CN104427870A - Uk-2生物合成基因和使用其提高uk-2生产率的方法 - Google Patents

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Abstract

为了提供能够以低成本大量生产UK-2的生产方法，分析产生UK-2的轮枝链霉菌属(Streptoverticillium)种3-7的基因组DNA以鉴定出预期是UK-2生物合成基因簇的区域。另外，通过菌落杂交，成功分离出该区域中的DNA。接着，使用所述DNA制备了其中存在于所述区域中的基因被破坏的菌株。发现该菌株不产生UK-2。确认了所述基因组区域是UK-2生物合成基因簇。此外，通过导入其中插入所分离的UK-2生物合成基因簇的载体来转化轮枝链霉菌属种3-7。还发现，与亲代菌株相比，转化体的UK-2生产率提高10-60倍。另外，已显示这些转化体的每个细胞中分别存在2个拷贝的UK-2生物合成基因簇。

Description

UK-2生物合成基因和使用其提高UK-2生产率的方法
技术领域
本发明涉及UK-2——用于稻瘟病防治试剂等的化合物——的生物合成所必需的基因(下文称为“UK-2生物合成基因”)，以及用于提高UK-2生产率(productivity)的方法。更具体地，本发明涉及UK-2生物合成基因、其中插入所述UK-2生物合成基因的载体、其中引入所述载体的转化体、用于通过检测所述UK-2生物合成基因的存在来确定UK-2生产率的方法、其中所述UK-2生物合成基因的存在是通过所述方法来检测的细菌、包含插入在其基因组中的所述UK-2生物合成基因的细菌、其中每个细胞中存在一个或两个或多个拷贝的UK-2生物合成基因的细菌，以及通过使用这些细菌等来生产UK-2和UK-2A衍生物的方法。
背景技术
UK-2是由放线菌(actinobacteria)产生的作为次级代谢产物的化合物，其表现出类似于抗霉素的针对多种真菌(包括丝状真菌和酵母)的强的抗真菌作用。另外，由于对培养细胞具有低细胞毒性，已发现UK-2可用于稻瘟病防治试剂、农业和园艺杀真菌剂和医用抗真菌剂(专利文献1、2)。此外，已经显示，基于其侧链结构的差异，天然存在四种类似物——UK-2A至D(非专利文献1)。
通过培养放线菌(属于轮枝链霉菌属(Streptoverticillium)的细菌等)，然后从其中收集UK-2来生产UK-2。但是，通常由从自然中分离的微生物产生的UK-2(所有的UK-2因子)的量非常少。因此，为了在工业上以低成本使用所述靶标(UK-2)，必须要提高生产率。
可通过以下方式提高所述靶标的生产率：对用于培养生产所述靶标的微生物的方法的研究，对培养基成分的研究、通过添加前体对发酵条件的改善、以及利用紫外线照射诱导的或化学诱变剂诱导的突变对细菌菌株的改良。另外，除了上述方法之外，生产率最近还已通过利用基因重组得以提高。
用于通过基因重组提高产率的一般方法包括提高所述靶标的生物合成所必需的基因的表达。例如，专利文献3公开该方法提高了无孢目(Agonomycetales)中的PF-1022的生产率。
但是，当使用该方法时，必须分离所述靶标的生物合成所必需的基因或使用已知技术合成的基因，还必须建立用于生产所述靶标的微生物(生产微生物)的转化方法。由于UK-2生物合成基因还有待阐明，因此实施利用UK-2生物合成基因的转化。无法通过基因重组来提高生产率。
[引文列表]
[专利文献]
[PTL 1]日本审查专利申请公开Hei 07－233165
[PTL 2]国际公开WO1999/11127
[PTL 3]国际公开WO2001/018179
[非专利文献]
[NPL 1]Ueki M.,et al.,Journal of antibiotics,July 25th,1996,vol.49,no.7,pp.639-643
[NPL 2]Namwat W.,et al,Journal of Bacteriology,September2002,vol.184,no.17,pp.4811-4818
发明内容
[技术问题]
鉴于上述传统技术中的问题，产生了本发明。本发明的一个目标是提供具有高的UK-2生产率的转化体，该转化体是通过分离UK-2的生物合成所必需的基因并随后导入该基因而获得。另外，另一个目标的是使用所述转化体以低成本生产大量的UK-2。并且另一个目标的是提供用于通过检测所述基因的存在来测定UK-2生产率的方法。
[问题的解决方案]
UK-2具有特征性的羟基吡啶甲酸骨架。同时，一种称为维吉霉素的化合物也具有羟基吡啶甲酸骨架。另外，已显示VisA(L-赖氨酸2-氨基转移酶)和VisB(3-羟基吡啶甲酸AMP连接酶)参与维吉霉素的生物合成(非专利文献2)。
因此，为了实现上述目的，本发明人首先制备了产生UK-2的轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA文库，并全面确定了所述菌株的基因组DNA的碱基序列。然后，在由基因组DNA所编码的推定蛋白质的氨基酸序列与VisA和VisB的氨基酸序列之间进行同源性分析，从而找出这样的基因组位点，即在该位点上其产物与这两种氨基酸序列具有高度同源性的基因被连续定位。此外，发现编码与非核糖体肽合成酶(NRPS)具有同源性的蛋白质的基因，以及编码与聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)具有同源性的蛋白质的基因均位于所述位点附近。
认为这些酶是形成UK-2骨架所必需的。此外，放线菌次级代谢产物基因形成基因簇。因此，预期所述基因组区域是UK-2生物合成基因簇。
然后，基于由此获得的关于预期编码UK-2生物合成所必需的酶的基因的碱基序列信息，制备了探针。通过使用探针进行菌落杂交，从上述基因组DNA文库中成功分离出预期存在于所述UK-2生物合成基因簇中的DNA(即，所述基因组区域中所包含的DNA)。另外，使用所述DNA制备了其中存在于所述基因组区域中的基因被破坏的轮枝链霉菌属种3-7。发现该菌株不产生UK-2。确认了所述基因组区域是UK-2生物合成基因簇。此外，通过引入其中插入了所分离的UK-2生物合成基因簇的载体来转化轮枝链霉菌属种3-7。还发现，与亲代菌株相比，所述转化体的UK-2产率提高了10-60倍或更多。另外，经确认，在这些转化体的每个细胞中分别存在2个拷贝的UK-2生物合成基因簇。
具体地，本发明涉及UK-2生物合成基因、其中插入了所述UK-2生物合成基因的载体、其中导入了所述载体的转化体、以及用于通过使用所述转化体产生UK-2等的方法。更具体地，本发明提供了以下内容。
<1>一种诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率的分离的核酸，所述核酸是至少一种选自以下(a)至(q)的核酸：
(a)编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:3的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:2的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(b)编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:5的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:4的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(c)编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:7的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:6的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(d)编码包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:9的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:8的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(e)编码包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:11的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:10的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(f)编码包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:13的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:12的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(g)编码包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:15的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:14的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(h)编码包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:17的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:16的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(i)编码包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:19的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:18的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(j)编码包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:21的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:20的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(k)编码包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:23的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:22的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(l)编码包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:25的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:24的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(m)编码包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:27的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:26的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(n)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:29的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:28的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(o)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:31的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:30的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(p)编码包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其上一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:33的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:32的碱基序列的核酸杂交的核酸；和
(q)编码包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其上一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ IDNO:35的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:34的碱基序列的核酸杂交的核酸。
<2><1>的核酸，其包含(a)至(q)的所有核酸。
<3><2>的核酸，其包含SEQ ID NO:1的碱基序列。
<4>其中插入了<1>至<3>中任一项的核酸的载体，用于诱导UK-2生物合成和提高UK-2的生产率。
<5>用于确定UK-2生产率的方法，所述方法包括在测试细菌中检测核酸的存在，该核酸包含<1>至<3>中任一项的核酸的碱基序列或与所述序列互补的碱基序列。
<6><5>的方法，其中用于检测核酸的存在的方法是PCR法。
<7><5>中的方法，其中所述PCR法是其中使用包含SEQ ID NO:45的碱基序列的引物和包含SEQ ID NO:46的碱基序列的引物来扩增核酸的方法。
<8>一种细菌，其中UK-2生物合成被诱导且UK-2生产率提高，并且其中包含<1>至<3>中任一项的核酸的碱基序列或与所述序列互补的碱基序列的核酸的存在是通过<5>至<7>中任一项的方法检测。
<9>一种细菌，其中通过导入<4>的载体诱导UK-2的生物合成和提高UK-2的生产率。
<10>一种细菌，其中UK-2生物合成被诱导且UK-2生产率提高，并且其中<1>至<3>中任一项的核酸被插入至其基因组中。
<11>一种细菌，其中每个细胞中存在核酸的一个或两个或多个拷贝，所述核酸包含<1>至<3>中任一项的核酸的碱基序列。
<12><8>至<11>中任一项的细菌，其是如下中的任一种：轮枝链霉菌属、链霉菌属(Streptomyces)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母(yeast)、丝状真菌(filamentous fungi)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
<13>用于产生UK-2的方法，所述方法包括以下步骤：
培养<8>至<12>中任一项的细菌，并且从所述细菌的培养物中收集UK-2。
<14>用于产生UK-2的衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
培养<8>至<12>中任一项的细菌，并且从所述细菌的培养物中收集UK-2；以及
从所收集的UK-2合成由下式(1)中的任意一种所代表的UK-2的衍生物。
[化合物1]
[在式(1)中，
R代表2-甲基丙酰基(2-methylpropanoyl)、反式-2-甲基-2-丁烯酰基(trans-2-methyl-2-butenoyl)、3-甲基丁酰基(3-methylbutanoyl)和2-甲基丁酰基中的任意一个。
R1代表如下中的任意一个：C1-6烷基、苯甲基、C1-10烷基羰基(所述C1-10烷基羰基可被羧基、苯甲氧基羰基、C1-4烷氧基羰基和苯甲氧基羰基氨基中的任意一个取代)、苯甲酰基、C1-4烷氧基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷基、可被硝基取代的苯甲氧基羰基(C1-4)烷基、C1-6烷基磺酰基、二(C1-6)烷基磷酰基、二苯基磷酰基，以及由下式(2)所表示的取代基；
[化合物2]
(在式(2)中，
Q选自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH＝CH2和环丙基。
M选自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH＝CH2和环丙基。
T选自O、OC(O)、OC(O)O、S、SC(O)、SC(O)O和由下式(3)所表示的取代基。
[化合物3]
G选自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基。
G和M可形成任选带有氧基(oxo)的异苯并呋喃环。
M和Q可形成3-8元碳环系统]。
<15>用于产生UK-2A衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
培养<8>至<12>中任一项的细菌，从所述细菌的培养物中收集UK-2A；以及
从所收集的UK-2A合成由下式(4)至(7)中任一项所表示的UK-2A衍生物。
[化合物4]
[化合物5]
[化合物6]
[化合物7]
需要注意的是，本文使用的术语“酰基”应意指通过从羧酸R-COOH中移除OH所提供的残基RCO-，其中R代表烃基。本文使用的术语“芳基”应意指苯基或萘基。本文使用的术语“杂芳基”应意指包含一个或多个杂原子的任意5或6元芳香环，其中这类杂原子选自O、N和S，并且其中所述芳香环的其余原子是碳原子。适合的实例包括，但不限于，吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、吡咯、吡唑、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、喹啉、喹喔啉(quinoxoline)和噻二唑。
[本发明的有利效果]
本发明通过将UK-2生物合成基因导入宿主细胞如细菌中，使得可能提供具有高的UK-2生产率的转化体。此外，还可能利用所述转化体以低成本大量生产UK-2。此外，还可能提供用于通过检测所述基因的存在来确定UK-2生产率的方法。
具体实施方式
<UK-2生物合成基因>
本发明提供了UK-2生物合成基因。如以下实施例所述，本发明人已从轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA中分离出表2中所示的17个基因，作为新的UK-2生物合成基因。
因此，本发明的UK-2生物合成基因的一个实施方案是“诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率的分离的核酸，所述核酸是编码包含SEQID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列的蛋白质的核酸”，且一般是“诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率的分离的核酸，所述核酸是包含SEQ ID NO:2,4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的碱基序列的核酸”。
在本发明中，短语“UK-2生产率的提高”及相关短语不仅意指细菌或类似生物天然具有的UK-2生产率的提高，还意指天然不具有UK-2生产能力的细菌或类似生物获得UK-2生产能力。
在本发明中，术语“分离”和相关术语意指使得所述核酸能够在与其原本存在的条件不同的条件下存在的人工处理。本发明的UK-2生物合成基因可例如通过以下方式分离：首先通过基于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的碱基序列的信息合成适合的引物，然后使用所述引物以轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA为模板进行PCR。或者，如以下实施例所述，还可通过使用从所述PCR中获得的扩增产物作为探针进行菌落杂交，从轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA文库或cDNA文库中分离得到本发明的UK-2生物合成基因。此外，还可通过基于碱基序列信息的全化学合成来制备本发明的UK-2生物合成基因。
在本发明中，“UK-2”是由下式(8)所表示的化合物：
[化合物8]
其中R代表直链或支链饱和脂肪族酰基，或直链或支链不饱和脂肪族酰基。优选地，“UK-2”是如下的化合物：其中R为异丁酰基(2-甲基丙酰基)的化合物(UK-2A)；其中R为巴豆酰基(tigloyl)(反式-2-甲基-2-丁烯酰基)的化合物(UK-2B)、其中R为异戊酰基(3-甲基丁酰基)的化合物(UK-2C)、以及其中R为2-甲基丁酰基的化合物(UK-2D)。
此外，在本发明中，“UK-2生物合成基因”是编码具有能够诱导UK-2生物合成的活性的蛋白质的基因。可通过，例如，以下实施例9中所述的方法来评估“能够诱导UK-2生物合成的活性”。具体地，在编码测试蛋白的核酸被插入载体中(所述载体会被导入或类似地进入宿主细胞，例如，轮枝链霉菌属种3-7)之后，通过所述测试蛋白在宿主细胞中的强制表达来测定该宿主细胞中所产生的UK-2的量。如果所产生的量大于不表达测试蛋白的宿主细胞中的量，可评估所述测试蛋白具有能够诱导UK-2生物合成的活性。
在现有技术的状态下，如果可获得UK-2生物合成基因的碱基序列的信息，本领域技术人员能够修饰所述碱基序列并获得编码参与UK-2生物合成的蛋白质的核酸，尽管所述蛋白质的氨基酸序列不同于从所述碱基序列编码的氨基酸序列。同时，在自然条件下，待编码的蛋白质的氨基酸序列还可通过碱基序列的突变而发生突变。因此，本发明的UK-2生物合成基因的另一个实施方案是“分离的核酸，其是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含其中一种或多种氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列”。在此处，“多于一种”是指在修饰之后参与UK-2生物合成的蛋白质中被修饰的氨基酸的数目，只要该蛋白仍具有诱导UK-2生物合成的活性。所述数目通常为1-50，优选为1-40，更优选为1到数个(例如，1-20、1-10、1-8和1-4)。
本领域技术人员能够通过已知方法(如定点诱变)基于UK-2生物合成基因的碱基序列的信息，制备编码这类变体的核酸。
另外，在现有技术的状态下，如果可获得UK-2生物合成基因的碱基序列信息，本领域技术人员能够通过杂交技术或聚合酶链式反应(PCR)技术，获得编码具有从非轮枝链霉菌属种3-7的菌株或其他细菌中诱导UK-2生物合成的活性的蛋白质的核酸(同源基因)。因此，本发明的UK-2生物合成基因的另一个实施方案是“分离的核酸，其是在严格条件下与包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34的碱基序列的核酸杂交的核酸”。
为了分离这种同源基因，通常在严格条件下进行杂交反应。所述“严格条件”是指在该条件下，杂交之后的膜洗涤步骤是在高温下于具有低盐浓度的溶液中进行。所述“严格条件”包括例如这样的洗涤条件，即以2×SSC浓度(1×SSC:15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)在0.5％SDS溶液中于60℃下进行20分钟。另外，例如，可根据已知的ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.制造)所附的说明中所述的方法进行所述杂交。
另外，由通过此方法获得的同源基因所编码的蛋白质通常与SEQID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列具有高度同源性。因此，本发明的UK-2生物合成基因的另一个实施方案是“分离的核酸，其是编码与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列具有95％或更高的同源性的氨基酸序列的核酸”。
可使用，例如来自NCBI的BLASTX(氨基酸水平)程序来确定序列的同源性。
如以下实施例所述，本发明的UK-2生物合成基因可用于制备具有高UK-2生产率的转化体，还可有效地用于筛选UK-2生物合成基因簇。
在制备这样的转化体和筛选UK-2生物合成基因簇的过程中，组合使用上述UK-2生物合成基因优于单独使用所述UK-2生物合成基因。组合的UK-2生物合成基因的数目没有特别限制，只要UK-2生物合成能够被所述组合诱导。例如，所述数目为2或更大，优选为5或更大，更优选为10或更大，更优选为15或更大。组合的UK-2生物合成基因的数目最优选为17，因为在该转化体中的UK-2的生产率可被显著提高。
所述组合的UK-2生物合成基因可作为单一核酸存在或作为分开的核酸存在。
本发明提供了“包含SEQ ID NO:1的碱基序列的核酸”，作为包含17个UK-2生物合成基因的单一核酸(UK-2生物合成基因簇)。在包含SEQ ID NO:1的碱基序列的核酸中的这些基因的开放阅读框架(ORF)的位置如以下表1所示。
如以下实施例所述，可通过如下方法分离“包含SEQ ID NO:1的碱基序列的核酸”：首先基于UK-2生物合成基因的碱基序列的信息等合成适合的引物，然后使用所述引物以单独制备的轮枝链霉菌属种3-7的粘粒基因组DNA文库为模板进行PCR，接着将所获得的扩增产物用作探针进行菌落杂交
<载体>
本发明提供了其中插入本发明的UK-2生物合成基因的载体。本发明的载体可基于自我复制的载体构建，即例如作为染色体外元件存在并且其复制不依赖于染色体复制的质粒。或者，本发明的载体在被导入宿主细胞(如细菌)并整合到其基因组中之后，可与宿主细胞的染色体一起复制。作为用于构建本发明的载体的步骤和方法，可使用任何在遗传工程领域中通常使用的步骤和方法。
本领域技术人员可根据待引入的宿主细胞的类型，从已知载体中适当选择本发明的载体。已知载体的实例包括粘粒载体(SuperCos 1粘粒载体等)、噬菌体载体、基于pUC的质粒(pCR2.1-TOPO质粒载体等)、基于pBluescript的质粒和pBR322质粒。
为了在宿主细胞中表达由本发明的UK-2生物合成基因编码的蛋白，本发明的“载体”除了包含所述基因以外，还优选地包含用于调控表达的DNA序列、用于选择所转化的宿主细胞的标记基因等。
“用于调控表达的DNA序列”的实例包括启动子、增强子和终止子。所述实例还包括乳糖操纵子，该乳糖操纵子能够通过将异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入到细菌中诱导位于下游的基因的表达。例如，可通过分别将启动子和终止子可操作地连接到本发明的UK-2生物合成基因的上游和下游来构建本发明的载体。
可根据用于选择所转化的宿主细胞(转化体)的方法适当选择所述“标记基因”。例如，可使用编码药物抗性的基因或补充营养缺陷型的基因。在所使用的宿主细胞是细菌的情况下，所述标记基因的实例包括氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因。具体地，在放线菌的情况下，所述实例包括安普霉素抗性基因、硫链丝菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、紫霉素抗性基因等。在酵母的情况下，所述标记基因的实例包括色氨酸生物合成酶基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等。在霉菌的情况下，所述实例包括潮霉素抗性基因、双丙氨膦(bialaphos)抗性基因、博来霉素抗性基因、金担子素(aureobasidin)抗性基因等。在植物的情况下，所述实例包括卡那霉素抗性基因、双丙氨膦抗性基因等。
<转化体等>
本发明提供了其中导入本发明的载体的转化体(例如，其中通过导入本发明的载体诱导UK-2生物合成并且提高UK-2生产率的细菌)。
另外，本发明提供了一种转化体，其中UK-2生物合成被诱导且UK-2生产率提高，并且其中本发明的UK-2生物合成基因插入到其基因组中。
通过导入本发明的载体而被转化的宿主细胞或其基因组中含有本发明的UK-2生物合成基因的宿主细胞未被特别限制。其实例包括放线菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌、谷氨酸棒状杆菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。从UK-2生产率的角度考虑，优选放线菌，更优选属于轮枝链霉菌属的细菌和属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌，甚至更优选属于轮枝链霉菌属的细菌，特别优选轮枝链霉菌属种3-7。
用于将本发明的载体导入宿主细胞的方法没有特别限制。其可由本领域技术人员可根据接受测试的宿主细胞的类型，从已知转化方法(例如，接合转移、噬菌体转导、钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、农杆菌法和粒子枪法)中适当选择并使用。另外，在包含所述“标记基因”的载体被导入宿主细胞的情况下，可通过以下方法有效地制备本发明的转化体：在加入对应于药物抗性基因的抗生素的培养基中培养，或在缺少对应于补充营养缺陷型的基因的营养物的培养基中培养。
另外，本发明提供了一种细菌，其中通过改良发酵条件、突变诱导等诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率。另外，如以下实施例所述，已证明包含至少两个拷贝的本发明的UK-2生物合成基因诱导了UK-2生物合成并且显著提高了UK-2产率。因此，本发明还提供了一种细菌，其中每个细胞中存在本发明的UK-2生物合成基因的一个或两个或多个拷贝。从UK-2生产率的角度考虑，这类细菌优选放线菌，更优选属于轮枝链霉菌属的细菌和属于链霉菌属的细菌，还优选属于轮枝链霉菌属的细菌。另外，从UK-2生产率的角度考虑，每个细胞中的本发明的UK-2生物合成基因的拷贝数优选地为两个或更多。需要注意的是，可例如通过以下实施例所述的PCR方法来鉴定每个细胞中本发明的UK-2生物合成基因的拷贝数。
<用于测定UK-2生产率的方法>
本发明人已分离并鉴定了UK-2的生物合成所必需的基因，并因此使得能够通过检测所述基因的存在来确定UK-2生产率。因此，本发明还提供了用于测定UK-2生产率的方法，所述方法包括在测试细菌中检测核酸的存在，该核酸包含本发明的UK-2生物合成基因的碱基序列或与所述序列互补的碱基序列。
在本发明的方法中，所述“测试细菌”没有特别限制。其实例包括放线菌(属于轮枝链霉菌属的细菌、属于链霉菌属的细菌等)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、丝状真菌和谷氨酸棒状杆菌。
在用于测定本发明的UK-2生产率的方法中，待检测的本发明的UK-2生物合成基因的碱基序列，即本发明的核酸的碱基序列，是至少一种选自上述(a)至(q)的核酸的碱基序列。
可通过靶向包含所述核酸的基因组DNA等或靶向来自基因组DNA的转录产物来直接检测所述核酸等。或者，还可通过靶向来自所述转录产物的翻译产物(由本发明的UK-2生物合成基因所编码的蛋白)来间接检测所述核酸等。另外，可使用任何已知的方法检测所述核酸等。在靶向基因组DNA的情况下，可使用，例如，原位杂交法(ISH)、基因组PCR法、直接测序法、DNA印迹法、以及使用基因组微阵列的分析方法。在靶向所述转录产物的情况下，可使用，例如，PCR法、直接测序法、RNA印迹法、点阵图法(dot plot method)、以及利用cDNA微阵列的分析方法。在靶向翻译产物的情况下，已知方法的实例包括使用针对本发明UK-2生物合成基因所编码的蛋白质的抗体的免疫方法(蛋白质印迹法、ELISA法、流式细胞术、免疫组织化学染色方法、成像细胞术(imaging cytometry)、放射免疫测定、免疫沉淀、使用抗体阵列的分析方法等)。在这些方法中，优选PCR法；更优选其中使用包含SEQ IDNO:45的碱基序列的引物和包含SEQ ID NO:46的碱基序列的引物来扩增核酸的PCR法。
另外，在本发明的方法中，从实现更准确测定UK-2生产率的角度考虑，优选检测上述多种核酸(本发明的UK-2生物合成基因)的存在，而非检测所述核酸中的一种核酸的存在。待检测的核酸数目是，例如，2个或更多，优选5个或更多，更优选10个或更多，甚至更优选15个或更多。特别优选检测所有的17种核酸，最优选检测包含所有的17种核酸的单一核酸(所述核酸包含SEQ ID NO:1的碱基序列)。此外，除了核酸的整个长度，在用于检测所述核酸的存在的正常实施中可靶向其一部分。因此，同样在本发明的方法中，对核酸等的检测可以是对其一部分等的检测。本领域技术人员可根据检测方法，适当选择待通过本发明的方法检测的核酸部分的长度。
然后，如果可通过这类方法检测测试细菌中所述核酸的存在，则确定该测试细菌具有UK-2生产率。另外，本发明的方法还可包括在允许UK-2产生的条件下，培养其中可检测到所述核酸的存在的测试细菌。
此外，本发明还提供了一种细菌，其中UK-2生物合成被诱导并且UK-2产率提高，并且其中通过用于测定本发明的UK-2生产率的方法检测包含本发明核酸的碱基序列或与所述序列互补的碱基序列的核酸的存在。从UK-2生产率的角度考虑，所述细菌优选为放线菌，更优选为属于轮枝链霉菌属的细菌和属于链霉菌属的细菌，并且甚至更优选为属于轮枝链霉菌属的细菌。
需要注意的是，如本文所使用的，具有本发明的UK-2生物合成基因的上述细菌等——即，其中UK-2生物合成被诱导并且UK-2生产率提高，并且其中可通过用于测定本发明的UK-2生产率的方法检测所述核酸的存在的细菌；其中通过导入本发明的载体诱导UK-2生物合成并且提高UK-2生产率的转化体；其中UK-2生物合成被诱导并且UK-2生产率提高，并且其中本发明的UK-2生物合成基因插入至其基因组中的转化体；其中每个细胞中存在一个或两个或多个本发明的UK-2生物合成基因的拷贝的细菌；以及其中通过改良发酵条件、突变诱导等诱导UK-2生物合成并且提高UK-2生产率的细菌——在下文中被统称为“本发明的细菌等”。
<用于生产UK-2的方法>
本发明提供了用于生产UK-2的方法，所述方法包括以下步骤：
培养本发明的细菌等，以及所述细菌等的培养物中收集UK-2。
可根据传统方法适当选择培养基、培养条件等来培养所述细菌等。作为培养基，可使用通常使用的成分。例如，作为碳源，可使用葡萄糖、蔗糖、纤维素、淀粉糖浆、糊精、淀粉、丙三醇、糖蜜、动物和植物油等。另外，作为氮源，可使用大豆粉、小麦胚芽、棉籽粉(pharmamedia)、玉米浆(corn steep liquor)、棉籽粕(cottonseed meal)、肉汤、蛋白胨、聚蛋白胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等。除此之外，如果需要的话，可有效添加可产生钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸、硫酸和其他离子的无机盐；无机盐的实例包括氯化钾、碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰和硫酸铜。另外，如果需要的话，还可加入多种维生素如硫胺素B1(盐酸硫胺素等)、氨基酸如谷氨酸(谷氨酸钠等)和天冬氨酸(DL-天冬氨酸等)、微量营养素如核苷酸、以及选择性药物如抗生素。此外，可适当加入有机物和无机物以促进细菌生长和UK-2生产。所述培养基的pH值没有特别限制，并且可根据待培养的细菌等的类型进行调节。例如，pH值约为6-8。
本领域的技术人员可根据待培养的细菌等的类型、待使用的培养基类型等来适当选择并设置培养条件。例如，可从已知的培养方法(例如在有氧条件下的振荡培养法、通气搅拌培养法和有氧浸没培养法(aerobic submerged culture method))中选择培养方法。优选通气搅拌培养法。适合的培养温度为15℃-40℃。在很多情况下，培养温度被设置为约26℃-37℃。另外，培养期优选为达到UK-2的最大累积量时的2-25天。
在本发明中，所述“培养物”是指通过培养本发明的细菌等获得的培养基，所述培养基包含增殖的细菌等，所述细菌等的分泌物和代谢产物，等等。所述培养物还包括上述的稀释液和浓缩物。
在所述培养物中，UK-2同时在所述细菌等和所述培养基中积累。因此，用于从所述培养物的培养基中收集UK-2的方法的实例是使用有机溶剂的萃取法，所述有机溶剂为例如不与水自由混合并且能够有效萃取UK-2的乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷。同时，例如，可通过使用有机溶剂如丙酮，对通过如过滤或离心获得的细菌等进行萃取以从所述培养物的细菌等中收集UK-2。另外，在使用玻璃珠等破坏所述培养物的细菌等之后，可以与上述从培养基中萃取相同的方式通过萃取收集UK-2。
此外，在从所述培养基中收集UK-2的过程中，可通过对如此制备的萃取级分(如有机溶剂)进行已知的纯化技术(如溶剂转移溶解、正相和反相色谱、凝胶过滤色谱和结晶的组合)来分离和纯化UK-2。
<用于生产UK-2的衍生物的方法>
如上所述，本发明使得能够以低成本大量生产UK-2。因此，也可以使用通过本发明的生产方法获得的UK-2作为其原料以低成本大量生产UK-2的衍生物。
因此，本发明还可提供用于生产UK-2的衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
培养本发明的细菌等，并从所述细菌等的培养物中收集UK-2(UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D)；和
从所收集的UK-2合成由下式(1)中的任意一种所代表的UK-2的衍生物。
[化合物9]
[在式(1)中，
R代表2-甲基丙酰基、反式-2-甲基-2-丁烯酰基、3-甲基丁酰基和2-甲基丁酰基中的任意一个。
R1代表C1-6烷基、苯甲基、C1-10烷基羰基(所述C1-10烷基羰基可被羧基、苯甲氧基羰基、C1-4烷氧基羰基和苯甲氧基羰基氨基中的任意一个取代)、苯甲酰基、C1-4烷氧基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷基、可被硝基取代的苯甲氧基羰基(C1-4)烷基、C1-6烷基磺酰基、二(C1-6)烷基磷酰基、二苯基磷酰基以及由下式(2)所表示的取代基；
[化合物10]
(在式(2)中，
Q选自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH＝CH2和环丙基。
M选自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH＝CH2和环丙基。
T选自O、OC(O)、OC(O)O、S、SC(O)、SC(O)O以及由下式(3)所表示的取代基；
[化合物11]
G选自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基。
G和M可形成任选地带有氧基的异苯并呋喃环。
M和Q可形成3-8元碳环系统。]
在由式(2)所表示的取代基中，烷基、炔基、烯基、环烷基、芳基和杂芳基可被至少一种选自以下取代基的取代基取代：
C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、C5-6环烯基、芳基、杂芳基、卤素原子、硝基、羟基、氰基、C1-6烷氧基、C2-6烯氧基、C3-6环烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰氧基、C1-6烷基酰氧基、C3-6环烷基酰氧基、芳基酰氧基、杂芳基酰氧基、C1-6烷氧基酰基、C3-6环烷氧基酰基、芳氧基酰基、杂芳氧基酰基、C1-6烷基酰基、C3-6环烷基酰基、芳基酰基、杂芳基酰基、C1-6烷基酰基氨基、C3-6环烷基酰基氨基、芳基酰基氨基、杂芳基酰基氨基、C1-6烷基氨基酰基、C3-6环烷基氨基酰基、芳基氨基酰基、杂芳基氨基酰基、C1-6烷基硫基(C1-6alkylthio)、C3-6环烷基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、C1-6烷基磺酰基、C3-6环烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基、C3-6环烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基，以及-C(NORx)RY，其中RY和Rx独立地是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基(其中含取代基的任意烷基或环烷基可被一个或多个卤素取代)中的任意一个。
需要注意的是，所述取代基还可被至少一种选自以下取代基的取代基取代：
C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、C5-6环烯基、芳基、杂芳基、卤素原子、硝基、羟基、氰基、C1-6烷氧基、C2-6烯氧基、C3-6环烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、酰氧基、C1-6烷基酰氧基、C3-6环烷基酰氧基、芳基酰氧基、杂芳基酰氧基、C1-6烷氧基酰基、C3-6环烷氧基酰基、芳氧基酰基、杂芳氧基酰基、C1-6烷基酰基、C3-6环烷基酰基、芳基酰基、杂芳基酰基、C1-6烷基酰基氨基、C3-6环烷基酰基氨基、芳基酰基氨基、杂芳基酰基氨基、C1-6烷基氨基酰基、C3-6环烷基氨基酰基、芳基氨基酰基、杂芳基氨基酰基、C1-6烷基硫基、C3-6环烷基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基、C1-6烷基磺酰基、C3-6环烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基、C3-6环烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基，以及-C(NORx)RY，其中RY和Rx独立地是H、C1-6烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基(其中含取代基的任意烷基或环烷基可被一个或多个卤素取代)中的任意一个。
此外，本发明还可提供用于生产UK-2A衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
培养本发明的细菌等，并从所述细菌等的培养物中收集UK-2A；以及
从所收集的UK-2A合成由下式(4)至(7)中的任意一种所代表的UK-2A衍生物。
[化合物12]
[化合物13]
[化合物14]
[化合物15]
在从所述培养物中收集UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D的过程中，例如，如上所述，可通过对萃取级分(如有机溶剂)进行已知的纯化技术(如溶剂转移溶解、正相和反相色谱、凝胶过滤色谱和结晶的组合)来分离和纯化UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D。更具体地，在减压下浓缩所述萃取级分如有机溶剂。将所得产物转移到并溶解在氯仿中，并进行硅胶色谱，然后用氯仿/甲烷逐步洗脱。因此，可获得包含约3:1比例的UK-2A和UK-2D并且包含微量UK-2B和UK-2C的级分。此外，通过使用C-18柱的反相高效液相色谱(HPLC)处理所述级分，并且因此可分离UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D(参见专利文献1)。
然后，可通过例如记载于国际公开2003/035617或国际公开1999/40081中的合成方法，使用如此收集的UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D作为其原料合成由式(1)和(4)至(7)中的任何一个所代表的UK-2A、UK-2B、UK-2C或UK-2D的衍生物。
实施例
在下文中，将基于实施例对本发明进行更为具体地描述。但是，本发明并不局限于下面的实施例。
需要注意的是，本发明实施例中所述的微生物是如下进行保藏。轮枝链霉菌属种3-7于2011年11月9日以登录号FERM BP-11437保藏在日本国家先进工业科学与技术研究所的国际专利生物保藏中心(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，邮编：305-8566，日本)。顺带提及的是，日本国家先进工业科学与技术研究所的国际专利生物保藏中心(曾用名：IPOD)对专利微生物的保藏于2012年4月由日本国家技术与评估研究所(NITE，#122，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，邮编：292-0818)接管。
从记载于日本审查专利申请公开Hei 07-233165中的SAM 2084菌株中建立了轮枝链霉菌属种3-7，本发明人通过单一紫外线照射对其进行了人工突变。所述SAM 2084菌株是从日本京都县的土壤中获得的UK-2生产细菌菌株，并以国际保藏号FERM BP-6446被鉴定。
(实施例1)
基因组DNA文库的制备
为了分离UK-2生物合成所必需的基因，首先，通过下述方法制备能够生产UK-2的轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA文库。
将轮枝链霉菌属种3-7接种至50ml改良YEME(0.3％Difco酵母提取物、0.5％Difco细菌蛋白胨、0.3％Oxoid麦芽提取物、3.0％蔗糖、1.0％葡萄糖、5mmol/L MgCl2·6H2O)，并在30℃下以220rpm振荡培养18小时。在培养完成后，通过以7500rmp离心10分钟来收集细菌细胞。从如此获得的细菌细胞中，使用盐析法制备基因组DNA[参见“Practical Streptomyces Genetics”，The John Innes Foundation，(UK)，Norwich，2000]。
将所获得的基因组DNA用限制性内切酶MboI部分消化，然后用碱性磷酸酶处理以去磷酸化DNA的末端。将所得DNA片段连接到可商购的粘粒载体SuperCos1(由Stratagene公司生产)上，该粘粒载体事先已被限制性内切酶XbaI消化、经碱性磷酸酶处理以去磷酸化并进一步被限制性内切酶BamHI消化。因此，制备了重组粘粒载体。使用由Epicentre Biotechnologies生产的MAXPLAX Lambda PackagingExtracts对此重组粘粒载体进行体外包装。使用其感染大肠杆菌XLI-Blue MRA以制备粘粒基因组DNA文库。
(实施例2)
UK-2生物合成基因的评估
基于通过实施例1中所述方法制备的基因组DNA，委托Genaris,Inc.构建用于Roche GS FLX Titanium测序仪的末端配对(mate-pair)文库。然后，使用该测序仪确定序列。除此之外，以基因组DNA为基础，构建用于此测序仪的片段文库。然后，使用该测序仪确定序列。将从末端配对文库获得的序列和从片段文库获得的序列共拼接在一起，以获得重叠群序列和支架序列。
UK-2具有特征性的3-羟基吡啶甲酸骨架。同时，维吉霉素也具有羟基吡啶甲酸骨架。已经公开了两个参与维吉霉素的生物合成的基因(visA，visB)(参见非专利文献2)。因此，在由这两个基因所编码的蛋白质的氨基酸序列与从UK-2生产细菌的基因组中获得的建议氨基酸序列之间进行同源性分析，以检验参与羟基吡啶甲酸骨架形成的基因的存在。表1和2示出了所获得的结果。
[表1]
[表2]
检查结果发现，与VisA和VisB具有高度同源性的基因连续定位的位点是衍生自轮枝链霉菌属种3-7的基因组上的单一位点(参见表1)。另外，还发现与被认为是形成UK-2骨架所必需的非核糖体肽合成酶(NRPS)和聚酮合酶(PKS)相关的基因位于上述基因的附近(参见表2)。预期这些基因周围的区域是UK-2生物合成基因簇，因为放线菌的次级代谢产物的基因形成簇。此外，定位于UK-2生物合成基因簇的基因(ORF)与各个基因编码的蛋白的推定功能之间对应如下。
ORF1是潜在参与生物合成基因簇的调控的基因。ORF5、ORF6、ORF7和ORF16是参与3-羟基吡啶甲酸骨架的生物合成的基因。ORF2、ORF3和ORF17是参与苄基丙二酸骨架的生物合成的基因。ORF13是参与吡啶甲酸骨架、丝氨酸和乳酸的生物合成的基因。ORF11和ORF12是参与苄基丙二酸的生物合成，以及吡啶甲酸、丝氨酸和乳酸的代谢的基因。ORF8是参与聚酮合酶(PKS)的硫酯键裂解，以及吡啶甲酸、丝氨酸、乳酸和苄基丙二酸的代谢的基因。
实施例3
<基因组DNA文库的筛选>
位于UK-2生物合成基因上游的ORF5序列的一部分被作为探针用于筛选实施例1中所制备的基因组DNA文库，并且通过PCR按如下所述进行制备。
使用实施例1中所述的基因组DNA为模板，以visA’-F:5’-GGGGCAGCCTGCTCGGCGAG-3’(SEQ ID NO:36)和visA’-R:5’-GGTGAGCTCCCCGATCAGGG-3’(SEQ ID NO:37)的寡DNA作为引物进行PCR。所述PCR是使用LA Taq DNA聚合酶(由Takara BioInc.生产)作为DNA聚合酶以及PERKIN ELMER GeneAmp PCRSystem 9700进行。通过添加以下物质将反应溶液的量调整至50μl：0.5μl(相当于0.5μg的量)的基因组DNA，25μl的酶所附带的用于2倍浓度反应的缓冲液，2.5μl的DMSO溶液，5μl的2.5mM dNTP溶液，0.25μl的每种引物(其浓度已被调至100pmol/μl)，0.3μl的酶，以及16.2μl的无菌水。所述反应如下进行：在95℃下预处理10分钟；孵育30个循环，每个循环包括95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟；再在72℃下孵育5分钟。反应完成之后，将所述反应溶液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳。结果确认了约1.3kbp的DNA片段被特异性扩增。接着，对剩余的反应溶液用混合溶液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，V/V)萃取以进行核酸纯化，然后用乙醇沉淀。将所得沉淀物再次溶解在无菌水中，并进行琼脂糖凝胶电泳。根据传统方法，切下约1.3kbp的条带，并收集DNA片段。
使用DNA片段作为探针，并使用ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.制造)进行菌落杂交，并筛选了约5000个菌落。获得了若干阳性菌落。从所述菌落中的一个分离出质粒pUK2-B44。
此外，位于UK-2生物合成基因下游的ORF13序列的一部分被用作探针，并且是通过PCR按如下所述进行制备。
使用实施例1中所述的基因组DNA为模板，以caiC-F:5’-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3’(SEQ ID NO:38)和caiC-R:5’-CGGGCTCGGTGGTGAGCAGG-3’(SEQ ID NO:39)的寡DNA作为引物进行PCR。所述PCR是利用LA Taq DNA聚合酶(由Takara BioInc.生产)作为DNA聚合酶以及PERKIN ELMER GeneAmp PCRSystem 9700进行。通过添加以下物质将反应溶液的量调整至50μl：0.5μl(相当于0.5μg的量)的基因组DNA，25μl的酶所附带的用于2倍浓度反应的缓冲液，2.5μl的DMSO溶液，5μl的2.5mM dNTP溶液，0.25μl的每种引物(其浓度已被调至100pmol/μl)，0.3μl的酶，以及16.2μl的无菌水。所述反应如下进行：在95℃下预处理10分钟；孵育30个循环，每个循环包括95℃ 30秒、59℃ 30秒、72℃ 2分钟20秒。反应完成之后，将所述反应溶液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳。结果确认了约2.3kbp的DNA片段被特异性扩增。接着，对剩余的反应溶液用上述混合溶液萃取以进行核酸纯化，然后用乙醇沉淀。将所得沉淀物再次溶解在无菌水中，并进行琼脂糖凝胶电泳。根据传统方法，切下约2.3kbp的条带，并收集DNA片段。
使用DNA片段作为探针，并使用ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.制造)进行菌落杂交，并筛选了约5000个菌落。获得了若干阳性菌落。从所述菌落中的一个分离出质粒pUK2-E4。
实施例4
<包含生物合成基因簇的质粒pUK2-3的构建>
使用如此获得的分别含有所预期的生物合成簇的上游区域1-21531和下游区域16211-34641的质粒pUK2-B44和pUK2-E4，构建了含有整个生物合成簇区域的质粒。首先，用限制性内切酶ClaI和PspXI消化这两个质粒，然后进行琼脂糖凝胶电泳，根据传统方法，分别切下约28kbp和约19kbp的条带，并收集DNA片段。利用DNA连接试剂盒<Mighty Mix>(由Takara Bio Inc.生产)连接所述DNA片段以制备pUK2-16。
接下来，使用记载于[Gust,B.,et al,"Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,"(US),2003,vol.100,pp.1541-1546]中的重定向技术，将质粒pUK2-16用作能够接合转移到放线菌中的载体。首先，通过电穿孔将质粒pUK2-16导入大肠杆菌BW25113/pIJ790菌株中，并获得大肠杆菌BW25113/pIJ790/pUK2-16菌株。将此菌株接种至含有浓度分别为25μg/ml、50μg/ml和50μg/ml的氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的100ml LB液体培养基(1％细菌胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中，并在30℃下过夜培养。然后，将100μl的培养液接种至在含有浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、50μg/ml和10mM的氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖的65ml的试管中制备的10ml SOB培养基(2％细菌胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化钠、0.0186％氯化钾)中。将所得到的培养物在30℃下振荡培养4小时。从所有的培养液中收集细菌细胞，用冰冷的10％的甘油溶液洗涤两次，并重悬浮于100μl的10％的甘油溶液中，作为用于电穿孔的细胞。同时，纯化5.2kb的SspI片段，其包含oriT、attP、C31，以及衍生自质粒pMJCOS1(John Innes Centre(Norwich))的安普霉素抗性基因。将所述DNA片段(约100ng)和50μl如此制备的细胞转移至已冰冷的带有2mm狭缝的杯(cuvette)中，并进行电穿孔(使用由BM Equipment Co.,Ltd.生产的Electro CellManipulator 600)。处理之后，将1ml冷却的LB液体培养基加入到所得产物中，使其在37℃下静置培养1小时。然后将其应用于含有氨苄青霉素和安普霉素的LB琼脂培养基，并在37℃下过夜培养。将所培养的菌株在含有氨苄青霉素和安普霉素的LB液体培养基培养，并分离pUK2-3质粒。所述pUK2-3是能够接合转移至放线菌的质粒，其具有在所述载体部分中的oriT、attP、Int C31和安普霉素抗性基因以及预期为所述UK-2生物合成基因簇的整个区域。
(实施例5)
<生物合成基因缺陷型载体的构建>
通过下述方法制备了基因破坏的菌株，该菌株缺少对应于来自轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA的ORF12和ORF13部分的约7.5kbp。
使用实施例1中所述的基因组DNA为模板，以caiC-F:5’-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3’(SEQ ID NO:38)和41c29-R:5’-GTCCGTGGCGCCGCCGGATT-3’(SEQ ID NO:40)的寡DNA作为引物进行PCR。所述PCR是使用LA TaqDNA聚合酶(由Takara BioInc.生产)作为DNA聚合酶以及使用PERKIN ELMER GeneAmp PCRSystem 9700进行。通过添加以下物质将所述反应溶液的量调整至50μl：0.5μl(相当于0.5μg的量)的基因组DNA，25μl的酶所附带的用于2倍浓度反应的缓冲液，2.5μl的DMSO溶液，5μl的2.5mM dNTP溶液，各0.25μl的每种引物(其浓度已被调至100pmol/μl)，0.3μl的酶，以及16.2μl的无菌水。所述反应如下进行：在95℃下预处理10分钟；孵育30个循环，每个循环包括95℃ 30秒、60℃ 5秒、72℃ 7分钟。反应完成之后，将所述反应溶液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳。结果确认了约7.5kbp的DNA片段被特异性扩增。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation生产)，根据其所附方案，将此DNA片段插入到pCR2.1-TOPO质粒载体中。从而获得质粒TOPO-41c29。
随后，如下所述，将安普霉素抗性基因插入到所述质粒TOPO-41c29的插入片段中以制备质粒TOPO-⊿41c29-Am。
将质粒pIJ773[Gust,B.,et al.,"Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,"(US),2003,vol.100,pp.1541-1546]用HindIII和EcoRI双重消化，随后进行琼脂糖凝胶电泳。然后根据传统方法切下DNA片段并收集。因此，获得了含有所述靶安普霉素抗性基因的约1.3kbp的DNA片段。以此片段为模板并使用两种类型的合成引物41c30-apraF:5'-GTCACCGTCCCCGCCTACGGCGACGGCGTCGTCCTGGTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(SEQ ID NO:41)和41c30-apraR:5'-GGTCGCGGGCGAAGGCGTAGCCGGGCAGGTCGGGCAGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'(SEQ ID NO:42)进行PCR。所述PCR是使用LA Taq DNA聚合酶(由Takara Bio Inc.生产)作为DNA聚合酶以及PERKIN ELMER GeneAmp PCR System 9700进行。
通过添加以下物质将所述反应溶液的量调整至50μl：0.5μl(相当于0.5μg的量)的基因组DNA，25μl的酶所附带的用于2倍浓度反应的缓冲液，2.5μl的DMSO溶液，5μl的2.5mM dNTP溶液，0.25μl的每种引物(其浓度已被调至100pmol/μl)，0.3μl的酶，以及16.2μl的无菌水。所述反应如下进行：在94℃下预处理2分钟；孵育10个循环，每个循环包括94℃ 45秒、50℃ 45秒、72℃ 1分钟30秒；然后孵育15个循环，每个循环包括94℃ 45秒、55℃ 45秒、72℃ 1分钟30秒；再在72℃下反应5分钟。反应完成之后，将反应溶液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳。结果确认了约1.4kbp的DNA片段被特异性扩增。
接下来，将TOPO-⊿41c29导入大肠杆菌BW25113/pIJ790[Gust,B.,et al,"Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,"(US),2003,vol.100,pp.1541-1546]中以获得大肠杆菌BW25113/pIJ790/TOPO-⊿41c29菌株。将此菌株接种至含有浓度分别为25μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的100ml LB液体培养基中，并在30℃下过夜培养。然后，将10ml的SOB培养基加入到补充有浓度分别为25μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和10mM的氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和L-阿拉伯糖的65ml的试管中。将100μl过夜培养的大肠杆菌BW25113/pIJ790/TOPO-⊿41c29菌株的培养液转移至此试管中，并在30℃下振荡培养4小时。将所有的培养液在4℃下以3000rpm离心5分钟以收集细菌细胞，再将其悬浮于10ml冰冷的10％甘油溶液中。在重复上述操作后，将所得到的细菌细胞重悬浮于100μl冷却的10％甘油溶液中。接下来，将50μl细菌细胞悬液收集到Eppendorf管中，加入5μl包含来源自PIJ773的上述自安普霉素抗性基因的约1.4kb的DNA片段的溶液。将所得混合物转移至冰冷的带有2mm狭缝的电穿孔杯(由BM Equipment Co.,Ltd.生产的BM6200)。使用Electro Cell Manipulator 600(BM EquipmentCo.,Ltd.生产)，在12.5kV、25μF和128Ω的条件下进行电穿孔。处理之后，将1ml冰冷的LB液体培养基加入到细菌细胞中，然后使其在37℃下静置培养1小时。将其应用于补充有浓度均为50μg/ml的氨苄青霉素和安普霉素的LB琼脂培养基上。使所得产物在37℃下过夜培养以获得同时具有氨苄青霉素抗性和安普霉素抗性的菌株。将此菌株在补充有浓度均为50μg/ml的氨苄青霉素和安普霉素的LB液体培养基中培养。因此，分离出质粒TOPO-⊿41c29-Am。
(实施例6)
<生物合成基因缺陷型菌株的制备>
根据传统方法，将质粒TOPO-⊿41c29导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002菌株[“Practical Streptomyces Genetics”，The JohnInnes Foundation，(UK)，Norwich，2000]以获得大肠杆菌ET12567/pUZ8002/TOPO-⊿41c29。
按如下所述将轮枝链霉菌属与大肠杆菌ET12567/pUZ8002/TOPO-⊿41c29接合。首先，将轮枝链霉菌属菌株接种至在65ml试管中制备的10ml液体培养基(S#1)[Ueki,M,et al,"The Journal of Antibiotics,"(Japan),1996,vol.49,pp.639-643]，并在30℃下培养24小时。将所得培养物应用于MS琼脂培养基(2％大豆粉、2％甘露醇、2％琼脂)上，在30℃下培养2天。培养之后，通过用3ml的20％甘油进行刮取收集菌丝体以制备宿主菌丝体溶液。
以3000rpm离心5分钟收集细菌细胞后，将其悬浮于3ml 20％的甘油溶液中。同时，将大肠杆菌ET12567/pUZ8002/TOPO-⊿41c29-Am在37℃下在补充有浓度均为50μg/ml的氨苄青霉素和安普霉素的LB液体培养基中培养18小时。然后，将1ml培养液转移至100ml LB液体培养基(包含浓度均为50μg/ml的氨苄青霉素和安普霉素)中，并在37℃下培养4小时。随后，将50ml培养液以3000rpm离心5分钟以收集细菌细胞。将细菌细胞悬浮于20ml的LB液体培养基中。在重复此操作两次之后，将细菌细胞悬浮于2ml的LB液体培养基中。
接下来，在1.5ml的试管中将100μl的轮枝链霉菌属细胞悬液与100μl的大肠杆菌ET12567/pUZ8002/粘粒203-7的细胞悬液合并在一起，离心以收集细菌细胞。将所收集的细胞悬浮于100μl的20％的甘油溶液中后，应用于20ml体积的、包含10mM MgCl2的MS琼脂培养基上。在30℃下培养18小时之后，在其上覆盖1ml含有400μg安普霉素和1500μg萘啶酸的无菌水。在30℃下培养5天之后，将琼脂培养基上培养的轮枝链霉菌属菌落进行纯系培养，并在补充有250μg/ml的安普霉素和250μg/ml的卡那霉素的1/2MS琼脂培养基(琼脂：2％；甘露醇：1％；大豆粉：1％；10mM MgCl2)中在30℃下培养2天。菌落在任何平板上均生长并被如下传代培养数代：接种于S#1培养基中，在30℃下培养24小时；接种于改良YEME培养基(10ml，在65ml的试管中)中，在30℃下振荡培养1天；并再将1ml所得到的培养物接种至另一个新鲜的改良YEME培养基(50ml，在250ml的Erlenmeyer摇瓶中)中。重复此操作5次后，以这样的方式稀释所得培养物以获得合适数量的活的细菌细胞。将此培养液应用于含250μg/ml安普霉素的1/2MS琼脂培养基上，并在30℃下培养4天。使如此培养的菌落在补充有250μg/ml的安普霉素和250μg/ml的卡那霉素的1/2MS琼脂培养基上进行复制。筛选出不在含有卡那霉素的培养基上生长，但是在含有安普霉素的培养基上生长的两种卡那霉素敏感型菌株(D1菌株、D2菌株)。
制备所获得的两种菌株的基因组DNA，使用引物：41c30F4:5’-CGTGACCGAGGTGGCGCG-3’(SEQ ID NO:43)和41c30RR2:5’-GTCGTCGGATGCGCCGTGCG-3’(SEQ ID NO:44)的组合进行PCR。经确认，两个菌株是依照设计的基因破坏的菌株，因为未获得约0.5kbp的扩增DNA片段。
(实施例7)
<生物合成基因缺陷型菌株的培养，以及培养液中UK-2A的定量>
将基因破坏的菌株D1和D2分别接种到在250ml的Erlenmeyer摇瓶中制备的50ml S#1培养基[Ueki,M,et al,"The Journal ofAntibiotics,"(Japan),1996,vol.49,pp.639-643]中，并在30℃下振荡培养24小时。然后，将1ml的培养液接种至生产培养基中，并在30℃下振荡培养4天。然后，将4ml丙酮加入到1ml所得培养液中以萃取UK-2A，接着将其过滤以获得萃取液。从中取5μl萃取液进行HPLC分析。在所述HPLC分析中，使用了HPLC System LC-2010C(由ShimadzuCorporation制造)进行分析。作为分析条件，柱子为Inertsil ODS-34.6X250mm，移动相为乙腈:水:磷酸＝60:40:0.1，流速为1.1ml/min，柱温为40℃，UV波长为340nm。将所获得的模式与UK-2A参照标准模式进行对较。鉴定出源自UK-2A的峰。根据其面积，对UK-2A进行定量。
同时，还在培养液中对所述转化体的亲代菌株——轮枝链霉菌属种3-7——进行了相同的培养和UK-2A定量。结果显示，D1和D2菌株的UK-2A生产率为0μg/ml。
(实施例8)
<导入生物合成基因簇的转化体的制备>
根据通常用于放线菌的方法[“Practical Streptomyces Genetics”，The John Innes Foundation，(UK)，Norwich，2000，pp.311-338]，将构建的pUK2-3导入轮枝链霉菌属种3-7。首先，根据传统方法，通过电穿孔将质粒pUK2-3导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002菌株以获得大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pUK2-3。将该菌株在补充有浓度分别25μg/ml、50μg/ml和50μg/ml的氯霉素、卡那霉素和安普霉素的LB液体培养基中在37℃下培养18小时。然后，将1ml培养液转移至100mlLB液体培养基(包含浓度分别为25μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的氯霉素、卡那霉素和安普霉素)中，并在37℃下培养4小时。随后，将50ml培养液以3000rpm离心5分钟以收集细菌细胞。将所得细菌细胞悬浮于50ml的LB液体培养基中。重复此操作两次之后，将所述细菌细胞悬浮于100μL LB液体培养基中。
同时，将轮枝链霉菌属种3-7应用于MS琼脂培养基上，并在30℃下培养2天。培养之后，使用1ml的20％甘油刮取菌丝体以制备宿主菌丝体溶液。
接下来，将如上所述制备的500μl宿主菌丝体溶液和500μl包含质粒pUK2-3的大肠杆菌溶液混合在一起，并收集细菌细胞。然后，将所得细菌细胞应用于MS琼脂培养基，所述培养基已通过使终浓度达到10mmol/L的方式添加10mM MgCl2来稀释。在30℃下培养20小时之后，在其上覆盖0.5ml含有6mg安普霉素和0.5mg萘啶酸的无菌水。在30℃下继续培养5天之后，获得了作为安普霉素抗性菌株的转化体。
实施例9
<导入基因的转化体的培养，以及培养液中UK-2A的定量>
通过实施例7中所述的方法培养导入基因的转化体。结果如表3所示，与亲代菌株的生产率相比，导入基因的转化体的UK-2A生产率提高了58-77倍。
[表3]
实施例10
<导入基因的转化体的培养，以及培养液中UK-2A、UK-2B及UK-2C和UK-2D的总和的定量>
通过实施例7中所述方法培养导入基因的转化体。具体地，将4ml丙酮加入到1ml所得培养液中以萃取UK-2A、UK-2B、UK-2C和UK-2D，然后将其过滤以获得萃取液。从中取5μl萃取液进行HPLC分析。在所述HPLC分析中，使用HPLC solution system(由ShimadzuCorporation制造)进行分析。作为分析条件，柱子是Inertsil ODS-34.6X150mm；移动相是通过下述步骤获得的溶液：在约800ml水中溶解7.8g磷酸二氢钠二水合物，用磷酸将所得溶液的pH值调至4.0，向其中添加水以制备1000ml磷酸水溶液，并且向350mL的所述磷酸水溶液中加入650mL乙腈(用于液相色谱)；流速是1.0ml/min；柱温是40℃；UV波长是230nm。将所获得的模式与UK-2A、UK-2B、UK-2C和UK-2D参照标准的模式进行对较。鉴定出分别源自UK-2A、UK-2B、UK-2C和UK-2D的峰。根据其面积，测定UK-2A的量、UK-2B的量、以及UK-2C和UK-2D的总量。
结果如表4所示，与亲代菌株的生产率相比，导入基因的转化体的UK-2A生产率、UK-2B生产率以及UK-2C与UK-2D总生产率分别提高了37-57倍、10-11倍和12-13倍。
[表4]
实施例11
<转化体中UK-2生物合成基因簇的拷贝数的定量>
通过实施例1中所述方法，制备了在实施例9中所确认的UK-2生产率提高的两种转化体菌株和作为宿主细胞的轮枝链霉菌属种3-7的基因组DNA。使用基因组DNA作为模板，并使用StepOnePlus Real-TimePCR System(由Applied BioSystems Inc.生产)根据其所附方案进行PCR。对如此获得的扩增片段进行定量。表5示出了所获得的结果。
需要注意的是，在PCR反应中，设计并合成了以下引物组，并将其用于扩增所导入的UK-2生物合成基因簇中的区域。
UK-2F2(RT)：5’-GCACCTTCATGTCCGGGTTG-3’(SEQ IDNO：45)
UK-2R2(RT)：5’-ATCGCCGCGTACACCATGAC-3’(SEQ IDNO：46)
另外，设计并合成了以下引物组，并将其作为内部对照来扩增非UK-2生物合成基因簇的区域。
cont F1(RT)：5’-CGAAGGTCCGGTTGATGGTG-3’(SEQ ID NO：47)
C0nt R1(RT)：5’-ATCGCTGCGACACCCTGGAG-3’(SEQ IDNO：48)
[表5]
菌株 拷贝数
亲代菌株(3-7) 1.00
转化体(3-7-1) 2.35
转化体(3-7-2) 2.08
如表5所示，结果表明，转化体中UK-2生物合成基因簇的拷贝数是亲代菌种3-7中的拷贝数的两倍。
[工业应用]
如上所述，本发明使得能够通过导入UK-2生物合成基因或UK-2生物合成基因簇提供具有高的UK-2生产率的转化体。
因此，通过利用本发明的转化体，能够以低成本大量生产UK-2。因此，本发明可用于生产稻瘟病防治试剂、农业和园艺杀真菌剂和医用抗真菌剂。
[对保藏的生物材料的引用]
[登陆号]
1.
(1)鉴定名称：轮枝链霉菌属种3-7
(2)登陆号：FERM BP-11437
(3)保藏日期：2011年11月9日
(4)保藏机构：日本国家先进工业科学与技术研究所的国际专利生物保藏中心
(5)日本国家先进工业科学与技术研究所的国际专利生物保藏中心(曾用名：IPOD)对专利微生物的保藏于2012年4月由日本国家技术与评估研究所(NITE)接管。
[序列表独立文本]
SEQ ID NOs:36至48
<223>人工合成的引物序列

Claims (15)

1.一种诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率的分离的核酸，所述核酸是至少一种选自以下(a)到(q)的核酸：
(a)编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ IDNO:2的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(b)编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ IDNO:4的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(c)编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ IDNO:6的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(d)编码包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:9的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ IDNO:8的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(e)编码包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:11的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:10的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(f)编码包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:13的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:12的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(g)编码包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:15的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:14的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(h)编码包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:17的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:16的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(i)编码包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:19的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:18的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(j)编码包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:21的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:20的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(k)编码包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:23的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:22的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(l)编码包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:25的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:24的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(m)编码包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:27的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQ ID NO:26碱基序列的核酸杂交的核酸；
(n)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:29的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:28的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(o)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:31的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:30的碱基序列的核酸杂交的核酸；
(p)编码包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:33的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:32的碱基序列的核酸杂交的核酸；和
(q)编码包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码包含其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入的SEQ ID NO:35的氨基酸序列的蛋白质的核酸，编码与SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有95％或更高同源性的氨基酸序列的核酸，或在严格条件下与包含SEQID NO:34的碱基序列的核酸杂交的核酸。
2.权利要求1的核酸，所述核酸包括(a)到(q)的所有核酸。
3.权利要求2的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1的碱基序列。
4.一种其中插入权利要求1至3中任一项的核酸的载体，用于诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率。
5.一种用于确定UK-2生产率的方法，所述方法包括在测试细菌中检测核酸的存在，所述核酸包含权利要求1至3中任一项的核酸的碱基序列或与所述序列互补的碱基序列。
6.权利要求5的方法，其中用于检测所述核酸的存在的方法是PCR法。
7.权利要求6的方法，其中所述PCR法是其中使用包含SEQ ID NO:45的碱基序列的引物和包含SEQ ID NO:46的碱基序列的引物来扩增核酸的方法。
8.一种细菌，其中UK-2生物合成被诱导且UK-2生产率提高，并且其中通过权利要求5的方法来检测核酸的存在，所述核酸包含权利要求1至3中任一项的核酸的碱基序列或与所述序列互补的碱基序列。
9.一种细菌，其中通过导入权利要求4的载体来诱导UK-2生物合成并提高UK-2生产率。
10.一种细菌，其中UK-2生物合成被诱导且UK-2产率提高，并且其中权利要求1的核酸插入到其基因组中。
11.一种细菌，其中每个细胞中存在一个或两个或多个拷贝的核酸，所述核酸包含权利要求1至3中任一项的核酸的碱基序列。
12.权利要求8至11中任一项的细菌，其是轮枝链霉菌属(Streptoverticillium)、链霉菌属(Streptomyces)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母(yeasts)、丝状真菌(filamentous fungi)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中的任意一种。
13.一种用于产生UK-2的方法，所述方法包括以下步骤：
培养权利要求8至12中任一项的细菌，并且从所述细菌的培养物中收集UK-2。
14.一种用于产生UK-2的衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
培养权利要求8至12中任一项的细菌，并且从所述细菌的培养物中收集UK-2；以及
从所收集的UK-2合成由下式(1)的任意一种所代表的UK-2的衍生物，
[在式(1)中，
R代表2-甲基丙酰基、反式-2-甲基-2-丁烯酰基、3-甲基丁酰基和2-甲基丁酰基中的任意一种，
R1代表以下中的任一个：C1-6烷基、苯甲基、C1-10烷基羰基(所述C1-10烷基羰基可被羧基、苯甲氧基羰基、C1-4烷氧基羰基和苯甲氧基羰基氨基中的任意一个取代)、苯甲酰基、C1-4烷氧基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷基、可被硝基取代的苯甲氧基羰基(C1-4)烷基、C1-6烷基磺酰基、二(C1-6)烷基磷酰基、二苯基磷酰基以及由下式(2)所代表的取代基；
(在式(2)中，
Q选自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH＝CH2和环丙基，
M选自H、CH3、CH2CH3、CF3、Ph、CH＝CH2和环丙基，
T选自O、OC(O)、OC(O)O、S、SC(O)、SC(O)O和由下式(3)所代表的取代基；
G选自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、芳基和杂芳基，
G和M可形成任选地具有氧基的异苯并呋喃环，
M和Q可形成3-8元碳环系统]。
15.一种用于生产UK-2A衍生物的方法，所述包括以下步骤：
培养权利要求8的细菌，并且从细菌的培养物中收集UK-2A；以及
从所收集的UK-2A合成由下式(4)至(7)中的任意一种所代表的UK-2A衍生物，
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