KR20150035751A - Uk-2 생합성 유전자 및 그것을 사용한 uk-2 생산성을 향상시키기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

낮은 비용으로 UK-2를 대량 생산할 수 있는 제조 방법을 제공하기 위하여, UK-2 생합성 유전자 클러스터로 예상되는 부위를 식별하기 위해 UK-2를 생산하는 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA가 분석되었다. 더욱이, 콜로니 혼성화에 의하여, 상기 부위의 DNA가 성공적으로 분리되었다. 게다가, 상기 DNA는 상기 부위에 존재하는 유전자가 차단된 종(strain)을 준비하는 데에 사용되었다. 상기 종은 UK-2를 생산하지 않는 것으로 밝혀졌다. 상기 유전체 부위는 UK-2 생합성 유전자 클러스터인 것으로 확인되었다. 게다가, 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7은 분리된 UK-2 생합성 유전자 클러스터가 삽입된 벡터의 도입에 의하여 형질전환되었다. 또한 상기 형질전환체에 의한 UK-2 생산성은 부모 종(strain)과 비교하여 10 배 내지 60 배 향상된 것으로 나타났다. 더욱이, 이들 형질전환체들 각각의 세포당 UK-2 생합성 유전자 클러스터의 2 복제가 존재하는 것으로 밝혀졌다.

Description

UK-2 생합성 유전자 및 그것을 사용한 UK-2 생산성을 향상시키기 위한 방법{UK-2 BIOSYNTHETIC GENES AND METHOD FOR IMPROVING UK-2 PRODUCTIVITY USING THE SAME}
본원은 도열병 방제제 등에 유용한 화합물인 UK-2의 생합성에 필요한 유전자(이하 "UK-2 생합성 유전자"라 칭함) 및 UK-2 생산성을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원은 UK-2 생합성 유전자, UK-2 생합성 유전자가 삽입되어 있는 벡터, 벡터가 도입되어 있는 형질전환체, UK-2 생합성 유전자의 존재를 탐지함으로써 UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법, UK-2 생합성 유전자의 존재가 상기 방법에 의해 탐지되는 박테리아, 그 유전체 내에 삽입된 UK-2 생합성 유전자를 포함하는 박테리아, UK-2 생합성 유전자 중 하나 또는 둘 또는 그 이상의 복제가 각 세포에 존재하는 박테리아, 및 이들 박테리아 등을 활용함으로써 UK-2 및 UK-2A 유도체를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
UK-2는 방선균에 의해 2차 대사 산물로서 생산되는 화합물이고, 곰팡이 및 효모를 포함하는 각종 균류에 대하여 안티마이신과 유사한 강한 항진균 작용을 나타낸다. 또한, 배양 세포에 대해서 낮은 세포 독성을 갖기 때문에 UK-2는 도열병 방제제, 농원예용 살진균제, 및 의학 항매제에 유용하다는 것이 밝혀졌다(특허문헌 1, 2). 게다가, 그 측쇄의 구조적 차이에 기초해서 4개의 유사체, UK-2A 내지 D가 자연적으로 존재한다는 것이 드러났다(비특허문헌 1).
UK-2는 방선균(스트렙토베르티실룸 속(genus)에 속하는 박테리아 등)을 배양한 다음, 그것으로부터 UK-2를 수집하여 생산된다. 그러나, 일반적으로 자연에서 분리된 미생물에 의해 생산되는 UK-2(모든 UK-2 인자)의 양은 매우 소량이다. 따라서, 산업적으로 저비용에서 목적물(UK-2)을 사용하기 위해서 생산성을 향상시켜야 한다.
목적물을 생산하는 미생물을 배양하기 위한 방법에 대한 조사, 배지 성분에 대한 조사, 전구체를 첨가하여 발효 조건의 향상, 및 자외선 조사 또는 화학적 돌연변이 유발 변이원을 활용하는 박테리아 균주의 향상을 통해 목적물의 생산성을 개선시킨다. 또한, 이들 방법 외에도, 생산성은 최근에 유전자 재조합을 활용하여 개선되어 왔다.
유전자 재조합에 의해 생산성을 개선시키기 위한 일반적인 방법은 목적물의 생합성에 필요한 유전자 발현의 개선을 포함하는 것이다. 예를 들면, 이 방법이 아고노미세탈레스 내에 PF-1022의 생산성을 향상시킨다고 특허문헌 3에 개시되어 있다.
그러나, 이 방법을 활용할 경우, 목적물의 생합성에 필요한 유전자 또는 공지의 기술을 사용하여 합성된 유전자를 분리시키고, 목적물(미생물을 생산)을 생산하여 미생물용 형질전환법을 확립하는 것이 본질이다. UK-2 생합성 유전자가 아직 밝혀지지 않았기 때문에 UK-2 생합성 유전자를 사용한 형질전환이 행해질 수 없다. 생산성은 유전자 재조합에 의해 향상될 수 없다.
일본 특허출원 공개 평07-233165 국제공개 제WO1999/11127호 국제공개 제WO2001/018179호
Ueki M. 등, Journal of antibiotics, 1996년 7월 25일, 49권, 7호, 639~643페이지 Namwat W. 등, Journal of Bacteriology, 2002년 9월, 184권, 17호, 4811~4818페이지
본원은 종래 기술에서 상술한 문제의 관점으로 이루어져 왔다. 본원의 목적은 유전자의 도입에 따라 UK-2 생합성에 필요한 유전자를 분리시킴으로써 얻어지는 높은 UK-2 생산성을 갖는 형질전환체를 제공하는 것이다. 게다가, 또 다른 목적은 형질전환체를 사용하여 저비용에서 다량의 UK-2를 생산하는 것이다. 그리고 추가 목적은 유전자의 존재를 탐지함으로써 UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
UK-2는 특유의 히드록시피콜린산 골격을 갖는다. 한편, 버지니아마이신이라 불리는 화합물도 히드록시피콜린산 골격을 갖는다. 또한, 그것은 VisA(L-라이신 2-아미노트랜스페라아제) 및 VisB(3-히드록시피콜린산 AMP 리가아제)가 버지니아마이신의 생합성에 관여하는 것으로 드러났다(비특허문헌 2).
따라서, 상기 목적들을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 UK-2를 생산하는 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA 라이브러리를 먼저 제조하고, 종합적으로 균주의 유전체 DNA의 염기 서열을 판단했다. 이어서, 유전체 DNA에 의해 인코딩된 추측상 단백질의 아미노산 서열과 VisA 및 VisB의 아미노산 서열 간의 상동성 분석을 수행함으로써 생성물과 이들 2개의 아미노산 서열이 높은 상동성을 갖는 유전자가 연속해서 위치되어 있는 유전체 부위를 알아냈다. 또한, 그것은 비리보솜 펩티드 합성 효소(NRPS)와 상동성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자 및 폴리케티드 합성 효소(PKS)와 상동성을 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자가 부위 근처에 위치하고 있다는 것을 알아냈다.
이들 효소는 UK-2 골격을 형성하는데 필요하다고 생각된다. 또한, 방선균의 2차 대사 산물 유전자는 클러스터를 형성한다. 따라서, 유전체 영역은 UK-2 생합성 유전자 클러스터가 될 것으로 기대된다.
이어서, UK-2의 생합성에 필요한 효소를 인코딩할 것으로 기대되는 유전자의 염기 서열의 얻어진 정보에 기초해서 프로브가 제조된다. 프로브를 사용한 콜로니 혼성화에 의해, UK-2 생합성 유전자 클러스터 내에 존재할 것으로 기대되는 DNAs(즉, 유전체 영역 내에 포함되는 DNAs)를 성공적으로 상술한 유전체 DNA 라이브러리로부터 분리했다. 게다가, DNAs는 유전체 영역 내에 존재하는 유전자가 파괴된 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7을 제조하는데 사용된다. 상기 균주는 UK-2를 생산하지 않는 것으로 밝혀졌다. 상기 유전체 영역은 UK-2 생합성 유전자 클러스터인 것이 확인되었다. 또한, 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7은 분리된 UK-2 생합성 유전자 클러스터가 삽입된 벡터를 도입하여 형질전환된다. 형질전환체에 의한 UK-2 생산성이 친주의 것과 비교해서 약 10~60배 또는 그 이상 향상된다는 것을 알아냈다. 또한, 그것은 UK-2 생합성 유전자 클러스터의 2개의 복제가 각각 이들 형질전환체의 각 세포에 존재하는 것을 확인했다.
구체적으로, 본원은 UK-2 생합성 유전자, UK-2 생합성 유전자가 삽입되어 있는 벡터, 벡터가 도입되어 있는 형질전환체, 및 형질전환체를 활용하여 UK-2 등을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본원은 하기의 것을 제공한다.
<1> 하기 (a) 내지 (q)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 핵산으로서, UK-2 생합성을 유도하고 UK-2의 생산성을 향상시키는, 분리된 핵산:
(a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 2의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(b) SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 4의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 6의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(d) SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 8의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(e) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 10의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(f) SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 12의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(g) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 14의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(h) SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 16의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(i) SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 18의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(j) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 20의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(k) SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 22의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(l) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 24의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(m) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 26의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(n) SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 28의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(o) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 30의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
(p) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 32의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산; 및
(q) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 34의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산.
<2> <1>에 있어서, (a) 내지 (q)의 핵산을 모두 포함하는, 핵산.
<3> <2>에 있어서, SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 포함하는, 핵산.
<4> <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 핵산이 삽입된, UK-2 생합성을 유도하고 UK-2 생산성을 향상시키기 위한 벡터.
<5> 시험 박테리아 내에서 <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 핵산의 염기 서열 또는 상기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의 존재를 탐지하는 것을 포함하는, UK-2 생산성을 판단하는 방법.
<6> <5>에 있어서, 핵산의 존재를 탐지하는 방법은 PCR 방법인 것인, 방법.
<7> <5>에 있어서, PCR 방법은 SEQ ID NO: 45의 염기 서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO: 46의 염기 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 핵산이 증폭되는 방법인 것인, 방법.
<8> UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아로서, <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 핵산의 염기 서열 또는 상기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의 존재가 <5> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 탐지되는, 박테리아.
<9> <4>에 따른 벡터의 도입에 의해 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아.
<10> <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 핵산이 유전체 내에 삽입된, UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아.
<11> <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 따른 핵산의 염기 서열을 포함하는 핵산의 하나 또는 둘 또는 그 이상의 복제가 각 세포에 존재하는 박테리아.
<12> <8> 내지 <11> 중 어느 하나에 따른 박테리아로서, 스트렙토베르티실룸(Streptoverticillium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 효모(yeasts), 곰팡이(filamentous fungi) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 중 어느 하나인 것인, 박테리아.
<13> UK-2의 생산 방법으로서:
<8> 내지 <12> 중 어느 하나에 따른 박테리아를 배양하고, 그리고 박테리아 배양으로부터 UK-2를 수집하는 것을 포함하는, 방법.
<14> UK-2 유도체의 생산 방법으로서:
<8> 내지 <12> 중 어느 하나에 따른 박테리아를 배양하고, 그리고 박테리아 배양으로부터 UK-2를 수집하고; 그리고
수집된 UK-2로부터 하기 식(1) 중 어느 하나로 표시되는 UK-2유도체를 합성하는 것을 포함하는 방법
[화학식 1]
Figure pct00001
(1)
[식(1)에서,
R은 2-메틸프로파노일기, 트랜스-2-메틸-2-부타노일기, 3-메틸부타노일기 및 2-메틸부타노일기 중 어느 하나를 나타냄.
R1은 C1 -6 알킬기, 벤질기, C1 -10 알킬카르보닐기(C1 -10 알킬카보닐기는 카르복실기, 벤질옥시카르보닐기, C1 -4 알킬옥시카르보닐기 및 벤질옥시카르보닐아미노기 중 어느 하나로 치환될 수 있음), 벤조일기, C1 -4 알킬옥시카르보닐기, (C1 -4)알킬옥시카르보닐(C1-4)알킬기, 니트로기로 치환가능한 벤질옥시카르보닐(C1-4)알킬기, C1 -6 알킬술포닐, 디(C1-6)알킬포스포릴기, 디페닐포르포리기 및 하기 식(2)으로 표시되는 치환기 중 어느 하나를 나타내고;
[화학식 2]
Figure pct00002
(2)
(식(2)에서,
Q는 H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 및 시클로프로필로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
M은 H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 및 시클로프로필로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
T는 O, OC(O), OC(O)O, S, SC(O), SC(O)O 및 하기 식(3)으로 표시되는 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택됨;
[화학식 3]
Figure pct00003
(3)
G는 H, C1 -6 알킬기, C1 -6 알콕시 C1 -6 알킬기, C2 -6 알케닐기, C2 -6 알키닐기, C3-6 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로아릴기로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
G 및 M은 임의적으로 옥소기를 가지는 이소벤조퓨란 고리를 형성할 수 있음.
M 및 Q는 3-8원 카르보시클릭 시스템을 형성할 수 있음.].
<15> UK-2A 유도체의 제조 방법으로서:
<8> 내지 <12> 중 어느 하나에 따른 박테리아를 배양하고, 그리고 박테리아 배양으로부터 UK-2A를 수집하고; 그리고
수집된 UK-2A로부터 하기 식(4) 내지 (7) 중 어느 하나로 표시되는 UK-2A 유도체를 합성하는 것을 포함하는, 방법.
[화학식 4]
Figure pct00004
(4)
[화학식 5]
(5)
[화학식 6]
Figure pct00006
(6)
[화학식 7]
Figure pct00007
(7)
여기서 사용되는 용어 "아실"은 R이 탄화수소기를 나타내는 카르복시산 R-COOH로부터 OH를 제거함으로써 제공된 RCO-잔기를 의미한다.
여기서 사용되는 용어 "아릴"은 페닐 또는 나프틸을 의미한다. 여기서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 5 또는 6원 방향족 고리를 의미하고, 그러한 헤테로원자들은 O, N 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 방향족 고리의 나머지 원자들은 탄소 원자이다.
적절한 예시들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 퓨란, 티오펜, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 퀴놀린, 퀴녹솔린 및 티아디아졸을 포함한다.
본원은 UK-2 생합성 유전자를 박테리아와 같은 숙주 세포 내로 도입함으로써 높은 UK-2 생산성을 가지는 형질전환체(transformant)를 제공할 수 있게 한다. 더욱이, 형질전환체를 이용하여 UK-2를 저비용으로 대량생산하는 것이 가능하다.
게다가, 유전자의 존재를 탐지함으로써 UK-2 생산성을 측정하는 방법을 제공할 수 있다.
<UK-2 생합성 유전자>
본원은 UK-2 생합성 유전자를 제공한다. 아래의 실시예에 기재될 것처럼, 본원의 발명자들은 신규한 UK-2 생합성 유전자들을 분리하였으며, 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA의 17 개의 유전자가 표 2에 나타나 있다.
따라서, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 일 구현예는 "UK-2 생합성을 유도하고 UK-2의 생산성을 향상시키는 분리된 핵산으로서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 또는 35의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산" 이고, 전형적으로 "UK-2 생합성을 유도하고 UK-2의 생산성을 향상시키는 분리된 핵산으로서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34의 염기 서열을 포함하는 핵산"이다.
본원에서 "UK-2 생산성의 향상" 이라는 어구 및 관련 어구들은 박테리아 등이 자연적으로 가지고 있는 UK-2의 생산성의 향상만을 뜻하는 것이 아니라, 자연적으로 UK-2 생산 능력을 가지고 있지 않은 박테리아 등이 UK-2 생산 능력을 취득하는 것 또한 의미한다.
본원에서, 용어 "분리" 및 관련 용어들은 핵산이 원래 존재하던 조건과 상이한 조건 하에 존재하도록 하는 인위적인 처리를 의미한다. 본원의 UK-2 생합성 유전자는 분리될 수 있으며, 예를 들어, 먼저 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34의 염기 서열의 정보를 기반으로 적절한 프라이머를 합성하고, 그리고 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA를 주형으로 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 것에 의할 수 있다. 양자택일적으로, 아래의 실시예에 기재될 것처럼, 본원의 UK-2 생합성 유전자는 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터, PCR로부터 수득된 증폭 산물을 프로브로 이용하여 콜로니 혼성화를 수행함으로써 또한 분리될 수 있다. 뿐만 아니라, 본원의 UK-2 생합성 유전자는 염기 서열 정보를 기반으로 한 전합성(total chemical synthesis)에 의해 또한 준비될 수 있다.
본원에서, "UK-2"는 하기 식(8)으로 표시되는 화합물이다:
[화학식 8]
Figure pct00008
(8)
여기에서 R은 직쇄형 또는 분지형의 포화 지방족 아실기 또는 직쇄형 또는 분지형의 불포화 지방족 아실기를 나타낸다. 바람직하게는, "UK-2"는 R이 이소부티릴기(2-메틸프로파노일기)인 화합물(UK-2A), R이 티글로일기(트랜스-2-메틸-2-부테노일기)인 화합물(UK-2B), R이 이소발레릴기(3-메틸부타노일기)인 화합물(UK-2C) 그리고 R이 2-메틸부타노일기인 화합물(UK-2D)이다.
더욱이, 본원에서, "UK-2 생합성 유전자"는 UK-2 생합성을 유도할 수 있는 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 유전자이다. "UK-2 생합성을 유도할 수 있는 활성"은, 예를 들어, 아래의 실시예 9에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 구체적으로, 시험 단백질을 인코딩하는 핵산이 숙주 세포(예를 들어, 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7) 내로 도입될 벡터 등에 삽입된 후에, 숙주 세포에서 생산된 UK-2의 양이 숙주 세포 내에서 강제로 발현되는 시험 단백질에 의해 측정된다. 시험 단백질이 발현되지 않는 숙주 세포에서보다 생산량이 큰 경우, 시험 단백질은 UK-2 생합성을 유도할 수 있는 활성을 가지는 것으로 평가할 수 있다.
당업계에서, UK-2 생합성 유전자의 염기 서열의 정보를 얻을 수 있는 경우, 비록 단백질의 아미노산 서열이 염기서열로부터 인코딩되는 것과 상이하다고 하여도, 당업자는 염기 서열을 수정하여 UK-2 생합성에 관여하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 수득할 수 있다. 한편, 자연에서도, 인코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 염기 서열의 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다. 따라서, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 또다른 구현예는 "하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 또는 35 의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산인 분리된 핵산"이다. 여기서, "하나 이상의"는 UK-2 생합성을 유도하는 활성을 여전히 가지는, 변형 후의 UK-2 생합성에 관련된 단백질 내에서 변경된 아미노산의 개수를 뜻한다. 개수는 일반적으로 1 내지 50이고, 바람직하게는 1 내지 40이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 수 개 (예를 들어, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 8, 및 1 내지 4) 이다.
당업자는 UK-2 생합성 유전자의 염기 서열의 정보에 기초한 자리지정 돌연변이와 같은 공지의 방법에 의하여 그러한 변이를 인코딩하는 핵산을 제조할 수 있다.
더욱이, 당업계에서, UK-2 생합성 유전자의 염기 서열의 정보를 얻을 수 있는 경우, 당업자는 혼성화 기술 또는 PCR 기술을 이용하여 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7 외의 다른 종 및 다른 박테리아들로부터 UK-2 생합성 유도 활성을 가지는 단백질을 인코딩하는 핵산(상동유전자)를 수득할 수 있다. 따라서, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 또다른 구현예는 "SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 또는 34의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산인 분리된 핵산"이다.
그러한 상동유전자를 분리하기 위해서, 보통 엄격한 조건 하에서 혼성화 반응을 수행한다. "엄격한 조건"은 혼성화 후 낮은 염 농도를 가지는 용액 내에서 높은 온도로 막 세척 공정이 수행되는 것이다. "엄격한 조건"은, 예를 들어, 2xSSC 농도(1xSSC : 15 mM 시트르산 삼나트륨, 150 mM 염화나트륨)의 0.5% SDS 용액에서 60℃에서 20 분 동안 세척하는 조건을 포함한다. 추가적으로, 예를 들어, 혼성화는 알려진 ECL Direct DNA/RNA Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech Inc. 제조)에 첨부된 지시서에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다.
더욱이, 그러한 방법에 의해 수득된 상동유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 일반적으로 SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 또는 35의 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 따라서, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 또다른 구현예는 "SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 또는 35의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산인 분리된 핵산"이다.
서열의 상동성은, 예를 들어, NCBI의 BLASTX (아미노산 수준) 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
아래의 실시예들에서 기재될 것처럼, 본원의 UK-2 생합성 유전자는 높은 UK-2 생산성을 가지는 형질변환체의 제조에 사용될 수 있으며, 또한 UK-2 생합성 유전자 클러스터의 스크리닝에 효과적으로 사용될 수도 있다.
그러한 형질전환체를 제조하고 UK-2 생합성 유전자 클러스터를 스크리닝하는 데에 있어서, 상기 기술한 조합된 UK-2 생합성 유전자들의 용도는 바람직하게는 UK-2 생합성 유전자들 각각의 용도이다. 조합된 UK-2 생합성 유전자들의 개수는, UK-2 생합성이 조합에 의해서 유도될 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 개수는 2 이상이고, 바람직하게는 5 이상이고, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 더더욱 바람직하게는 15 이상이다. 조합된 UK-2 생합성 유전자의 개수는 가장 바람직하게는 17인데, 그 이유는 형질전환체에서의 UK-2 생산성이 현저하게 향상될 수 있기 때문이다.
조합된 UK-2 생합성 유전자는 단일 핵산 또는 분리된 핵산들로서 존재할 수 있다.
본원은 17 UK-2 생합성 유전자들을 포함하는 단일 핵산(UK-2 생합성 유전자 클러스터)인 "SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 포함하는 핵산"을 제공한다. SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 포함하는 핵산 내 상기 유전자들의 열린 번역틀(ORFs)의 위치는 나중에 기술되는 표 1에 나타나 있다.
나중에 실시예에서 기술되는 바와 같이, "SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 포함하는 핵산"은 먼저 UK-2 생합성 유전자 등의 염기 서열의 정보를 기반으로 한 적절한 프라이머를 합성하고, 그리고 독립적으로 제조된 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 코스미드 유전체 DNA를 주형으로 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 이어서 수득된 증폭 산물을 프로브로 이용하여 콜로니 혼성화를 수행하는 것에 의해서 분리될 수 있다.
<벡터>
본원은, 본원의 UK-2 생합성 유전자가 삽입된 벡터를 제공한다. 본원의 벡터는 자가복제 벡터, 즉, 예를 들어, 염색체외 요소(extrachromosomal element)로서 존재하며, 염색체의 복제로부터 독립적으로 복제하는, 플라스미드를 기반으로 구성될 수 있다. 양자택일적으로, 본원의 벡터는 박테리아와 같은 숙주 세포 내에 도입되고 그 유전체 내에 편입된 후 숙주세포의 염색체와 함께 복제될 수 있다. 본원의 벡터의 구성 절차 및 방법은, 유전자 조작 분야에서 일반적으로 사용되는 절차 및 방법을 사용할 수 있다.
당업자는 도입되는 숙주 세포의 종류에 따라 공지의 벡터들 중 본원의 적절한 벡터를 선택할 수 있다. 공지의 벡터들의 예는 코스미드 벡터(SuperCos 1 코스미드 벡터 등), 파지 벡터, pUC 기반 플라스미드 (pCR2.1-TOPO 플리스미드 벡터 등), pBluescript 기반 플라스미드 및 pBR322 플라스미드를 포함한다.
본원의 UK-2 생합성 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 숙주 세포 내에서 발현시키기 위해, 본원의 "벡터"는 바람직하게는, 상기 유전자 외에도, 발현을 조절하기 위한 DNA 서열, 형질전환된 숙주세포를 선별하기 위한 마커 유전자 등을 포함한다.
"발현을 조절하기 위한 DNA 서열"의 예는 프로모터, 인핸서, 및 종결자를 포함한다. 예는 또한 박테리아에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가함으로써 하류에 존재하는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 락토오즈 오페론을 포함한다. 본원의 벡터는, 예를 들어, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 상류 또는 하류에 프로모터 및 종결자를 각각 작동가능하게 삽입함으로써 구성될 수 있다.
"마커 유전자"는 형질변환된 숙주 세포(형질변환체)를 선별하는 방법에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 약물 저항을 인코딩하는 유전자 또는 영양 요구성(auxotrophy)을 보완하는 유전자가 사용될 수 있다. 박테리아가 숙주 세포로 사용되는 경우, 마커 유전자의 예는 앰피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 및 테트라사이클린 저항성 유전자를 포함한다. 특히, 방사균(actinobacterium)의 경우, 예는 아프라마이신 저항성 유전자, 티오스트렙톤 저항성 유전자, 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 스트렙토마이신 저항성 유전자, 비오마이신 저항성 유전자 등을 포함한다. 효모의 경우, 예는 트립토판 생합성 유전자(TRP1), 우라실 생합성 유전자(URA3), 류신 생합성 유전자(LEU2) 등을 포함한다. 곰팡이(mold)의 경우, 예는 히그로마이신 저항성 유전자, 비알라포스 저항성 유전자, 블레오마이신 저항성 유전자, 아우레오바시딘 저항성 유전자 등을 포함한다. 식물의 경우, 예는 카나마이신 저항성 유전자, 비알라포스 저항성 유전자 등을 포함한다.
<형질변환체 등>
본원은, 본원의 벡터가 도입된 형질변환체를 제공한다 (예를 들어, 본원의 벡터의 도입에 의해 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아).
더욱이, 본원은, 본원의 UK-2 생합성 유전자가 그의 유전체 내에 삽입되어 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 형질전환체를 제공한다.
본원의 벡터가 도입됨으로써 형질전환되는 숙주세포 또는 본원의 UK-2 생합성 유전자의 유전체의 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 그 예는 방사균(actinobacteria), 대장균(Escherichia coli ), 바실러스 서브틸리스, 효모, 곰팡이(filamentous fungi), 코리노박테리움 글루타미쿰, 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. UK-2 생산성의 관점에서, 방사균이 바람직하고, 스트렙토베르티실룸 속(genus)에 속하는 박테리아와 스트렙토마이세스 속에 속하는 박테리아가 더욱 바람직하고, 스트렙토베르티실룸 속에 속하는 박테리아가 더더욱 바람직하며, 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7이 특히 바람직하다.
본원의 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 시험 하에서 숙주세포의 종류에 따라 접합전달법(conjugal transfer), 파지도입(phage transduction), 칼슘이온법, 리튬이온법, 전기천공법, PEG법, 아그로박테리움법, 및 입자총(particle gun) 방법과 같은 공지의 형질전환 방법들로부터 당업자에 의해 적절하게 선택 및 이용될 수 있다. 더욱이, "마커 유전자"를 포함하는 벡터가 숙주세포 내로 도입되는 경우, 본원의 형질전환체는 약물 저항성 유전자에 따른 항생제가 첨가된 배지 또는 영양 요구성 보완 유전자에 따른 영양분이 결핍된 배지에서 배양함으로써 효과적으로 제조될 수 있다.
게다가, 본원은 발효 조건(fermentation conditions), 돌연변이 유발 등의 향상 조건에 의하여 UK-2의 생합성이 유도되고 UK-2의 생산성이 향상되는 박테리아를 제공한다. 더욱이, 아래의 실시예에서 기술되는 것처럼, 본원의 UK-2 생합성 유전자를 적어도 2 개 포함하면 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 상당히 향상된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본원은 또한 본원의 UK-2 생합성 유전자 하나 또는 둘 또는 그 이상의 복제가 각 세포에 존재하는 박테리아를 제공한다. UK-2의 생산성의 측면에서, 그러한 박테리아는 바람직하게는 방사균, 더욱 바람직하게는 스트렙토베르티실룸 속에 속하는 박테리아 및 스트렙토마이세스 속에 속하는 박테리아, 그리고 더더욱 바람직하게는 스트렙토베르티실룸 속에 속하는 박테리아이다. 추가적으로, UK-2의 생산성의 측면에서, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 세포당 복제의 수는 바람직하게는 2 개 이상이다. 본원의 UK-2 생합성 유전자의 세포당 복제의 개수는, 예를 들어, 아래의 실시예에서 기술되는 PCR 방법에 의해 확인될 수 있다.
<UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법>
본 발명자들은 UK-2 생합성에 필요한 유전자를 분리하고 확인함으로써, 유전자의 존재를 탐지하여 UK-2 생산성을 판단하는 것이 가능해졌다. 따라서, 본원은 시험 박테리아 내에서, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 염기 서열 또는 그 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의 존재를 탐지하는 것을 포함하여 UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본원의 방법에 있어서, "시험 박테리아"는 특별히 제한되지 않는다. 그 예로는 방선균(스트렙토베르티실룸 속에 속하는 박테리아, 스트렙토마이세스 속에 속하는 박테리아 등), 대장균, 바실러스 서브틸리스, 효모, 곰팡이, 및 코리네박테리움 글루타미쿰을 포함한다.
본원의 UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법에 있어서, 탐지되는 본원의 UK-2 생합성 유전자의 염기 서열, 즉 본원의 핵산의 염기 서열은 상술한 (a)~(q)로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산의 염기 서열이다.
핵산 등은 핵산 등을 포함하는 유전체 DNA 또는 유전체 DNA로부터 전사 산물을 직접 표적화하여 탐지될 수 있다. 대안적으로, 핵산 등은 전사 산물(본원의 UK-2 생합성 유전자에 의해 인코딩된 단백질)로부터 변형 산물을 간접 표적화하여 탐지할 수도 있다. 또한, 핵산 등의 탐지는 공지된 방법 중 어느 하나를 채용할 수 있다. 유전체 DNA를 표적하는 경우에 있어서, 예를 들면 현장 혼성화(ISH)법, 유전체 PCR법, 직접 시퀀싱법, 서던 블롯팅법, 및 유전체 마이크로어레이를 사용한 분석법을 채용할 수 있다. 전사 산물을 표적화하는 경우에 있어서, 예를 들면 PCR법, 직접 시퀀싱법, 노던 블롯팅법, 도트 플롯법, 및 cDNA 마이크로어레이를 사용한 분석법을 채용할 수 있다. 변역 산물을 표적화하는 경우에 있어서, 공지된 방법의 예로는 본원의 UK-2 생합성 유전자에 의해 인코딩된 단백질에 대한 항체를 사용한 면역학적 방법을 포함한다(웨스턴 블롯팅법, ELISA법, 유동세포계수법, 면역 조직화학적 염색, 이미징 세포계수, 방사면역판단법, 면역 침강법, 항체 어레이를 사용한 분석법 등). 이들 방법 중에서도, PCR법이 바람직할 수 있고, 핵산이 SEQ ID NO: 45의 염기 서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO: 46의 염기 서열을 포함하는 프라이머를 사용해서 증폭되는 PCR법이 보다 바람직할 수 있다.
부가적으로, 본원의 방법에 있어서, UK-2 생산성의 보다 정확한 판단을 달성하는 관점에서 이것은 하나의 핵산의 존재를 탐지하는 것보다 상술한 다수의 핵산(본원의 UK-2 생합성 유전자)의 존재를 탐지하는 것이 바람직하다. 탐지되는 핵산의 수는, 예를 들면 2개 또는 그 이상, 바람직하게는 5개 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 10개 또는 그 이상, 및 더욱 바람직하게는 15개 또는 그 이상이다. 17개 핵산 모두를 탐지하는 것이 특히 바람직할 수 있고, 17개 핵산(SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 포함하는 핵산) 모두를 포함하는 단일 핵산을 탐지하는 것이 가장 바람직할 수 있다. 또한, 핵산의 전체 길이 외에도, 일반적인 사례에서는 핵산의 존재 탐지를 위해 그의 일부가 표적화된다. 따라서, 본원의 방법에 있어서, 핵산 등의 탐지는 핵산 등의 일부의 탐지일 수 있다. 당업자는 탐지법에 따라 본원의 방법에 의해 탐지되는 핵산의 일부의 길이를 적절하게 선택할 수 있다.
이어서, 시험 박테리아 내에서 핵산의 존재가 이러한 방법에 의해 탐지될 수 있다면, 시험 박테리아는 UK-2 생산성을 갖는다고 판단된다. 부가적으로, 본원의 방법은 UK-2를 생산하는 것을 허용하는 조건에서 핵산의 존재를 탐지할 수 있는 시험 박테리아를 배양하는 것을 추가 포함할 수 있다.
또한, 본원은 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상되며, 본원의 핵산의 염기 서열 또는 그 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의 존재가 본원의 UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법에 의해 탐지되는 박테리아를 제공하는 것이다. UK-2 생산성의 관점에서, 이러한 박테리아는 방선균인 것이 바람직하고, 스트렙토베르티실룸 속에 속하는 박테리아 및 스트렙토마이세스 속에 속하는 박테리아가 보다 바람직하며, 스트렙토베르티실룸 속에 속하는 박테리아가 더욱 바람직하다.
단, 여기 사용된 바와 같이, 본원의 UK-2 생합성 유전자를 갖는 상술한 박테리아 등, 즉 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상되며, 핵산의 존재가 본원의 UK-2 생산성을 판단하기 위한 방법에 의해 탐지되는 박테리아, 본원의 벡터를 도입함으로써 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상되는 형질전환체, UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상되고, 본원의 UK-2 생합성 유전자가 그 유전체 내에 삽입되는 형질전환체, 본원의 UK-2 생합성 유전자의 1개 또는 2개 또는 그 이상의 복제가 각 세포에 존재하는 박테리아, 및 발효 조건, 돌연변이 유발 등에 향상에 의해 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상되는 박테리아가 "본원의 박테리아 등"이라 이하에서 총칭된다.
<UK-2를 생산하기 위한 방법>
본원은 UK-2를 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은:
본원의 박테리아 등을 배양하고, 박테리아 등의 배양으로부터 UK-2를 수집하는 단계를 포함한다.
박테리아 등은 종래 방법에 의해서 적절하게 배지, 배양 조건 등을 선택함으로써 배양될 수 있다. 배지로서, 일반적으로 사용되는 성분을 사용할 수 있다. 예를 들면, 탄소원으로서는 글루코오스, 수크로오스, 셀룰로오스, 물엿, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 당밀, 동식물유 등을 사용할 수 있다. 게다가, 질소원으로서는 콩가루, 밀배아, 파마미디아, 옥수수 침지액, 면실박, 브로스, 펩톤, 폴리펩톤, 백아 추출물, 효모 추출물, 황산 암모늄, 질산 나트륨, 우레아 등을 사용할 수 있다. 이외에도, 필요에 따라 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온을 생산할 수 있는 무기염을 부가하는 것이 효과적이고; 무기염의 예로는 염화 칼륨, 탄산 칼슘, 인산수소2칼륨, 황산 마그네슘, 인산 칼륨, 황산 아연, 황산 망간, 및 황산 구리를 포함한다. 부가적으로, 필요에 따라 티아민(염산 티아민 등)과 같은 각종 비타민, 글루탐산(글루타민산 나트륨 등) 및 아스파라긴(DL-아스파라긴 등)과 같은 아미노산, 뉴클레오티드와 같은 미량 영양소, 및 항생제와 같은 선택적 약물을 부가할 수도 있다. 또한, 박테리아의 성장 및 UK-2 생산을 촉진시키기 위한 유기 물질과 무기 물질을 적절하게 부가할 수 있다. 배지의 pH는 특히 제한되지 않고, 배양되는 박테리아 등의 타입에 따라 조정될 수 있다. 예를 들면, pH는 대략 6~8이다.
당업자는 배양되는 박테리아 등의 타입, 사용되는 배지의 타입 등에 따라 배양 조건을 적절하게 선택하고 설정할 수 있다. 예를 들면, 배양법은 호기성 조건 하에 진탕 배양법, 통기와 교반 배양법 및 호기성 침수 배양법과 같은 공지의 배양법으로부터 선택될 수 있다. 통기와 교반 배양법이 바람직하다. 적절한 배양 온도는 15℃~40℃이다. 다수의 경우에 있어서, 배양 온도는 26℃~37℃쯤으로 설정된다. 게다가, 배양 기간은 UK-2의 최대 축적이 달성될 경우 2일~25일이 바람직하다.
본원에 있어서, "배양"은 본원의 박테리아 등을 배양함으로써 얻어지는 배지, 급증된 박테리아 등, 박테리아 등의 분비물 및 대사 산물 등을 나타낸다. 배양은 이들의 희석 및 농축도 포함한다.
배양에 있어서, UK-2는 박테리아 등 및 배지 모두에 축적된다. 따라서, 배양의 배지로부터 UK-2를 수집하기 위한 방법의 예로는 자유롭게 물과 혼합하지 않고, UK-2를 효과적으로 추출할 수 있는 에틸 아세테이트, 클로로폼, 및 디클로로메탄과 같은 유기 용제를 사용한 추출법이다. 한편, 배양의 박테리아 등으로부터, 예를 들면 UK-2는 여과 또는 원심 분리와 같은 수단에 의해 얻어지는 박테리아 등에 아세톤과 같은 유기 용제로 추출하여 수집될 수 있다. 또한, 배양의 박테리아 등을 글라스 비즈 등을 사용하여 파괴한 후, UK-2는 배지로부터 상술한 추출과 같은 동일한 방식으로 추출하여 수집될 수 있다.
게다가, 배양으로 UK-2를 수집할 경우, 이렇게 제조된 유기 용제와 같은 추출 분획에 용제 전이 용해, 순상 및 역상 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 및 결정화와 같은 공지의 정제 기술을 조합해서 실시함으로써 UK-2가 분리되고 정제될 수 있다.
<UK-2 유도체를 생산하기 위한 방법>
상술한 바와 같이, 본원은 저비용으로 UK-2의 대량 생산을 가능하게 한다. 따라서, 저비용으로 UK-2 유도체의 대량 생산이 그 재료로서 본원의 생산법으로 얻어지는 UK-2를 사용해서 가능해진다.
따라서, 본원은 UK-2 유도체를 생산하기 위한 방법을 제공할 수 있다. 상기 방법은:
본원의 박테리아 등을 배양하고, UK-2(UK-2A, UK-2B, UK-2C 또는 UK-2D)를 박테리아 등의 배양으로부터 수집하는 단계; 및
수집된 UK-2로부터 하기 식(1) 중 어느 하나로 나타내어지는 UK-2 유도체를 합성하는 단계를 포함한다.
[화학식 9]
Figure pct00009
[식(1)에서,
R은 2-메틸프로파노일기, 트랜스-2-메틸-2-부타노일기, 3-메틸부타노일기 및 2-메틸부타노일기 중 어느 하나를 나타냄.
R1은 C1 -6 알킬기, 벤질기, C1 -10 알킬카르보닐기(C1 -10 알킬카르보닐기는 카르복실기, 벤질옥시카르보닐기, C1 -4 알킬옥시카르보닐기 및 벤질옥시카르보닐아미노기 중 어느 하나로 치환될 수 있음), 벤조일기, C1 -4 알킬옥시카르보닐기, (C1 -4)알킬옥시카르보닐(C1-4)알킬기, 니트로기로 치환 가능한 벤질옥시카르보닐(C1-4)알킬기, C1-6 알킬술포닐, 디(C1-6)알킬포스포릴기, 디페닐포스포리기 및 하기 식(2)으로 표시되는 치환기 중 어느 하나를 나타내고;
[화학식 10]
Figure pct00010
(식(2)에서,
Q는 H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 및 시클로프로필로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
M은 H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 및 시클로프로필로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
T는 O, OC(O), OC(O)O, S, SC(O), SC(O)O 및 하기 식(3)으로 표시되는 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택됨;
[화학식 11]
Figure pct00011
G는 H, C1 -6 알킬기, C1 -6 알콕시 C1 -6 알킬기, C2 -6 알케닐기, C2 -6 알키닐기, C3-6 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로아릴기로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
G 및 M은 임의적으로 옥소기를 가지는 이소벤조퓨란 고리를 형성할 수 있음.
M 및 Q는 3-8원 카르보시클릭 시스템을 형성할 수 있음.].
식(2)으로 표시되는 치환기에 있어서, 알킬기, 알키닐기, 알케닐기, 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로아릴기는 하기 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기로 치환될 수 있고;
C1 -6 알킬기, C2 -6 알케닐기, C2 -6 알키닐기, C3 -6 시클로알킬기, C5 -6 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로아릴기, 할로겐 원자, 니트로기, 히드록시기, 시아노기, C1 -6 알콕시기, C2 -6 알케녹시기, C3 -6 시클로알콕시기, 아릴옥시기, 헤테로아릴옥시기, 아실옥시기, C1 -6 알킬아실옥시기, C3 -6 시클로알킬아실옥시기, 아릴아실옥시기, 헤테로아릴아실옥시기, C1 -6 알킬옥시아실기, C3 -6 시클로알킬옥시아실기, 아릴옥시아실기, 헤테로아릴옥시아실기, C1 -6 알킬아실기, C3 -6 시클로알킬아실기, 아릴아실기, 헤테로아릴아실기, C1 -6 알킬아실아미노기, C3 -6 시클로알킬아실아미노기, 아릴아실아미노기, 헤테로아릴아실아미노기, C1 -6 알킬아미노아실기, C3 -6 시클로알킬아미노아실기, 아릴아미노아실기, 헤테로아릴아미노아실기, C1 -6 알킬티오기, C3 -6 시클로알킬티오기, 아릴티오기, 헤테로아릴티오기 C1 -6 알킬술포닐기, C3 -6 시클로알킬술포닐기, 아릴술포닐기, 헤테로아릴술포닐기, C1 -6 알킬술피닐기, C3 -6 시클로아릴술피닐기, 아릴술피닐기, 헤테로아릴술피닐기 및 -C(NORX)RY 여기서 RY 및 RX는 독립적으로 H, C1 -6 알킬기, C2 -6 알케닐기, C3 -6 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로아릴기 중 어느 하나이고 이것들 중 치환기를 포함하는 임의의 알킬 또는 시클로알킬은 하나 또는 그 이상의 할로겐으로 치환될 수 있다.
단, 치환기는 하기 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환기로도 치환될 수 있고;
C1 -6 알킬기, C2 -6 알케닐기, C2 -6 알키닐기, C3 -6 시클로알킬기, C5 -6 시클로알케닐기, 아릴기, 헤테로아릴기, 할로겐 원자, 니트로기, 히드록시기, 시아노기, C1 -6 알콕시기, C2 -6 알케녹시기, C3 -6 시클로알콕시기, 아릴옥시기, 헤테로아릴옥시기, 아실옥시기, C1 -6 알킬아실옥시기, C3 -6 시클로알킬아실옥시기, 아릴아실옥시기, 헤테로아릴아실옥시기, C1 -6 알킬옥시아실기, C3 -6 시클로알킬옥시아실기, 아릴옥시아실기, 헤테로아릴옥시아실기, C1 -6 알킬아실기, C3 -6 시클로알킬아실기, 아릴아실기, 헤테로아릴아실기, C1 -6 알킬아실아미노기, C3 -6 시클로알킬아실아미노기, 아릴아실아미노기, 헤테로아릴아실아미노기, C1 -6 알킬아미노아실기, C3 -6 시클로알킬아미노아실기, 아릴아미노아실기, 헤테로아릴아미노아실기, C1 -6 알킬티오기, C3 -6 시클로알킬티오기, 아릴티오기, 헤테로아릴티오기 C1 -6 알킬술포닐기, C3 -6 시클로알킬술포닐기, 아릴술포닐기, 헤테로아릴술포닐기, C1 -6 알킬술피닐기, C3 -6 시클로알킬술피닐기, 아릴술피닐기, 헤테로아릴술피닐기 및 -C(NORX)RY 여기서 RY 및 RX는 독립적으로 H, C1 -6 알킬기, C2 -6 알케닐기, C3 -6 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로아릴기 중 어느 하나이고 이것들 중 치환기를 포함하는 임의의 알킬 또는 시클로알킬은 하나 또는 그 이상의 할로겐으로 치환될 수 있다.
또한, 본원은 UK-2 유도체를 생산하기 위한 방법도 제공될 수 있고, 상기 방법은:
본원의 박테리아 등을 배양하고, 그리고 박테리아 등의 배양으로부터 UK-2를 수집하는 단계; 및
수집된 UK-2로부터 하기 식(4)~(7) 중 어느 하나로 표시되는 UK-2 유도체를 합성하는 단계를 포함한다.
[화학식 12]
Figure pct00012
[화학식 13]
Figure pct00013
[화학식 14]
Figure pct00014
[화학식 15]
Figure pct00015
배양으로부터 UK-2A, UK-2B, UK-2C 또는 UK-2D 수집할 때, UK-2A, UK-2B, UK-2C 또는 UK-2D는, 예를 들면 유기 용제와 같은 추출 분획을 용제 전이 용해, 순상 및 역상 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 및 결정화와 같은 공지된 정제 기술을 조합하여 실시함으로써 상술한 바와 같이 분리되고 정제될 수 있다. 보다 구체적으로, 유기 용제와 같은 추출 분획은 감압 하에 농축된다. 생성물을 클로로폼에 옮겨서 용해시키고, 클로로폼/메탄올을 사용해서 순차적으로 용출시키는 실리카겔 크로마토그래피로 실시했다. 따라서, 약 3:1의 비율로 UK-2A 및 UK-2D를 포함하고, UK-2B 및 UK-2C의 미량을 포함하는 분획을 얻을 수 있다. 추가로, 분획은 C-18 칼럼을 사용해서 역상 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 처리됨으로써, UK-2A, UK-2B, UK-2C 또는 UK-2D가 분리될 수 있다(특허문헌 1 참조).
이어서, 식(1) 및 (4)~(7) 중 어느 하나로 표시되는 UK-2A, UK-2B, UK-2C 또는 UK-2D의 유도체는 UK-2A, UK-2B, UK-2C 또는 UK-2D를 사용하여 합성됨으로써, 예를 들면 국제공개 2003/035617호 또는 국제공개 1999/40081호에 기재된 합성 방법에 의해 그 물질로서 수집될 수 있다.
[실시예]
이하, 본원은 실시예에 기초해서 보다 구체적으로 기재될 것이다. 그러나, 본원은 이하 실시예에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 실시예에 기재된 미생물은 다음과 같이 기탁된다. 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7은 헤이세이 23(2011) 11월 9일자로 수탁 번호 FERM BP-11437 하에 일본 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터(일본 우편번호 305-8566 이바라키 츠쿠바 히가시 1-1-1 센트럴 6)에 기탁되었다. 부수적으로, 일본 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터(구 명칭: IPOD)에 의한 특허 미생물의 기탁은 2012년 4월 자로 제품평가기술기반기구(우편번호 292-0818 시바 키사라즈시 2-5-8 카즈사카마타리 #122 NITE)에 의해 계승되었다.
(실시예 1)
<유전체 DNA 라이브러리의 제조>
UK-2 생합성에 필요한 유전자를 분리하기 위해서, 우선 UK-2를 생산할 수 있는 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA 라이브러리가 후술하는 방법에 의해 제조되었다.
스트렙토베르티실룸 sp. 3-7은 개질된 YEME(0.3% Difco 효모 추출물, 0.5% Difco 백토 펩톤, 0.3% Oxoid 맥아 추출물, 3.0% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 5 m㏖/L MgCl2·6H2O) 50 ㎖에 접종되고 18시간 동안 30℃에서 220 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양이 완료된 후, 박테리아 세포를 10분 동안 7500 rpm에서 원심 분리하여 수집하였다. 이렇게 얻어진 박테리아 세포로부터, 유전체 DNA는 염석법을 채용하여 제조하였다["Practical Streptomyces Genetics," The John Innes Foundation, (UK), Norwich, 2000 참조].
얻어진 유전체 DNA는 제한 효소 MboI로 부분적으로 절단된 다음, 알칼리성 인산가수분해효소로 처리해서 DNA 말단을 탈인산화시켰다. 이 DNA 단편을, 제한 효소 XbaI로 절단하기 전에 알칼리성 인산가수분해효소 처리하여 탈인산화시키고 추가로 제한 효소 BamHI로 절단한 상업적으로 이용 가능한 코스미드 벡터 SuperCos1(Stratagene Corporation 제조)에 라이게이션시켰다. 따라서, 재조합형 코스미드 벡터가 제조되었다. 이 재조합 코스미드 벡터는 Epicentre Biotechnologies에 의해 제조된 MAXPLAX Lambda Packaging Extracts를 사용하여 인 비트로 패키징을 실시했다. 코스미드 유전체 DNA 라이브러리를 제조하기 위해 대장균 XLI-Blue MRA가 함께 감염되었다.
(실시예 2)
<UK-2 생합성 유전자의 평가>
실시예 1에 기재된 방법에 의해 제조된 유전체 DNA에 기초해서, Roche GS FLX 티타늄 시퀀서용 메이트 페어 라이브러리의 구축을 Genaris, Inc.에 위탁했다. 이어서, 이 시퀀서는 서열을 결정하는데 사용되었다. 이와 별개로, 유전체 DNA에 기초해서 이 시퀀서용 단편 라이브러리가 구성되었다. 이어서, 이 시퀀서는 서열을 결정하는데 사용되었다. 메이트 페어 라이브러리로부터 얻어진 시퀀스 및 단편 라이브러리로부터 얻어진 시퀀스는 함께 조립되어서 콘틱 시퀀스 및 스카폴드 시퀀스를 얻었다.
UK-2는 특유의 3-히드록시피콜린산 골격을 갖는다. 한편, 버지니아마이신도 히드록시피콜린산 골격을 갖는다. 버지니아마이신 생합성에 관여되는 2개의 유전자(visA, visB)가 개시되어 왔다(비특허문헌 2 참조). 따라서, 상동성 분석은 이들 2개의 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 아미노산 서열과 UK-2 생성 박테리아의 유전체으로부터 얻어지는 제안되는 아미노산 서열 사이에서 수행되어서 히드록시피콜린산 골격 형성에 관여되는 유전자의 존재를 검사했다. 표 1 및 2는 얻어진 결과를 나타낸다.
Figure pct00016
Figure pct00017
검사 결과, VisA 및 VisB와 높은 상동성을 갖는 유전자가 연속하여 위치되는 자리는 스크렙토베르티실룸 sp. 3-7로부터 유래된 유전체 상의 단일 자리라는 것을 알아냈다(표 1 참조). 또한, UK-2 골격을 형성하는데 필요하다고 생각되는 비리보솜 펩티드 합성 효소(NRPS) 및 폴리케티드 합성 효소(PKS)와 관련된 유전자가 이들 유전자 근처에 위치하였다(표 2 참조). 방선균의 2차 대사 산물의 유전자가 클러스터를 형성하기 때문에 유전자 주위 영역은 UK-2 생합성 유전자 클러스터가 된다고 예상되었다. 또한, UK-2 생합성 유전자 클러스터에 위치된 유전자(ORFs)와 다음과 같이 각각의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질들의 예상되는 기능 간에 다음과 같은 정령이 존재한다.
ORF1은 잠재적으로 생합성 유전자 클러스터의 조절에 관여하는 유전자이다. ORF5, ORF6, ORF7, 및 ORF16은 3-히드록시피콜린산 골격의 생합성에 관여하는 유전자이다. ORF2, ORF3, 및 ORF17은 벤질말론산 골격의 생합성에 관여하는 유전자이다. ORF13은 피콜린산 골격, 세린, 및 젖산의 생합성에 관여하는 유전자이다. ORF11 및 ORF12는 벤질말론산의 생합성과 피콜린산, 세린, 및 젖산의 신진대사에 관여하는 유전자이다. ORF8은 폴리케티드 합성 효소(PKS)의 황화에스테르 결합의 절단과 피콜린산, 세린, 젖산, 및 벤질말론산의 신진대사에 관여하는 유전자이다.
(실시예 3)
<유전체 DNA 라이브러리의 스크리닝>
UK-2 생합성 유전자의 상류에 위치된 ORF5 시퀀스의 부분은 실시예 1에 제조된 유전체 DNA 라이브러리의 스크리닝을 위한 프로브로서 사용되었고, 후술한 바와 같이 PCR에 의해 제조되었다.
PCR은 프라이머로서 실시예 1에 기재된 유전체 DNA 및 visA'-F: 5'-GGGGCAGCCTGCTCGGCGAG-3(SEQ ID NO: 36) 및 visA'-R: 5'-GGTGAGCTCCCCGATCAGGG-3(SEQ ID NO : 37)의 올리고 DNAs를 사용하여 수행되었다. PCR은 DNA 폴리메라아제로서 LA Tag DNA 폴리메라아제(Takara Bio Inc. 제조) 및 PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700을 사용하여 수행되었다. 유전체 DNA의 0.5 ㎕(0.5 ㎍과 상응하는 양), 효소를 수반하는 2배 농축 반응을 위한 버퍼 25 ㎕, DMSO 용액 2.5 ㎕, 2.5-mM dNTP 용액 5 ㎕, 농도가 100 pmol/㎕로 조정된 각각의 프라이머 0.25 ㎕, 효소 0.3 ㎕, 및 멸균수 16.2 ㎕를 첨가하여 반응액의 양을 50 ㎕로 조정했다. 반응을 다음과 같이 행했다: 10분 동안 95℃에서 전처리; 30초 동안 95℃, 30초 동안 55℃, 및 2분 동안 72℃로 각각 이루어지는 30주기로 인큐베이션; 5분 동안 72℃에서 추가 인큐베이션했다. 반응이 완료된 후, 반응액의 일부를 아가로오스겔 상에 전기 영동시켰다. 결과적으로, DNA 단편의 약 1.3 kbp가 특별히 증폭된다는 것을 확인했다. 이어서, 나머지 반응액을 핵산 정제용 혼합 용액(페놀:클로로폼:이소아밀 알콜=25:24:1, V/V)으로 추출한 다음, 에탄올 침전물로 추출을 실시했다. 침전물을 멸균수에 다시 용해하고, 아가로오스겔 상에서 전기 영동시켰다. 밴드의 약 1.3 kbp가 종래 방법에 의해서 절단되고, DNA 단편이 수집되었다.
콜로니 혼성화법은 프로브로서 DNA 단편 및 ECL Direct DNA/RNA 라벨링과 탐지 시스템(Amersham Pharmacia Biotech Inc. 제조)을 사용하여 수행되었고, 약 5000 콜로니가 스크리닝되었다. 다수의 양성 클론이 얻어졌다. 플라스미드 pUK2-B44는 클론 중 하나로부터 분리되었다.
또한, UK-2 생합성 유전자의 하류에 위치되는 ORF13의 일부가 프로브로서 사용되었고, 후술하는 바와 같이 PCR에 의해 제조되었다.
PCR은 주형으로서 실시예 1에 기재된 유전체 DNA 및 프라이머로서 caiC-F: 5'-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3'(SEQ ID NO: 38) 및 caiC-R: 5'-CGGGCTCGGTGGTGAGCAGG-3'(SEQ ID NO: 39)의 올리고 DNAs를 사용하여 수행되었다. PCR은 DNA 폴리메라아제로서 LA Tag DNA 폴리메라아제(Takara Bio Inc. 제조) 및 PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700을 사용하여 수행되었다. 유전체 DNA의 0.5 ㎕(0.5 ㎍과 상응하는 양), 효소를 수반하는 2배 농축 반응을 위한 버퍼 25 ㎕, DMSO 용액 2.5 ㎕, 2.5-mM dNTP 용액 5 ㎕, 농도가 100 pmol/㎕로 조정된 각각의 프라이머 0.25 ㎕, 효소 0.3 ㎕, 및 멸균수 16.2 ㎕를 첨가하여 반응액의 양을 50 ㎕로 조정했다. 반응을 다음과 같이 행했다: 10분 동안 95℃에서 전처리; 30초 동안 95℃, 30초 동안 59℃, 및 2분 및 20초 동안 72℃로 각각 이루어지는 30주기로 인큐베이션했다. 결과적으로, DNA 단편의 약 2.3 kbp가 특별히 증폭된다는 것을 확인했다. 이어서, 나머지 반응액을 상술한 핵산 정제용 혼합 용액으로 추출한 다음, 에탄올 침전물로 추출을 실시했다. 침전물을 멸균수에 다시 용해하고, 아가로오스겔 상에서 전기 영동시켰다. 밴드의 약 2.3 kbp가 종래 방법에 의해서 절단되고, DNA 단편이 수집되었다.
콜로니 혼성화법은 프로브로서 DNA 단편 및 ECL Direct DNA/RNA 라벨링과 탐지 시스템(Amersham Pharmacia Biotech Inc. 제조)을 사용하여 수행되었고, 약 5000 콜로니가 스크리닝되었다. 다수의 양성 클론이 얻어졌다. 플라스미드 pUK2-B4는 클론 중 하나로부터 분리되었다.
(실시예 4)
<생합성 유전자 클러스터를 포함하는 플라스미드 pUK2-3의 구축>
예상되는 생합성 클러스터의 상류 영역 1~21531과 하류 영역 16211~34641을 각각 포함하는 이렇게 얻어진 플라스미드 pUK2-B44 및 pUK2-E4를 사용해서 전체 생합성 클러스터 영역을 포함하는 플라스미드를 구축했다. 우선, 플라스미드 모두는 제한 효소 ClaI 및 PspXI로 절단된 다음, 아가로오스겔 상에 전기 영동되고, 밴드의 약 28 kbp와 약 19 kbp가 각각 종래 방법에 의해서 절단되어 DNA 단편이 수집되었다. DNA 단편은 DNA 라이게이션 키트<Mighty Mix>(Takara Bio Inc. 제조)를 사용하여 라이게이션되어서 pUK2-16을 제조했다.
이어서, [Gust, B. 등, "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America," (US), 2003, 100권, 1541-1546페이지]에 기재된 전용(redirect) 기술을 사용해서, 플라스미드 pUK2-16이 방선균에 접합 전달 가능한 벡터로서 사용되었다. 우선, 플라스미드 pUK2-16은 전기 영동에 의한 대장균 BW25113/pIJ790 균주에 도입되어서 대장균 BW25113/pIJ790/pUK2-16 균주를 얻었다. 이 균주를 각각 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 클로람페니콜, 카나마이신 및 앰피실린을 함유하는 LB 액체 배지 100 ㎖(1% 백토 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화 나트륨)에 접종하고, 밤새 30℃에서 배양했다. 이어서, 배양액의 100 ㎕를 각각 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 10 mM의 농도로 클로람페니콜, 카나마이신, 앰피실린 및 L-아라비노스를 함유하는 65 ㎖ 시험관에서 제조된 SOB 배지 10 ㎖(2% 백토 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.05% 염화 나트륨, 0.0186% 염화 칼륨)에 접종했다. 얻어진 배양을 4시간 동안 30℃에서 진탕 배양했다. 박테리아 세포를 모든 배양 용액으로부터 수집하고, 빙냉한 10% 글리세린 용액으로 2회 세정하고, 전기 영동용 세포로서 10% 글리세린 용액 100 ㎕에 재현탁했다. 한편, oriT, attP, Int φC31을 함유하는 SspI 단편 5.2 kb 및 pMJCOS1(John Innes Centre(Norwich))로부터 유래된 아프라마이신 저항성 유전자를 정제했다. 이렇게 제조된 DNA 단편(약 100 ng) 및 세포의 50 ㎕를 미리 빙냉한 2 ㎜의 갭을 가진 큐벳에 옮기고, 전기 영동(BM Equipment Co., Ltd.에서 제조된 Electro Cell Manipulator 600을 사용)을 실시했다. 처리 후에, 냉각된 LB 액체 배지 1 ㎖를 생성물에 부가하고, 이것을 배양하기 위해 1시간 동안 37℃에서 정치했다. 이것을 앰피실린 및 아프라마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 적용한 다음, 밤새 37℃에서 배양했다. 성장 균주를 앰피실린 및 아프라마이신을 함유하는 LB 액체 배지 내에서 배양하고, 플라스미드 pUK2-3을 분리했다. 이 pUK2-3은 방선균에 접합 전달할 수 있는 플라스미드이고, 이것은 oriT, attP, Int φC31 및 벡터 일부에 아프라마이신 저항성 유전자를 갖고 전체 영역은 UK-2 생합성 클러스터가 될 것으로 기대된다.
(실시예 5)
<생합성 유전자 결핍 벡터의 구축>
스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA로부터 ORF12 및 ORF13의 일부에 해당하는 약 7.5 kbp의 유전자가 결핍된, 유전자 파괴된 균주를 후술하는 방법에 의해 제조했다.
PCR은 주형으로서 실시예 1에 기재된 유전체 DNA 및 프라이머로서 caiC-F: 5'-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3'(SEQ ID NO: 38)과 41c29-R: 5'-GTCCGTGGCGCCGCCGGATT-3'(SEQ ID NO: 40)의 올리고 DNAs를 사용하여 수행되었다. PCR은 DNA 폴리메라아제로서 LA Taq DNA 폴리메라아제(Takara Bio Inc. 제조) 및 PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700을 사용하여 행해진다. 유전체 DNA의 0.5 ㎕(0.5 ㎍과 상응하는 양), 효소를 수반하는 2배 농축 반응을 위한 버퍼 25 ㎕, DMSO 용액 2.5 ㎕, 2.5-mM dNTP 용액 5 ㎕, 농도가 100 pmol/㎕로 조정된 각각의 프라이머 0.25 ㎕, 효소 0.3 ㎕, 및 멸균수 16.2 ㎕를 첨가하여 반응액의 양을 50 ㎕로 조정했다. 반응을 다음과 같이 행했다: 10분 동안 95℃에서 전처리; 30초 동안 95℃, 5초 동안 60℃, 및 7분 동안 72℃로 각각 이루어지는 30주기로 인큐베이션했다. 반응이 완료된 후에, 반응액의 일부를 아가로오스겔 상에서 전기 영동시켰다. 결과적으로, DNA 단편의 약 7.5 kbp가 특별히 증폭된다는 것을 확인했다. DNA 단편을 이것에 부착된 프로토콜에 따라 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen Corporation 제조)를 사용하여 pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터에 삽입했다. 그렇게 함으로써, 플라스미드 TOPO-41c29를 얻었다.
이어서, 아프라마이신 저항성 유전자를 플라스미드 TOPO-41c29의 삽입된 단편에 삽입해서 다음과 같이 플라스미드 TOPO-
Figure pct00018
41c29-Am을 제조했다.
플라스미드 pIJ733[Gust, B. 등, "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America," (US), 2003, 100권, 1541-1546페이지]를 HindIII 및 EcoRI로 이중 절단시킨 다음, 아가로오스 겔 상에서 전기 영동시켰다. 이어서, DNA 단편을 종래 방법에 의해 절단하고 수집했다. 따라서, 목적 아프라마이신 저항성 유전자를 포함하는 DNA 단편의 약 1.3 kb를 얻었다. PCR은 주형으로서 이 단편 및 41c30-apraF: 5'-GTCACCGTCCCCGCCTACGGCGACGGCGTCGTCCTGGTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(SEQ ID NO: 41)과 41c30-apraR: 5'-GGTCGCGGGCGAAGGCGTAGCCGGGCAGGTCGGGCAGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'(SEQ ID NO: 42)의 2가지 타입의 합성 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR은 DNA 폴리메라아제로서 LA Taq DNA 폴리메라아제(Takara Bio Inc. 제조) 및 PERKIN ELMER GeneAmp PCR 시스템 9700을 사용하여 행해진다.
유전체 DNA의 0.5 ㎕(0.5 ㎍과 상응하는 양), 효소를 수반하는 2배 농축 반응을 위한 버퍼 25 ㎕, DMSO 용액 2.5 ㎕, 2.5-mM dNTP 용액 5 ㎕, 농도가 100 pmol/㎕로 조정된 각각의 프라이머 0.25 ㎕, 효소 0.3 ㎕, 및 멸균수 16.2 ㎕를 부가하여 반응액의 양을 50 ㎕로 조정했다. 반응을 다음과 같이 행했다: 2분 동안 94℃에서 전처리; 45초 동안 94℃, 45초 동안 50℃, 및 1분과 30초 동안 72℃로 각각 이루어지는 10주기로 인큐베이션하고; 이어서, 45초 동안 94℃, 45초 동안 55℃, 및 1분과 30초 동안 72℃로 각각 이루어지는 15주기로 인큐베이션하고; 5분 동안 72℃에서 추가 반응을 수행했다. 반응이 완료된 후에, 반응액의 일부를 아가로오스 겔 상에서 전기 영동시켰다. 결과적으로, DNA 단편의 약 1.4 kbp가 특별히 증폭된다는 것을 확인했다.
이어서, TOPO-
Figure pct00019
41c29를 대장균 BW25113/pIJ790[Gust, B. 등, "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America," (US), 2003, 100권, 1541-1546페이지]에 도입해서 대장균 BW25113/pIJ790/TOPO-
Figure pct00020
41c29 균주를 얻었다. 이 균주를 각각 25 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농축으로 클로람페니콜, 카나마이신 및 앰피실린을 함유하는 LB 액체 배지 100 ㎖에 접종하고, 밤새 30℃에서 배양했다. 이어서, SOB 배지 10 ㎖를 각각 25 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 10 mM의 농축에서 클로람페니콜, 카나마이신, 앰피실린, 및 L-아라비노오스로 보충된 65 ㎖ 시험관에 공급했다. 이것에, 밤새 배양된 대장균 BW25113/pIJ790/TOPO-
Figure pct00021
41c29 균주의 배양액 100 ㎕를 옮기고, 4시간 동안 30℃에서 진탕 배양했다. 모든 배양액을 5분 동안 4℃에서 3000 rpm으로 원심 분리한 다음, 빙랭한 10% 글리세린 용액 10 ㎖에 현탁되어 있는 박테리아 세포를 수집했다. 이 작업을 반복한 후에, 얻어진 박테리아 세포를 냉각된 10% 글리세린 용액 100 ㎕에 재현탁했다. 이어서, 박테리아 세포 현탁액 50 ㎕를 Eppendorf 튜브에 수집하고, 그것에 pIJ773으로부터 유래된 상술한 아프라마이신 저항성 유전자를 함유하는 DNA 단편의 약 1.4 kb의 용액 5 ㎕를 첨가했다. 혼합물을 이미 빙랭한 2 ㎜의 갭을 가진 전기 영동 큐벳(BM6200: BM Equipment Co., Ltd. 제조)에 옮겼다. 전기 영동은 12.5 kV, 25 ㎌, 및 128 Ω의 조건 하에서 Electro Cell Manipulator 600(BM Equipment Co., Ltd. 제조)을 사용하여 행했다. 처리 후에, 이미 빙랭한 LB 액체 배지 1 ㎖를 박테리아 세포에 첨가한 다음, 배양하기 위해서 1시간 동안 37℃에서 정치했다. 이것을 50 ㎍/㎖에서 각각 앰피실린 및 아프라마이신으로 보충된 LB 한천 배지에 적용했다. 생성물을 밤새 37℃에서 배양해서 앰피실린 및 아프라마이신 모두에 대한 내성을 갖는 균주를 얻었다. 이 균주를 50 ㎍/㎖에서 각각 앰피실린 및 아프라마이신으로 보충된 LB 액체 배지 내에서 배양했다. 따라서, 플라스미드 TOPO-
Figure pct00022
41c29Am을 분리했다.
(실시예 6)
<생합성 유전자 결핍 균주의 생성>
플라스미드 TOPO-
Figure pct00023
41c29를 종래 방법에 의해 대장균 ET12567/pUZ8002 균주["Practical 스트렙토마이시스 Genetics," The John Innes Foundation, (UK), Norwich, 2000]에 도입해서 대장균 ET12567/pUZ8002/TOPO-
Figure pct00024
41c29를 얻었다.
스트렙토베르티실룸을 다음과 같이 대장균 ET12567/pUZ8002/TOPO-
Figure pct00025
41c29에 공역했다. 우선, 스트렙토베르티실룸 균주를 65 ㎖ 시험관에서 제조된 액체 배지(S#1)[Ueki, M 등, "The Journal of Antibiotics," (Japan), 1996, 49권, 639-643페이지]에 접종하고, 24시간 동안 30℃에서 배양했다. 생성물을 MS 한천 배지(2% 콩가루, 2% 만니톨, 2% 한천)에 적용하고, 2일 동안 30℃에서 배양했다. 배양 후에, 균사체를 20% 글리세롤 3 ㎖로 스크레이핑함으로써 수집해서 숙주 균사체 용액을 제조했다.
박테리아 세포를 5분 동안 3000 rpm에서 원심 분리하여 수집한 후에, 박테리아 세포를 20% 글리세린 용액 3 ㎖에 현탁했다. 한편, 대장균 ET12567/pUZ8002/TOPO-
Figure pct00026
41c29-Am를 50 ㎍/㎖의 농도에서 각각 앰피실린 및 아프라마이신으로 보충된 LB 액체 배지에 18시간 동안 37℃에서 배양했다. 이어서, 배양액 1 ㎖를 LB 액체 배지(50 ㎍/㎖의 농도에서 각각 앰피실린 및 아프라마이신을 함유) 100 ㎖에 옮기고, 4시간 동안 37℃에서 배양했다. 연속해서, 배양액 50 ㎖를 5분 동안 3000 rpm에서 원심 분리해서 박테리아 세포를 수집했다. 박테리아 세포를 LB 액체 배지 20 ㎖에 현탁했다. 이 작업을 2회 반복한 후에, 박테리아 세포를 LB 액체 배지 2 ㎖에서 현탁했다.
이어서, 스트렙토베르티실룸 세포 현탁액 10 ㎕와 대장균 ET12567/pUZ8002/코스미드203-7의 박테리아 세포 현탁액 100 ㎕를 1.5 ㎖ 관에서 함께 조합하고, 원심 분리해서 박테리아 세포를 수집했다. 20% 글리세린 용액 100 ㎕에서 현탁한 후에, 이것을 20 ㎖ 부피를 갖고 10 mM MgCl2를 함유하는 MS 한천 배지에 적용했다. 18시간 동안 30℃에서 배양한 후에, 아프라마이신 400 ㎍과 날리딕스산 1500 ㎍을 함유하는 멸균수 1 ㎖를 그것에 대해 함침했다. 5일 동안 30℃에서 배양된 후에, 한천 배지에서 성장한 스트렙토베르티실룸 클로니를 순수 배양을 실시하고 아프라마이신 250 ㎍/㎖과 카나마이신 250 ㎍/㎖로 보충된 1/2 MS 한천 배지(한천: 2%, 만니톨: 1%, 콩가루: 1%, 10 mM MgCl2)에서 2일 동안 30℃에서 배양했다. 클로니는 임의의 플레이트에서 성장하고 여러 과정: S#1 배지에 접종한 다음, 24시간 동안 30℃에서 배양하고, 개질된 YEME 배지(65 ㎖ 시험관 내에서 10 ㎖)에 접종한 다음, 1일 동안 30℃에서 진탕 배양하고, 또다른 신선한 개질된 YEME 배지(250 ㎖ 삼각 플라스크 내에서 50 ㎖)에 얻어진 배양물 1 ㎖를 추가 접종하여 계대 배양했다. 이 작업을 5번 반복한 후에, 얻어진 배양물을 이러한 방식으로 희석해서 적정 수의 살아있는 박테리아 세포를 얻었다. 이 배양액을 아프라마이신 250 ㎍/㎖를 함유하는 1/2 MS 한천 배지에 적용하고, 4일 동안 30℃에서 배양했다. 이렇게 성장한 클로니를 아프라마이신 250 ㎍/㎖과 카나마이신 250 ㎍/㎖로 보충된 1/2 MS 한천 배지에서 자기 복제했다. 카나마이신 함유 배지에서 성장하지 않지만 아프라마이신 함유 배지에서 성장하는 2개의 카나마이신-민감성 균주(D1 균주, D2 균주)를 선택했다.
얻어진 2개의 균주의 유전체 DNAs를 제조하고, PCR 반응을 41c30F4: 5'-CGTGACCGAGGTGGCGCG-3'(SEQ ID NO: 43)과 41c30RR2: 5'-GTCGTCGGATGCGCCGTGCG-3'(SEQ ID NO: 44)의 프라이머의 조합을 사용하여 수행했다. 증폭된 DNA 단편의 약 0.5 kbp가 얻어지지 않기 때문에 고안한 대로 2개의 균주는 균주를 파쇄한 것으로 확인되었다.
(실시예 7)
<생합성 유전자 결핍 균주의 배양, 및 배양액에서 UK-2A의 정량화>
파쇄된 균주, D1 균주와 D2 균주를 250 ㎖ 삼각 플라스크 내에서 제조된 S#1 배지[Ueki, M, 등, "The Journal of Antibiotics," (Japan), 1996, 49권, 639-643페이지] 50 ㎖에 각각 접종하고, 24시간 동안 30℃에서 진탕 배양했다. 이어서, 배양액 1 ㎖를 생성 배지에 접종하고, 4일 동안 30℃에서 진탕 배양했다. 이어서, 아세톤 4 ㎖를 얻어진 배양액 1 ㎖에 첨가함으로써 여과되는 UK-2A를 추출해서 추출액을 얻었다. 이것에 대해서, 5 ㎕로 HPLC 분석을 실시했다. HPLC 분석에 있어서, HPLC 시스템 LC-2010C(Shimadzu Corporation 제조)를 분석에 사용했다. 분석 조건으로서, 칼럼은 Inertsil ODS-3 4.6×250 ㎜이고, 이동상은 아세토니트릴:물:인산=60:40:0.1이며, 유동 속도는 1.1 ㎖/분이고, 칼럼 온도는 40℃이며, UV 파장은 340 ㎚이다. 얻어진 패턴을 UK-2A 표준 시료의 것과 비교했다. UK-2A로부터 유래된 피크를 확인했다. 그것의 영역에 기초해서, UK-2A를 정량화했다.
동시에, 배양액에서 UK-2A의 동일한 배양과 정량화를 형질전환체의 친주인 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7에 대해서도 행했다. 결과적으로, D1과 D2 균주에 의한 UK-2A 생산성은 0 ㎍/㎖이었다.
(실시예 8)
<생합성 유전자 클러스터 도입된 형질전환체의 생성>
구축된 pUK2-3을 방선균에 일반적으로 사용되는 방법["Practical Streptomyces Genetics," The John Innes Foundation, (UK), Norwich, 2000, 311-338페이지]에 따라 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7에 도입했다. 우선, 플라스미드 pUK2-3을 종래 방법에 의한 전기천공법에 의해 대장균 ET12567/pUZ8002 균주 내에 도입했다. 이 균주를 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도에서 각각 클로람페니콜, 카나마이신 및 아프라마이신으로 보충된 LB 액체 배지 내에 18시간 동안 37℃에서 배양했다. 이어서, 배양액을 LB 액체 배지(25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도에서 각각 클로람페니콜, 카나마이신 및 아프라마이신을 함유) 100 ㎖에 옮기고, 4시간 동안 37℃에서 배양했다. 연속해서, 배양액 50 ㎖를 5분 동안 3000 rpm에서 원심 분리해서 박테리아 세포를 수집했다. 박테리아 세포를 LB 박테리아 배지 50 ㎖에 현탁했다. 이 작업을 2회 반복한 후에, 박테리아 세포를 LB 액체 배지 100 ㎕에 현탁했다.
한편, 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7을 MS 한천 배지에 적용하고, 2일 동안 30℃에서 배양했다. 배양 후에, 균사체를 20% 글리세롤 1 ㎖로 스크레이퍼해서 숙주 균사체 용액을 제조했다.
이어서, 상술한 바와 같이 제조된 플라스미드 pUK2-3을 포함하는 숙주 균사체 용액 500 ㎕ 및 대장균 용액 500 ㎕를 함께 혼합하고, 박테리아 세포를 수집했다. 이어서, 박테리아 세포를 10 m㏖/L로 최종 농도를 주기 위한 이러한 방식으로 10 mM MgCl2를 첨가하여 희석시킨 MS 한천 배지에 적용했다.20시간 동안 30℃에서 배양한 후에, 아프라마이신 6 ㎎과 날리딕스산 0.5 ㎎을 함유하는 멸균수 0.5 ㎖를 그것에 대해 함침했다. 5일 동안 30℃에서 추가 배양한 후에, 형질전환체를 아프라마이신 내성 균주로서 얻었다.
(실시예 9)
<유전자 도입된 형질전환체의 배양, 및 배양액에서 UK-2A의 정량화>
유전자 도입된 형질전환체를 실시예 7에 기재된 방법에 의해 배양했다. 결과적으로, 표 3에 나타낸 바와 같이, 유전자 도입된 형질전환체의 UK-2A 생산성이 친주의 것과 비교해서 58~77배 향상되었다.
Figure pct00027
(실시예 10)
<유전자 도입된 형질전환체의 배양, 및 배양액에서 UK-2A, UK-2B, 및 UK-2C와 UK-2D의 합의 정량화>
유전자가 도입된 형질전환체를 실시예 7에 기재된 방법에 의해 배양했다. 구체적으로, 아세톤 4 ㎖를 얻어진 배양액 1 ㎖에 첨가함으로써 여과되는 UK-2A, UK-2B, UK-2C 및 UK-2D를 추출해서 추출액을 얻었다. 이것에 대해서, 5 ㎕로 HPLC 분석을 실시했다. HPLC 분석에 있어서, HPLC 용액 시스템(Shimadzu Corporation 제조)을 분석용으로 사용했다. 분석 조건으로서, 칼럼은 Inertsil ODS-3 4.6×150 ㎜이고; 이동상은 약 800 ㎖의 물로 아인산 이수소나트륨 이수화물 7.8 g을 용해하고, 인산을 사용하여 생성물의 pH를 4.0으로 조정하며, 이것에 물을 첨가해서 인산 수용액 1000 ㎖를 제조하고, 인산 수용액 350 ㎖에 액체 크로마토그래피용 아세토니트릴 650 ㎖를 첨가함으로써 얻어지는 용액이며; 유동 속도는 1.0 ㎖/분이고; 칼럼 온도는 40℃이며; UV 파장은 230 ㎚였다. 얻어진 패턴을 UK-2A, UK-2B, UK-2C 및 UK-2D 표준 시료의 것과 비교했다. UK-2A, UK-2B, UK-2C 및 UK-2D로부터 유래된 각각의 피크를 확인했다. 그것의 영역에 기초해서, UK-2A의 양, UK-2B의 양, 및 UK-2C와 UK-2D의 합계를 판단했다.
결과적으로, 표 4에 나타낸 바와 같이, 유전자가 도입된 형질전환체의 UK-2A, UK-2B, 및 UK-2C와 UK-2D의 합계의 생산성을 각각 친주의 것과 비교해서 37~57배, 10~11배, 및 12~13배 향상시켰다.
Figure pct00028
(실시예 11)
<형질전환체의 UK-2 생합성 유전자 클러스터의 복제수의 정량화>
실시예 9에서 향상된 UK-2 생산성을 갖는 것으로 확인된 형질전환체 2 균주와, 숙주 세포였던 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7의 유전체 DNA가 실시예 1에 기술된 방법에 의하여 준비되었다. PCR 반응을 주형으로서 유전체 DNAs 및 그것에 부착된 프로토콜에 따라 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied BioSystems Inc. 제조)을 사용하여 행했다. 이렇게 얻어진 증폭된 단편을 정량화했다. 표 5는 얻어진 결과를 나타낸다.
단, PCR 반응에서 하기 프라이머 세트가 설계 및 합성되었고, 도입된 UK-2 생합성 유전자 클러스터 내의 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다.
UK-2 F2 (RT): 5'-GCACCTTCATGTCCGGGTTG-3'(SEQ ID NO: 45)
UK-2 R2 (RT): 5'-ATCGCCGCGTACACCATGAC-3'(SEQ ID NO: 46).
또한, 하기 프라이머가 설계 및 합성되었고, UK-2 생합성 유전자 클러스터 이외의 영역을 증폭시키기 위해 내부 제어로서 사용되었다.
cont F1 (RT): 5'-CGAAGGTCCGGTTGATGGTG-3'(SEQ ID NO: 47)
Cont R1 (RT): 5'-ATCGCTGCGACACCCTGGAG-3'(SEQ ID NO: 48)
Figure pct00029
표 5에 나타낸 바와 같이, 형질전환체의 UK-2 생합성 유전자 클러스터의 복제수가 친주 sp. 3-7의 것에 2배인 것으로 드러났다.
[산업상 이용 가능성]
상술한 바와 같이, 본원은 UK-2 생합성 유전자 또는 UK-2 생합성 유전자 클러스터의 도입에 의해 높은 UK-2 생산성을 갖는 형질전환체를 제공하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본원의 형질전환체를 사용함으로써 저비용으로 UK-2의 대량 생산이 가능해진다. 따라서, 본원은 도열병 방제제, 농원예용 살진균제, 및 의약 항매제를 생성하는데 유용하다.
[기탁된 생물학적 재료에 대한 참조]
[수탁 번호]
1. (1) 확인용 표시: 스트렙토베르티실룸 sp. 3-7
(2) 수탁 번호: FERM BP-11437
(3) 기탁일: 2011년 11월 9일
(4) 기탁 기관: 국제특허생물기탁센터, 일본 산업기술총합연구소
(5) 국제특허생물기탁센터, 일본 산업기술총합연구소(구 명칭: IPOD)에 의한 특허 미생물의 기탁은 제품평가기술기반기구(NITE)로 2012년 4월에 계승되었다.
[서열 목록 전체 텍스트]
SEQ ID NOs: 36~48
<223> 인위적으로 합성된 프라이머 서열
국제특허생물기탁센터 IPODFERMBP-11437 20111109 일본 산업기술총합연구소 NITEFERMBP-11437 20111109
SEQUENCE LISTING <110> Meiji Seika Pharma Co., Ltd. <120> UK-2 BIOSYNTHETIC GENE AND METHOD FOR IMPROVING UK-2 PRODUCTIVITY USING THE SAME <130> IBPF13-515WO <150> JP2012/153986 <151> 2012-07-09 <160> 48 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 31318 <212> DNA <213> Streptoverticillium <400> 1 atgagttcct tggcgacccc cacccccact ctcgagggcc tcctcacgac accggcggcg 60 cagcacgccg aagcacaccc cccgctccac cggccgggct cggccacggc ctgcctcgac 120 cggggcctgg tcctccggca ggcggacgag gagttcttcc gccggttcgg cggctcggcc 180 ccgcgcctcg tcggccggtc cttcaccgag ctggtgcacc ccggctgccg ggagcccctg 240 ctgcggcagt tcgccgggct caccgagggc cggcgcgacc ggttcggcac cgaggtcatc 300 gcggtgggcc cggacggcac cccgttccgg accgacctga cggcgctggc ggtacgcggc 360 ggaacccccg acatctcggc cgtctggctg acgctggcgg cggccggcga gaccgcgcag 420 cccgccgccg cgacgccccg caagaagatc ctcagcgaga tcgacgcccg catcctcgaa 480 ggcatcgcgg ccggtgtctc caccgtcccc ctggccgcac gcctgtatct gagccggcag 540 ggggtcgagt accacgtgaa gagcctgttc cggcagctcc gcgtgcccaa ccgggccgcg 600 ctcgtctccc gcgcctactc catgggcctg ctcaaggtgg ggacctggcc gcccaaggtg 660 gcgccggact tcgtcaagtg agcccggacc gcggggtgat gacgtgtcgc ggcgcggggt 720 ccgcgtgcag ccgggcgacc agcggcgcgc gggcggccag cacccggcgc tggttgacgt 780 agcccttgtc ggtgatctcg cccgcgtcca ggtcgggcgg gtccgcgagc accagcagcc 840 gctggacccg ggacgcggac ccggcgcccc ggttgagtcg ctccagtgcc gcgccgaggt 900 gggcggccag cgcgtcggag tacagcaccc cgccgtccgc ggccggccgc cggccgagca 960 gccgctcggc ctcggccggg tcgagccacg ccagcgcgca gaccgcgtcc cggtgctccc 1020 cggtgatcac cgcgtcggag aggaccggcg cggccgaaag cagcgcgccg cgcacggctt 1080 cgacgtgcac gaacgtaccg gtggacagct tgaagtcctc ggtcagccgg ccccggaaca 1140 ccagccccgc gcccgcgtcg ccggggtcgg cgaacgcgac ggcgtctccc ggccggtagt 1200 agccctcctc gtcgaaggcg cgcgcgtcga ggtccgggcg gccgaggtag ccgggcgtca 1260 cgtgcgggcc gcgcacccgg acctcgtagc cgtcaccctc cgccggtacg agcttcagct 1320 ccacccccgg cagcggcacg ccgatgcacc gcgggtcggt gaacgggaag tgcgcgctgg 1380 tggacgccgg cgaggtctcg gtggcgcccc acgagcccgt caccggcacg tcccgcccgg 1440 tcacttcgcg gcccagcgcc cggagccgtt cgcgcagggc cggggccagc gccgccgccg 1500 cgttgaagac gagccgcagc cgggcgaaga accgctccgc cagctcccgg tcgcgctcca 1560 gggcggggac gagccgcgcg tacccggccg ggacgttgaa cgccagggtc ggggagacct 1620 cgcgcaggtt ggccagggtg cgcccgaaca gctccggggt cgggcggccg tcgtcgaggt 1680 acagagtgcc gccgttggcc agcaccaggt tcacgttgtg gttgccgccg aaggtgtggc 1740 tccacggcag ccagtccagc agcaccggcc gctccccggc caggaacggc cacacctgcc 1800 gcatcatccg ctggttggca cagagcatgc cgtgcgtggt gacgacgccc ttcggcgctc 1860 ccgtcgagcc cgacgtgaag aggaccttcg cgaccgtcgc gctcgtgacg cccgcacggg 1920 ccgcctcgaa cgcgcggccc ggcaccgtac gcagcagggc gtccagcgag tgctccgccg 1980 gcccgccccg cgccgccacg acgatggctc caccgcccgc cgcggccagc gcgggaccga 2040 acggcccggc gtcctcggcg tacaccgcgc ccggccgcag cagttccgcg atcgcccgga 2100 tccgcgcgtg gtcccggctc agcagggagt aggcgacgct gaccggcgcc accgggatcc 2160 cggcgctcag cgcgccgagc gtcatcagca ggtgcccggt ggagttgccg gacaggacca 2220 tcagcggccg ccgcgccgac agcccgcggt cgagcagcgc ctgcccgacc gcctccgccg 2280 ccgccagcac ctcgccgtac gtgcggtgcc cccaccggcc gtcggccccg cgctcggcga 2340 ccagcgggcg gtcgggcccg gcctgggccc aggtgcggag atggtcggtc acggaggcgg 2400 gatacacccc cagcggctgc gccgacgaga ggagcacggt cccgtccggc cggtcccgcc 2460 ggacggtccg ggcgggcgcg aacagcggtg acgaggtctc cccggcggtg gtcccaccgg 2520 cggcggagtg cggggcggtg cgcgtggtcg ggtgcggcat cggggttccc tcccggtctc 2580 gcggggctgt cagacgtgcc gctcgaccgc gcggcggagc tcgcccgcgc gcagcagggc 2640 ggcgacggtc tcgatgtcgg cgtccagcgg ccggtcggcg gagaggaacg gcgagtaccc 2700 gcggacgagc gtgtgcgcgg cccgggtcgc gctccccagc cgcccgaccc cggtgaggtc 2760 cgcggcctgg cacagggcga gcaggtggat ggcggtgacc tggctcgtca gccggaccac 2820 cgtgtgcgcg tgccgcgcgg cgatggtgcc catgctcacc ttgtcctggt tgtgcgcctc 2880 ggtcgaacgg gagaacgagc tcacgggcat cgtcaggtgc agcgcctcgg cggtcagcgc 2940 ggacgcggcg atctgcgcgc ccttgaaccc gtggtgcagc cctgcctccg ggtcgtcggg 3000 accgaccggg acgaccaggt tcggggtgag gccgatgctg aacttgtcgt ccaccaggat 3060 cgccagctgg cggtcgagca ggtcggcgac cccggccacg gcggcggaga ccgcctgcgc 3120 cgcctgggcg 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ctgacctggc ggccgctgct gtcgccgaag ccggtcgtca ccccgtagat 4020 cgggatgccg gaggcgacga tccgctccgt ggcctcccgc gacgccgtca tgcgctcggc 4080 cgcggccgcc gcgagggcga ttctctgctt gcccggctgg gtcgcgaccc gccgcacggc 4140 ccgcagcgag aggctgtggc cgtccagctc gatggtggtg tcgtcggtgg gcgaggccat 4200 gtcggtcccc ttcggtcggt gggcgatggg cggtgggcga tcgaccgcgt gcgccgctcc 4260 ttgccgggcg gcccgcggac gccggtccgc ggtcgcggag ccgtgggtgt gcgcgccggc 4320 ggtacgggag aggggcccgt cgccgccggc gggatgggtg ggcgtggggg cgttgctcag 4380 ccgggcgttc cgccgatgcc ccactggtcg cgggggatgc cctggagcgt cacccacgtc 4440 acgtcgcggc actcggggcc gagggcgcgg accgccgcct cggtgagctc cccgatcagg 4500 gcgcggcggg tctcgggcgt gaggcggtct tcgtagaggc tgacctggat caggggcacg 4560 agggttcctt ctctcgtcgg gcgggtgctt cccggccact cagcgcggcg gccaggttgg 4620 cgccgagggt ctcgacctgg cgatcggtca tggcggggtg gcagggcagg ttgaggtgct 4680 cgccgaacca caggcgttcg gcgaccgggc actcgccctc gccgtgcccg cgcagccgcc 4740 actcgggcag caggtgcacc gggtggtagc gcaactgggc gggggtaccg gagcgttgca 4800 gggcgtccag cacgcggtcg cggcgtccgt cgccggggac gagcgcggtg tagaggtggt 4860 acgggtgcac cgcgtcgggc gcggcggtca gcggccggac gtcgaagcgg cggcacaccg 4920 cgtcgagttc cgcggcgatc gcccgccggc gggcgacgaa ctccggcagc cgttccagct 4980 gcaccaggcc caccgcgcag gcggcctcgg agagcgcggc gttggtcccg ctgccccgca 5040 gccccgtgca gtcctcccgg taggcgtagt cggcgtacgc catccacggc agcgccgcgg 5100 ggggccggcg gtgcgcggac gaggtgaagg tgccgtccac cgcgttcgac cggatccggt 5160 cgatcctgcg ggccagttcg ggcgacgggg tgcacaccat gccgccctcg ccgagggtgg 5220 tgatgttctt ggacgcctgg aagctgaagc aggacaggtc gccgagcgcg ccggggcggc 5280 ggccccggta ctcggcgccg atcgcgtgcg cgcagtcctc caccacgagg gcgccgtgcg 5340 cgtgcgcgat ggcggtgatc cggtccatgt cggcggggtt gccgccgtag tggacgagga 5400 tgacggcctt cgtgcgctcg ttgacgagag tctccagcgc gtccgggtcc atgttgaggc 5460 tgcccggctc cacgtcgcag aatcgcaccg ttgcctcggt cgcgagcagc ggctgcgcgg 5520 tggcgtggta cgtctgcggc gtcacgacga cctcgtcccc ggcccgcagg tcgagcagcc 5580 ggatcgcgat ctccagcgcg accgtcccgc tggtgaccgt cagggcgtgc gcggcgccga 5640 cgtgccgggc gaaggcccgc tcgaactcct cgcgcaccgg gcccatcgac aggggcgcgt 5700 ccgcgcgcag cacctcggcc acggcccgca cctccgcctc gccgagcagg ctgccccggt 5760 gcgggtggac gtcgccggcg cggtccgccg tcgcccggct cacgagcggg caccggccgg 5820 ctcggggtcg gacccggcgg cgtccgggcc cggcggcgcg tcgaggccga ggtcggccac 5880 gaggcgcttc ttgtcgacct tgccgaggcc gctcttgggg aacgcctcga cgcacacgac 5940 ccggtcgggg aacttgtagg acgccagccc gcggtcgcgc aggtagcggc gcagctcgcc 6000 cagggtcggg ggcgtgccga ccgggatgat cacggcgcag gtgcgctcgc cgaggacggc 6060 gtcggccatc ggcaccacgg cggcctggtc gatccgctcg tggccggtga ggtggccctc 6120 cagctcgggg gcggacacct tgtcgccgcc gcggacgatg acgtccttcg cgcggcccat 6180 caccacgacg ccgccgtcgt cggtgatccg caccaggtcg ccggtgcggt agaagccgtc 6240 cggggtgaac gccccggcgt tgtgctcctc ggcccggtag tagccgcgca gggtgtacgg 6300 gccccgggtg agcagctcgc ccgtcccgcc ggccgccacc tcgtcgcccg ccgcgtccac 6360 cacccgcagt tcgtcgtggg gggagatggg ccggccctgg gtggtgagga cggtctcggg 6420 cgcgtcctcg cggcgcgtga ggcacagcag gccctcggac atcccgaaca cctgctggag 6480 acgggccgtc agcgccggtc cgacctcctc ggcgagcgac cggtgcacca ccgcgctgcc 6540 gacctgcacc agctccagcg tcgccagctc ctcccggcgc ccgtcggcgg cggcgatcca 6600 ggagtgcgcg atcgtcggca cgaccgacgt cgtggtgacc ccgtgccggg cgatgagcgg 6660 gaagcacacc tgggggtcgg gcacggtgct cagcacgacg gcgcccccgt tggcgaacac 6720 cccgaccaca cccgggcagc cccacgtgaa gttgaaggcg atcggcaggg tggcgaggta 6780 gcgggtgtcc tcggagtact cgcagatccc ggcggcggta cgggcctggt acaggtagtc 6840 gtcgtgcgtc cgcgggatga gcttcggcag cgccgtggtg ccgccggaca gcaggaagaa 6900 ggccacgtcc gacgcgtcgg gaccggtcgc gccggccggg tccaggggcg tctccgcctc 6960 gggaagcggc gcgaactccc cggggtcgcc gaccacgaac acgtgccgga gcgacgcgtg 7020 ccgctcgcgc agggaccggg ccagcccgcg gtggtcgaac cccaggaacc ggtcgagggt 7080 cacgtaggcg ctcgccccgg tcaggccgca gatgtggtcc agctccgcca tgcggtggtt 7140 gggcagcgtg aagaccggca gcacaccgat gcggaagaag gcgaacgaca ccgccacgtg 7200 ctcggcgacg ttgggcagtt ggagcacggc ccggtcgccc gcccgcaggc cggcggccga 7260 gaacccggcg gccaggcggt cggcccaccg gtcgagggcg gcgtaggtga aggaccgctc 7320 cccgtcgatc agagccacgt tgtccggggt gcgcgcggcc tgggaacgca gcagctcgcc 7380 caggggctca ccggcccagg tgccgtcggc ccggtagcgc tccgcggtct cggccggcca 7440 ggggacgaaa ccatcgagtc catcgagtcc atcgagaaga ggcatggcag gggctcacct 7500 tcgttctgtg acggctggca tcggagaacg gtctatcaac ggagctctga ggaattcctt 7560 agtcctgccg cggctagcct cacgtcccgg tcgggccggt cgggccggac gcaccggaca 7620 gaggggagca cccgtcatga ccgtcgacga ggcttcggcg cacgagggcc gcctgccggc 7680 cttcgaggtg ttcgaccagg gcttcaagac cgatccgtac ccgtggtacc gcaagctgcg 7740 cgaggcggcg ccgatccacc gggtacggat gaccctgggc gcggacgtgt ggctggtgac 7800 cggctacgag ctggcgaaga ccgtgctcgc ggacggccgg ttctccaaga tgaccgtcaa 7860 cgccgagcgc gcgtggcgct ccctggagct catcccggac gaccccgacg ccctggtcaa 7920 ccggatgctg ctgatgagcg atccgcccga ccacgagcgc ctccgccgcc tggtgtcccg 7980 ggcgttcacg gcgcgctcga tggaggcgat gcggccccgc atcgccgagg tcgccgacga 8040 actcgtcgca cggttcgccg gccggggccg cgtcgacctc atccgcgagt tcgcgttccc 8100 gctgcccgcc atgatcatct gcgatctgct cggcgtcccc gccgaacacc gcacccggtt 8160 cgaggagtac ctgcggctgc tctgcctggc cgaacccgag gacgtccacc ggatgcccgc 8220 cgtcttcgcc gaactcacgg cggaactcgc cgagttggtc gagcgcaagc gggccgagcc 8280 cgacgggcac ctgctctccg cgctggtcgg gatccgggac ggcagcgacc ggctcaccga 8340 cgacgaactg gtctccatgg ccttccagct catgtacggc gcccaggaca ccaccgtcaa 8400 cctcatcggc aacggcatgc tcgccctgct ggacaacccc gccgccatgg ccgaactgcg 8460 ggagaacccg gagctcatcc cgggcgccgt cgaggagatc ctccgcttcg acccgccggt 8520 ggagaccgcc accccgcggt acgccctgga accgctcgac gtcggcggga tgcgcgtgga 8580 gaagggcggg gtcgtgctcg tctccctcgc gagcgcctcc cgcgaccccg ggcagttcga 8640 ggaccccgac gtcttcgaca tccaccgcga ggtgcgcgga cagctcgcgt tcgggcacgg 8700 gctgcactac tgcctcgggg ccgtgatggc ccgcgtgaag ggcgaggtcg ccctgcgggc 8760 cctgctgtgc ggcctggacg acctgcgccc ggacgaggac gccgaaccgc tcgcgcgcca 8820 cgccgggttc atcatgcgcg ggctgaaggc gctccccgtc cgcttcaccc cgcgcgccgc 8880 gtgaaccgga cgcgcccgcc ccgcaccgcc tcgggaccct gggtgccgca ccggcccggc 8940 accgccccgg gaccggtgac gctgttctgc ttcccctacg ggggaggcgg cagccgcgcc 9000 tacgccgaac 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816 Met Ser Gly Ala Val Lys Ser Trp Gln Gly Ala Ala Thr Ala Gln Tyr 260 265 270 ccg ggg tac gag aag ctc gcc gac aag gtc gcc tcc tcc gac ctg cgc 864 Pro Gly Tyr Glu Lys Leu Ala Asp Lys Val Ala Ser Ser Asp Leu Arg 275 280 285 aag tcg tgg gag cag gac aag gtg ctg atc ggc acc acc ggc gac atc 912 Lys Ser Trp Glu Gln Asp Lys Val Leu Ile Gly Thr Thr Gly Asp Ile 290 295 300 acc gag cag ctg gag cgg gtg cgc gag cgg gtg ggc ggc gac gtg acc 960 Thr Glu Gln Leu Glu Arg Val Arg Glu Arg Val Gly Gly Asp Val Thr 305 310 315 320 gtc agc ctg cac atg aac aac ggc gtg acg cca ctg gag cag gcg cgg 1008 Val Ser Leu His Met Asn Asn Gly Val Thr Pro Leu Glu Gln Ala Arg 325 330 335 tgg gcg gtc gcc gag ttc gcc gcc gag atc gcg ccg cgg ttc gcg gct 1056 Trp Ala Val Ala Glu Phe Ala Ala Glu Ile Ala Pro Arg Phe Ala Ala 340 345 350 gcc tga 1062 Ala <210> 31 <211> 353 <212> PRT <213> Streptoverticillium <400> 31 Met Asp Phe Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ala Leu Asp Glu Arg Asp Lys 1 5 10 15 Ala Pro His Asp Tyr Phe Asp Asp Cys Leu Ala Leu Ala Val Asp Ala 20 25 30 Asp Arg Leu Gly Tyr Glu His Val Gln Val Val Glu His His Leu Gly 35 40 45 Pro Tyr Gly Gly Tyr Ser Pro Asp Pro Val Val Leu Leu Ser Ala Ile 50 55 60 Ala Ala Arg Thr Glu Arg Leu Arg Ile Thr Thr Gly Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 Ala Phe Asp His Pro Leu Lys Leu Ala Gly Arg Leu Ala Met Leu Asp 85 90 95 Gln Leu Ser Gly Gly Arg Val Asp Val Gly Val Gly Arg Ala Phe Leu 100 105 110 Pro His Glu Phe Thr Ala Phe Glu Val Ser Met Glu Glu Ser Arg Ala 115 120 125 Arg Phe Thr Glu Ala Leu Arg Ala Phe Val Ala Leu Trp Thr Gly Thr 130 135 140 Asp Val Val Phe Glu Gly Glu Phe His Arg Phe Gly Ser Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Pro Arg Pro His Gln Thr Pro His Pro Pro Leu Phe Val Ala Ser 165 170 175 Ala Ser Ser Ala Glu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Arg Glu Gly His Asn 180 185 190 Leu Gln Ile Val Pro Thr Ile Thr Ser Gly Glu Gln Phe Ala Glu Met 195 200 205 Leu Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Phe Ala Ala His His Pro Asp Arg Ala 210 215 220 Pro Arg Ile Gln Val Lys Tyr Ser Cys Tyr Leu Asp Arg Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ser Ala Trp Arg Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ser Asn Tyr Leu Asp Lys 245 250 255 Met Ser Gly Ala Val Lys Ser Trp Gln Gly Ala Ala Thr Ala Gln Tyr 260 265 270 Pro Gly Tyr Glu Lys Leu Ala Asp Lys Val Ala Ser Ser Asp Leu Arg 275 280 285 Lys Ser Trp Glu Gln Asp Lys Val Leu Ile Gly Thr Thr Gly Asp Ile 290 295 300 Thr Glu Gln Leu Glu Arg Val Arg Glu Arg Val Gly Gly Asp Val Thr 305 310 315 320 Val Ser Leu His Met Asn Asn Gly Val Thr Pro Leu Glu Gln Ala Arg 325 330 335 Trp Ala Val Ala Glu Phe Ala Ala Glu Ile Ala Pro Arg Phe Ala Ala 340 345 350 Ala <210> 32 <211> 630 <212> DNA <213> Streptoverticillium <220> <221> CDS <222> (1)..(630) <223> <400> 32 atg agc agc gaa gta ccc gag atc agg gtc agc gac gag cgg gtc aac 48 Met Ser Ser Glu Val Pro Glu Ile Arg Val Ser Asp Glu Arg Val Asn 1 5 10 15 cgc acg ctc acc gcg gtc aac gcc cgg gcg gcc gag cac gac cgg tcg 96 Arg Thr Leu Thr Ala Val Asn Ala Arg Ala Ala Glu His Asp Arg Ser 20 25 30 cta ttc gag cag gtg cgc gac tcg ctg gcg gtc gcg gtg ccg ccg gag 144 Leu Phe Glu Gln Val Arg Asp Ser Leu Ala Val Ala Val Pro Pro Glu 35 40 45 gcg ggc acg ctg atg tac cag ctc gtg cgc gcc acc cgg gcc gcc aag 192 Ala Gly Thr Leu Met Tyr Gln Leu Val Arg Ala Thr Arg Ala Ala Lys 50 55 60 gtg gtg gag ctg ggg atg tcg ctc ggc gtc tcc acg gtc tac ctc gcc 240 Val Val Glu Leu Gly Met Ser Leu Gly Val Ser Thr Val Tyr Leu Ala 65 70 75 80 gcc gcc gtg cgc gac aac ggg ggc gag ggg cgg gtc tac acg acc gag 288 Ala Ala Val Arg Asp Asn Gly Gly Glu Gly Arg Val Tyr Thr Thr Glu 85 90 95 atc gac gag gcg aag atc aag cag ggc cgc gcc acc ctg gcc gac gcc 336 Ile Asp Glu Ala Lys Ile Lys Gln Gly Arg Ala Thr Leu Ala Asp Ala 100 105 110 ggc gtc gcc gac ctc gtc gag gtg ctg gag ggc gac gcg ctc cag acc 384 Gly Val Ala Asp Leu Val Glu Val Leu Glu Gly Asp Ala Leu Gln Thr 115 120 125 ctg gac tcg gtg ccc gac ggc gtc cag ttc gtc ctg ctc gac ggc tgg 432 Leu Asp Ser Val Pro Asp Gly Val Gln Phe Val Leu Leu Asp Gly Trp 130 135 140 aac gag agc tac ctg cgg gtg atg aag atc ctg gag ccc aag ctc gcg 480 Asn Glu Ser Tyr Leu Arg Val Met Lys Ile Leu Glu Pro Lys Leu Ala 145 150 155 160 ccg ggc gcc ctc gtg ctc gcc gac gac gtc aac ctc ttc ggc gag ggc 528 Pro Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Asp Val Asn Leu Phe Gly Glu Gly 165 170 175 tgc gtg gac ttc ctg gag tac gtc cgc gac ccc gcg aac ggc tac ctg 576 Cys Val Asp Phe Leu Glu Tyr Val Arg Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Leu 180 185 190 tcc gtc aac ttc ccg atg ggc gag ggc ctg gag ctc agc atg cgc gtg 624 Ser Val Asn Phe Pro Met Gly Glu Gly Leu Glu Leu Ser Met Arg Val 195 200 205 ggc tga 630 Gly <210> 33 <211> 209 <212> PRT <213> Streptoverticillium <400> 33 Met Ser Ser Glu Val Pro Glu Ile Arg Val Ser Asp Glu Arg Val Asn 1 5 10 15 Arg Thr Leu Thr Ala Val Asn Ala Arg Ala Ala Glu His Asp Arg Ser 20 25 30 Leu Phe Glu Gln Val Arg Asp Ser Leu Ala Val Ala Val Pro Pro Glu 35 40 45 Ala Gly Thr Leu Met Tyr Gln Leu Val Arg Ala Thr Arg Ala Ala Lys 50 55 60 Val Val Glu Leu Gly Met Ser Leu Gly Val Ser Thr Val Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Ala Ala Val Arg Asp Asn Gly Gly Glu Gly Arg Val Tyr Thr Thr Glu 85 90 95 Ile Asp Glu Ala Lys Ile Lys Gln Gly Arg Ala Thr Leu Ala Asp Ala 100 105 110 Gly Val Ala Asp Leu Val Glu Val Leu Glu Gly Asp Ala Leu Gln Thr 115 120 125 Leu Asp Ser Val Pro Asp Gly Val Gln Phe Val Leu Leu Asp Gly Trp 130 135 140 Asn Glu Ser Tyr Leu Arg Val Met Lys Ile Leu Glu Pro Lys Leu Ala 145 150 155 160 Pro Gly Ala Leu Val Leu Ala Asp Asp Val Asn Leu Phe Gly Glu Gly 165 170 175 Cys Val Asp Phe Leu Glu Tyr Val Arg Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Leu 180 185 190 Ser Val Asn Phe Pro Met Gly Glu Gly Leu Glu Leu Ser Met Arg Val 195 200 205 Gly <210> 34 <211> 1341 <212> DNA <213> Streptoverticillium <220> <221> CDS <222> (1)..(1341) <223> <400> 34 atg acg gaa ctg cgt gac gcg gtg ctg cgt ggc gcg tcc ccc gag gaa 48 Met Thr Glu Leu Arg Asp Ala Val Leu Arg Gly Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 ctg ctg cgc gcc ccc ctc ccg gcc acc tac cgg gcc gcc cac ctg cgc 96 Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro Ala Thr Tyr Arg Ala Ala His Leu Arg 20 25 30 gcc gag gac gtc ggc atg ttc gac ggc acg gac ggc gac cgc gac gtg 144 Ala Glu Asp Val Gly Met Phe Asp Gly Thr Asp Gly Asp Arg Asp Val 35 40 45 cgc aag tcg gtg gcc gtg ggc cag gtg ccg ctg ccc gag atc gcg ccc 192 Arg Lys Ser Val Ala Val Gly Gln Val Pro Leu Pro Glu Ile Ala Pro 50 55 60 gac gag gtc ctg atc gcg gtc atg gcc gcc gcg gtc aac tac aac tcc 240 Asp Glu Val Leu Ile Ala Val Met Ala Ala Ala Val Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 gtg tgg tcg gcg acg ttc ctg ccg atg ccg acc ttc cgc ttc ctc gag 288 Val Trp Ser Ala Thr Phe Leu Pro Met Pro Thr Phe Arg Phe Leu Glu 85 90 95 aag tac gcc cgc cag ggc ggc tgg gca gca cgc cac gac cag ccc tac 336 Lys Tyr Ala Arg Gln Gly Gly Trp Ala Ala Arg His Asp Gln Pro Tyr 100 105 110 cac gtg atc ggc tcc gac tgc tcg ggc gtc gtc gtg cgc gtc ggc tcc 384 His Val Ile Gly Ser Asp Cys Ser Gly Val Val Val Arg Val Gly Ser 115 120 125 ggc gtg cgc cgg tgg cgg gtc ggc gac cac gtg gtg atc cac ccg gtg 432 Gly Val Arg Arg Trp Arg Val Gly Asp His Val Val Ile His Pro Val 130 135 140 cac gtg gac gac cag ggc gcc gcc acc cac gac gac gcc atg atg gac 480 His Val Asp Asp Gln Gly Ala Ala Thr His Asp Asp Ala Met Met Asp 145 150 155 160 gac cag cag cgc gcc tgg ggg tac gag acc aac ttc ggc gcc ttc ggc 528 Asp Gln Gln Arg Ala Trp Gly Tyr Glu Thr Asn Phe Gly Ala Phe Gly 165 170 175 gag tac gcc gtc gcc cgc gcc agc caa ctg gtc gcc aag ccc ggc cac 576 Glu Tyr Ala Val Ala Arg Ala Ser Gln Leu Val Ala Lys Pro Gly His 180 185 190 ttg acg tgg gag gag tcg gcg gcg aac acg ctg tgc acc acc acg tcg 624 Leu Thr Trp Glu Glu Ser Ala Ala Asn Thr Leu Cys Thr Thr Thr Ser 195 200 205 tac cgc atg ctc gtc ggg gcg cac ggc gcc cgg atg aag cag ggg gac 672 Tyr Arg Met Leu Val Gly Ala His Gly Ala Arg Met Lys Gln Gly Asp 210 215 220 gtg gtc ctg gtc tgg ggc gcg gcg ggc ggc ctg ggg acg tac gcc gtg 720 Val Val Leu Val Trp Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Thr Tyr Ala Val 225 230 235 240 cag ttg gtc aag aac ggc ggc ggt atc ccc gtc gcc gtc gtc agc tcg 768 Gln Leu Val Lys Asn Gly Gly Gly Ile Pro Val Ala Val Val Ser Ser 245 250 255 ccc gcg aag gcg gag gcg gtc cgc cgg ctg ggc tgc gag cac gtc atc 816 Pro Ala Lys Ala Glu Ala Val Arg Arg Leu Gly Cys Glu His Val Ile 260 265 270 gac cgc acc gaa ctc ggg ctc acc ggc gac ccc tcg ggc gac ttc gac 864 Asp Arg Thr Glu Leu Gly Leu Thr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Phe Asp 275 280 285 gcc gtg cgg gag atc ggc aag cgg ctg ggc gcc cgc atc cgc gaa ctc 912 Ala Val Arg Glu Ile Gly Lys Arg Leu Gly Ala Arg Ile Arg Glu Leu 290 295 300 gcc ggc cgc gac ccc gac atc gtc ttc gag cac acc ggc cgg gcc acc 960 Ala Gly Arg Asp Pro Asp Ile Val Phe Glu His Thr Gly Arg Ala Thr 305 310 315 320 ttc gcc ctc tcg gtg ttc gtc gtc cgc cgc ggc ggc acc gtc gtc acc 1008 Phe Ala Leu Ser Val Phe Val Val Arg Arg Gly Gly Thr Val Val Thr 325 330 335 tgc gga tcc agc tcg ggc tac cgg cac ctg tac gac aac cgg tac ctg 1056 Cys Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Arg His Leu Tyr Asp Asn Arg Tyr Leu 340 345 350 tgg atg aag ctg aac acc gtc atc ggc agc cac ggc gga aac ctg cag 1104 Trp Met Lys Leu Asn Thr Val Ile Gly Ser His Gly Gly Asn Leu Gln 355 360 365 gaa gcc acc gag agc acc cgc ctg atc gcc tcc ggc gcg atc gtt ccg 1152 Glu Ala Thr Glu Ser Thr Arg Leu Ile Ala Ser Gly Ala Ile Val Pro 370 375 380 gcg ctc tcc gag gtc cac ccc ttc gag gac gtg gcc gag gcg atg cgg 1200 Ala Leu Ser Glu Val His Pro Phe Glu Asp Val Ala Glu Ala Met Arg 385 390 395 400 cgg gtc cag ctc aac gag cac gtc ggc aag gtc gtc gtc ctg tgc cag 1248 Arg Val Gln Leu Asn Glu His Val Gly Lys Val Val Val Leu Cys Gln 405 410 415 gcc ccc acc gcc ggc ctg ggc gtg acc gac ccg gag ctg cgg gaa cgg 1296 Ala Pro Thr Ala Gly Leu Gly Val Thr Asp Pro Glu Leu Arg Glu Arg 420 425 430 ctg ggg gag gag cgg acg gca ccc ctg ctg cgg gac tcc gcc tga 1341 Leu Gly Glu Glu Arg Thr Ala Pro Leu Leu Arg Asp Ser Ala 435 440 445 <210> 35 <211> 446 <212> PRT <213> Streptoverticillium <400> 35 Met Thr Glu Leu Arg Asp Ala Val Leu Arg Gly Ala Ser Pro Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro Ala Thr Tyr Arg Ala Ala His Leu Arg 20 25 30 Ala Glu Asp Val Gly Met Phe Asp Gly Thr Asp Gly Asp Arg Asp Val 35 40 45 Arg Lys Ser Val Ala Val Gly Gln Val Pro Leu Pro Glu Ile Ala Pro 50 55 60 Asp Glu Val Leu Ile Ala Val Met Ala Ala Ala Val Asn Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Val Trp Ser Ala Thr Phe Leu Pro Met Pro Thr Phe Arg Phe Leu Glu 85 90 95 Lys Tyr Ala Arg Gln Gly Gly Trp Ala Ala Arg His Asp Gln Pro Tyr 100 105 110 His Val Ile Gly Ser Asp Cys Ser Gly Val Val Val Arg Val Gly Ser 115 120 125 Gly Val Arg Arg Trp Arg Val Gly Asp His Val Val Ile His Pro Val 130 135 140 His Val Asp Asp Gln Gly Ala Ala Thr His Asp Asp Ala Met Met Asp 145 150 155 160 Asp Gln Gln Arg Ala Trp Gly Tyr Glu Thr Asn Phe Gly Ala Phe Gly 165 170 175 Glu Tyr Ala Val Ala Arg Ala Ser Gln Leu Val Ala Lys Pro Gly His 180 185 190 Leu Thr Trp Glu Glu Ser Ala Ala Asn Thr Leu Cys Thr Thr Thr Ser 195 200 205 Tyr Arg Met Leu Val Gly Ala His Gly Ala Arg Met Lys Gln Gly Asp 210 215 220 Val Val Leu Val Trp Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Thr Tyr Ala Val 225 230 235 240 Gln Leu Val Lys Asn Gly Gly Gly Ile Pro Val Ala Val Val Ser Ser 245 250 255 Pro Ala Lys Ala Glu Ala Val Arg Arg Leu Gly Cys Glu His Val Ile 260 265 270 Asp Arg Thr Glu Leu Gly Leu Thr Gly Asp Pro Ser Gly Asp Phe Asp 275 280 285 Ala Val Arg Glu Ile Gly Lys Arg Leu Gly Ala Arg Ile Arg Glu Leu 290 295 300 Ala Gly Arg Asp Pro Asp Ile Val Phe Glu His Thr Gly Arg Ala Thr 305 310 315 320 Phe Ala Leu Ser Val Phe Val Val Arg Arg Gly Gly Thr Val Val Thr 325 330 335 Cys Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Arg His Leu Tyr Asp Asn Arg Tyr Leu 340 345 350 Trp Met Lys Leu Asn Thr Val Ile Gly Ser His Gly Gly Asn Leu Gln 355 360 365 Glu Ala Thr Glu Ser Thr Arg Leu Ile Ala Ser Gly Ala Ile Val Pro 370 375 380 Ala Leu Ser Glu Val His Pro Phe Glu Asp Val Ala Glu Ala Met Arg 385 390 395 400 Arg Val Gln Leu Asn Glu His Val Gly Lys Val Val Val Leu Cys Gln 405 410 415 Ala Pro Thr Ala Gly Leu Gly Val Thr Asp Pro Glu Leu Arg Glu Arg 420 425 430 Leu Gly Glu Glu Arg Thr Ala Pro Leu Leu Arg Asp Ser Ala 435 440 445 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 36 ggggcagcct gctcggcgag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 37 ggtgagctcc ccgatcaggg 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 38 gcgctcgtac gcctcgctga t 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 39 cgggctcggt ggtgagcagg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 40 gtccgtggcg ccgccggatt 20 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 41 gtcaccgtcc ccgcctacgg cgacggcgtc gtcctggtga ttccggggat ccgtcgacc 59 <210> 42 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 42 ggtcgcgggc gaaggcgtag ccgggcaggt cgggcaggat gtaggctgga gctgcttc 58 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 43 cgtgaccgag gtggcgcg 18 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 44 gtcgtcggat gcgccgtgcg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 45 gcaccttcat gtccgggttg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 46 atcgccgcgt acaccatgac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 47 cgaaggtccg gttgatggtg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized primer sequence <400> 48 atcgctgcga caccctggag 20

Claims (15)

  1. 하기 (a) 내지 (q)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 핵산으로서, UK-2 생합성을 유도하고 UK-2의 생산성을 향상시키는, 분리된 핵산:
    (a) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 2의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (b) SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 4의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 6의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (d) SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 8의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (e) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 10의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (f) SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 12의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (g) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 14의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (h) SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 16의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (i) SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 18의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (j) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 20의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (k) SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 22의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (l) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 24의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (m) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 26의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (n) SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 28의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (o) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 30의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산;
    (p) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 32의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산; 및
    (q) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산, SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 SEQ ID NO: 34의 염기 서열을 포함하는 핵산과 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, (a) 내지 (q)의 핵산을 모두 포함하는, 핵산.
  3. 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 포함하는, 핵산.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 핵산이 삽입된, UK-2 생합성을 유도하고 UK-2 생산성을 향상시키기 위한 벡터.
  5. 시험 박테리아 내에서 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 염기 서열 또는 상기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의 존재를 탐지하는 것을 포함하는, UK-2 생산성을 판단하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 핵산의 존재를 탐지하는 방법은 PCR 방법인 것인, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, PCR 방법은 SEQ ID NO: 45의 염기 서열을 포함하는 프라이머 및 SEQ ID NO: 46의 염기 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 핵산이 증폭되는 방법인 것인, 방법.
  8. UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아로서, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 염기 서열 또는 상기 서열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 핵산의 존재가 제 5 항에 따른 방법에 의해 탐지되는, 박테리아.
  9. 제 4 항에 따른 벡터의 도입에 의해 UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아.
  10. 제 1 항에 따른 핵산이 유전체 내에 삽입된, UK-2 생합성이 유도되고 UK-2 생산성이 향상된 박테리아.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 염기 서열을 포함하는 핵산의 하나 또는 둘 또는 그 이상의 복제가 각 세포에 존재하는 박테리아.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아로서, 스트렙토베르티실룸(Streptoverticillium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 효모(yeasts), 곰팡이(filamentous fungi) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 중 어느 하나인 것인, 박테리아.
  13. UK-2의 생산 방법으로서:
    제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 배양하고, 그리고 박테리아 배양으로부터 UK-2를 수집하는 것을 포함하는, 방법.
  14. UK-2 유도체의 생산 방법으로서:
    제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 박테리아를 배양하고, 그리고 박테리아 배양으로부터 UK-2를 수집하고; 그리고
    수집된 UK-2로부터 하기 식(1) 중 어느 하나로 표시되는 UK-2유도체를 합성하는 것을 포함하는 방법
    [화학식 1]
    Figure pct00030
    (1)
    [식(1)에서,
    R은 2-메틸프로파노일기, 트랜스-2-메틸-2-부타노일기, 3-메틸부타노일기 및 2-메틸부타노일기 중 어느 하나를 나타냄.
    R1은 C1-6 알킬기, 벤질기, C1-10 알킬카르보닐기(C1-10 알킬카보닐기는 카르복실기, 벤질옥시카르보닐기, C1-4 알킬옥시카르보닐기 및 벤질옥시카르보닐아미노기 중 어느 하나로 치환될 수 있음), 벤조일기, C1-4 알킬옥시카르보닐기, (C1-4)알킬옥시카르보닐(C1-4)알킬기, 니트로기로 치환가능한 벤질옥시카르보닐(C1-4)알킬기, C1-6 알킬술포닐, 디(C1-6)알킬포스포릴기, 디페닐포르포리기 및 하기 식(2)으로 표시되는 치환기 중 어느 하나를 나타내고;
    [화학식 2]
    Figure pct00031
    (2)
    (식(2)에서,
    Q는 H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 및 시클로프로필로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
    M은 H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 및 시클로프로필로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
    T는 O, OC(O), OC(O)O, S, SC(O), SC(O)O 및 하기 식(3)으로 표시되는 치환기로 이루어지는 군으로부터 선택됨;
    [화학식 3]
    Figure pct00032
    (3)
    G는 H, C1-6 알킬기, C1-6 알콕시 C1-6 알킬기, C2-6 알케닐기, C2-6 알키닐기, C3-6 시클로알킬기, 아릴기 및 헤테로아릴기로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
    G 및 M은 임의적으로 옥소기를 가지는 이소벤조퓨란 고리를 형성할 수 있음.
    M 및 Q는 3-8원 카르보시클릭 시스템을 형성할 수 있음.].
  15. UK-2A 유도체의 제조 방법으로서:
    제 8 항에 따른 박테리아를 배양하고, 그리고 박테리아 배양으로부터 UK-2A를 수집하고; 그리고
    수집된 UK-2A로부터 하기 식(4) 내지 (7) 중 어느 하나로 표시되는 UK-2A 유도체를 합성하는 것을 포함하는, 방법.
    [화학식 4]
    Figure pct00033
    (4)
    [화학식 5]
    Figure pct00034
    (5)
    [화학식 6]
    Figure pct00035
    (6)
    [화학식 7]
    Figure pct00036
    (7)
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