TWI601822B - Ｕｋ－２生合成基因和使用彼以改善ｕｋ－２生產率之方法 - Google Patents

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Description

UK-2生合成基因和使用彼以改善UK-2生產率之方法
本發明關於生合成UK-2所必須之基因(以下稱為「UK-2生合成基因」)及用於改善UK-2生產率之方法，UK-2為可用來作為稻熱病控制劑及類似物之化合物。更特別地，本發明關於UK-2生合成基因、其中插入該UK-2生合成基因之載體、其中導入該載體之轉形株、藉由檢測該UK-2生合成基因之存在以用於測定UK-2生產率之方法、其中該UK-2生合成基因之存在係由該方法檢測之細菌、包含被插入彼之基因組中之該UK-2生合成基因之細菌、其中每個細胞存在一或二或多份該UK-2生合成基因之細菌，及藉由利用這些細菌等以產製UK-2及UK-2A衍生物之方法。
UK-2是一種由放線菌(actinobacteria)產生為二次代謝物之化合物，其具有類似抗黴素(antimycin)之抗各種真菌包括絲狀真菌及酵母菌的強效抗真菌作用。另外，由於對 培養細胞之細胞毒性低，研究發現UK-2可用來作為稻熱病控制劑、農業及園藝殺真菌劑及醫學抗真菌劑(專利文獻1，2)。另外，研究顯示其具有四種天然存在之類似物UK-2A至D，根據彼等側鏈之結構差異區分(非專利文獻1)。
UK-2之產製係藉由培養放線菌(屬於鏈黴輪生屬(Streptoverticillium)之細菌等)，然後自其中收集UK-2。然而一般來說，由天然分離之微生物所產製之UK-2(所有UK-2因子)的量非常少。因此，為了以低價工業化使用該目標(UK-2)，必須改善生產率。
該目標之生產率係經由對培養生產該目標之微生物的方法之研究、對培養基成分之研究、藉由添加前體以改善醱酵條件，及利用紫外線照射誘導或化學突變劑誘導之突變改良菌株而獲得改善。除了這些方法之外，生產率最近已藉由基因重組獲得改善。
一種用於藉由基因重組改善生產率之一般方法為包括促進生合成該目標所需之基因的表現。舉例來說，專利文獻3揭示此方法改善無孢子菌目(Agonomycetales)中之PF-1022的生產率。
然而當使用這種方法時，必須分離用於生合成該目標所必需之基因或利用已知技術合成該基因，還要建立轉形生產該目標之微生物(生產微生物)的方法。由於還不知道UK-2生合成基因，因此無法利用UK-2生合成基因進行轉形。生產率無法藉由基因重組改善。
[引用文獻] [專利文獻]
[PTL 1]日本審查專利申請公開案Hei 07-233165
[PTL 2]國際公開號WO1999/11127
[PTL 3]國際公開號WO2001/018179
[非專利文獻]
[NPL 1] Ueki M., et al., Journal of antibiotics, July 25th, 1996, vol. 49, no. 7, pp. 639 to 643
[NPL 2] Namwat W., et al, Journal of Bacteriology, September 2002, vol. 184, no. 17, pp. 4811 to 4818
本發明係鑑於上述習用技術中遇到的問題而生。本發明之目的為提供一種具有高UK-2生產率之轉形株，該轉形株係藉由分離生合成UK-2所必需之基因然後將該基因導入獲得。另一目的為利用該轉形株以低價產生大量之UK-2。又一目的為提供藉由檢測該基因之存在以測定UK-2生產率之方法。
UK-2具有特徵性之羥基吡啶甲酸骨架。同時，一種稱為維吉尼亞黴素(virginiamycin)也具有羥基吡啶甲酸骨架。另外，文獻顯示VisA(L-離胺酸2-胺基轉胺酶)及 VisB(3-羥基吡啶甲酸AMP接合酶)與維吉尼亞黴素之生合成有關(非專利文獻2)。
因此，為了達到上述目的，本發明首先準備產生UK-2之鏈黴輪生屬菌種3-7的基因組DNA庫，並完整測定該菌株之基因組DNA的鹼基序列。接著，在由該基因組DNA所編碼之假定蛋白的胺基酸序列與VisA及VisB的胺基酸序列之間進行同源性分析，以找出該基因組哪個位點之基因產物與這兩種胺基酸序列具高度同源性且為連續相連。另外，研究發現編碼與非核糖體肽合成酶(NRPS)具同源性之蛋白的基因與編碼與聚酮合成酶(PKS)具同源性之蛋白的基因位於靠近該位點。
這些酶被認為是形成UK-2骨架所必須。此外，放線菌之二次代謝物基因形成群集。因此，該基因組區域被預期是UK-2生合成基因簇。
接著，根據如此獲得之預期編碼生合成UK-2所需之酶的基因之鹼基序列的資訊，製備探針。藉由使用該探針之菌落雜交，自上述之基因組DNA庫成功分離預期位於該UK-2生合成基因簇中之DNA(即該基因組區域中包含之DNA)。另外，該DNA被用來製備存在於該基因組區域之基因被破壞的鏈黴輪生屬菌種3-7。該菌株被發現不會產生UK-2。經證實該基因組區域為UK-2生合成基因簇。另外，導入其中插入經分離之UK-2生合成基因簇之載體以轉形鏈黴輪生屬菌種3-7。也發現轉形株之UK-2生產率相較於母株改善約10至60倍或更高。另外，證實這些 轉形株的每個細胞分別存在2份UK-2生合成基因簇。
特別是，本發明關於UK-2生合成基因、其中插入該UK-2生合成基因之載體、其中導入該載體之轉形株，及藉由利用該轉形株生產UK-2及該類似物之方法。更特別地，本發明提供下列。
<1>一種誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率之經分離之核酸，該核酸為至少一種選自下列(a)至(q)之核酸：(a)編碼包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：2之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(b)編碼包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：5之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：4之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(c)編碼包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含 SEQ ID NO：6之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(d)編碼包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：8之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(e)編碼包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：10之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(f)編碼包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：12之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(g)編碼包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：15之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與 包含SEQ ID NO：14之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(h)編碼包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：17之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：16之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(i)編碼包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：18之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(j)編碼包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：20之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(k)編碼包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：23之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與 包含SEQ ID NO：22之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(1)編碼包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：25之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：24之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(m)編碼包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：27之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：26之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(n)編碼包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：28之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(o)編碼包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：31之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與 包含SEQ ID NO：30之鹼基序列的核酸雜交之核酸；(p)編碼包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：33之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：32之鹼基序列的核酸雜交之核酸；及(q)編碼包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸、編碼與SEQ ID NO：35之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸、或在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：34之鹼基序列的核酸雜交之核酸。
<2>如<1>之核酸，其包含(a)至(q)之所有核酸。
<3>如<2>之核酸，其包含SEQ ID NO：1之鹼基序列。
<4>一種插入如<1>至<3>中任一項之核酸的載體，其係用於誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率。
<5>一種用於測定UK-2生產率之方法，其包含在測試細菌中檢測包含如<1>至<3>中任一項之核酸的鹼基序列或與該序列互補之鹼基序列的核酸之存在。
<6>如<5>之方法，其中用於檢測核酸之存在的方法係PCR方法。
<7>如<5>之方法，其中該PCR方法為其中該核酸利用包含SEQ ID NO：45之鹼基序列的引子及包含SEQ ID NO：46之鹼基序列的引子進行擴增之方法。
<8>一種細菌，其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善，且其中包含如<1>至<3>中任一項之核酸的鹼基序列或與該序列互補之鹼基序列的核酸之存在係由如<5>至<7>中任一項之方法檢測。
<9>一種細菌，其中UK-2生合成之誘導及UK-2生產率之改善係藉由導入如<4>之載體。
<10>一種細菌，其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善，且其中如<1>至<3>中任一項之核酸被插入至彼之基因組。
<11>一種細菌，其中每細胞存在一或二或多份如<1>至<3>中任一項之核酸的鹼基序列之核酸。
<12>如<8>至<11>項中任一項所述之細菌，其為鏈黴輪生屬、鏈黴菌屬、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌及麩胺酸棒狀桿菌之任一者。
<13>一種用於產製UK-2之方法，該方法包含下列步驟：培養如<8>至<12>中任一項所述之細菌及自該細菌之培養物收集UK-2。
<14>一種用於產製UK-2之衍生物之方法，該方法包含下列步驟：培養如<8>至<12>中任一項所述之細菌及自該細菌之培養物收集UK-2；及自該收集之UK-2合成UK-2之衍生物，該衍生物係由下式(1)之任一者表示： [在式(1)中，R代表2-甲基丙醯基、反-2-甲基-2-丁烯醯基、3-甲基丁醯基及2-甲基丁醯基之任一者，R1代表C1-6烷基、苄基、C1-10烷基羰基(該C1-10烷基羰基可經羧基、苯甲氧基羰基、C1-4烷氧基羰基及苯甲氧基羰基胺基之任一者取代)、苯甲醯基、C1-4烷氧基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷基、可經硝基取代之苯甲氧基羰基(C1-4)烷基、C1-6烷基磺醯基、二(C1-6)烷基磷氧基、二苯基磷氧基及由下式(2)表示之取代基之任一者； (在式(2)中， Q係選自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH=CH2及環丙基；M係選自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH=CH2及環丙基；T係選自O、OC(O)、OC(O)O、S、SC(O)、SC(O)O及由下式(3)代表之取代基；
G係選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6環烷基、芳基及雜芳基；G及M可能形成可任意選擇地具有一側氧基之異苯并呋喃環；M及Q可能形成3至8元之碳環系統]。
<15>一種用於產製UK-2A之衍生物之方法，該方法包含下列步驟：培養如<8>至<12>中任一項所述之細菌及自該細菌之培養物收集UK-2A；及自該收集之UK-2A合成UK-2A之衍生物，該衍生物係由下式(4)至(7)之任一者表示：
應注意，此處所使用之用語「醯基」表示自羧酸R-COOH移除OH所提供之殘基RCO-，其中R代表烴基。此處所使用之用語「芳基」表示苯基或萘基。此處所使用之用語「雜芳基」表示包含一或多個雜原子之任何5或6元芳香環，其中該雜原子係選自O、N及S，且其中該芳香環之其餘原子為碳原子。適當實例包括但不限於吡啶、嗒、嘧啶、吡、吡咯、吡唑、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、喹啉、喹啉及噻二唑。
本發明藉由導入UK-2生合成基因至宿主細胞(如細菌)以提供具有高UK-2生產率之轉形株。另外，也可能利用該轉形株以低價大量生產UK-2。另外，也可能提供一種藉由檢測該基因之存在以測定UK-2生產率之方法。
[本發明之詳細說明] <UK-2生合成基因>
本發明提供一種UK-2生合成基因。如稍後之實施例中所述，本發明人已自鏈黴輪生屬菌種3-7之基因組DNA分離出17種如表2所示之新穎的UK-2生合成基因。
因此，本發明之UK-2生合成基因的一實施態樣為一種「誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率之經分離之核酸，該核酸為一種編碼包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35之胺基酸序列的蛋白之核酸」，且通常為一種「誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率之經分離之核酸，該核酸為一種包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34之鹼基序列的核酸。」
在本發明中，用語「改善UK-2生產率」及相關用語不僅表示改善細菌或類似物原本就具有之UK-2生產率，同時原本不具UK-2生產能力之細菌或類似物也獲得UK-2生產能力。
在本發明中，用語「分離」及相關用語代表允許核酸在有別於該原本存在條件之條件下存在的人工處理。本發明之UK-2生合成基因的分離，首先可藉由例如根據SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34之鹼基序列的資訊合成適當引子，然後利用該引子以鏈黴輪生屬菌種3-7之基因組DNA為模板進行PCR。或者如稍後之實施例所述，本發明之UK-2生合成基因也可藉由菌落雜交，利用由PCR獲得之 擴增產物做為探針，以自鏈黴輪生屬菌種3-7的基因組DNA庫或cDNA庫分離。此外，本發明之UK-2生合成基因也可根據鹼基序列資訊，藉由總化學合成法製備。
在本發明中，「UK-2」是一種由下式(8)表示之化合物： 其中R代表線性或分支飽和脂肪族醯基，或線性或分支不飽和脂肪族醯基。較佳地，「UK-2」是其中R係異丁醯基(2-甲基丙醯基)之化合物(UK-2A)、其中R係巴豆醯基(反-2-甲基-2-丁烯醯基)之化合物(UK-2B)、其中R係異戊醯基(3-甲基丁醯基)之化合物(UK-2C)及其中R係2-甲基丁醯基之化合物(UK-2D)。
另外，在本發明中，該「UK-2生合成基因」是一種編碼具有能誘導UK-2生合成之活性的蛋白之基因。該「能誘導UK-2生合成之活性」可藉由例如稍後實施例9所述之方法評估。特別是，在編碼該測試蛋白之核酸被插入載體，且該載體被導入或類似地進入宿主細胞(例如鏈 黴輪生屬菌種3-7)之後，該宿主細胞所產生之UK-2的量藉由在該宿主細胞中強迫表現該測試蛋白測量。若所產生之量大於未表現該測試蛋白之宿主細胞，可評估該測試蛋白具有能誘導UK-2生合成之活性。
在最新的發展中，若可獲得UK-2生合成基因之鹼基序列的資訊，該領域之技藝人士可修改該鹼基序列並獲得編碼與UK-2生合成有關之蛋白的核酸，不過該蛋白之胺基酸序列會與由該鹼基序列所編碼之蛋白不同。同時在天然中，編碼蛋白之胺基酸序列也可能因為鹼基序列突變而發生突變。因此，本發明之UK-2生合成基因的另一實施態樣是一種「編碼包含SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入的蛋白之核酸。」在此處，「超過一個」係指在修飾後與UK-2生合成有關之蛋白質中經修飾之胺基酸的數目，惟其該蛋白仍具有誘導UK-2生合成之活性。該數目通常為1至50，較佳為1至40，更佳為1至多個數目(例如1至20、1至10、1至8及1至4)。
該領域之技藝人士可根據該UK-2生合成基因之鹼基序列的資訊，藉由已知方法(如定點突變形成)製備編碼變異體之核酸。
另外，在最新發展中，若可獲得該UK-2生合成基因之鹼基序列的資訊，該領域之技藝人士可藉由雜交技術或聚合酶連鎖反應(PCR)技術，獲得編碼具有在其他非鏈黴 輪生屬菌種3-7菌株及其他細菌誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸(同源性基因)。因此，本發明之UK-2生合成基因的另一實施態樣是一種「經分離之核酸，其係在嚴謹條件下與包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34之鹼基序列的核酸雜交之核酸。」
要分離這種同源基因，通常在嚴謹條件下進行雜交反應。「嚴謹條件」是指在該條件下，雜交之後的膜洗程序在高溫且具低鹽濃度之溶液中進行。「嚴謹條件」包括例如以2倍SSC濃度(1倍SSC：15mM檸檬酸鈉、150mM氯化鈉)之0.5% SDS溶液在60℃清洗20分鐘之清洗條件。此外，該雜交可根據例如已知ECL直接DNA/RNA標示及檢測系統(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.製造)隨附說明中所述之方法進行。
另外，由該方法獲得之同源性基因所編碼之蛋白，通常與SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35之胺基酸序列具有高度同源性。因此，本發明之UK-2生合成基因的另一實施態樣是一種「經分離之核酸，其係編碼與SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸。」
序列的同源性可利用例如NCBI之BLASTX(胺基酸層級)程式測定。
如稍後之實施例所述，本發明之UK-2生合成基因可被用於製備具有高UK-2生產率之轉形株，也可被有效地用來篩選UK-2生合成基因簇。
在製備該等轉形株及篩選UK-2生合成基因簇時，組合使用上述UK-2生合成基因優於個別使用該等UK-2生合成基因。組合之UK-2生合成基因的數量並無特別限制，只要該等UK-2生合成可被該組合誘導。舉例來說，該數量為2或更大，較佳為5或更大，更佳為10或更大，更佳為15或更大。組合之UK-2生合成基因的數量最佳為17，因為該轉形株中之UK-2的生產率可被顯著改善。
組合之UK-2生合成基因可能以單一核酸或分開之核酸存在。
本發明提供「包含SEQ ID NO：1之鹼基序列之核酸」做為包含該17種UK-2生合成基因之單一核酸(UK-2生合成基因簇)。該等基因之開放閱讀框(ORF)於包含SEQ ID NO：1之鹼基序列之核酸中的位置如稍後表1所示。
如稍後之實施例所述，「包含SEQ ID NO：1之鹼基序列之核酸」之分離，首先可藉由根據該UK-2生合成基因之鹼基序列的資訊等合成適當引子，然後利用該引子與獨立製備之鏈黴輪生屬菌種3-7的黏質體基因組DNA庫之模板進行PCR，接著再利用該獲得之擴增產物做為探針進行菌落雜交。
<載體>
本發明提供其中插入本發明之UK-2生合成基因的載體。本發明之載體可利用自我複製載體建構，例如以染色體外元件存在且獨立複製於染色體複製以外之質體。或者，本發明之載體在被導入宿主細胞如細菌且併入彼之基因組之中後，可能與該宿主細胞之染色體一起複製。至於建構本發明之載體之程序及方法，任何該基因工程領域中經常使用之程序及方法皆可被使用。
該領域之技藝人士可根據所欲導入之宿主細胞的類型，自已知載體選擇用於本發明之適當載體。已知載體之實例包括黏質體載體(SuperCos 1黏質體載體等)、噬菌體載體、pUC基底質體(pCR2.1-TOPO質體載體等)、pBluescript基底質體及pBR322質體。
為了在宿主細胞中表現由本發明之UK-2生合成基因所編碼之蛋白，本發明之「載體」除了該基因之外還較佳地包含用於調節表現之DNA序列、用於篩選該經轉形之宿主細胞的標誌基因等。
「用於調節表現之DNA序列」的實例包括啟動子、增強子及終止子。該實例還包括藉由添加異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至細菌能誘導位於下游之基因的表現之乳糖操縱子。本發明之載體可藉由例如可操作地分別連接啟動子及終止子至本發明之UK-2生合成基因的上游及下游加以建構。
「標誌基因」可根據用於篩選該經轉形之宿主細胞 (轉形株)的方法加以適當選擇。舉例來說，可使用編碼抗藥性之基因或互補該營養缺陷型之基因。當所使用的宿主細胞為細菌之情況中，標誌基因之實例包括安比西林(ampicillin)抗藥性基因、卡那黴素抗藥性基因及四環素抗藥性基因。特別是以放線桿菌為例，實例包括安普黴素(apramycin)抗藥性基因、硫鏈素(thiostrepton)抗藥性基因、潮黴素(hygromycin)抗藥性基因、卡那黴素抗藥性基因、鏈黴素抗藥性基因、紫黴素(viomycin)抗藥性基因等等。以酵母菌為例，實例包括色胺酸生合成酶基因(TRP1)、尿嘧啶生合成基因(URA3)、白胺酸生合成基因(LEU2)等等。以黴菌為例，實例包括潮黴素抗藥性基因、雙丙氨磷(bialaphos)抗藥性基因、博來黴素(bleomycin)抗藥性基因、金担子素(aureobasidin)抗藥性基因等等。以植物為例，實例包括卡那黴素抗藥性基因、雙丙氨磷抗藥性基因等等。
<轉形株等>
本發明提供其中導入本發明之載體之轉形株(例如藉由導入本發明之載體而誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率之細菌)。
另外，本發明提供一種轉形株，其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善，且其中本發明之UK-2生合成基因係經插入彼之基因組。
經導入本發明之載體而被轉形之宿主細胞或導入本發 明之UK-2生合成基因至基因組之宿主細胞並未特別受限。彼等之實例包括放線菌(actinobacteria)、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母菌、絲狀真菌、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、植物細胞、昆蟲細胞及動物細胞。從UK-2生產率之觀點來看，放線菌為較佳，屬於鏈黴輪生屬(Streptoverticillium)之細菌及屬於鏈黴菌屬(Streptomyces)之細菌為更佳，屬於鏈黴輪生屬之細菌甚至更佳，且鏈黴輪生屬菌種3-7係特別較佳。
用於導入本發明之載體至宿主細胞之方法並無特別限制。其可由該領域之技藝人士根據測試中之宿主細胞的類型，自已知之轉形方法中適當地選擇及施用，如接合轉移、噬菌體轉導、鈣離子法、鋰離子法、電穿孔法、PEG法、土壤桿菌(Agrobacterium)法及粒子槍法。另外，在其中包含「標誌基因」之載體被導入宿主細胞之例中，本發明之轉形株可藉由在添加對應該抗藥性基因之抗生素的培養基中培養，或在缺乏對應互補該營養缺陷型之基因的營養素之培養基中培養，以有效地製備。
另外，本發明提供一種細菌，其中藉由改善醱酵條件、突變誘導或類似者以誘導UK-2生合成及改善UK-2生產率。另外，如稍後之實施例所述，包含至少二份本發明之UK-2生合成基因誘導UK-2生合成且顯著改善UK-2生產率。因此，本發明也提供一種其中每細胞存在一或二或多份本發明之UK-2生合成基因的細菌。從UK-2生產 率之觀點來說，該細菌較佳為放線菌，更佳為屬於鏈黴輪生屬之細菌及屬於鏈黴菌屬之細菌，且更佳為屬於鏈黴輪生屬之細菌。此外，從UK-2生產率之觀點來說，每細胞中本發明之UK-2生合成基因的份數為較佳地二或更多。應注意，每細胞中本發明之UK-2生合成基因的份數可藉由例如稍後之實施例中所述之PCR方法識別。
<用於測定UK-2生產率之方法>
本發明人已分離及識別生合成UK-2所需之基因，因此可能藉由檢測該等基因之存在來測定UK-2生產率。因此，本發明也提供一種用於測定UK-2生產率之方法，其包含在測試細菌中檢測包含本發明之UK-2生合成基因的鹼基序列或與該序列互補之鹼基序列之核酸的存在。
在本發明之方法中，「測試細菌」並未特別限制。彼等之實例包括放線菌(屬於鏈黴輪生屬之細菌、屬於鏈黴菌屬之細菌及類似細菌)、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌及麩胺酸棒狀桿菌。
在用於測定本發明之UK-2生產率的方法中，所欲檢測之本發明的UK-2生合成基因之鹼基序列也就是本發明之核酸的鹼基序列，為選自上述(a)至(q)之至少一種核酸的鹼基序列。
核酸等可直接以包括該核酸等之基因組DNA為目標檢測，或以該基因組DNA之轉錄產物為目標檢測。或者，該核酸等也可間接以該轉錄產物之轉譯產物(由本發 明之UK-2生合成基因編碼之蛋白)為目標檢測。另外，該核酸等之檢測可採用任何已知方法。在以基因組DNA為目標之例中，可能採用例如原位雜交(ISH)法、基因組PCR法、直接定序法、南方墨點法及使用基因微陣列之分析方法。在以轉錄產物為目標之例中，可能採用例如PCR法、直接定序法、北方墨點法、點圖法及使用cDNA微陣列之分析方法。在以轉譯產物為目標之例中，已知方法之實例包括使用抗本發明之UK-2生合成基因所編碼之蛋白的抗體之免疫方法(西方墨點法、ELISA法、流式細胞分析、免疫組織化學染色、細胞圖像分析、放射免疫分析、免疫沉澱分析、使用抗體陣列之分析方法及類似法)。在這些方法當中，較佳的是PCR法，更佳的是其中該核酸利用包含SEQ ID NO：45之鹼基序列的引子及包含SEQ ID NO：46之鹼基序列的引子進行擴增之PCR方法。
此外，在本發明之方法中，自達成更正確測定UK-2生產率之觀點看來，較佳的是檢測上述多種核酸(本發明之UK-2生合成基因)之存在，而非檢測該等核酸之一者的存在。所欲檢測之核酸數目為例如二或更大，較佳五或更大，更佳10或更大，甚至更佳15或更大。檢測所有17種核酸係特別較佳，且檢測包含所有17種核酸之單一核酸(包含SEQ ID NO：1之鹼基序列之核酸)係最佳。另外，除了完整長度之該核酸之外，彼等之部分係以正常方式被當作目標以用於檢測該核酸之存在。因此，在本發明之方法中，檢測該核酸等也可為檢測該核酸之部份等。該 領域之技藝人士可根據該檢測方法，適當選擇欲藉由本發明之方法檢測之該核酸之部分的長度。
接著，若該測試細菌中可藉由該方法檢測到該核酸之存在，該測試細菌被測定為具有UK-2生產率。此外，本發明之方法可能另包含在允許UK-2產製之條件下，培養其中可檢測到該核酸之存在的測試細菌。
此外，本發明也提供一種細菌，其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善，且其中包含本發明之核酸的鹼基序列或與該序列互補之鹼基序列的核酸之存在係由本發明之用於測定UK-2生產率之方法檢測。從UK-2生產率之觀點來說，該細菌較佳為放線菌，更佳為屬於鏈黴輪生屬之細菌及屬於鏈黴菌屬之細菌，且甚至更佳為屬於鏈黴輪生屬之細菌。
應注意在本發明中，上述具有本發明之UK-2生合成基因之細菌等，也就是其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善且其中該核酸之存在係由用於測定本發明之UK-2生產率之方法檢測的細菌、其中藉由導入本發明之載體以誘導UK-2生合成及改善UK-2生產率之轉形株、其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善且其中本發明之UK-2生合成基因係經插入彼之基因組之轉形株、其中每細胞存在一或二或多份本發明之UK-2生合成基因的細菌，及其中藉由改善醱酵條件、突變誘導及類似者以誘導UK-2生合成及改善UK-2生產率之細菌，在以下總稱為「本發明之細菌等」。
<用於產製UK-2之方法>
本發明提供一種用於產製UK-2之方法，該方法包含下列步驟：培養本發明之細菌等，及自該細菌等之培養物收集UK-2。
該細菌等可根據習用方法，藉由選擇適當之培養基、培養條件等等培養。在培養基方面，經常使用之成分可被使用。舉例來說，碳來源可能使用葡萄糖、纖維素、澱粉糖漿、糊精、澱粉、甘油、糖蜜、動物油、植物油或類似物。另外，氮來源可能使用大豆粉、小麥胚芽、棉仔粉(pharmamedia)、玉米浸液、棉仔粕、肉汁、蛋白腖、聚蛋白腖、麥芽萃取物、酵母菌萃取物、硫酸銨、硝酸鈉、尿素或類似物。除此之外，若需要的話，可有效添加可產生鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、氯、磷酸、硫酸及其他離子之無機鹽；該等無機鹽之實例包括氯化鉀、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硫酸錳及硫酸銅。此外，若有需要，也可能添加各種維生素如硫胺素(鹽酸噻胺及類似物)、胺基酸如麩胺酸(麩酸鈉及類似物)及天冬醯胺酸(DL-天冬醯胺酸及類似物)、微量營養素如核苷酸及選擇性藥物如抗生素。另外，可適當添加有機物及無機物以促進細菌之生長及UK-2生產。該培養基之pH並不特別受限，可能根據所欲培養之細菌等的類型調整。舉例來說，pH大約為6至8。
該領域之技藝人士可根據所欲培養之細菌等的類型、所欲使用之培養基的類型等，選擇及設定適當的培養條件。舉例來說，該培養方法可選自已知培養方法，諸如在有氧條件下振動培養、通氣攪拌培養及有氧浸沒培養。通氣攪拌培養係較佳。適當的培養溫度為15℃至40℃。在許多情況中，培養溫度設定於約26℃至37℃。另外，培養期較佳為當達到UK-2最大累積量之2天至25天。
在本發明中，「培養物」係指藉由培養本發明之細菌等所獲得之培養基、包含該增生細菌等之培養基、該細菌等之分泌物及代謝物等等。該培養物也包括上述者之稀釋物及濃縮物。
在培養物中，UK-2係累積於該細菌等及該培養基中。因此，自該培養物之培養基收集UK-2之方法的實例為利用不與水互溶之有機溶劑如乙酸乙酯、氯仿及二氯甲烷萃取，且該方法可有效地萃取UK-2。同時，舉例來說，可藉由有機溶劑如丙酮，對於自該培養物之細菌等憑藉如過濾或離心方法所獲得之該細菌等萃取以收集UK-2。另外，UK-2可在利用玻璃珠等破壞該培養物之細菌等之後，以如上述自培養基萃取之相同方法藉由萃取收集。
另外，自該培養物收集UK-2時，UK-2可藉由使如此製備之萃取組分如有機溶劑進行已知之純化技術以分離及純化，如組合溶劑轉移溶解、正相及逆相層析、膠體過濾層析及結晶。
<用於產製UK-2衍生物之方法>
如上所述，本發明使得以低成本大量產製UK-2成為可能。因此，也可能利用由本發明之產製方法所獲得之UK-2作為彼之材料以低成本大量產製UK-2之衍生物。
因此，本發明也提供一種用於產製UK-2之衍生物之方法，該方法包含下列步驟：培養本發明之細菌等，及自該細菌等之培養物收集UK-2(UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D)；及自該收集之UK-2合成UK-2之衍生物，該衍生物係由下式(1)之任一者表示： [在式(1)中，R代表2-甲基丙醯基、反-2-甲基-2-丁烯醯基、3-甲基丁醯基及2-甲基丁醯基之任一者，R1代表C1-6烷基、苄基、C1-10烷基羰基(該C1-10烷基羰基可經羧基、苯甲氧基羰基、C1-4烷氧基羰基及苯甲 氧基羰基胺基之任一者取代)、苯甲醯基、C1-4烷氧基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷基、可經硝基取代之苯甲氧基羰基(C1-4)烷基、C1-6烷基磺醯基、二(C1-6)烷基磷氧基、二苯基磷氧基及由下式(2)表示之取代基之任一者； (在式(2)中，Q係選自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH=CH2及環丙基；M係選自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH=CH2及環丙基；T係選自O、OC(O)、OC(O)O、S、SC(O)、SC(O)O及由下式(3)代表之取代基；
G係選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C2-6 烯基、C2-6炔基、C3-6環烷基、芳基及雜芳基；G及M可能形成可任意選擇地具有一側氧基之異苯并呋喃環；M及Q可能形成3至8元之碳環系統]。
在以式(2)表示之取代基中，該烷基、炔基、烯基、環烷基、芳基及雜芳基可由選自下列取代基之至少一種取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6環烷基、C5-6環烯基、芳基、雜芳基、鹵素原子、硝基、羥基、氰基、C1-6烷氧基、C2-6烯氧基、C3-6環烷氧基、芳基氧基、雜芳基氧基、醯基氧基、C1-6烷基醯基氧基、C3-6環烷基醯基氧基、芳基醯基氧基、雜芳基醯基氧基、C1-6烷基氧基醯基、C3-6環烷基氧基醯基、芳基氧基醯基、雜芳基氧基醯基、C1-6烷基醯基、C3-6環烷基醯基、芳基醯基、雜芳基醯基、C1-6烷基醯基胺基、C3-6環烷基醯基胺基、芳基醯基胺基、雜芳基醯基胺基、C1-6烷基胺基醯基、C3-6環烷基胺基醯基、芳基胺基醯基、雜芳基胺基醯基、C1-6烷基硫基、C3-6環烷基硫基、芳基硫基、雜芳基硫基、C1-6烷基磺基、C3-6環烷基磺基、芳基磺基、雜芳基磺基、C1-6烷基亞磺醯基、C3-6環烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、雜芳基亞磺醯基及-C(NORx)RY，其中Rγ及Rx係獨立地H、C1-6烷基、C2-6烯基、C3-6環烷基、芳基及雜芳基(其中包含取代基之任何烷基或環烷基可經一或多種鹵素取代)中之任一者。
應注意的是，該取代基亦可能由選自下列取代基之至少一種取代基取代：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6環烷基、C5-6環烯基、芳基、雜芳基、鹵素原子、硝基、羥基、氰基、C1-6烷氧基、C2-6烯氧基、C3-6環烷氧基、芳基氧基、雜芳基氧基、醯基氧基、C1-6烷基醯基氧基、C3-6環烷基醯基氧基、芳基醯基氧基、雜芳基醯基氧基、C1-6烷基氧基醯基、C3-6環烷基氧基醯基、芳基氧基醯基、雜芳基氧基醯基、C1-6烷基醯基、C3-6環烷基醯基、芳基醯基、雜芳基醯基、C1-6烷基醯基胺基、C3-6環烷基醯基胺基、芳基醯基胺基、雜芳基醯基胺基、C1-6烷基胺基醯基、C3-6環烷基胺基醯基、芳基胺基醯基、雜芳基胺基醯基、C1-6烷基硫基、C3-6環烷基硫基、芳基硫基、雜芳基硫基、C1-6烷基磺基、C3-6環烷基磺基、芳基磺基、雜芳基磺基、C1-6烷基亞磺醯基、C3-6環烷基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、雜芳基亞磺醯基及-C(NORx)RY，其中Rγ及Rx係獨立地H、C1-6烷基、C2-6烯基、C3-6環烷基、芳基及雜芳基(其中包含取代基之任何烷基或環烷基可經一或多種鹵素取代)中之任一者。
此外，本發明亦可提供用於產製UK-2A衍生物之方法，該方法包含下列步驟：培養本發明之細菌等，及自該細菌等之培養物收集UK-2A；及自該收集之UK-2A合成由下式(4)至(7)之任一者表示 之UK-2A衍生物。
自該培養物收集UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D時，UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D可藉由例如如上述之使該萃取組分如有機溶劑進行已知之純化技術以分離及純化，如組合溶劑轉移溶解、正相及逆相層析、膠體過濾層析及結晶。更特別地，該萃取組分如有機溶劑係於減壓下濃縮。該形成物被轉移及溶解於氯仿中，接著經矽膠層析處理，然後以氯仿/甲醇分步洗脫。因此，可獲得包含比例大約3：1之UK-2A及UK-2D且也包含微量UK-2B及UK-2C之組分。另外，該組分係利用C-18管柱藉由逆相高效液相層析(HPLC)處理，因此可分離UK-2A、 UK-2B、UK-2C或UK-2D(見專利文獻1)。
接著，由式(1)及(4)至(7)之任一者所代表之UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D的衍生物可利用藉此收集以作為彼之材料的UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D合成，合成方法如國際公開號2003/035617或國際公開號1999/40081所述。
以下，本發明將根據實施例更具體說明。然而，本發明並不受下列實施例之限制。
請注意，本發明之實施例中所描述之微生物寄存如下。鏈黴輪生屬(Streptoverticillium)菌種3-7於2011年11月9日以編號FERM BP-11437，寄存於日本國家先進工業科學與技術研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)的國際專利微生物寄存機構(International Patent Organism Depositary)(Central 6,1-1-1,Higashi,Tsukuba,Ibaraki,postal code 305-8566,Japan)。順帶地，寄存於日本國家先進工業科學與技術研究所國際專利微生物寄存機構(舊稱IPOD)的專利微生物寄存物於2012年四月由日本製品評價技術基盤機構(NITE,#122,2-5-8 Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,postal code 292-0818)繼代。
鏈黴輪生屬菌種3-7係由日本審查專利申請公報No.Hei 07-233165所述之SAM 2084菌株建立，其係由本發 明人利用單一紫外線照射誘發人工突變。該SAM 2084菌株為自日本京都府之土壤獲得之UK-2產製細菌菌株，其識別編號為國際寄存編號FERM BP-6446。
(實施例1) <製備基因組DNA庫>
為了要分離UK-2生合成所需之基因，首先，利用下述之方法製備能產製UK-2之鏈黴輪生屬菌種3-7的基因組DNA庫。
鏈黴輪生屬菌種3-7被接種於50ml之改良YEME(0.3% Difco酵母菌抽取物、0.5% Difco細菌蛋白腖、0.3% Oxoid麥芽抽取物、3.0%蔗糖、1.0%葡萄糖、5mmol/L MgCl2．6H2O)，在30℃下以220rpm震盪培養18小時。在培養完成後，藉由7500rpm離心10分鐘以收集細菌細胞。利用鹽析法自如此獲得之細菌細胞製備基因組DNA(見"Practical Streptomyces Genetics," The John Innes Foundation,(UK),Norwich,2000)。
所獲得之基因組DNA利用限制酶MboI部分消化，然後用鹼性磷酸酶處理以去磷酸化DNA末端。此DNA片段被接合至市售黏質體載體SuperCos1(由Stratagene Corporation製造)，該載體已預先經限制酶XbaI消化、經鹼性磷酸酶處理以去磷酸化及另經限制酶BamHI消化。因此，製備重組黏質體載體。此重組黏質體載體利用Epicentre Biotechnologies製造之MAXPLAX Lambda Packaging Extracts進行試管內λ噬菌體包裝。大腸桿菌(Escherichia coli)XLI-Blue MRA係以該重組黏質體載體感染以製備該黏質體基因組DNA庫。
(實施例2) <預測UK-2生合成基因>
根據由實施例1所述之方法製備之基因組DNA，委託Genaris,Inc建構用於Roche GS FLX Titanium定序儀器之黏合配對(mate-pair)庫。接著，使用此定序儀器測定該序列。除此之外，根據該基因組DNA，建構用於此定序儀之片段庫。然後，使用此定序儀器測定該序列。自該黏合配對庫獲得之序列及自該片段庫獲得之序列被組裝在一起以獲得片段重疊序列及支架序列。
UK-2具有特徵性之3-羥基吡啶甲酸骨架。同時，維吉尼亞黴素(virginiamycin)也具有羥基吡啶甲酸骨架。與維吉尼亞黴素生合成有關的二個基因(visA、visB)已被揭露(見非專利文獻2)。因此，對由這兩個基因編碼之蛋白質的胺基酸序列以及自UK-2產製細菌之基因組獲得的建議胺基酸序列進行同源性分析，以檢查與羥基吡啶甲酸骨架形成有關之基因的存在。表1及2顯示該獲得之結果。
檢查之結果顯示，與VisA及VisB具有高度同源性之基因為連續相連的位置，被發現為源自鏈黴輪生屬菌種3-7之基因組上的單一位置(見表1)。另外，發現與非核糖體肽合成酶(NRPS)及聚酮合成酶(PKS)有關之基因位於靠近這些基因，而NRPS及PKS被認為是形成UK-2骨架所 需(見表2)。在這些基因附近的區域被認為是UK-2生合成基因簇，因為放線菌的二次代謝物基因形成簇。另外，以下列出位於UK-2生合成基因簇中之基因(ORF)，以及由該個別基因編碼之蛋白的假定功能。
ORF1是可能與該生合成基因簇之調節有關之基因。ORF5、ORF6、ORF7及ORF16為與3-羥基吡啶甲酸骨架之生合成有關之基因。ORF2、ORF3及ORF17為與苄基丙二酸骨架之生合成有關之基因。ORF13為與2-吡啶甲酸骨架、絲胺酸及乳酸之生合成有關的基因。ORF11及ORF12為與苄基丙二酸之生合成以及2-吡啶甲酸、絲胺酸及乳酸之代謝有關之基因。ORF8為與切割聚酮合成酶(PKS)之硫酯鍵以及2-吡啶甲酸、絲胺酸、乳酸及苄基丙二酸之代謝有關之基因。
(實施例3) <篩選基因組DNA庫>
位於該等UK-2生合成基因上游之ORF5的序列的一部分被用來作為篩選實施例1製備之基因組DNA庫的探針，其係由下述之PCR製備。
PCR係利用實施例1所述之基因組DNA作為模板，以visA’-F：5’-GGGGCAGCCTGCTCGGCGAG-3’(SEQ ID NO：36)及visA’-R：5’-GGTGAGCTCCCCGATCAGGG-3’(SEQ ID NO：37)之寡DNA作為引子。PCR利用LA Taq DNA聚合酶(由Takara Bio Inc.製造)作為DNA聚合酶，使用PERKIN ELMER GeneAmp PCR系統9700進行。反應溶液之量藉由添加下列以調整至50μl：0.5μl(相當於0.5μg)之基因組DNA、25μl之酶所隨附之2倍濃度反應緩衝劑、2.5μl之DMSO溶液、5μl之2.5-mM dNTP溶液、0.25μl之各引子(濃度調整為100pmol/μl)、0.3μl的酶以及16.2μl的無菌水。反應進行如下：於95℃預處理10分鐘，培養30個循環(每個循環由95℃ 30秒、55℃ 30秒及72℃ 2分鐘組成)，再於72℃培養5分鐘。當反應完成後，取該反應溶液的一部分於洋菜糖膠體上電泳。結果證實大約1.3kbp之DNA片段被特別擴增。接著，剩下的反應溶液經混合溶液(苯酚：氯仿：異戊醇=25：24：1，V/V)萃取以進行核酸純化，然後經乙醇沉澱。將該沉澱物再次溶解於無菌水，然後在洋菜糖膠體上電泳。根據習知方法切下大約1.3kbp之條帶，收集DNA片段。
菌落雜交係利用DNA片段作為探針，並以ECL直接DNA/RNA標示及檢測系統(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.製造)進行，大約篩選5000個菌落。獲得許多陽性菌落。質體pUK2-B44係由其中的一個菌落分離。
另外，位於UK-2生合成基因下游之ORF13的一部分被用來作為探針，並如下所述利用PCR製備。
PCR係利用實施例1所述之基因組DNA作為模板，以caiC-F：5’-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3’(SEQ ID NO：38)及caiC-R：5’-CGGGCTCGGTGGTGAGCAGG-3’(SEQ ID NO：39)之寡DNA作為引子。PCR利用LA Taq DNA聚合酶(由 Takara Bio Inc.製造)作為DNA聚合酶，使用PERKIN ELMER GeneAmp PCR系統9700進行。反應溶液之量藉由添加下列以調整至50μl：0.5μl(相當於0.5μg)之基因組DNA、25μl之酶所隨附之2倍濃度反應緩衝劑、2.5μl之DMSO溶液、5μl之2.5-mM dNTP溶液、0.25μl之各引子(濃度調整為100pmol/μl)、0.3μl的酶以及16.2μl的無菌水。反應進行如下：於95℃預處理10分鐘，培養30個循環，每個循環由95℃ 30秒、59℃ 30秒及72℃ 2分鐘20秒組成。當反應完成後，取該反應溶液的一部分於洋菜糖膠體上電泳。結果證實大約2.3kbp之DNA片段被特別擴增。接著，剩下的反應溶液經上述之混合溶液萃取以進行核酸純化，然後經乙醇沉澱。將該沉澱物再次溶解於無菌水，然後在洋菜糖膠體上電泳。根據習知方法切下大約2.3kbp之條帶，收集DNA片段。
菌落雜交係利用DNA片段作為探針，並以ECL直接DNA/RNA標示及檢測系統(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.製造)進行，大約篩選5000個菌落。獲得許多陽性菌落。質體pUK2-E4係由其中的一個菌落分離。
(實施例4) <建構包含生合成基因簇之質體pUK2-3>
使用如此獲得之分別包含該預期生合成基因簇之上游區域1至21531及下游區域16211至34641的質體pUK2-B44及pUK2-E4，建構包含該完整生合成基因簇區域之質 體。首先，兩個質體皆以限制酶ClaI及PspXI消化，然後於洋菜膠上電泳，利用習知方法分別切下大約28kbp及大約19kbp之條帶，收集該DNA片段。利用DNA接合套組<Mighty Mix>(由Takara Bio Inc.製造)連接DNA片段以製備pUK2-16。
接著，利用如Gust,B.,et al,"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,"(US),2003,vol.100,pp.1541-1546中所述之轉導技術，使用質體pUK2-16作為能接合轉移至放線菌之載體。首先，質體pUK2-16利用電穿孔被導入大腸桿菌BW25113/pIJ790菌株，獲得大腸桿菌BW25113/pIJ790/pUK2-16菌株。此菌株被接種於包含氯黴素25μg/ml、卡那黴素50μg/ml及安比西林50μg/ml之100ml LB液體培養基(1%細菌胰化蛋白腖、0.5%酵母菌萃取物、0.5%氯化鈉)中，於30℃培養隔夜。接著，100μl之培養液被接種至於包含氯黴素25μg/ml、卡那黴素50μg/ml、安比西林50μg/ml及L-阿拉伯糖10mM之65-ml試管中製備之10ml之SOB培養基(2%細菌胰化蛋白腖、0.5%酵母菌萃取物、0.05%氯化鈉、0.0186%氯化鉀)。所形成之培養液於30℃振搖培養4小時。細菌細胞係自所有培養液收集，以10%冰甘油溶液清洗兩次，重懸於100μl之10%甘油溶液以作為用於電穿孔之細胞。同時，純化5.2kb之SspI片段，其包含oriT、attP、IntφC31及源自質體pMJCOS1(John Innes Centre(Norwich))之安普黴素抗藥性基因。該 DNA片段(約100ng)及50μl如此製備之細胞被轉移至冰浴中之2mm電穿孔樣品管以進行電穿孔(使用Electro Cell Manipulator 600，由BM Equipment Co.,Ltd.製造)。處理後，取1ml冰冷LB液體培養基加至所形成之物，讓該物於37℃培養1小時。接著將其施加於包含安比西林與安普黴素之LB洋菜培養基，於37℃培養隔夜。該成長菌株於包含安比西林及安普黴素之LB液體培養基中培養，並分離出質體pUK2-3。此pUK2-3為能接合轉移至放線菌之質體，其於載體部分具有oriT、attP、IntφC31及安普黴素之抗藥性基因，整個區域預期為UK-2生合成基因簇。
(實施例5) <建構生合成基因缺乏載體>
缺乏大約7.5kbp之對應鏈黴輪生屬菌株3-7之基因組DNA的ORF12及ORF13部分之基因缺損菌株係由下述方法製備。
PCR係利用實施例1所述之基因組DNA作為模板，以caiC-F：5’-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3’(SEQ ID NO：38)及41c29-R：5’-GTCCGTGGCGCCGCCGGATT-3’(SEQ ID NO：40)之寡DNA作為引子。PCR利用LA Taq DNA聚合酶(由Takara Bio Inc.製造)作為DNA聚合酶，使用PERKIN ELMER GeneAmp PCR系統9700進行。反應溶液之量藉由添加下列以調整至50μl：0.5μl(相當於0.5μg)之基因 組DNA、25μl之酶所隨附之2倍濃度反應緩衝劑、2.5μl之DMSO溶液、5μl之2.5-mM dNTP溶液、0.25μl之各引子(濃度調整為100pmol/μl)、0.3μl的酶以及16.2μl的無菌水。反應進行如下：於95℃預處理10分鐘，培養30個循環，每個循環由95℃ 30秒、60℃ 5秒及72℃ 7分鐘組成。當反應完成後，取該反應溶液的一部分於洋菜糖膠體上電泳。結果證實大約7.5kbp之DNA片段被特別擴增。使用TOPO TA選殖套組(由Invitrogen Corporation製造)，根據隨附說明將該DNA片段插入pCR2.1-TOPO質體載體。如此獲得質體TOPO-41c29。
接著，將安普黴素抗藥性基因插入該質體TOPO-41c29之該插入片段以如下述製備質體TOPO-⊿41c29-Am。
質體pIJ773(Gust,B.,et al.,"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,"(US),2003,vol.100,pp.1541-1546)係經HindIII及EcoRI雙重消化，然後在洋菜膠上電泳。接著，根據習知方法切下並收集DNA片段。因此，獲得大約1.3kb之包含該目標安普黴素抗藥性基因之DNA片段。利用此片段作為模板進行PCR，使用兩種合成性引子41c30-apraF：5'-GTCACCGTCCCCGCCTACGGCGACGGCGTCGTCCTGGTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(SEQ ID NO：41)及41c30-apraR：5'-GGTCGCGGGCGAAGGCGTAGCCGGGCAGGTCGGGCAGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'(SEQ ID NO：42)。PCR利用LA Taq DNA聚合酶(由Takara Bio Inc.製造)作為DNA 聚合酶，使用PERKIN ELMER GeneAmp PCR系統9700進行。
反應溶液之量藉由添加下列以調整至50μl：0.5μl(相當於0.5μg)之基因組DNA、25μl之酶所隨附之2倍濃度反應緩衝劑、2.5μl之DMSO溶液、5μl之2.5-mM dNTP溶液、0.25μl之各引子(濃度調整為100pmol/μl)、0.3μl的酶以及16.2μl的無菌水。該反應進行如下：於94℃預處理2分鐘，培養10個循環，每個循環由94℃ 45秒、50℃ 45秒及72℃ 1分鐘30秒組成；然後培養15個循環，每個循環由94℃ 45秒、55℃ 45秒及72℃ 1分30秒組成；再於72℃反應5分鐘。當反應完成後，取該反應溶液的一部分於洋菜糖膠體上電泳。結果證實大約1.4kbp之DNA片段被特別擴增。
接著，將TOPO-⊿41c29導入大腸桿菌BW25113/pIJ790(Gust,B.,et al.,"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,"(US),2003,vol.100,pp.1541-1546)以獲得大腸桿菌BW25113/pIJ790/TOPO-⊿41c29菌株。此菌株被接種於包含氯黴素25μg/ml、卡那黴素25μg/ml及安比西林50μg/ml之100ml LB液體培養基中，於30℃培養隔夜。接著，將10ml之SOB培養基加到添加氯黴素25μg/ml、卡那黴素25μg/ml、安比西林50μg/ml及L-阿拉伯糖10mM之65-ml試管中。在該試管中加入經隔夜培養之100μl之大腸桿菌BW25113/pIJ790/TOPO-⊿41c29菌株培養液，並於30℃振 盪培養4小時。所有培養液於4℃以3000rpm離心5分鐘以收集細菌細胞，然後將細菌細胞重懸於10ml之冰冷10%甘油溶液。在重複此操作後，所形成之細菌細胞經重懸於100μl之冰冷10%甘油溶液。接著，50μl之細菌細胞重懸液被收集至微量離心管，並加入5μl之包含上述源自pIJ773之安普黴素抗藥性基因的約1.4kb DNA片段之溶液。該混合物被轉移至冰浴中之2mm電穿孔樣品管(BM6200，由BM Equipment Co.,Ltd.製造)。電穿孔係利用Electro Cell Manipulator 600(由BM Equipment Co.,Ltd.製造)進行，條件為12.5kV、25μF及128Ω。處理後，取1ml冰冷LB液體培養基加至該細菌細胞，接著讓該細胞於37℃培養1小時。將此培養液加入添加濃度各50μg/ml之安比西林及安普黴素的LB洋菜培養基。使其於37℃培養隔夜，以獲得具有安比西林及安普黴素抗藥性之菌株。將此菌株培養於添加濃度各50μg/ml之安比西林及安普黴素的LB液體培養基。因此，分離出質體TOPO-⊿41c29-Am。
(實施例6) <製備生合成基因缺乏菌株>
質體TOPO-⊿41c29根據習知方法導入大腸桿菌ET12567/pUZ8002菌株("Practical Streptomyces Genetics,"The John Innes Foundation,(UK),Norwich,2000)，以獲得大腸桿菌ET12567/pUZ8002/TOPO-⊿41c29。
鏈黴輪生屬與大腸桿菌ET12567/pUZ8002/TOPO-⊿41c29根據下述方法接合。首先，鏈黴輪生屬菌株被接種於65-ml試管中之10ml液體培養基(S#1)[Ueki,M,et al,"The Journal of Antibiotics,"(Japan),1996,vol.49,pp.639-643]，並於30℃培養24小時。所形成之菌株被加入MS洋菜培養基(2%大豆麵粉、2%甘露醇、2%洋菜膠)，於30℃培養2天。在培養後，刮取菌絲收集於3ml之20%甘油以製備宿主菌絲溶液。
以3000rpm離心5分鐘收集細菌細胞之後，將該細菌細胞重懸於3ml之20%甘油溶液。同時，大腸桿菌ET12567/pUZ8002/TOPO-⊿41c29-Am係於37℃培養18小時，培養基為添加濃度各50μg/ml之安比西林及安普黴素的LB液體培養基。接著，將1ml之培養溶液轉移至100ml之LB液體培養基(包含濃度各50μg/ml之安比西林及安普黴素)，於37℃培養4小時。接著，取50ml之培養溶液於3000rpm離心5分鐘以收集細菌細胞。將細菌細胞重懸於20ml之LB液體培養基。重複此操作兩次後，將細菌細胞重懸於2ml之LB液體培養基。
接著，取100μl之鏈黴輪生屬細胞懸浮液與100μl之大腸桿菌ET12567/pUZ8002/cosmid203-7細菌細胞懸浮液組合於1.5-ml試管，離心以收集細菌細胞。以100μl之20%甘油溶液重懸，將此液施加於體積20ml且包含10mM MgCl2之MS洋菜培養基。在30℃培養18小時後，在其上覆蓋包含400μg安普黴素及1500μg奈啶酮酸之1 ml無菌水。在30℃培養5天後，對於長在洋菜培養基上的鏈黴輪生屬菌落進行純化培養，培養於30℃ 2天，培養基為添加250μg/ml安普酶素及250μg/ml卡那黴素之1/2 MS洋菜培養基(洋菜：2%，甘露醇：1%，大豆粉：1%，10mM MgCl2)。在任一培養盤上生長之菌落被繼代培養數次：接種至S#1培養基，然後培養於30℃ 24小時，接種於經改良之YEME培養基(10ml於65-ml試管)，然後於30℃振盪培養1天，再接種1ml之該培養液至另一新鮮經改良之YEME培養基(50ml於250-ml Erlenmeyer培養瓶)。此操作重複五次後，稀釋該培養液以獲得適當數量之活細菌細胞。此培養溶液被添加至包含250μg/ml之安普黴素之1/2 MS洋菜培養基，於30℃培養4天。如此生長之菌落係於添加250μg/ml之安普黴素及250μg/ml之卡那黴素的1/2 MS洋菜培養基中複製。選擇二個對卡那黴素具感受性之菌株(D1株、D2株)，彼等不生長於含卡那黴素之培養基，但生長於含安普黴素之培養基。
製備該獲得之二菌株的基因組DNA，使用41c30F4：5’-CGTGACCGAGGTGGCGCG-3’(SEQ ID NO：43)及41c30RR2：5’-GTCGTCGGATGCGCCGTGCG-3’(SEQ ID NO：44)之引子組合進行PCR反應。經證實該二菌株為如設計之缺損菌株，因為未獲得約0.5kbp之擴增DNA片段。
(實施例7) <培養生合成基因缺損菌株，定量培養液中之UK-2A>
該缺損菌株D1株及D2株分別被接種於250-ml Erlenmeyer培養瓶中之50ml S#1培養基[Ueki,M,et al,"The Journal of Antibiotics,"(Japan),1996,vol.49,pp.639-643]，並於30℃振盪培養24小時。然後，接種1ml之培養液至生產培養基，於30℃振盪培養4天。然後添加4ml之丙酮至1ml該形成之培養液以萃取UK-2A，該液接著經過濾以得到萃取液。取其中的5μl以進行HPLC分析。在HPLC分析中，HPLC系統LC-2010C(由Shimadzu Corporation製造)被用來進行分析。分析所使用之管柱為Inertsil ODS-3 4.6X250mm，移動相為乙腈：水：磷酸=60：40：0.1，流速為1.1ml/min，管柱溫度為40℃，UV波長為340nm。得到的模式與UK-2A參考標準之模式比較。識別源自UK-2A的尖峰。根據彼之面積，定量UK-2A。
同時，也對該等轉形株之母株鏈黴輪生屬菌株3-7的培養液進行相同的培養及UK-2A定量。結果，D1及D2株的UK-2A生產率為0μg/ml。
(實施例8) <製備導入生合成基因簇之轉形株>
根據一般用於放線菌之方法，將經建構之pUK2-3導入鏈黴輪生屬菌株3-7["Practical Streptomyces Genetics,"The John Innes Foundation,(UK),Norwich,2000,pp.311-338]。首先，質體pUK2-3根據習知方法經由電穿孔 導入大腸桿菌ET12567/pUZ8002，以獲得大腸桿菌ET12567/pUZ8002/pUK2-3。此菌株於37℃培養18小時，培養基為添加氯黴素25μg/ml、卡那黴素50μg/ml及安普黴素50μg/ml之LB液體培養基。接著，將1ml之培養溶液轉移至100ml之LB液體培養基(包含濃度分別為25μg/ml、25μg/ml及50μg/ml之氯黴素、卡那黴素及安普黴素)，於37℃培養4小時。接著，取50ml之培養溶液於3000rpm離心5分鐘以收集細菌細胞。將細菌細胞重懸於50ml之LB液體培養基。重複此操作兩次後，將細菌細胞重懸於100μL之LB液體培養基。
同時，將鏈黴輪生屬菌株3-7添加至MS洋菜培養基，於30℃培養2天。在培養後，刮取菌絲置於1ml之20%甘油以製備宿主菌絲溶液。
接著，500μl之宿主菌絲溶液及500μl之包含上述製備之該質體pUK2-3的大腸桿菌溶液被混合在一起，收集細菌細胞。接著，該細菌細胞被施加至已藉由添加10mM MgCl2以將終濃度稀釋成10mmol/L之MS洋菜培養基。在30℃培養20小時後，在其上覆蓋包含6mg安普黴素及0.5mg奈啶酮酸之0.5ml無菌水。繼續於30℃培養5天之後，獲得具有安普黴素抗藥性之轉形株。
(實施例9) <培養基因導入轉形株，定量培養液中之UK-2A>
該基因導入之轉形株係藉由實施例7所述之方法培 養。結果如表3所示，該基因導入轉形株之UK-2A生產率比母株改善58至77倍。
(實施例10) <培養基因導入轉形株，定量培養液中之UK-2A、UK-2B及UK-2C與UK-2D之加總>
該基因導入之轉形株係藉由實施例7所述之方法培養。特別地，添加4ml之丙酮至1ml該形成之培養液以萃取UK-2A、UK-2B、UK-2C及UK-2D，該液接著經過濾以得到萃取液。取其中的5μl以進行HPLC分析。在HPLC分析中，HPLC溶液系統(由Shimadzu Corporation製造)被用來進行分析。以分析條件來說，管柱為Inertsil ODS-3 4.6X150mm；移動相為藉由溶解7.8g之磷酸二氫鈉二水於大約800mL之水，使用磷酸調整該溶液之pH至4.0，添加水以製備1000ml之磷酸水溶液，然後添加650mL液相層析級乙腈至350mL之磷酸水溶液所獲得之溶液；流速為1.0ml/min；管柱溫度為40℃；UV波長為230nm。得到的模式與UK-2A、UK-2B及UK-2C與UK- 2D參考標準之模式比較。識別分別源自UK-2A、UK-2B、UK-2C及UK-2D之波峰。根據彼等之面積，測定UK-2A之量、UK-2B之量及UK-2C與UK-2D之總量。
結果如表4所示，該基因導入轉形株之UK-2A、UK-2B及UK-2C與UK-2D加總的生產率，分別較母株改善37至57倍、10至11倍及12至13倍。
(實施例11) <定量轉形株中UK-2生合成基因簇之份數>
實施例9證實具有改善之UK-2生產率之二個轉形株 的基因組DNA，以及作為宿主細胞之鏈黴輪生屬菌株3-7的基因組DNA係根據實施例1所述之方法製備。PCR反應以該等基因組DNA作為模板，使用StepOnePlus Real-Time PCR系統(由Applied BioSystems Inc.製造)根據隨附之說明進行。對如此獲得之擴增片段進行定量。表5顯示該獲得之結果。
應注意的是在PCR反應中，下列引子對係經設計及合成，並用來擴增該導入之UK-2生合成基因簇中之區域。
UK-2 F2(RT)：5’-GCACCTTCATGTCCGGGTTG-3’(SEQ ID NO：45)
UK-2 R2(RT)：5’-ATCGCCGCGTACACCATGAC-3’(SEQ ID NO：46)。
另外，下列引子對係經設計及合成，並用來作為內部對照以擴增不是該UK-2生合成基因簇之區域。
cont F1(RT)：5’-CGAAGGTCCGGTTGATGGTG-3’(SEQ ID NO：47)
Cont R1(RT)：5’-ATCGCTGCGACACCCTGGAG-3’(SEQ ID NO：48)
如表5所示，在轉形株中UK-2生合成基因簇的份數為母株3-7的二倍。
[工業應用]
如上所述，本發明藉由導入UK-2生合成基因或UK-2生合成基因簇，而使得提供具有高UK-2生產率之轉形株成為可能。
因此，藉由使用本發明之轉形株，以低價大量生產UK-2成為可能。因此，本發明可用於生產稻熱病控制劑、農業用及園藝用之殺真菌劑及醫學抗真菌劑。
[寄存生物物質] [編號]
1.
(1)識別名稱：鏈黴輪生屬(Streptoverticillium)菌株3-7
(2)編號：FERM BP-11437
(3)寄存日期：2011年11月9日
(4)寄存機構：日本國家先進工業科學與技術研究所國際專利微生物寄存機構(International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)
(5)寄存於日本國家先進工業科學與技術研究所國際專利微生物寄存機構(舊稱IPOD)的專利微生物寄存物於2012年4月由日本製品評價技術基盤機構(NITE)繼代。
[序列表非關鍵詞文字]
SEQ ID NO：36至48
<223>人工合成引子序列
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.食品工業發展研究所2013/08/28；BCRC910593
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.日本；獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄託中心；2011/11/09；FERM BP-11437
<110> 明治製藥藥品會社(Meiji Seika Pharma Co.,Ltd.)
<120> UK-2生合成基因和使用彼以改善UK-2之生產率之方法
<130> IBPF13-515W0
<150> JP2012/153986
<151> 2012-07-09
<160> 48
<170> PatentIn version 3.1
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<211> 31318
<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬(Streptoverticillium)
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<212> PRT
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
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<223>
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<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
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<221> CDS
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<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
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<221> CDS
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<212> PRT
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
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<221> CDS
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<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<212> DNA
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<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 22
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<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
<400> 23
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<211> 3831
<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
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<223>
<400> 24
<210> 25
<211> 1276
<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
<400> 25
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<211> 9735
<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(9735)
<223>
<400> 26
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<211> 3244
<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
<400> 27
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<211> 1173
<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
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<213> 鏈黴輪生屬
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<211> 1062
<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
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<221> CDS
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<223>
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
<220>
<221> CDS
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<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
<213> 鏈黴輪生屬
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<221> CDS
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<211> 446
<212> PRT
<213> 鏈黴輪生屬
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<212> DNA
<213> 人工
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<223> 人工合成引子序列
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<212> DNA
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<223> 人工合成引子序列
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<213> 人工
<220>
<223> 人工合成引子序列
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<223> 人工合成引子序列
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成引子序列
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<220>
<223> 人工合成引子序列
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成引子序列
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<223> 人工合成引子序列
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<223> 人工合成引子序列
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<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成引子序列
<400> 48

Claims (15)

  1. 一種誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率之經分離之核酸，其中該核酸為至少一種選自下列(a)至(q)之核酸：(a)編碼包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(b)編碼包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：5之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(c)編碼包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：7之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(d)編碼包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列且其中1至20 個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(e)編碼包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(f)編碼包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(g)編碼包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：15之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(h)編碼包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列且其中1 至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：17之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(i)編碼包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(j)編碼包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：21之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(k)編碼包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：23之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(l)編碼包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列且其中1 至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：25之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(m)編碼包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：27之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(n)編碼包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：29之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(o)編碼包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：31之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；(p)編碼包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列且其中1 至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：33之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸；及(q)編碼包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的蛋白之核酸、編碼包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列且其中1至50個胺基酸經取代、刪除、添加及/或插入而未降低誘導UK-2生合成之活性的蛋白之核酸、或編碼與SEQ ID NO：35之胺基酸序列具有95%或高於95%之同源性的胺基酸序列之核酸。
  2. 如申請專利範圍第1項之核酸，其包含(a)至(q)之所有核酸。
  3. 如申請專利範圍第2項之核酸，其包含SEQ ID NO：1之鹼基序列。
  4. 一種插入如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸的載體，其係用於誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率。
  5. 一種用於測定UK-2生產率之方法，其包含：在測試細菌中檢測包含如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸的鹼基序列或與該序列互補之鹼基序列的核酸之存在；及若於該測試細菌中可檢測該核酸之存在，則測定具有UK-2生產率之該測試細菌。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中用於檢測核酸 之存在的方法係PCR方法。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該PCR方法為其中該核酸利用包含SEQ ID NO：45之鹼基序列的引子及包含SEQ ID NO：46之鹼基序列的引子進行擴增之方法。
  8. 一種細菌，其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善，且其中藉由如申請專利範圍第5項之方法檢測包含如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸的鹼基序列的核酸之存在。
  9. 一種細菌，其中藉由導入如申請專利範圍第4項之載體誘導UK-2生合成且改善UK-2生產率。
  10. 一種細菌，其中UK-2生合成係經誘導且UK-2生產率係經改善，且其中如申請專利範圍第1項之核酸被插入至彼之基因組。
  11. 一種細菌，其中每細胞存在一或二或多份包含如申請專利範圍第1至3項中任一項之核酸的鹼基序列之核酸。
  12. 如申請專利範圍第8至11項中任一項所述之細菌，其為鏈黴輪生屬(Streptoverticillium)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、酵母菌、絲狀真菌及麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)之任一者。
  13. 一種用於產製UK-2之方法，該方法包含下列步驟： 培養如申請專利範圍第8至12項中任一項所述之細菌，及自該細菌之培養物收集UK-2。
  14. 一種用於產製UK-2之衍生物之方法，該方法包含下列步驟：培養如申請專利範圍第8至12項中任一項所述之細菌及自該細菌之培養物收集UK-2；及自該收集之UK-2合成UK-2之衍生物，該衍生物係由下式(1)之任一者表示： 在式(1)中，R代表2-甲基丙醯基、反-2-甲基-2-丁烯醯基、3-甲基丁醯基及2-甲基丁醯基之任一者，R1代表C1-6烷基、苄基、C1-10烷基羰基(該C1-10烷基羰基可經羧基、苯甲氧基羰基、C1-4烷氧基羰基及苯甲氧基羰基胺基之任一者取代)、苯甲醯基、C1-4烷氧基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷基、可經硝基取代之苯甲氧基羰 基(C1-4)烷基、C1-6烷基磺醯基、二(C1-6)烷基磷氧基、二苯基磷氧基及由下式(2)表示之取代基之任一者； 在式(2)中，Q係選自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH=CH2及環丙基；M係選自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH=CH2及環丙基；T係選自O、OC(O)、OC(O)O、S、SC(O)、SC(O)O及由下式(3)代表之取代基； G係選自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6環烷基、芳基及雜芳基；G及M可能形成可任意選擇地具有一側氧基之異苯 并呋喃環；M及Q可能形成3至8元之碳環系統。
  15. 一種用於產製UK-2A衍生物之方法，該方法包含下列步驟：培養如申請專利範圍第8項所述之細菌及自該細菌之培養物收集UK-2A；及自該收集之UK-2A合成由下式(4)至(7)之任一者表示之UK-2A衍生物：
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