KR100552913B1 - 대장균 및／또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합플라스미드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균 및/또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합 플라스미드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 렌티모브스 WJ5 균주로부터 유래하며 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 pWBL5 플라스미드 및 이를 이용하여 제조되며 대장균 및/또는 바실러스에서 상호 복제가 가능한 재조합 플라스미드에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 대장균 유래 유전자의 도입 없이도 대장균 및 바실러스에서 복제가 가능하다는 장점을 가지며, 따라서 대장균 및 바실러스에서 다양한 외래 유전자들을 클로닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

대장균 및／또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합 플라스미드{Recombinant plasmid capable of replication in E.coli and/or Bacillus sp.}

도 1은 제한효소 KpnⅠ(unique site)를 처리한 플라스미드 pWBL5(linear form)의 아가로스-겔 전기영동(agarose-gel electrophoresis) 결과를 보여주는 사진이고,

도 2는 플라스미드 pWBL5의 개략적인 제한효소 지도이고,

도 3은 플라스미드 pWBL5로부터 대장균에서 복제 가능한 재조합 플라스미드 pWBL5KM을 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고,

도 4는 재조합 플라스미드 pWBL5KM의 전기영동 결과를 보여주는 사진이고,

도 5는 플라스미드 pWBL5로부터 대장균과 바실러스에서 상호 복제 가능한 재조합 플라스미드 pWBL5EBS를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고,

도 6은 재조합 플라스미드 pWBL5EBS의 전기영동 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 대장균 및/또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합 플라스미드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 렌티모브스 WJ5 균주로부터 유래하며 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 pWBL5 플라스미드 및 이를 이용하여 제조되며 대장균 및/또는 바실러스에서 상호 복제가 가능한 재조합 플라스미드에 관한 것이다.

환경 보호와 생태계 보전에 대한 국제적 관심이 고조되면서 과다한 농약의 남용은 심각한 국제적 문제로 대두되고 있으며, 이를 대체하고 농산물 증산에 이용할 수 있는 생물농약의 개발이 중요 분야로 등장하고 있다. 이러한 과제를 성공적으로 수행하기 위해서는 농약성 미생물의 탐색, 생리 생화학적 특성 구명, 활성물질의 구조 분석, 관련 유전자의 확인ㆍ분리 및 재조합 유전자 도입에 의한 형질전환체의 개발, 활성물질의 변형 및 유도체 합성, 환경보전 능력 실험 및 포장 실험 등이 필수적이다. 이중에서도 클로닝 벡터의 개발은 농약성 물질의 생산을 증가시키는 등 생물농약 개발의 근간이 되고 있다.

현재, 바실러스 속 균주들은 유용물질의 산업적 생산을 위한 유전자 재조합 숙주균으로 활발히 이용되고 있으며, 생물농약의 생산에도 크게 이용될 것으로 생각된다. 재조합 유전자를 바실러스에서 안정하게 발현시키기 위해서 널리 사용되고 있는 유전자 운반체로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphyllococcus aureus)에서 유래한 항생제 내성 플라스미드로부터 개발된 것들이 많으며, 대표적인 것들로 pUB110(Lacey, R. W. et al., J. Med. Microbiol. 7:285-297, 1974) 및 pC194 플라스미드(Ehrlich, S. D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:1680-1682, 1977)가 잘 알려져 있다.

일반적으로, 그람 양성 세균에서는 테타 복제(theta-replication)보다는 롤링 써클 복제(rolling circle replication)가 플라스미드를 더 안정하게 숙주균에서 유지시키는 것으로 알려져 있다(Gloria, del S. et al., Microbiol. Mol. Bio. Rev. 62:434-464, 1998). 이와 같이 벡터가 숙주세포에서 안정하게 유지되기 위해서는 복제와 분배가 잘 이루어져야 하는데, 다른 종의 균주로부터 유래한 플라스미드는 바실러스 속 균주에서 복제와 분배가 제대로 일어나지 않아 플라스미드를 불안정화시킨다. 이러한 이유에서 좀 더 안정한 바실러스용 벡터를 개발하기 위하여, 바실러스 속 균주의 내재형 플라스미드를 이용한 셔틀벡터의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 속 균주로부터 신규한 pWBL5 플라스미드를 분리하였으며, 이를 이용하여 대장균 및/또는 바실러스 속 균주에서 상호 복제가 가능한 재조합 플라스미드를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 유래 신규 플라스미드 및 이로부터 제조되며 대장균 및/또는 바실러스에서 상호 복제가 가능한 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 렌티모브스 WJ5로부터 유래되며 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 pWBL5 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드의 일부 또는 전체와 선별 유전자를 포함하며, 대장균 및/또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합 플라스미드를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 렌티모브스 WJ5로부터 유래되며 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 pWBL5 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 플라스미드는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며, 도 2로 표시되는 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하고 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 렌티모브스 WJ5로부터 분리되었다.

상기에서, 바실러스 렌티모브스 WJ5 균주는 해안의 폐그물로부터 분리된 것으로, 병원성 진균에 대해 특이적으로 항진균 활성을 가지고 있으며, 살균제, 살충 제, 제초제와 같은 농약에 대해 뛰어난 저항성을 가지는 미생물이다. 상기 미생물을 순수 배양하여 그람염색(Gram stain)을 수행하고, 세포의 지방산 구성 분석과 데이터베이스를 이용하여 동정하였으며, 생화학적 특성을 파악하여 동정 결과를 보완하였다(표 1 및 표 2 참조). 그 결과, 본 발명자들은 상기 미생물을 바실러스 속 렌티모브스 균주로 판정하여 "바실러스 렌티모브스 WJ5"라 명명하였으며, 2002년 11월 19일자로 한국 미생물 보존 센터에 기탁하였다(수탁번호: KFCC-11316).

본 발명의 신규한 플라스미드 pWBL5는 그 크기가 17,535 bp이고, G+C 함량은 45.0%로 나타났다. 염기서열을 ABI 프리즘 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems, USA)로 분석한 결과, 발현이 예상되는 14개의 ORF(open reading frame)를 확인하였으며, 이들을 각각 ORF 1 내지 ORF 14로 명명하였다. 이 중 ORF 2와 ORF 4는 각각 178개와 343개의 아미노산 잔기로 구성되며, 부위 특이적 복제효소(site-specific recombinase) XerD의 보존된 도메인(conserved domain)과 높은 서열 상동성을 나타내었으며, 각 ORF의 10-15 bp 상부에 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)로 예상되는 TCCT 서열이 존재하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드의 일부 또는 전체와 선별 유전자를 포함하며, 대장균 및/또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합 플라스미드를 제공한다.

상기에서, 선별 유전자는 암피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 스트랩토마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 에리트로마이 신 저항성 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 대장균 및/또는 바실러스에서 복제 가능한 재조합 플라스미드는 플라스미드 pWBL5와 pBluescript SK(+), mini-TnKm, pJH101, pKT210, pUC19, 및 pBR322로 구성된 군으로부터 선택되는 대장균 유래 형질전환용 벡터에 각각 제한효소 처리 및/또는 PCR하여 제한효소 처리 후 절단된 절편들을 서로 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 플라스미드 pWBL5와 pBluescript SK(+) 벡터에 각각 제한효소 PstⅠ을 처리하여 절단한 후 절단된 절편들을 서로 접합시킴으로써 재조합 플라스미드를 제조하였다. 상기 재조합 플라스미드는 도 5의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하며, pWBL5EBS 플라스미드라 명명하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 신규 내재형 플라스미드를 가지는 항진균 활성 세균의 분리

먼저 항진균 활성을 가지는 새로운 미생물을 탐색하기 위하여 수집한 시료로부터 NA 배지(nutrient agar medium, Difco) 및 PDA 배지(potato dextrose agar medium)를 이용하여 희석평판법으로 100여 균주를 분리하였으며, 이 중 항진균 활 성이 뛰어난 균주들을 분리하였다. 상기 분리된 균주를 이용하여 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 활성 테스트를 통하여 활성 균주를 일차 선발하고, 선발된 균주를 이용하여 식물 병원성 균에 대한 항진균 활성 테스트를 실시함으로써 10여 개의 항진균 활성 균주를 선발하였다. 상기 항진균 활성 균주를 대상으로 내재형 플라스미드가 포함되었는지 확인하고자 빔보임 등(Bimboim, H. C. et al., Nucleic Acids Res. 7:1513-1523, 1982)의 방법을 변형하여 플라스미드를 분리하였으며, 이를 아가로즈-겔에서 전기영동하여 플라스미드를 포함하는 한 종의 균주를 선별하였다.

선별된 균주를 순수배양하여 그람 염색(Gram stain)을 수행하고, MIDI 시스템을 이용한 FAME(fatty acid methyl esters) 분석, 생화학적 특성을 파악하기 위한 API CH 분석 및 16S rDNA 분석을 수행하였다. 구체적으로, 그람염색은 슬라이드 글라스에 액체 배양된 세균액을 떨어뜨린 다음 넓게 펴서 알코올 램프를 이용하여 건조키시고, 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하고 세척한 후 요오드 용액으로 매염시키고 세척하였다. 상기 슬라이드 글라스를 알콜로 탈색시키고 세척한 다음 사프라닌액으로 대조염색한 후 현미경으로 색을 관찰하였다(Beveridge, T. J. et al., J. Bacteriol. 156:846-858, 1983).

생화학적 특성을 파악하기 위한 API CHB 분석은 API 50 CHB 동정 키트(bioMerieux, USA)를 이용하여 분석하였으며, 순수 분리된 균체를 배지에 풀어 균액을 만든 후 49 가지의 스트립에 분주하고 배양하면 배양기간 동안 발효된 탄수화물이 산을 생성하고 pH를 떨어뜨린다. 배지에는 pH 인디케이터가 들어있어서 색 의 변화로 양성/음성을 판독할 수 있다(Wong, J. D. et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15:109-113, 1992).

또한, MIDI 시스템을 이용한 FAME(fatty acid methyl esters) 분석은 표준조건에서 세균을 배양한 후, 50∼100 mg의 균체를 tube에 모으고 이 균체를 용액 Ⅰ(NaOH 45 g, MeOH 150 ml, deionized distilled water 150 ml) 및 용액 Ⅱ(6 N HCl 325 ml, MeOH 275 ml)를 사용하여 saponification, methylation시킨 후, 용액 Ⅲ(Hexane/Methyl tert-Butyl Ether(1/1))으로 Fatty Acid Methyl Ester(FAME)를 추출하였다. 상기 추출액을 GC(Gas Chromatography)로 분석을 용이하게 하기 위해 용액 Ⅳ(NaOH 10.8 g, ddw 900 ml)로 세척한 후 GC로 분석하였다. 이어서 Sherlock 소프트웨어를 이용하여 GC에서 분석된 크로마토그램과 데이터를 정성 및 정량 분석하여 이를 라이브러리와 대조하여 SI(Similarity Index) 값으로 표시하여 동정하였다(Sonesson, L. L. et al., J. Chromatogr. 417:366-370, 1987).

또한, RDP(Ribosomal Database Project)에서 제공하는 16S rDNA 데이터베이스는 계통분류학적 관점에서 비교가 가능하도록 정리되어 있으므로, 특정 군집을 연구하기 위한 PCR 프라이머의 설계가 가능하다. 상기로부터 설계된 PCR 프라이머를 이용하여 16S rDNA유전자를 증폭하고 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다. 상기에서 확인된 염기서열을 CLUSTAL W를 이용하여 데이터베이스의 정보와 비교 분석함으로써 군집 구성원의 계통분류학적 위치를 판단하였다(Thompson, J. D. et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680, 1994).

그 결과, 상기에서 선별된 균주는 그람 양성균으로서 하기 표 1 및 표 2의 생화학적 특성을 가지며 바실러스 렌티모브스 종에 속하는 균주로 동정되었다.

본 발명자들은 상기 균주를 바실러스 렌티모브스 WJ5 균주로 명명하고 2002년 11월 19일부로 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KFCC-11316).

세포 지방산 분석

지방산	함량(%)
C13:0 ISO	0.28
C14:0 ISO	1.24
C14:0	1.47
C15:0 ISO	21.92
C15:0 ANTEISO	38.20
C15:0	0.68
C16:0 ISO	3.24
C16:1 w11c	0.86
C16:0	11.67
ISO C17:1 w10c	0.38
C17:0 ISO	9.82
C17:0 ANTEISO	9.07
C18:3 w6c (6,9,12)	0.82
C18:0	0.35

탄수화물 발효 분석

탄수화물	바실러스 렌티모브스 WJ5	탄수화물	바실러스 렌티모브스 WJ5
대조군	-	에스쿨린드롤리시스	-
글리세롤	+	살리신	+
에리트리톨	-	셀로비오스	+
D-아라비노스	-	말토즈	+
L-아라비노스	+	락토즈	+
리보스	+	멜리비오스	+
D-자일로스	+	수크로즈	+
L-자일로스	-	트레할로스	+
아도니톨	-	이뉼린	-
β-메틸-D-질로사이드	-	멜레지토스	-
갈락토스	-	라피노스	+
글루코스	+	스타치	+
프룩토스	+	글리코겐	+
만노스	+	자일리톨	-
소보스	-	젠티오비오스	-
람노스	-	D-튜라노스	-
듈시톨	-	D-라이조스	-
이노시톨	+	D-타가토스	-
만니톨	+	D-퓨코스	-
솔비톨	-	L-퓨코스	-
α-메틸-D-만노시드	-	D-아라비톨	-
α-메틸-D-글루코시드	+	L-아라비톨	-
N-아세틸-글루코사민	-	글루코네이트	-
아미그달린	-	2-케토-글루코네이트	-
아뷰틴	+	5-케토-글루코네이트	-

+: 발효, -: 비발효

<실시예 2> 바실러스 렌티모브스 WJ5로부터 pWBL5 플라스미드의 분리 및 정제

상기 실시예 1에서 분리, 동정된 바실러스 렌티모브스 WJ5로부터 빔보임 등 (Bimboim, H. C. et al., Nucleic Acids Res. 7:1513-1523, 1982)의 방법을 변형하여 플라스미드 pWBL5를 분리하였다. 구체적으로, 바실러스 렌티모브스 WJ5를 NB 배지(nutrient broth medium, Difco)를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 후 라이소자임 칵테일(lysozyme cocktail: 10 ㎎/㎖ lysozyme, 5 mM sucrose, 25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 첨가하고 25℃에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응물에 알카라인 용해 완충액(alkaline lysis buffer: 0.2 N NaOH, 1% SDS)를 첨가하여 세포를 용해한 후, 즉시 중화제(3 M sodium acetate, pH 4.8)를 첨가하고 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이어, 상등액을 회수하고 0.7배 부피의 에탄올을 첨가하여 잘 혼합하였다. 상기 혼합액을 영하 20℃에서 1시간 동안 정치한 후 15,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 멸균 증류수에 녹였다. 상기 용액에 동일 부피의 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)을 첨가하여 잘 섞은 후 원심분리하였으며 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 0.7배 부피의 에탄올 및 0.1배 부피의 3 M 소디움 아세테이트(sodium acetate)를 첨가하고 잘 섞은 후, 영하 20℃에 1시간 동안 정치한 후 원심분리하여 정제된 플라스미드를 분리하였다. 상기 분리한 플라스미드를 제한효소 KpnⅠ으로 처리하고 아가로스-겔에서 전기영동 하였다.

그 결과, 약 18 kb 크기의 플라스미드 밴드를 확인하였다(도 1).

<실시예 3> 신규 플라스미드 pWBL5의 분석

상기 실시예 2에서 분리 정제한 플라스미드 pWBL5의 전체 염기서열을 결정하기 위하여, 샷건(shotgun)법으로 플라스미드를 약 1 kb 정도로 조각낸 후 이를 형질전환시켜 48개의 클론(clone)을 확보하였으며, 이들의 염기서열을 ABI 프리즘 3700 DNA 분석기(Applied Biosystems, USA)로 결정하였다. 각각의 독립된 약 1 kb 정도 길이의 결정된 염기서열들을 조립(assembly)하기 위하여 콘티그 소프트웨어(contig software, Smallsoft Co.)를 이용하여 콘티그(contig)를 만들었으며, 갭(gap)을 보충하기 위하여 양쪽 말단의 서열을 프라이머로 이용하여 이들을 서열분석하는 방법으로 플라스미드의 전체 염기서열을 결정하고 분석하였다. 또한, 제한효소 EcoRⅠ, KpnⅠ, MluⅠ으로 처리하여 제한효소 지도를 작성하여 그 염기서열 분석 결과를 확인하였다.

그 결과, 상기 결정된 플라스미드 pWBL5의 염기서열을 서열번호 1에 기재하였으며, 그 크기는 17,535 bp이고 G+C 함량은 45.0%로 나타났다. 또한, 발현이 예상되는 ORFs가 존재하였으며, 이들을 각각 ORF 1 내지 ORF 14로 명명하였다. 이 중 ORF 2와 ORF 4는 각각 178개와 343개의 아미노산 잔기로 구성되며, 부위 특이적 복제효소 XerD(COG4974, NCBI)의 보존된 도메인과 높은 서열 상동성을 나타내었다. 또한, 각 ORF의 10-15 bp 상부에 라이보좀 결합부위(RBS)로 예상되는 TCCT 서열이 존재하는 것을 확인하였다.

<실시예 4> 플라스미드 pWBL5로부터 대장균에서 복제 가능한 바실러스 유래 재조합 플라스미드 pWBL5KM의 제작

상기 플라스미드 pWBL5로부터 대장균에서 복제 가능한 바실러스 유래 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여, 상기 플라스미드에 대장균에서 복제 가능한 복제기점(origin)이 존재하는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 카나마이신 저항성 유전자를 가지는 mini-Tn5Km(Lorenzo et al., J. Bacteriol. 172:6568-6572, 1990) 벡터를 제한효소 BamHⅠ으로 절단한 후 제한효소 Sau3AⅠ으로 절단한 pWBL5와 접합(ligation)시키고, 이를 대장균 XL1-Blue 균주에 형질전환하여 카나마이신을 포함하는 고체 배지에서 선별하였다.

그 결과, 카나마이신 배지에서 생존하는 대장균이 있음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 플라스미드 pWBL5 내에 대장균에서 복제 가능한 복제기점이 존재하는 것을 확인하였으며, 생존한 대장균 콜로니(colony)로부터 상기 실시예 2의 방법에 따라 플라스미드를 분리, 정제하여 약 10 kb 크기의 플라스미드를 확보하였고, 이를 pWBL5KM라 명명하였다(도 3). 도 3에 나타낸 바와 같이, 대장균에서 복제 가능한 바실러스 유래 재조합 플라스미드 pWBL5KM은 pWBL5에서 유래한 염기서열 및 mini-Tn5Km에서 유래한 카나마이신 저항성 유전자를 포함하고 있었으며, 그 크기는 약 10 kb이었다(도 4). 상기 벡터는 20회 이상의 세포분열 후에도 세포 내에서 유지되는 높은 안정성을 나타내었다.

<실시예 5> 플라스미드 pWBL5로부터 대장균과 바실러스 렌티모브스에서 상호 복제 가능한 재조합 플라스미드 pWBL5EBS의 제작

상기 플라스미드 pWBL5로부터 대장균 및 바실러스에서 상호 복제 가능한 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여, 암피실린 저항성 유전자를 가지는 대장균 형질전환용 벡터 pBluescript SK(+)(Stratagene, USA)를 주형으로 하고 PstⅠ 어댑터(adaptor)를 가지는 프라이머를 이용하여 암피실린 저항성 유전자를 PCR 증 폭한 후 제한효소 PstⅠ으로 절단하고, 상기 실시예 2에서 분리하여 제한효소 PstⅠ으로 절단한 pWBL5와 접합(ligation)시켜 재조합 플라스미드 pWBL5EBS를 제조하였다(도 5). 상기 제조된 재조합 플라스미드 pWBL5EBS를 실제로 바실러스 및 대장균에 형질전환하기 위하여, E.coli XL1-Blue 균주와 B. lentimorbus WJ5 균주를 각각 LB(Luria-Bertani broth, Difco) 배지 및 NB(nutrient broth, Difco) 배지에서 배양한 후 10% 글리세롤과 포타슘 일렉트로포레이션 완중액(PEB; 272 mM sucrose, 1 mM MgCl₂, 7 mM KH₂PO₄)으로 3회 세척하고, 10% 글리세롤 및 포타슘 일렉트로포레이션 완중액에 분주하여 일렉트로 컴피턴트 세포로 사용하였다. 1 ㎍의 재조합 플라스미드 pWBL5EBS를 각각 90 ㎕ 일렉트로 컴피턴트 세포와 섞어 전지천공법(E. coli: 25 ㎌, 200 Ω, 25 kV/㎝; B. lentimorbus: 25 ㎌, 200 Ω, 10 kV/㎝)으로 형질전환하였다(Xue, G. P. et al. J. Microbiol. Methods 34:183-191, 1999). 이어서 각각 900 ㎕의 LB 배지와 NB 배지를 첨가하여 30℃에서 1시간 동안 배양하고 50 ㎍/㎖의 암피실린이 첨가된 배지에 도말하여 형질전환체를 선발하였다.

그 결과, 상기 제조한 재조합 플라스미드 pWBL5EBS는 pWBL5에서 유래한 서열 1로 표시되는 염기서열 및 pBluescript SK(+)에서 유래한 암피실린 저항성 유전자를 포함하고 있었으며, 그 크기는 약 18.5 kb임을 확인하였다(도 6). 또한, 상기 재조합 플라스미드는 20회 이상의 세포분열 후에도 세포 내에서 유지되는 높은 안정성을 나타내었다. 상기 결과들로부터 본 발명의 재조합 플라스미드 pWBL5EBS가 바실러스 및 대장균 내에서 모두 복제가능함을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 플라스미드는 항진균 활성을 가지는 바실러스로부터 유래되었으며 대장균 유래 유전자의 도입 없이 대장균 및 바실러스에서 복제가 가능하다는 장점을 가지고, 따라서 대장균 및 바실러스에서 다양한 외래 유전자들을 클로닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Recombinant plasmid capable of replication in E.coli and/or Bacillus sp. <130> 3p-08-20 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17535 <212> DNA <213> Bacillus lentimorbus <220> <221> misc_feature <222> (382)..(717) <223> ORF1 <220> <221> misc_feature <222> (2378)..(2914) <223> ORF2 <220> <221> misc_feature <222> (3116)..(3832) <223> ORF3 <220> <221> misc_feature <222> (3991)..(5032) <223> ORF4 <220> <221> misc_feature <222> (5943)..(8198) <223> ORF5 <220> <221> misc_feature <222> (8444)..(9055) <223> ORF6 <220> <221> misc_feature <222> (9349)..(10056) <223> ORF7 <220> <221> misc_feature <222> (10093)..(10746) <223> ORF8 <220> <221> misc_feature <222> (10760)..(11239) <223> ORF9 <220> <221> misc_feature <222> (11240)..(11604) <223> ORF10 <220> <221> misc_feature <222> (12208)..(13137) <223> ORF11 <220> <221> misc_feature <222> (14378)..(14716) <223> ORF12 <220> <221> misc_feature <222> (15080)..(15619) <223> ORF13 <220> <221> 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cgattccttt ggcgtgcagt tgatagccga 2520 atgttttacg cagcgtatgc gtaccgatcg caatgtctaa gccggcccga tcagcggcag 2580 cttttaaaat gttatacgcc tgcacacggc taatcggttt atttacacct ttgcgcgaac 2640 gaaagatata cgcatcatca gggccgacca acttagcggc ggcaagctga actgttttcg 2700 atagctttat cggccgcatc ttccccgttt tcccttcccg tagctttaaa tgcgtttgtc 2760 cgcgaagatc gccgttcttc agcgttaata agtcagagat acgcagcccc aacgacaccc 2820 caaaaacaaa catgtccttg tcacgtccgt tcagtgcgtt cttcatgcgg ttaatgtctc 2880 gcttcgtttt aattgcatcc acagcatttg ccattatata cacctcaata tttatatttc 2940 gttcgttgat tagtaacaaa atgtgacgaa caagccgacc ttatcgcaaa ttgctacaac 3000 actgaagaat tgctagaaga ccttcccgtc accttaacat acgagatcgc acgttcaccc 3060 gccgttttga tttcgtcaca aattgtgagg acctacttac gcacccagcg ccttcctaat 3120 cgtcaaatcg cgcagcaaat agccggtcga gcatccggtc tagtacgcca ttataatagc 3180 cggccaagtt gcgaataggc ttccgtttag tcgctataaa cgtttgacga acggcttcca 3240 gtccgattcc ttgaagaata tcggcagcat acacgccttt taaatacgac gtatgcgcaa 3300 ggtatatacc gtacagcttg ctcgttaatt 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agacctggac ggtgt 17535

Claims (5)

1. 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 렌티모브스 WJ5(수탁번호: KFCC-11316)로부터 유래되며 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 pWBL5 플라스미드.
2. 상기 서열번호 1의 염기서열 전체를 포함하는 염기서열 및 선별 유전자를 가지는, 대장균과 바실러스 모두에서 복제 가능한 재조합 플라스미드.
3. 제 2항에 있어서, 선별 유전자는 암피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 스트랩토마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 에리트로마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
4. 제 2항에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 제 1항의 플라스미드 pWBL5와 pBluescript SK(+), mini-Tn5Km, pEK104, pUC19 및 pBR322로 구성된 군으로부터 선택되는 대장균 유래 형질전환용 벡터에 각각 제한효소를 처리하여 절단한 후 절단 된 절편들을 서로 접합시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
5. 제 4항에 있어서, 제 1항의 플라스미드 pWBL5와 pBluescript SK(+) 벡터에 각각 제한효소 PstI을 처리하여 절단한 후 절단된 절편들을 서로 접합시킴으로써 제조되며, 도 5의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 pWBL5EBS 재조합 플라스미드.

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