) 존재 위치: 1..355
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 325개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: abcD
(B) 존재 위치: 1..325
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 345개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: abcE
(B) 존재 위치: 1..345
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징
(A) 길이: 393개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: abcF
(B) 존재 위치: 1..393
(xi) 서열 기술:

Claims (48)

  1. 아카르보스 생합성용 유전자를 포함하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드 생합성용 유전자를 포함하는 DNA 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자가 도 3에 도시된 바와 같이, 이의 전사 방향 및 순서로 배열됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 도 3에 도시된 바와 같은 제한 효소 절단 부위 패턴을 나타냄을 특징으로 하는 DNA 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 표 4에 따른 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나;
    (b) 엄격한 조건하에서 (a)에 따른 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함하거나;
    (c) 유전자 암호의 변성으로 인해 (a) 및 (b)에 따른 DNA 분자와는 상이하지만 (a) 및 (b)에 따른 DNA 분자를 사용하여 상응하게 발현될 수 있는 단백질의 발현을 가능하게 하는 DNA 서열 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, (a)에서 언급한 서열로서 표 4에 따른 뉴클레오티드 1 내지 720의 DNA 서열(acbA 유전자) 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  7. 제5항에 있어서, (a)에서 언급한 서열로서 표 4에 따른 뉴클레오티드 720 내지 2006의 DNA 서열(acbB 유전자) 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  8. 제5항에 있어서, (a)에서 언급한 서열로서 표 4에 따른 뉴클레오티드 2268 내지 3332의 DNA 서열(acbC 유전자) 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  9. 제5항에 있어서, (a)에서 언급한 서열로서 표 4에 따른 뉴클레오티드 3332 내지 4306의 DNA 서열(acbD 유전자) 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  10. 제5항에 있어서, (a)에서 언급한 서열로서 표 4에 따른 뉴클레오티드 4380 내지 5414의 DNA 서열(acbE 유전자) 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  11. 제5항에 있어서, (a)에서 언급한 서열로서 표 4에 따른 뉴클레오티드 5676 내지 6854의 DNA 서열(acbF 유전자) 또는 이의 일부를 포함함을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
  12. 제5항에 따른 DNA 분자의 PCR 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  13. 제12항에 있어서, 표 1에 따른 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머.
  14. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 아카르보스-생산 미생물에서 천연 아카르보스 생합성 유전자를 제거하거나 변형시키기 위한 방법에 사용하기 위한 벡터.
  16. 제15항에 있어서, pGM160 및 관련된 벡터로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 벡터.
  17. 제14항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터이고 상기 DNA 분자가 프로모터 서열에 작동적으로 결합됨을 특징으로 하는 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 악티노플라네스(Actinoplanes), 암풀라리엘라(Ampullariella) 및 스트렙토스포란쥼(Sterptosporangium) 균주, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스(Streptomyces hygroscopicus var. limoneus) 및 스트렙토마이세스 글라우체센스(Streptomyces glaucescens) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 페니실륨 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 숙주 유기체에서 발현시키기에 적합한 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 또는 악티노플라네스 종에서 발현시키기에 적합한 벡터.
  20. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자 또는 제14항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환되는 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 또는 스트렙토스포란쥼 균주, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스 또는 스트렙토마이세스 글라우체센스, 및 아스퍼질러스 나이거, 페니실륨 크리소게눔 및 사카로마이세스 세레비지애로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따른 유전자 집락의 유전자를 발현시킴으로써 수득될 수 있는 단백질 혼합물.
  24. 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 유전자를 발현시킴으로써 수득될 수 있는 분리된 단백질.
  25. 제6항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질(acbA 유전자 생성물).
  26. 제7항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질(acbB 유전자 생성물).
  27. 제8항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질(acbC 유전자 생성물).
  28. 제9항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질(acbD 유전자 생성물).
  29. 제10항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질(acbE 유전자 생성물).
  30. 제11항에 따른 DNA에 의해 암호화되는 단백질(acbF 유전자 생성물).
  31. (a) 단백질을 적합한 숙주 세포에서 발현시킨 다음,
    (b) 분리시킴으로 특징으로 하여, 제23항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 따른 단백질을 수득하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 또는 스트렙토스포란쥼 균주, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스 또는 스트렙토마이세스 글라우체센스, 및 아스퍼질러스 나이거, 페니실륨 크리소게눔 및 사카로마이세스 세레비지애로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 숙주 세포가 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  34. (a) 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전자를 적합한 숙주 세포에서의 발현에 사용하고,
    (b) 상기 숙주 세포의 배양 상등액으로부터 아카르보스를 분리시킴으로 특징으로 하여, 아카르보스를 제조하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 제21항 또는 제22항에 따른 숙주 세포가 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  36. (a) 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전자를 천연의 아카르보스-생산 숙주 세포에서 제거하고,
    (b) 상기 숙주 세포로부터 아카르보스를 분리시킴으로 특징으로 하여, 아카르보스를 제조하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제22항에 따른 숙주 세포가 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제34항 또는 제35항에 따른 방법을 제36항 또는 제37항에 따른 방법과 조합함을 특징으로 하는, 아카르보스의 제조 방법.
  39. (a) 제5항에 따른 DNA 분자로부터 유도되는 하이브리드화 프로브를 사용한 하이브리드화 방법에 의해 인접한 게놈성 DNA 영역을 분리시키고,
    (b) 이를 서열화함을 특징으로 하여, 제5항에 따른 아카르보스를 생합성하기 위해 유전자 집락을 완전한 것으로 만드는 방법.
  40. (a) 제5항에 따른 DNA 분자로부터의 DNA 서열로부터 유도되는 PCR 프라이머 및 사용된 벡터 시스템의 서열에 대해 하이브리드화를 가능하게 하는 특정 서열을 보유하는 프라이머를 사용한 PCR을 통해 인접한 게놈성 DNA 영역을 분리시키고,
    (b) 이를 서열화함을 특징으로 하여, 제5항에 따른 아카르보스를 생합성하기 위해 유전자 집락을 완전한 것으로 만드는 방법.
  41. 제5항에 따른 재조합 DNA 분자에 기인하여,
    (a) 하이브리드화 프로브를 제조하고,
    (b) 이들 하이브리드화 프로브를 상응하는 미생물로부터 수득된 DNA 라이브러리의 게놈성 또는 cDNA 스크리닝에 사용하며,
    (c) 발견되는 클론을 분리한 다음, 이를 특성화함을 특징으로 하여, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 아카르보스-생산 미생물로부터 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 유전자 집락을 분리하는 방법.
  42. 제5항에 따른 재조합 DNA 분자에 기인하여,
    (a) PCR 프라이머를 제조하고,
    (b) 이들 PCR 프라이머를 사용하여 상응하는 미생물로부터 게놈성 DNA 또는 cDNA의 DNA 단편을 축적시키며,
    (c) 이와 같이 축적된 단편들을 분리시킨 다음, 이를 특성화하고,
    (d) 경우에 따라, 제41항에 따른 방법에 사용함을 특징으로 하여, 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 이외의 아카르보스-생산 미생물로부터 아카르보스 및 동종 슈도-올리고사카라이드를 생합성하기 위한 유전자 집락을 분리하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 미생물이 악티노마이세탈레스(Actinomycetales), 스트렙토마이세스, 악티노플라네스, 암풀라리엘라 및 스트렙토스포란쥼 균주, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변종 리모네우스 및 스트렙토마이세스 글라우체센스로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 미생물이 특히 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O 및 악티노플라네스 종으로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  45. 아카르보스를 수득하기 위한 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 용도.
  46. 보다 풍부한 아카르보스 생산을 가능하게 하는 균주의 돌연변이체를 제조하기 위한 스트렙토마이세스 글라우체센스 GLA.O의 용도.
  47. a) 돌연변이를 각각의 유전자 프로모터 중의 하나 이상에 도입하고,
    b) 이로써 생성된 생산자 균주의 아카르보스 수율을 출발 균주의 것과 비교함을 포함하여, 아카르보스 수율을 증진시키기 위하여 내인성 아카르보스 생합성 유전자의 유전자 발현을 변형시키는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 돌연변이가,
    a) 전이
    b) 결실 및/또는
    c) 부가임을 특징으로 하는 방법.
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