CN118063531A - 大环内酯类化合物PA-46101s C-E的制备及其应用 - Google Patents
大环内酯类化合物PA-46101s C-E的制备及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了大环内酯类化合物PA‑46101s C‑E的制备及其应用。本发明对Streptomyces sp.SCSIO 40066进行突变获得了突变株Streptomyces sp.SCSIO 40066/△pasO1,Streptomyces sp.SCSIO 40066/△pasO4,Streptomyces sp.SCSIO 40066/△pasO1O4,从突变株的发酵培养物中分离到3个新的,具有抗菌作用的螺环乙酰乙酸内酯类化合物PA‑46101s C‑E。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物领域,具体涉及新的抗生素化合物PA-46101s C-E(3-5)及其制备方法。
背景技术
PA-46101s是一类螺环乙酰乙酸内酯类聚酮类化合物,这一家族的化合物结构多样,具有抗炎、抗菌和抗肿瘤等多种活性。众所周知,由于各种因素的影响,没有经过结构修饰的天然产物成药难度很大。随着分子生物学和基因编辑技术的进步,使得从天然产物生物合成基因改造角度出发获取结构和活性优化的天然产物成为可能,并且具有特异性强,催化效率高和绿色环保的优点。
发明内容
本发明的第一个目的是提供3个新的螺环乙酰乙酸内酯类化合物PA-46101s C-E(3-5)。
本发明的3个新的PA-46101s类大环内酯化合物PA-46101s C-E(3-5),其结构如(I)所示:
式(I)。
本发明的第二个目的是提供化合物PA-46101s C-E在制备抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物是抗藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。
本发明的第三个目的是提供一种P450氧化酶编码基因敲除突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1,其特征是将pas基因簇中P450氧化酶编码基因pasO1进行敲除得到,所述的基因pasO1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第四个目的是提供一种P450氧化酶编码基因敲除突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4,其特征是将pas基因簇中P450氧化酶编码基因pasO4进行敲除得到,所述的基因pasO4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第五个目的是提供一种P450氧化酶编码基因敲除突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4,其特征是先将pas基因簇中P450氧化酶编码基因pasO4进行同框缺失,再对基因簇中的P450氧化酶编码基因pasO1进行同框缺失得到,所述的基因pasO1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述的基因pasO4的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明的第六个目的是提供一种制备PA-46101s C-E(3-5),的制备方法,其特征在于,PA-46101 C(3)是从菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1代谢产物中分离得到;PA-46101 D(4)是从菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4代谢产物中分离得到;PA-46101 E(5)是从菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4代谢产物中分离得到。
具体步骤为:
分别制备菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1,Streptomycessp. SCSIO40066/△pasO4,Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4的发酵培养物,通过离心将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分开;发酵液经大孔树脂吸附,后用丙酮洗脱,减压浓缩回收丙酮,剩余的水相用丁酮萃取,再减压浓缩至干得到浸膏A;菌丝体先用丙酮浸提,减压浓缩回收丙酮,剩余的水相用丁酮萃取,减压浓缩至干得到浸膏B,合并浸膏A和B得到发酵粗提物;
a. 菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO1的发酵粗提物经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5,通过薄层色谱分析(TLC)和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2,经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离,等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/1,v/v,每15mL接为一瓶,共接约30瓶,经HPLC检测将含有目标化合物的8-12瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1,进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化,柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,70/30,v/v,2.5mL/min,得到亚馏分Frs. A2-1-1,t R= 17.8min,最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化,制备条件为氯仿/甲醇,10/1,v/v,R f = 0.45,得到化合物PA-46101 C;
b. 菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO4的粗提物经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5,通过薄层色谱分析和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2,经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离,等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇=1/1,v/v,每15mL接为一瓶,共接约30瓶,经HPLC检测将含有目标化合物的16-20瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1,进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化,柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,75/25,v/v,2.5mL/min,得到亚馏分Frs. A2-1-1,t R= 22.3min,最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化,制备条件为氯仿/甲醇/甲酸,10/1/0.011,v/v,R f = 0.60,得到化合物PA-46101 D;
c. 菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO1O4的粗提物经经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5,通过TLC和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2,经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离,等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇=1/1,v/v,每15mL接为一瓶,共接约30瓶,经HPLC检测将含有目标化合物的18-22瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1。进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化,柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,95/5,v/v,2.5mL/min,得到亚馏分Frs. A2-1-1,t R= 13.2min,最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化,制备条件为氯仿/甲醇,10/1,v/v,R f = 0.55,得到化合物PA-46101 E。
所述的突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1,Streptomycessp. SCSIO40066/△pasO4,Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4发酵培养物是通过以下方法制备:将活化后的菌株分别接种到装有A1培养基的三角锥形瓶中,28 °C,200 rpm,培养得种子液;再将种子液以10%的接种量接入到装有A1培养基的三角锥形瓶中,28 °C,200 rpm,振荡培养,制得发酵培养物,所述的A1培养基每升是鱼粉10 g,甘油10 g,KBr 0.2 g, CaCO33g,海盐 30 g,水1000 mL,pH 7.2-7.4。
本发明对Streptomycessp. SCSIO 40066进行突变获得了突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1,Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4,Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4,从突变株的发酵培养物中分离到3个新的,具有抗菌作用的螺环乙酰乙酸内酯类化合物PA-46101s C-E。
Streptomycessp. SCSIO 40066公开于NCBI中(Streptomycessp. strain SCSIO40066 16S ribosomal RNA gene, partial sequence - Nucleotide - NCBI (nih.gov),GenBank: PP037986.1)。该菌株申请人也持有,并保证自申请日起20年向公众提供。
附图说明
图1是Streptomycessp. SCSIO 40066中PA-46101生物合成基因簇图;
图2是pasO1敲除示意图;
图3是pasO4敲除示意图;
图4是pasO1O4敲除示意图;
图5是基因敲除突变株的发酵提取物的高效液相色谱图;
高效液相色谱(HPLC)条件:色谱柱为Phenomenex C18, 150×4.6mm, 5 μm,流动相包括A相和B相,流动相A相:10%(体积分数)的乙腈+0. 1%(体积分数)的甲酸,溶剂为水,流动B相:90%(体积分数)的乙腈,溶剂为水;进样程序:0-20min,流动相比例为A相/B相(体积比):95:5-5:95,20-21min,流动相比例为A相/B相(体积比):5:95,21-25min,流动相比例为A相/B相(体积比):5:95-95:5,25-30min,流动相比例为A相/B相(体积比):95:5,检测波长236 nm,流速1 ml min-1。
图6是化合物3的HRESIMS谱图
图7是化合物3的1H-NMR谱图;
图8是化合物3的13C-NMR谱图;
图9是化合物3的DEPT135谱图;
图10是化合物3的COSY谱图;
图11是化合物3的HSQC谱图;
图12是化合物3的HMBC谱图;
图13是化合物4的HRESIMS谱图;
图14是化合物4的1H-NMR谱图;
图15是化合物4的13C-NMR谱图;
图16是化合物4的DEPT135谱图;
图17是化合物4的COSY谱图;
图18是化合物4的HSQC谱图;
图19是化合物4的HMBC谱图;
图20是化合物5的HRESIMS谱图;
图21是化合物5的1H-NMR谱图;
图22是化合物5的13C-NMR谱图;
图23是化合物5的DEPT135谱图;
图24是化合物5的COSY谱图;
图25是化合物5的HSQC谱图;
图26是化合物5的HMBC谱图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
1、基因敲除突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1的构建(图2)
通过PCR-targeting的方法对链霉菌Streptomycessp. SCSIO 40066中PA-46101生物合成基因簇(图1)中P450氧化酶基因pasO1进行敲除,得到突变株Streptomycessp.SCSIO 40066/△pasO1。对比野生型Streptomycessp. SCSIO 40066的发酵检测图,突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1中产生了新化合物3(图5),经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY等数据分析,确认新化合物PA-46101 C的结构。
2、基因敲除突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4的构建(图3)
通过PCR-targeting的方法对链霉菌Streptomycessp. SCSIO 40066中PA-46101生物合成基因簇(图1)中P450氧化酶基因pasO4进行敲除,得到突变株Streptomycessp.SCSIO 40066/△pasO4。对比野生型Streptomycessp. SCSIO 40066的发酵检测图,突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4中产生了新化合物4(图5),经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY等数据分析,确认新化合物PA-46101 D的结构。
3、基因敲除突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4的构建(图4)
通过温敏型质粒pKC1139介导的同框缺失的方法对链霉菌Streptomycessp.SCSIO 40066中PA-46101生物合成基因簇(图1)中P450氧化酶基因pasO4进行敲除,得到突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4-inframe,再用温敏型质粒pKC1139介导的同框缺失的方法对链霉菌Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4-inframe中PA-46101生物合成基因簇(图1)中P450氧化酶基因pasO1进行敲除,得到突变株Streptomycessp. SCSIO40066/△pasO1O4。对比野生型Streptomycessp. SCSIO 40066的发酵检测图,突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4中产生了新化合物5(图5),经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY等数据分析,确认新化合物PA-46101 E的结构。
表1. 本发明中使用的引物
;
。
实施例1:基因敲除突变菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1的构建
利用λ RED介导的PCR targeting基因敲除方法,以pIJ773质粒中的Apr抗性基因作为结合子筛选标签,通过插入突变的方法对目的基因pasO1进行灭活。接合转移过程说明如下:链霉菌(Streptomycessp.)SCSIO 40066在SFM培养基(黄豆粉 30 g,甘露醇 30 g,海盐 30 g,琼脂粉 20 g,水 1000 mL,pH 7.0,其配制方法是将各成分混合均匀,调pH值灭菌备用)平板中划线培养5-7天,长出的孢子用无菌棉签收集于TSB培养基中,涡旋振荡,使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5 mL的TSB培养基中,50 ºC热激10 min,然后于28 ºC萌发2 h,作为接合转移的受体菌。供体菌E. coli BW25113/pIJ790/pCGS6003在50mL含50 µg mL-1阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8。含穿梭质粒的助体菌E. coli ET12567/pUB307在50 mL含50 µg mL-1卡那霉素和50 µg mL-1的氯霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8,离心收集两种菌体(4000 rpm,10 min),用LB清洗菌体3遍,悬浮于300 µL LB培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400µL和供体菌100 µL混合均匀,涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上,吹干后,于28 ºC培养18-20 h。然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,抗生素终浓度为50 µg mL-1阿泊拉霉素和100µg mL-1甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28 ºC培养箱中,培养5-7天后观察。当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有50 µg mL-1阿泊拉霉素和100 µgmL-1甲氧苄氨嘧啶的SFM平板上,28 ºC培养3天后,抽取各个突变株的基因组DNA。利用验证引物PA-O1TF/TR对基因组DNA进行PCR验证(以野生型菌株作为阴性对照),可扩增得到大小约为1.9 kb的DNA片段(野生型菌株对照的PCR产物大小为1.7 kb),传代松弛和抗生素对点后得到双交换结合子,即得到单基因敲除突变株SCSIO 40066/ΔpasO1。
实施例2:基因敲除突变菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO4的构建
利用λ RED介导的PCR targeting基因敲除方法,以pIJ773质粒中的Apr抗性基因作为结合子筛选标签,通过插入突变的方法对目的基因pasO4进行灭活。接合转移过程说明如下:链霉菌(Streptomycessp.)SCSIO 40066在SFM培养基平板中划线培养5-7天,长出的孢子用无菌棉签收集于TSB培养基中,涡旋振荡,使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5 mL的TSB培养基中,50 ºC热激10 min,然后于28 ºC萌发2 h,作为接合转移的受体菌。供体菌E. coli BW25113/pIJ790/pCGS6004在50 mL含50 µg mL-1阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8。含穿梭质粒的助体菌E. coli ET12567/pUB307在50 mL含50 µg mL-1卡那霉素和50 µg mL-1的氯霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8,离心收集两种菌体(4000 rpm,10 min),用LB清洗菌体3遍,悬浮于300 µL LB培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400 µL和供体菌100 µL混合均匀,涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上,吹干后,于28 ºC培养18-20 h。然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,抗生素终浓度为50 µg mL-1阿泊拉霉素和100µg mL-1甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28 ºC培养箱中,培养5-7天后观察。当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有50 µg mL-1阿泊拉霉素和100 µg mL-1甲氧苄氨嘧啶的SFM平板上,28ºC培养3天后,抽取各个突变株的基因组DNA。利用验证引物PA-O4TF/TR对基因组DNA进行PCR验证(以野生型菌株作为阴性对照),可扩增得到大小约为2.6 kb的DNA片段(野生型菌株对照的PCR产物大小为1.7 kb),传代松弛和抗生素对点后得到双交换结合子,即得到单基因敲除突变株SCSIO 40066/ΔpasO4。
实施例3:基因敲除突变菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/△pasO1O4的构建
利用同源重组介导的基因同框缺失方法,以Apr抗性基因作为结合子筛选标签,通过插入突变的方法对目的基因pasO4进行灭活。接合转移过程说明如下:链霉菌(Streptomycessp.)SCSIO 40066在SFM培养基平板中划线培养5-7天,长出的孢子用无菌棉签收集于TSB培养基中,涡旋振荡,使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5 mL的TSB培养基中,50 ºC热激10 min,然后于28 ºC萌发2 h,作为接合转移的受体菌。供体菌E. coli DH5α/pCSG6006在50 mL含50 µg mL-1阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8。含穿梭质粒的助体菌E. coli ET12567/pUB307在50 mL含50 µg mL-1卡那霉素和50 µg mL-1的氯霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8,离心收集两种菌体(4000 rpm,10 min),用LB清洗菌体3遍,悬浮于300 µL LB培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400 µL和供体菌100 µL混合均匀,涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上,吹干后,于28 ºC培养18-20 h。然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,抗生素终浓度为50 µg mL-1阿泊拉霉素和100µg mL-1甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28 ºC培养箱中,培养5-7天后观察。当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有50 µg mL-1阿泊拉霉素和100 µg mL-1甲氧苄氨嘧啶的SFM平板上,28 ºC培养3天后,抽取各个突变株的基因组DNA。利用验证引物PA-O4TF/TR对基因组DNA进行PCR验证(以野生型菌株作为阴性对照),可扩增得到大小约为1.1 kb的DNA片段(野生型菌株对照的PCR产物大小为1.7 kb)。于37℃条件下传代培养完成含抗性基因的载体片段丢失,并挑取单克隆进行抗生素对点实验,得到在Apr抗性平板上不生长且在无抗性平板上生长的单基因同框缺失突变株SCSIO 40066/ΔpasO4-inframe。
利用同源重组介导的基因同框缺失方法,以Apr抗性基因作为结合子筛选标签,通过插入突变的方法对目的基因pasO1进行灭活。接合转移过程说明如下:放线菌SCSIO40066/ΔpasO4-inframe在SFM培养基平板中划线培养5-7天,长出的孢子用无菌棉签收集于TSB培养基中,涡旋振荡,使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5 mL的TSB培养基中,50 ºC热激10 min,然后于28 ºC萌发2 h,作为接合转移的受体菌。供体菌E. coliDH5α/pCSG6007在50 mL含50 µg mL-1阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8。含穿梭质粒的助体菌E. coli ET12567/pUB307在50 mL含50 µg mL-1卡那霉素和50 µg mL-1的氯霉素的LB液体培养基中于37 ºC生长至OD600值约为0.8,离心收集两种菌体(4000 rpm,10 min),用LB清洗菌体3遍,悬浮于300 µL LB培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400 µL和供体菌100 µL混合均匀,涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上,吹干后,于28 ºC培养18-20 h。然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,抗生素终浓度为50 µg mL-1阿泊拉霉素和100µg mL-1甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28 ºC培养箱中,培养5-7天后观察。当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有50 µgmL-1阿泊拉霉素和100 µg mL-1甲氧苄氨嘧啶的SFM平板上,28 ºC培养3天后,抽取各个突变株的基因组DNA。利用验证引物PA-O1TF/TR对基因组DNA进行PCR验证(以野生型菌株作为阴性对照),可扩增得到大小约为0.9kb的DNA片段(野生型菌株对照的PCR产物大小为1.7kb)。于37℃条件下传代培养完成含抗性基因的载体片段丢失,并挑取单克隆进行抗生素对点实验,得到在Apr抗性平板上不生长且在无抗性平板上生长的单基因同框缺失突变株SCSIO40066/ΔpasO1O4。
实施例4: PA-46101s类化合物的发酵和制备
1、放大发酵培养:
突变株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO1、Streptomycessp. SCSIO40066/ΔpasO4、Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO1O4发酵所采用的种子培养基和发酵培养基为A1(鱼粉10 g,甘油10 g,KBr 0.2 g, CaCO33 g,海盐 30 g,水1000 mL,pH7.2-7.4,其配制方法是将各成分混合均匀,调pH值灭菌备用)。
所有的突变株活化后,将孢子接入到种子培养基中,28 ºC,200 rpm,培养48 h制得种子液;将种子液以体积比10%的接种量接入到发酵培养基中(14 L),28 ºC,200 rpm,培养120 h,而分别制得各突变株的发酵培养物。
2、发酵液的萃取:
发酵培养物先进行离心分离(3500 rpm,8min),得到上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液经大孔树脂XAD16吸附,后用丙酮洗脱,减压浓缩回收丙酮,剩余的水相用丁酮萃取,再减压浓缩至干得到浸膏A;菌丝体先用丙酮浸提,减压浓缩回收丙酮,剩余的水相用丁酮萃取,减压浓缩至干得到浸膏B,合并浸膏A和B得到发酵粗提物。
3、化合物的分离:
a. 菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO1的发酵粗提物经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5。通过薄层色谱分析(TLC)和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2(氯仿/甲醇 = 10/1洗脱馏分)。经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离(等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/1,v/v),每15mL接为一瓶,共接约30瓶。经HPLC检测将含有目标化合物的8-12瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1。进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化(柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,70/30,v/v,2.5mL/min),得到亚馏分Frs. A2-1-1(t R=17.8min)。最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化(制备条件为氯仿/甲醇,10/1,v/v,R f = 0.45),得到化合物PA-46101 C(3)。
b. 菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO4的粗提物经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5。通过薄层色谱分析(TLC)和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2(氯仿/甲醇 =10/1洗脱馏分)。经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离(等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇=1/1,v/v),每15mL接为一瓶,共接约30瓶。经HPLC检测将含有目标化合物的16-20瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1。进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化(柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,75/25,v/v,2.5mL/min),得到亚馏分Frs. A2-1-1(t R= 22.3min)。最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化(制备条件为氯仿/甲醇/甲酸,10/1/0.011,v/v,R f = 0.60),得到化合物PA-46101 D(4)。
c. 菌株Streptomycessp. SCSIO 40066/ΔpasO1O4的粗提物经经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5。通过TLC和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2(氯仿/甲醇 =10/1洗脱馏分)。经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离(等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇=1/1,v/v),每15mL接为一瓶,共接约30瓶。经HPLC检测将含有目标化合物的18-22瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1。进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化(柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,95/5,v/v,2.5mL/min),得到亚馏分Frs. A2-1-1(t R= 13.2min)。最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化(制备条件为氯仿/甲醇,10/1,v/v,R f = 0.55),得到化合物PA-46101 E(5)。
4、化合物的鉴定:
图6是化合物3的HRESIMS谱图,图7是化合物3的1H-NMR谱图,图8是化合物3的13C-NMR谱图,图9是化合物3的DEPT135谱图,图10是化合物3的COSY谱图,图11是化合物3的HSQC谱图,图12是化合物3的HMBC谱图,图13是化合物4的HRESIMS谱图,图14是化合物4的1H-NMR谱图,图15是化合物4的13C-NMR谱图,图16是化合物4的DEPT135谱图,图17是化合物4的COSY谱图,图18是化合物4的HSQC谱图,图19是化合物4的HMBC谱图,图20是化合物5的HRESIMS谱图,图21是化合物5的1H-NMR谱图,图22是化合物5的13C-NMR谱图,图23是化合物5的DEPT135谱图,图24是化合物5的COSY谱图,图25是化合物5的HSQC谱图,图26是化合物5的HMBC谱图。PA-46101s C-E(3-5)的结构经1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY分析确定。其结构式如下所示:
实施例5:用于基因敲除的质粒pCSG6003的构建
根据基因pasO1的DNA序列(SEQ ID NO.1)及蛋白翻译序列以及PCR targeting敲除序列,设计一对长片段敲除引物(约60 bp)。引物的5'端39bp大写字母部分的序列与该基因相匹配,而3'端小写字母部分的序列分别与pIJ773中包含转移起始序列oriT和阿泊拉抗性基因aac(3)IV的DNA片段两侧的序列相匹配。用限制性内切酶EcoRI和HindIII处理质粒pIJ773,回收得到1.4 kb左右含有转移原点oriT和Apr抗性基因aac(3)IV的DNA片段,作为PCR模板,用基因敲除引物(pasO1-tarF1和pasO1-tarR1)扩增出1.4 kb的片段,并通过胶回收待用。制备E. coliBW25113/pIJ790化学转化感受态细胞(该菌株中的质粒pIJ790为温敏型质粒,只含Crm抗性);将包含目的基因的阳性克隆cosmid文库质粒pCSG6001通过化学转化法导入E. coliBW25113/pIJ790感受态细胞中,用筛库引物验证长出的单菌落是否为阳性菌株(菌株培养温度全程控制在28–30℃,保证质粒pIJ790不丢失;阳性菌株为Crm和Kan抗性),得到重组菌株,并制备成化转感受态。注意该菌株扩大培养(50 mL)时,需在LB液体培养基中加入500µL L-阿拉伯糖溶液(1 mol/L)和250 µL MgCl2溶液(2 mol/L),培养温度为28–30℃,诱导同源重组元件λ RED的累积。将纯化后的PCR产物(大小为1.4 kb)通过化学转化法导入感受态细胞中,并通过宿主细胞中的同源重组元件λ RED诱导含有同源臂的aac (3)IV和oriT置换抗性片段靶向置换目标基因pasO1。在LB固体培养基平板(含AMP、Kan和Apr抗性)上于37℃摇床中过夜培养,从平板上挑出单菌落到5 mL LB液体培养基中于37℃摇床中过夜培养,抽提质粒验证并测序。该重组菌株中的cosmid质粒上细胞色素P450单加氧酶编码基因pasO1的部分片段被置换为包含aac(3)IV和oriT片段的基因,命名为E.coliBW25113/pIJ790/pCGS6003。
实施例6:用于基因敲除的质粒pCSG6004的构建
根据基因pasO4的DNA序列(SEQ ID NO.2)及蛋白翻译序列以及PCR targeting敲除序列,设计一对长片段敲除引物(约60 bp)。引物的5'端39bp大写字母部分的序列与该基因相匹配,而3'端小写字母部分的序列分别与pIJ773中包含转移起始序列oriT和阿泊拉抗性基因aac(3)IV的DNA片段两侧的序列相匹配。用限制性内切酶EcoRI和HindIII处理质粒pIJ773,回收得到1.4 kb左右含有转移原点oriT和Apr抗性基因aac(3)IV的DNA片段,作为PCR模板,用基因敲除引物扩(pasO4-tarF1和pasO4-tarR1)增出1.4 kb的片段,并通过胶回收待用。制备E. coliBW25113/pIJ790化学转化感受态细胞(该菌株中的质粒pIJ790为温敏型质粒,只含Crm抗性);将包含目的基因的阳性克隆cosmid文库质粒pCSG6002通过化学转化法导入E. coliBW25113/pIJ790感受态细胞中,用筛库引物验证长出的单菌落是否为阳性菌株(菌株培养温度全程控制在28–30℃,保证质粒pIJ790不丢失;阳性菌株为Crm和Kan抗性),得到重组菌株并制备化转感受态。注意该菌株扩大培养(50 mL)时,需在LB液体培养基中加入500 µL L-阿拉伯糖溶液(1 mol/L)和250 µL MgCl2溶液(2 mol/L),培养温度为28–30℃,诱导同源重组元件λ RED的累积。将纯化后的PCR产物(大小为1.4 kb)通过化学转化法导入感受态细胞中,并通过宿主细胞中的同源重组元件λ RED诱导含有同源臂的aac (3)IV和oriT置换抗性片段靶向置换目标基因pasO1。在LB固体培养基平板(含AMP、Kan和Apr抗性)上于37℃摇床中过夜培养,从平板上挑出单菌落到5 mL LB液体培养基中于37℃摇床中过夜培养,抽提质粒验证并测序。该重组菌株中的cosmid质粒上细胞色素P450单加氧酶编码基因pasO4的部分片段被置换为包含aac(3)IV和oriT片段的基因,命名为E. coliBW25113/pIJ790/pCGS6004,得到菌株E. coliDH5α/pCSG6004。
实施例7:用于基因敲除的质粒pCSG6006的构建
根据基因pasO4的DNA序列(SEQ ID NO.2)及蛋白翻译序列以及同框缺失基因敲除序列,分别设计上下游同源臂扩增引物(约40bp)。以链霉菌SCSIO 40066的基因组DNA为模板,采用引物pasO4-UHA-F/pasO4-UHA-R和pasO4-DHA-F/pasO4-DHA-R分别扩增基因pasO4的上下游同源臂,分别命名为ArmA和ArmB,根据胶回收试剂盒说明书对片段进行纯化和回收处理。用EcoRI和HindIII对温敏型穿梭质粒pKC1139进行双酶切处理,根据胶回收试剂盒说明书对片段进行纯化和回收处理。采用Gibson Assembly一步克隆重组法组装线性化质粒与上下游同源臂,得到用于介导基因同框缺失的质粒,命名为pCSG6006,并转化到大肠杆菌E. coliDH5α中,并挑取约50个单克隆菌落进行PCR验证。选取5–10个单克隆菌落接种到5mL LB液体培养基(含Apr抗性)中,置于37℃恒温摇床(200 rpm)中过夜培养,得到菌株E. coliDH5α/pCSG6006。
实施例8:用于基因敲除的质粒pCSG6007的构建
根据基因pasO1的DNA序列及蛋白翻译序列以及同框缺失基因敲除序列,分别设计上下游同源臂扩增引物(约40 bp)。以链霉菌SCSIO 40066的基因组DNA为模板,采用引物pasO1-UHA-F/pasO1-UHA-R和pasO1-DHA-F/pasO1-DHA-R分别扩增基因pasO4的上下游同源臂,分别命名为ArmA1和ArmB1,根据胶回收试剂盒说明书对片段进行纯化和回收处理。用EcoRI和HindIII对温敏型穿梭质粒pKC1139进行双酶切处理,根据胶回收试剂盒说明书对片段进行纯化和回收处理。采用Gibson Assembly一步克隆重组法组装线性化质粒与上下游同源臂,得到用于介导基因同框缺失的质粒,命名为pCSG6007,并转化到大肠杆菌E. coliDH5α中,并挑取约50个单克隆菌落进行PCR验证。选取5–10个单克隆菌落接种到5mL LB液体培养基(含Apr抗性)中,置于37℃恒温摇床(200rpm)中过夜培养,得到菌株E. coliDH5α/pCSG6007。
实施例9:基因组cosmid文库质粒pCSG6001和pCSG6002的构建和筛选
根据文库包装蛋白试剂盒MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts(购自美国Epicentre公司)的说明书构建菌株Streptomycessp. SCSIO 40066的cosmid文库,利用设计的文库筛选引物pasO1-cosmid-F1/R1和pasO4-cosmid-F1/R1对制备得到的基因组cosmid文库模板进行筛选,定位目标克隆子,并接种到5 mL LB液体培养基(含Kan抗性)中,置于37℃恒温摇床(200 rpm)中过夜培养,得到质粒pCSG6001和pCSG6002。
实施例10:化合物PA-46101s的抗菌活性测定
化合物PA-46101s针对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、溶藻弧菌13214、大肠杆菌25922、肺炎克雷白杆菌ATCC 13883、铜绿假单胞菌ATCC 27853和鲍曼不动杆菌ATCC19606进行抑制活性测定,采用微量肉汤稀释法测定分离化合物的最小抑菌浓度(MIC),实验方法参考文献[Tan B, Chen S, Zhang Q, et al. Heterologous expression leadsto discovery of diversified lobophorin analogues and a flexibleglycosyltransferase [J]. Organic Letters, 2020, 22(3): 1062-1066.],以TMP、万古霉素和AMP作为对照。结果表明PA-46101 C-E对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、粪肠球菌ATCC 29212、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA有不同程度的抑制作用,范围为0.125-64 µg mL‒1,其中PA-46101 C对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、暹罗芽孢杆菌BS01、粪肠球菌ATCC 29212的生长抑制浓度为2、32、32、64 µg mL‒1,A-46101 D对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、暹罗芽孢杆菌BS01、粪肠球菌ATCC29212和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的生长抑制浓度为2、2、2、4、4 µg mL‒1,A-46101 E对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、暹罗芽孢杆菌BS01、金黄色葡萄球菌ATCC 29213的生长抑制浓度为2、32、4、32 µg mL‒1。通过生物工程或化学修饰可望开发成为抗革兰氏阳性菌新药。
实施例11:化合物PA-46101s的酶活性抑制测定
化合物PA-46101s针对酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖苷酶和猪胰弹性蛋白酶进行抑制活性测定,采用体外实验测定分离化合物的半抑制浓度(IC50),实验方法参考文献[Yang C F, Huang C S, Fang C Y, et al. Inactivation of Flavoenzyme-EncodingGene flsO in Fluostatin Biosynthesis Leads to Diversified AngucyclinoneDerivatives [J]. Journal of Organic Chemistry, 2021, 86(16): 11019-11028.],分别以曲酸、石杉碱钾A、阿卡波糖和西维来司钠作为对照。结果表明PA-46101 C对酪氨酸酶具有显著的抑制作用,IC50值为141.1 ± 11.0μM(阳性对照为195.1 ± 4.25μM),对乙酰胆碱酯酶具有中等的抑制作用,IC50值为11.03 ± 0.17μM(阳性对照为0.058 ± 0.01μM),通过生物工程或化学修饰可望开发成为酶抑制剂新药。
PasO1的基因序列(SEQ ID NO.1)
ATGGCCGAGGACTCCGGCGTCTCCACCGCGGAGCCGTACGTACTGCCCACCGCACGTCCCCGCCCCTTCGACCTGCCGCCGGACCTGGCGCGGGTGCGGGCCGAGCAGCCGCTCCAGCGGCTCGCCTACCCCGACGGCCACGTCGGATGGCTGGTCACCAGCTACGCCCTGGCCCGGACCGTGCTGGACGAGCCGCGGTTCAGCGCCCGGCTGGATCTCAAGCGCTCTCCCGTGGAACGCCCCGGCTCCACGGCGTTCATGGGGCGGACGGCCCCTCCGGGGATGTTCATCGGCATGGACCCGCCGGAGCACACCCGCTACCGCAGTCTGCTCACGCGGGTGTTCAGCGCGCGGCGGATGAAGGAGCTGAGCCCGCGGATCGAGCAGATCGTCGACCAGCGCCTCGACGCGATGGAGGCCGCGGGCCCTCCGGCCGACCTGGTCCCGGCGTTCTCGCTGCCGGTTCCCGTCGAGGTGATCAGCGAGTTGATGGGGGCGCCCGAGGTGCAGCGTGAGGCGCTGGAGCGCAACGCGGCCACCTTCGTCAGCCTCAACGCGACCCCCGAGCAGGTGGGAGCGGCCATCGGGGAGATCTCCGGATCGCTGATGGAGCTCGTGCGGCAGAAGCGCAAGGCGCCGGGGAACGATGTGCTGAGCGACCTGACCGAGAGCGACCTCACCGACGAGGAACTCGTCGGTATCGCGATGCTGCTGCTGGCCGCGGGCCACGAGACCACGGCGAACATGCTCGCGCTGGGCACCTATGCGCTGCTCAGGGAGGAGGACCAGCGCGCGGCGCTCACCGCCGATCCCTCGCTGCTGGACAACGCCGTCGAGGAGTTGATGCGCTACCTGACCGTCGTCCAGTACAGCCCGACGCGGGCGCCGCTGGAGGACACGGAGCTGGACGGGCAGCTCATCAAAGCCGGCGAGACCATCACGGTCTCGCTGCCCGCGGCCAACAGGGACCCGGAGCGGTTCGACAACCCGGAGAAGCTGGATGTCACCGCGCCGCCGACGGCGCACCTGGCGTTCGGCCACGGACTGCACCTGTGCCTGGGCCAGCAGCTCGCACGCATCGAGATGCGCATCGGCTTCCAGAAGCTCTTCGCGCGCTTCCCCGGGCTGCGCCTCGCGGCCGCGCCGGAGGAGATCCCGATGCGGGAGGACATGAACACCTACGGCGTCCACCGGCTGCCCGTCGCCTGGTAG
PasO4的基因序列(SEQ ID NO.2)
ATGACAGTGGAACCGGACGCCGTCGACGGACTGCCGACGGCTCGCGGCTGCCCGTTCAGCCCGCCCGCGGAGCTGACCGAGCTGAGCGCGACCCGGCCCCTCACCCGCATGTCCTACCCGGACGGCCACATGGGCTGGCTGGTGACGAGCCATCCCCTGGCACGCCGGATACTGGCCAGCCAGGACTTCAGCGCACGTCACGACCTGCGGCACTCACCGATCCCGACGATGCTCACACCGACGCAGGCCCCGCCCGGGGCTTTCATCGGCATGGACCCGCCCGAGCACACCCGCTACCGGAAGCCTCTCAACCAGTACTTCACCGTCCGCCGCATACGGCAGCTGGAGCCCGCGATCGAGCGGACGACGCGGGAGCACCTGCACGCCATGGAGGAGACGGGCGCTCCTACCGACCTGATGCGCGCCTTCGCCCTGCCGATCCCGGTCGCGGTGATCTCCGAGCTGCTCGGTTCCACTCCGGAGATCAACGAGGAACTGCAGCGGCTCCGGGCCGTCTCCATGGACCCGAAGAGCCCGGCCGAAGACGTGGGCGCCTCGGTGAAGGCGACACACGAGCTCATGCAGAACCTCGTGACGTACAAACGGGACAACCCCGGCGACGATCTGCTCACCAAGCTGATCGACGACGGCGAACTCGACGACGCCGAGCTGACCGGCCTCGCCCTGATGATGCTCATCGCCGGCCATGAGACGACCGCCCAGATGATCGGCCTCAGCATGTACTACCTGCTGCGGCACGAGGAGATCCGTGACCGGCTGACCGGCGGACCCGTGCTGACGGACGAGGCGGTGAACGAACTCCTGCGCTGTCTGTCGGCCGTCCAGTTCGTCACCCGGGTGGCCCTGACGGACCTCGAACTGGGCGGCGTCACCGTGCGGAAGGGCGAGGCCTGCACGATCTCCCTCCCGGCCGTGAACCGGGACGCCCGGGCCTTCGAGGAACCGGACCTCTTCAAGACACCAAACCTCTTCGAAGCCGTCGGCGGCACGGCCGGGAACCTCCAGCCCGCGGGGCACTCCCCGGCTTCCGGAAACCCCTCTGCTTCCGGAAGCCACCTGGCCTTCGGCCACGGCATCCACCAGTGCATCGGACACAACCTCGCCAGGTCCGAGATGAAGATCGCCATCGGTGCGGTGTGGCAACGCTTCCCGGCGCTGCGTCTGGCGGGAGACGACGCGGACATCACCACCCGCGAGGCGTTCAACACCTACGGGCTCGACCGGCTCCCGGTGGAGTGGTAG。
Claims (6)
1.化合物PA-46101 C、D或E,其结构如式(I)所示:
式(I)。
2.权利要求1所述的化合物PA-46101 C、D或E在制备抗菌药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的抗菌药物是抗藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。
4.一种制备权利要求1所述的化合物PA-46101 C、D或E的制备方法,其特征在于,PA-46101 C是从菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO1代谢产物中分离得到;PA-46101 D是从菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO4代谢产物中分离得到;PA-46101 E是从菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO1O4代谢产物中分离得到;
所述的菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO1是将Streptomyces sp. SCSIO40066的pas基因簇中P450氧化酶编码基因pasO1进行敲除得到,所述的基因pasO1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述的菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO4将Streptomyces sp. SCSIO40066的pas基因簇中P450氧化酶编码基因pasO4进行敲除得到,所述的基因pasO4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述的菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO1O4是先将Streptomyces sp.SCSIO 40066的pas基因簇中P450氧化酶编码基因pasO4进行同框缺失,再对基因簇中的P450氧化酶编码基因pasO1进行同框缺失得到。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,具体步骤为:
分别制备菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO1,Streptomyces sp. SCSIO40066/△pasO4,Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO1O4的发酵培养物,通过离心将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分开;发酵液经大孔树脂吸附,后用丙酮洗脱,减压浓缩回收丙酮,剩余的水相用丁酮萃取,再减压浓缩至干得到浸膏A;菌丝体先用丙酮浸提,减压浓缩回收丙酮,剩余的水相用丁酮萃取,减压浓缩至干得到浸膏B,合并浸膏A和B得到发酵粗提物;
a. 菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/ΔpasO1的发酵粗提物经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5,通过薄层色谱分析和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2,经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离,等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 =1/1,v/v,每15mL接为一瓶,共接30瓶,经HPLC检测将含有目标化合物的8-12瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1,进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化,柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,70/30,v/v,2.5mL/min,得到亚馏分Frs. A2-1-1,t R = 17.8min,最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化,制备条件为氯仿/甲醇,10/1,v/v,R f = 0.45,得到化合物PA-46101 C;
b. 菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/ΔpasO4的粗提物经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5,通过薄层色谱分析和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs. A2,经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离,等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇=1/1,v/v,每15mL接为一瓶,共接30瓶,经HPLC检测将含有目标化合物的16-20瓶合并得到亚馏分Frs. A2-1,进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化,柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,75/25,v/v,2.5mL/min,得到亚馏分Frs. A2-1-1,t R = 22.3min,最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化,制备条件为氯仿/甲醇/甲酸,10/1/0.011,v/v,R f = 0.60,得到化合物PA-46101D;
c. 菌株Streptomyces sp. SCSIO 40066/ΔpasO1O4的粗提物经经正相硅胶柱层析分离,梯度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇 = 1/0、10/1、5/1、1/1和0/1,v/v,500mL,顺序分离得到五个馏分Frs. A1−A5,通过TLC和HPLC高效液相色谱检测确定目标化合物集中在Frs.A2,经凝胶色谱柱层析Sephadex LH-20分离,等度洗脱,洗脱溶剂为氯仿/甲醇=1/1,v/v,每15mL接为一瓶,共接30瓶,经HPLC检测将含有目标化合物的18-22瓶合并得到亚馏分Frs.A2-1,进一步通过半制备高效液相色谱法对目标化合物进行分离纯化,柱子参数为:Phenomenex Kinetex C18,250 × 4.6 mm,5 µm;制备条件为乙腈/水,95/5,v/v,2.5mL/min,得到亚馏分Frs. A2-1-1,t R = 13.2min,最后通过半制备TLC法对Frs. A2-1-1进一步分离纯化,制备条件为氯仿/甲醇,10/1,v/v,R f = 0.55,得到化合物PA-46101 E。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的菌株Streptomyces sp. SCSIO40066/△pasO1,Streptomyces sp. SCSIO 40066/△pasO4,Streptomyces sp. SCSIO40066/△pasO1O4发酵培养物是通过以下方法制备:将活化后的菌株分别接种到装有A1培养基的三角锥形瓶中,28 °C,200 rpm,培养得种子液;再将种子液以10%的接种量接入到装有A1培养基的三角锥形瓶中,28 °C,200 rpm,振荡培养,制得发酵培养物,所述的A1培养基每升是鱼粉10 g,甘油10 g,KBr 0.2 g, CaCO3 3 g,海盐 30 g,水1000 mL,pH 7.2-7.4。
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