ES2592405T3 - Genes de biosíntesis de UK-2 y método para mejorar la productividad de UK-2 usando los mismos - Google Patents

Genes de biosíntesis de UK-2 y método para mejorar la productividad de UK-2 usando los mismos Download PDF

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Naomi Sumida
Koji Yanai
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Abstract

Ácido nucleico aislado que induce la biosíntesis de UK-2 y mejora la productividad de UK-2, el ácido nucleico es al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (q): (a) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 2; (b) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4; (c) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 6; (d) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 20 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 8; (e) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 10; (f) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 12; (g) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 14; (h) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 16; (i) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 18; (j) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 20; (k) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 22; (l) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 24; (m) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 26; (n) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones 30 rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 28; (o) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 30; (p) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 32; y (q) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Genes de biosíntesis de UK-2 y método para mejorar la productividad de UK-2 usando los mismos
Campo técnico
La presente invención se refiere a un gen necesario para la biosíntesis de UK-2 que es un compuesto útil para
5 agentes de control del añublo del arroz y similares (a continuación en el presente documento denominado “gen de biosíntesis de UK-2”) y a un método para mejorar la productividad de UK-2. Más específicamente, la presente invención se refiere a un gen de biosíntesis de UK-2, a un vector en el que se inserta el gen de biosíntesis de UK-2, a un transformante en el que se introduce el vector, a un método para determinar la productividad de UK-2 detectando la presencia del gen de biosíntesis de UK-2, a una bacteria en la que se detecta la presencia del gen de
10 biosíntesis de UK-2 mediante el método, a una bacteria que comprende el gen de biosíntesis de UK-2 insertado en el genoma de la misma, a una bacteria en la que están presentes una o dos o más copias del gen de biosíntesis de UK-2 por célula, y a métodos para producir UK-2 y un derivado de UK-2A utilizando estas bacterias y así sucesivamente.
Antecedentes de la técnica
15 UK-2 es un compuesto producido como metabolito secundario por actinobacterias, y muestra acciones antifúngicas fuertes similares a antimicina contra diversos hongos incluyendo hongos filamentosos y levaduras. Además, puesto que tiene una baja citotoxicidad para células en cultivo, se ha encontrado que UK-2 es útil para agentes de control del añublo del arroz, fungicidas agrícolas y hortícolas, y agentes antifúngicos médicos (documentos de patente 1, 2). Además, se ha revelado que existen de manera natural cuatro análogos, UK-2A a D, basándose en la diferencia de
20 estructura de sus cadenas naturales (documento no de patente 1).
UK-2 se produce cultivando actinobacterias (bacterias y similares que pertenecen al género Streptoverticillium) y luego recogiendo UK-2 a partir de las mismas. Sin embargo, generalmente, la cantidad de UK-2 (todos los factores de UK-2) producida por microorganismos aislados de la naturaleza es muy pequeña. Por consiguiente, con el fin de usar el compuesto objetivo (UK-2) industrialmente a bajo coste, la productividad tiene que mejorarse.
25 La productividad del compuesto objetivo se mejora a través de investigaciones sobre los métodos para cultivar los microorganismos que producen el compuesto objetivo, investigaciones sobre los componentes del medio, la mejora en las condiciones de fermentación mediante la adición del precursor y la mejora en la cepa bacteriana utilizando mutación inducida por mutágenos químicos o irradiación ultravioleta. Además, aparte de estos métodos, la productividad se ha mejorado recientemente utilizando recombinación génica.
30 Un método general para mejorar la productividad mediante recombinación génica es el que incluye la potenciación de la expresión de un gen necesario para la biosíntesis del compuesto objetivo. Por ejemplo, el documento de patente 3 da a conocer que este método mejora la productividad de PF-1022 en Agonomycetales.
Sin embargo, cuando se utiliza este método, es esencial aislar el gen necesario para la biosíntesis del compuesto objetivo o el gen sintetizado usando técnicas conocidas, y también para establecer el método de transformación para
35 microorganismos que producen el compuesto objetivo (microorganismos productores). Puesto que el gen de biosíntesis de UK-2 aún tiene que dilucidarse, no puede realizarse la transformación usando el gen de biosíntesis de UK-2. La productividad no puede mejorarse mediante recombinación génica.
Lista de menciones
Documentos de patente
40 [PTL 1] Publicación de solicitud de patente japonesa examinada n.º Hei 07-233165
[PTL 2] Publicación internacional n.º WO1999/11127
[PTL 3] Publicación internacional n.º WO2001/018179
[Documentos no de patente]
[NPL 1] Ueki M., et al., Journal of antibiotics, 25 de julio de 1996, vol. 49, n.º 7, págs. 639 a 643
45 [NPL 2] Namwat W., et al, Journal of Bacteriology, septiembre de 2002, vol. 184, n.º 17, págs. 4811 a 4818
Sumario de la invención
Problema técnico
La presente invención se ha realizado en vista de los problemas descritos anteriormente en las técnicas convencionales. Un objeto de la presente invención es proporcionar un transformante que tiene alta productividad de 50 UK-2, obtenido aislando un gen necesario para la biosíntesis de UK-2 seguido por la introducción del gen. Además,
imagen2
otro objeto es producir una gran cantidad de UK-2 a bajo coste usando el transformante. Y un objeto adicional es proporcionar un método para determinar la productividad de UK-2 detectando la presencia del gen.
Solución al problema
UK-2 tiene un esqueleto de ácido hidroxipicolínico característico. Mientras tanto, un compuesto denominado
5 virginiamicina tiene también un esqueleto de ácido hidroxipicolínico. Además, se ha revelado que VisA (L-lisina 2aminotransferasa) y VisB (ácido 3-hidroxipicolínico AMP ligasa) están implicadas en la biosíntesis de virginiamicina (documento no de patente 2).
Por tanto, con el fin de lograr los objetos anteriores, los presentes inventores prepararon en primer lugar la biblioteca de ADN genómico de Streptoverticillium sp. 3-7, que produce UK-2, y determinaron exhaustivamente la secuencia 10 de bases del ADN genómico de la cepa. Entonces, se realizó un análisis de homología entre la secuencia de aminoácidos de una supuesta proteína codificada por el ADN genómico y las secuencias de aminoácidos de VisA y VisB para encontrar así un sitio genómico en el que están ubicados de manera consecutiva genes cuyos productos tienen una alta homología con estas dos secuencias de aminoácidos. Además, se encontró que un gen que codifica para una proteína que tiene una homología con una péptido sintetasa no ribosómica (NRPS) y un gen que codifica
15 para una proteína que tiene una homología con una policétido sintasa (PKS) están ubicados cerca del sitio.
Se cree que estas enzimas son necesarias para formar el esqueleto de UK-2. Además, los genes de metabolitos secundarios de actinobacterias forman agrupaciones. Por consiguiente, se espera que la región genómica sea una agrupación génica de biosíntesis de UK-2.
Entonces, basándose en la información así obtenida sobre las secuencias de bases de los genes que se espera que
20 codifiquen para las enzimas necesarias para la biosíntesis de UK-2, se preparó una sonda. Mediante hibridación de colonias usando la sonda, se aislaron satisfactoriamente ADN que se espera que estén en la agrupación génica de biosíntesis de UK-2 (es decir, ADN contenidos en la región genómica) a partir de la biblioteca de ADN genómico descrita anteriormente. Además, se usaron los ADN para preparar Streptoverticillium sp. 3-7 en el que los genes presentes en la región genómica se alteraron. Se encontró que la cepa no producía UK-2. Se verificó que la región
25 genómica era la agrupación génica de biosíntesis de UK-2. Además, se transformó Streptoverticillium sp. 3-7 mediante la introducción de un vector en el que se insertó la agrupación génica de biosíntesis de UK-2 aislada. Se encontró también que la productividad de UK-2 por el transformante mejorada de aproximadamente 10 a 60 veces o más en comparación con la de la cepa original. Además, se confirmó que estaban presentes 2 copias de la agrupación génica de biosíntesis de UK-2 por célula en estos transformantes, respectivamente.
30 Específicamente, la presente invención se refiere a un gen de biosíntesis de UK-2, a un vector en el que se inserta el gen de biosíntesis de UK-2, a un transformante en el que se introduce el vector y a métodos para producir UK-2 y similares utilizando el transformante. Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente.
<1> Un ácido nucleico aislado que induce la biosíntesis de UK-2 y mejora la productividad de UK-2, el ácido nucleico es al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (q):
35 (a) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la
40 secuencia de bases de SEQ ID NO: 2;
(b) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ
45 ID NO: 5, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4;
(c) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para
50 una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 6;
(d) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 en
55 la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 20 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 8;
imagen3
(e) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica
5 para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 10;
(f) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 en
10 la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 12;
(g) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
15 15, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 14;
20 (h) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la
25 secuencia de bases de SEQ ID NO: 16;
(i) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ
30 ID NO: 19, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 18;
(j) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para
35 una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 20;
(k) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
40 23 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 22;
(l) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25,
45 un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 24;
50 (m) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la
55 secuencia de bases de SEQ ID NO: 26;
(n)
un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica
para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 28;
(o)
un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
imagen4
5 31, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 30;
10 (p) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la
15 secuencia de bases de SEQ ID NO: 32; y
(q) un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de
20 SEQ ID NO: 35, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 34.
<2> El ácido nucleico según <1>, que comprende todos los ácidos nucleicos de (a) a (q).
<3> El ácido nucleico según <2>, que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1.
<4> Un vector en el que se inserta el ácido nucleico según uno cualquiera de <1> a <3>, para inducir la biosíntesis 25 de UK-2 y mejorar la productividad de UK-2.
<5> Un método para determinar la productividad de UK-2, que comprende detectar, en una bacteria de prueba, la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases del ácido nucleico según uno cualquiera de
<1> a <3> o una secuencia de bases complementaria a la secuencia.
<6> El método según <5>, en el que el método para detectar la presencia del ácido nucleico es un método de PCR.
30 <7> El método según <6>, en el que el método de PCR es un método en el que el ácido nucleico se amplifica usando un cebador que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 45 y un cebador que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 46.
<8> Una bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2 introduciendo el vector según <4>.
35 <9> Un transformante de bacteria en el que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2, y en el que se inserta el ácido nucleico según <1> en el genoma del mismo.
<10> Un transformante de bacteria en el que están presentes una o dos o más copias de un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases del ácido nucleico según uno cualquiera de <1> a <3> por célula.
<11> La bacteria según uno cualquiera de <8> a <10>, que es una cualquiera de Streptoverticillium, Streptomyces, 40 Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos y Corynebacterium glutamicum.
<12> Un método para producir UK-2, que comprende la etapa de:
cultivar la bacteria según uno cualquiera de <8> a <11>, y recoger UK-2 de un cultivo de la bacteria.
<13> Un método para producir un derivado de UK-2, que comprende las etapas de:
cultivar la bacteria según uno cualquiera de <8> a <11>, y recoger UK-2 de un cultivo de la bacteria; y
45 sintetizar un derivado de UK-2 representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas (1) a partir de la UK-2 recogida
[Fórm. quím. 1] [en la fórmula (1),
imagen5
R representa uno cualquiera de un grupo 2 metilpropanoílo, un grupo trans-2-metil-2-butenoílo, un grupo 3metilbutanoílo y un grupo 2-metilbutanoílo.
5 R1 representa uno cualquiera de un grupo alquilo C1-6, un grupo bencilo, un grupo alquilcarbonilo C1-10 (el grupo alquilcarbonilo C1-10 puede estar sustituido con uno cualquiera de un grupo carboxilo, un grupo benciloxicarbonilo, un grupo alquiloxicarbonilo C1-4 y grupo benciloxicarbonilamino), un grupo benzoílo, un grupo alquiloxicarbonilo C1-4, un grupo alquiloxicarbonil (C1-4)-alquilo (C1-4), un grupo benciloxicarbonilalquilo (C1-4) puede estar sustituido con un grupo nitro, un grupo alquilsulfonilo C1-6, dialquil (C1-6)-fosforilo, un grupo difenilfosforilo y un sustituyente
10 representado por la siguiente fórmula (2);
[Fórm. quím. 2]
imagen6
(en la fórmula (2), Q se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 y un ciclopropilo. M se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 y un ciclopropilo.
15 T se selecciona del grupo que consiste en O, OC(O), OC(O)O, S, SC(O), SC(O)O y un sustituyente representado por la siguiente fórmula (3); [Fórm. quím. 3]
imagen7
G se selecciona del grupo que consiste en H, grupo alquilo C1-6, un grupo alquiloxi C1-6-alquilo C1-6, un grupo 20 alquenilo C2-6, un grupo alquinilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo arilo y un grupo heteroarilo.
G y M pueden formar un anillo de isobenzofurano que tiene opcionalmente un grupo oxo.
M y Q pueden formar un sistema carbocíclico de 3-8 miembros.]
<14> Un método para producir un derivado de UK-2A, que comprende las etapas de: cultivar la bacteria según uno cualquiera de <8> a <11>, y recoger UK-2A de un cultivo de la bacteria; y
imagen8
sintetizar un derivado de UK-2A representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas (4) a (7) a partir de la UK-2A recogida.
[Fórm. quím. 4]
[Fórm. quím. 5]
[Fórm. quím. 6]
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[Fórm. quím. 7] 5
10
15
20
25
30
35
40
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Obsérvese que, tal como se usa en el presente documento, el término “acilo” significará un residuo RCOproporcionado mediante la eliminación de OH de un ácido carboxílico R-COOH, en el que R representa un grupo hidrocarbonato. Tal como se usa en el presente documento, el término “arilo” significará fenilo o naftilo. Tal como se usa en el presente documento, el término “heteroarilo” significará cualquier anillo aromático de 5 ó 6 miembros, que contiene uno o más heteroátomos, en donde tales heteroátomos se seleccionan del grupo que consiste en O, N y S, y en donde los átomos restantes del anillo aromático son átomos de carbono. Los ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a piridina, una piridazina, una pirimidina, una pirazina, un pirrol, un pirazol, un imidazol, un furano, un tiofeno, un oxazol, un isoxazol, un tiazol, un isotiazol, una quinolina, una quinoxolina y un tiadiazol.
[Efectos ventajosos de la invención]
La presente invención hace posible proporcionar un transformante que tiene alta productividad de UK-2 introduciendo un gen de biosíntesis de UK-2 en una célula huésped tal como una bacteria. Además, también es posible la producción de UK-2 a bajo coste usando el transformante. Además, también hace posible proporcionar un método para determinar la productividad de UK-2 detectando la presencia del gen.
[Descripción de realizaciones]
<Gen de biosíntesis de UK-2>
La presente invención proporciona un gen de biosíntesis de UK-2. Tal como se describe en los ejemplos más adelante, los presentes inventores han aislado, como genes de biosíntesis de UK-2 novedosos, 17 genes mostrados en la tabla 2 a partir de un ADN genómico de Streptoverticillium sp. 3-7.
Por tanto, una realización del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención es un “ácido nucleico aislado que induce la biosíntesis de UK-2 y mejora la productividad de UK-2, el ácido nucleico es un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35”, y normalmente un “ácido nucleico aislado que induce la biosíntesis de UK-2 y mejora la productividad de UK-2, el ácido nucleico es un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34”.
En la presente invención, la frase “mejora en la productividad de UK-2” y frases relacionadas significan no sólo una mejora en la productividad de UK-2 que tiene una bacteria o similar de manera natural, sino también la adquisición de una capacidad de producción de UK-2 por una bacteria o similar que no tiene de manera natural la capacidad de producción de UK-2.
En la presente invención, el término “aislamiento” y términos relacionados significan un tratamiento artificial que permite que el ácido nucleico exista en una condición diferente de la condición existente originalmente. El gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención puede aislarse, por ejemplo, sintetizando en primer lugar un cebador apropiado basándose en la información sobre la secuencia de bases de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34, y luego llevando a cabo PCR usando el cebador con un molde del ADN genómico de Streptoverticillium sp. 3-7. Alternativamente, tal como se describe en los ejemplos más adelante, el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención también puede aislarse a partir de una biblioteca de ADN genómico o biblioteca de ADNc de Streptoverticillium sp. 3-7 llevando a cabo hibridación de colonias usando el producto de amplificación obtenido mediante la PCR como sonda. Además, el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención también puede prepararse mediante síntesis química total basándose en la información de secuencia de bases.
En la presente invención, “UK-2” es un compuesto representado por la siguiente fórmula (8):
[Fórm. quím. 8] en la que R representa un grupo acilo alifático saturado lineal o ramificado o un grupo acilo alifático insaturado lineal
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o ramificado. Preferiblemente, “UK-2” es un compuesto en el que R es un grupo isobutirilo (grupo 2 metilpropanoílo) (UK-2A), un compuesto en el que R es un grupo tigloílo (grupo trans-2-metil-2-butenoílo) (UK-2B), un compuesto en
5 el que R es un grupo isovalerilo (grupo 3-metilbutanoílo) (UK-2C) y un compuesto en el que R es un grupo 2metilbutanoílo (UK-2D).
Además, en la presente invención, el “gen de biosíntesis de UK-2” es un gen que codifica para una proteína que tiene una actividad que puede inducir la biosíntesis de UK-2. La “actividad que puede inducir la biosíntesis de UK-2” puede evaluarse mediante, por ejemplo, un método descrito en el ejemplo 9 más adelante. Específicamente, tras
10 insertarse un ácido nucleico para codificar para la proteína de prueba en un vector que se somete a introducción o similar en una célula huésped (por ejemplo, Streptoverticillium sp. 3-7), se mide la cantidad de UK-2 producida en la célula huésped mediante expresión forzada de la proteína de prueba en la célula huésped. Si la cantidad producida es mayor que en una célula huésped en la que no se expresa la proteína de prueba, puede evaluarse que la proteína de prueba tiene una actividad que puede inducir la biosíntesis de UK-2.
15 En el estado de la técnica, si está disponible la información sobre la secuencia de bases del gen de biosíntesis de UK-2, los expertos en la técnica pueden modificar la secuencia de bases y obtener un ácido nucleico que codifica para una proteína implicada en la biosíntesis de UK-2, aunque la secuencia de aminoácidos de la proteína sea diferente de la que está codificada en la secuencia de bases. Mientras tanto, en la naturaleza también, la secuencia de aminoácidos de una proteína que va a codificarse puede experimentar mutación mediante una mutación de la
20 secuencia de bases. Por tanto, otra realización del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención es un “ácido nucleico aislado que es un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35 en la que uno o más aminoácidos se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan”. En este caso, “más de uno” se refiere al número de aminoácidos modificados en una proteína implicada en la biosíntesis de UK-2 tras la modificación, siempre que la
25 proteína tenga todavía una actividad de inducción de la biosíntesis de UK-2. El número es normalmente de 1 a 50, preferiblemente de 1 a 40, y más preferiblemente de 1 a varios (por ejemplo, de 1 a 20, de 1 a 10, de 1 a 8 y de 1 a 4).
Los expertos en la técnica pueden preparar el ácido nucleico que codifica para una variante de este tipo mediante métodos conocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio basándose en la información sobre la secuencia de
30 bases del gen de biosíntesis de UK-2.
Además, en el estado de la técnica, si está disponible la información sobre la secuencia de bases del gen de biosíntesis de UK-2, los expertos en la técnica pueden obtener ácidos nucleicos (genes homólogos) que codifican para una proteína que tiene una actividad de inducción de la biosíntesis de UK-2 a partir de cepas distintas de Streptoverticillium sp. 3-7 y otras bacterias mediante una técnica de hibridación o una técnica de reacción en cadena
35 de la polimerasa (PCR). Por tanto, otra realización del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención es un “ácido nucleico aislado que es un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ó 34”.
Para aislar un gen homólogo de este tipo, normalmente se lleva a cabo una reacción de hibridación en condiciones rigurosas. Las “condiciones rigurosas” significan aquéllas en las que el procedimiento de lavado de la membrana tras 40 la hibridación se lleva a cabo a alta temperatura en una disolución que tiene una baja concentración de sal. Las “condiciones rigurosas” incluyen condiciones de lavado, por ejemplo, a una concentración de 2xSSC (1xSSC: citrato de trisodio 15 mM, cloruro de sodio 150 mM) en una disolución de SDS al 0,5% a 60ºC durante 20 minutos. Adicionalmente, la hibridación puede llevarse a cabo, por ejemplo, según un método descrito en las instrucciones adjuntas al sistema de detección y marcaje de ADN/ARN conocido ECL Direct (fabricado por Amersham Pharmacia
45 Biotech Inc.).
Además, la proteína codificada por el gen homólogo obtenido mediante un método de este tipo tiene normalmente una alta homología con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35. Por tanto, otra realización del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención es un “ácido nucleico aislado que es un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 35”.
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5 La homología de las secuencias puede determinarse usando, por ejemplo, un programa de BLASTX (nivel de aminoácidos) del NCBI.
Tal como se describe en los ejemplos más adelante, el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención puede usarse para preparar un transformante que tiene una alta productividad de UK-2, y también puede usarse para examinar eficazmente la agrupación génica de biosíntesis de UK-2.
10 En la preparación de un transformante de este tipo y el examen de la agrupación génica de biosíntesis de UK-2, es preferible el uso de los genes de biosíntesis de UK-2 descritos anteriormente en combinación al uso individual de los genes de biosíntesis de UK-2. El número de los genes de biosíntesis de UK-2 en combinación no está particularmente limitado, siempre que pueda inducirse la biosíntesis de UK-2 mediante la combinación. Por ejemplo, el número es de 2 o mayor, preferiblemente 5 o mayor, además preferiblemente 10 o mayor, y más preferiblemente
15 15 o mayor. El número de los genes de biosíntesis de UK-2 en combinación es lo más preferiblemente 17 porque la productividad de UK-2 en el transformante puede mejorarse significativamente.
Los genes de biosíntesis de UK-2 en combinación pueden existir como un único ácido nucleico o como ácidos nucleicos separados.
La presente invención proporciona un “ácido nucleico que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 1”
20 como un único ácido nucleico (agrupación génica de biosíntesis de UK-2) que comprende los 17 genes de biosíntesis de UK-2. Las ubicaciones de los marcos de lectura abiertos (ORF) de los genes en el ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 son tal como se muestra en la tabla 1 descrita más adelante.
Tal como se describe en el ejemplo más adelante, el “ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1” puede aislarse sintetizando en primer lugar un cebador apropiado basándose en la información sobre la 25 secuencia de bases del gen de biosíntesis de UK-2, y similares, y luego llevando a cabo PCR usando el cebador con un molde de una biblioteca de ADN genómico de cósmido de Streptoverticillium sp. 3-7 preparada independientemente, seguido por hibridación de colonias usando el producto de amplificación obtenido como sonda.
<Vector>
La presente invención proporciona un vector en el que se inserta el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente
30 invención. El vector de la presente invención puede construirse basándose en un vector autorreplicante, es decir, por ejemplo, un plásmido que existe como elemento extracromosómico, y que se replica independientemente de la replicación del cromosoma. Alternativamente, el vector de la presente invención puede replicarse junto con el cromosoma de una célula huésped tal como una bacteria, tras introducirse en la célula huésped e incorporarse en el genoma de la misma. Como procedimiento y método para construir el vector de la presente invención, puede usarse
35 cualquier procedimiento y método comúnmente usado en el campo de la ingeniería genética.
Los expertos en la técnica pueden seleccionar como apropiado el vector de la presente invención de los vectores conocidos según el tipo de la célula huésped que va a introducirse. Los ejemplos de los vectores conocidos incluyen vectores de cósmido (vector de cósmido SuperCos 1 y similares), vectores de fago, plásmidos basados en pUC (vector de plásmido pCR2.1-TOPO y similares), plásmidos basados en pBluescript y plásmidos pBR322.
40 Para expresar la proteína codificada por el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención en la célula huésped, el “vector” de la presente invención comprende preferiblemente, además del gen, una secuencia de ADN para regular la expresión, un gen marcador para seleccionar la célula huésped transformada, y similares.
Los ejemplos de la “secuencia de ADN para regular la expresión” incluyen un promotor, un potenciador y un terminador. El ejemplo también incluye un operón de lactosa que puede inducir la expresión de gen ubicado en el
45 sentido de 3’ mediante la adición de isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a las bacterias. El vector de la presente invención puede construirse, por ejemplo, ligando operativamente un promotor y un terminador respectivamente en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención.
El “gen marcador” puede seleccionarse según sea apropiado según el método para seleccionar la célula huésped transformada (transformante). Por ejemplo, puede usarse un gen que codifica para resistencia a fármacos o un gen 50 que complementa la auxotrofía. En un caso en el que la célula huésped usada es una bacteria, los ejemplos del gen marcador incluyen un gen de resistencia a ampicilina, un gen de resistencia a kanamicina y un gen de resistencia a tetraciclina. Particularmente, en el caso de una actinobacteria, los ejemplos incluyen un gen de resistencia a apramicina, un gen de resistencia a tiostreptona, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a kanamicina, un gen de resistencia a estreptomicina, un gen de resistencia a viomicina, y similares. En el caso de una 55 levadura, los ejemplos incluyen un gen de triptófano biosintetasa (TRP1), un gen de biosíntesis de uracilo (URA3), un gen de biosíntesis de leucina (LEU2), y similares. En el caso de un moho, los ejemplos incluyen un gen de
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10
15
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resistencia a higromicina, un gen de resistencia a bialafos, un gen de resistencia a bleomicina, un gen de resistencia a aureobasidina, y similares. En el caso de una planta, los ejemplos incluyen un gen de resistencia a kanamicina, un gen de resistencia a bialafos, y similares.
<Transformante etc.>
La presente invención proporciona un transformante en el que se introduce el vector de la presente invención (por ejemplo, una bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2 introduciendo el vector de la presente invención).
Además, la presente invención proporciona un transformante en el que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2, y en el que se inserta el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención en el genoma del mismo.
La célula huésped que se transforma mediante la introducción del vector de la presente invención o la célula huésped en el genoma de la cual el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención no está particularmente limitada. Los ejemplos de la misma incluyen actinobacterias, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos, Corynebacterium glutamicum, células vegetales, células de insecto y células animales. Desde el punto de vista de la productividad de UK-2, son preferibles actinobacterias, bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium y bacterias que pertenecen al género Streptomyces son más preferibles, bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium son incluso más preferibles, y Streptoverticillium sp. 3-7 es particularmente preferible.
El método para introducir el vector de la presente invención en la célula huésped no está particularmente limitado. Puede seleccionarse y emplearse según sea apropiado por los expertos en la técnica a partir de métodos de transformación conocidos métodos tales como transferencia por conjugación, transducción de fagos, un método de ión de calcio, un método de ión de litio, un método de electroporación, un método de PEG, un método de Agrobacterium y un método de pistola de partículas, dependiendo del tipo de la célula huésped a prueba. Además, en un caso en el que el vector que comprende el “gen marcador” se introduce en la célula huésped, el transformante de la presente invención puede prepararse eficazmente mediante cultivo en un medio al que se le añade un antibiótico correspondiente al gen de resistencia a fármacos o en un medio que es deficiente en un nutriente correspondiente al gen que complementa la auxotrofía.
Además, la presente invención proporciona una bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2 mediante una mejora en las condiciones de fermentación, inducción de mutación, o similar. Además, se ha revelado tal como se describe en los ejemplos más adelante que comprender al menos dos copias del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención induce biosíntesis de UK-2 y mejora significativamente la productividad de UK-2. Por tanto, la presente invención también proporciona una bacteria en la que están presentes una o dos o más copias del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención por célula. Desde el punto de vista de la productividad de UK-2, tales bacterias son preferiblemente actinobacterias, más preferiblemente bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium y bacterias que pertenecen al género Streptomyces, y además preferiblemente bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium. Adicionalmente, desde el punto de vista de la productividad de UK-2, el número de copias del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención por célula es preferiblemente de dos o mayor. Obsérvese que el número de copias del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención por célula puede identificarse, por ejemplo, mediante un método de PCR tal como se describe en los ejemplos más adelante.
<Método para determinar la productividad de UK-2>
Los presentes inventores han aislado e identificado genes necesarios para la biosíntesis de UK-2, y por tanto han hecho posible determinar la productividad de UK-2 detectando la presencia de los genes. Por tanto, la presente invención también proporciona un método para determinar la productividad de UK-2, que comprende detectar, en una bacteria de prueba, la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención o una secuencia de bases complementaria a la secuencia.
En el método de la presente invención, la “bacteria de prueba” no está particularmente limitada. Los ejemplos de la misma incluyen actinobacterias (bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium, bacterias que pertenecen al género Streptomyces, y similares), Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos y Corynebacterium glutamicum.
En el método para determinar la productividad de UK-2 de la presente invención, la secuencia de bases del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención que va a detectarse, es decir, la secuencia de bases del ácido nucleico de la presente invención, es una secuencia de bases de al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en los puntos (a) a (q) descritos anteriormente.
El ácido nucleico y así sucesivamente puede detectarse directamente seleccionando como diana un ADN genómico que incluye el ácido nucleico y así sucesivamente o un producto de transcripción del ADN genómico. Alternativamente, el ácido nucleico y así sucesivamente también puede detectarse indirectamente seleccionado como diana un producto de traducción del producto de transcripción (una proteína codificada por el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención). Además, la detección del ácido nucleico y así sucesivamente puede emplear cualquiera de los métodos conocidos. En el caso de selección como diana del ADN genómico, es posible emplear, por ejemplo, un método de hibridación in situ (ISH), un método de PCR genómico, un método de secuenciación directa, un método de transferencia de tipo Southern y un método de análisis usando un
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5 microalineamiento del genoma. En el caso de selección como diana del producto de transcripción, es posible emplear, por ejemplo, un método de PCR, un método de secuenciación directa, un método de transferencia de tipo Northern, un método de diagrama de puntos, y un método de análisis usando un microalineamiento de ADNc. En el caso de selección como diana del producto de traducción, los ejemplos de los métodos conocidos incluyen métodos inmunológicos usando un anticuerpo contra una proteína codificada por el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención (un método de inmunotransferencia de tipo Western, un método de ELISA, citometría de flujo, tinción inmunohistoquímica, citometría de obtención de imágenes, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, un método de análisis usando una matriz de anticuerpos, y similares). Entre estos métodos, es preferible un método de PCR, y es más preferible un método de PCR en el que el ácido nucleico se amplifica usando un cebador que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 45 y un cebador que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 46.
15 Adicionalmente, en el método de la presente invención, desde el punto de vista de lograr una determinación más precisa de la productividad de UK-2, es preferible detectar la presencia de múltiples ácidos nucleicos (los genes de biosíntesis de UK-2 de la presente invención) descritos anteriormente, en vez de detectar la presencia de uno de los ácidos nucleicos. El número de los ácidos nucleicos que va a detectarse es, por ejemplo, de dos o mayor, preferiblemente cinco o mayor, más preferiblemente 10 o mayor, e incluso más preferiblemente 15 o mayor. La detección de los 17 ácidos nucleicos es particularmente preferible, y la detección de un único ácido nucleico que comprende los 17 ácidos nucleicos (el ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1) es lo más preferible. Además, aparte de la longitud completa del ácido nucleico, se selecciona como diana una parte del mismo en una práctica normal para detectar la presencia del ácido nucleico. Por tanto, en el método de la presente invención también, la detección del ácido nucleico y así sucesivamente puede ser la detección de una parte del
25 ácido nucleico y así sucesivamente. Los expertos en la técnica pueden seleccionar como apropiada la longitud de la parte del ácido nucleico que va a detectarse mediante el método de la presente invención, dependiendo del método de detección.
Entonces, si la presencia del ácido nucleico en la bacteria de prueba puede detectarse mediante un método de este tipo, se determina que la bacteria de prueba tiene productividad de UK-2. Adicionalmente, el método de la presente invención puede comprender además cultivar la bacteria de prueba en la que puede detectarse la presencia del ácido nucleico, en condiciones que permiten que se produzca UK-2.
Además, la presente invención también proporciona una bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2, y en la que se detecta la presencia del ácido nucleico que comprende la secuencia de bases del ácido nucleico de la presente invención o la secuencia de bases complementaria a la secuencia
35 mediante el método para determinar productividad de UK-2 de la presente invención. Desde el punto de vista de la productividad de UK-2, tales bacterias son preferiblemente actinobacterias, más preferiblemente bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium y bacterias que pertenecen al género Streptomyces, e incluso más preferiblemente bacterias que pertenecen al género Streptoverticillium.
Obsérvese que, tal como se usa en el presente documento, las bacterias descritas anteriormente y así sucesivamente que tienen el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención, es decir, la bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2, y en la que se detecta la presencia del ácido nucleico mediante el método para determinar productividad de UK-2 de la presente invención, el transformante en el que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2 introduciendo el vector de la presente invención, el transformante en el que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2, y en el
45 que se inserta el gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención en el genoma del mismo, la bacteria en la que están presentes una o dos o más copias del gen de biosíntesis de UK-2 de la presente invención por célula, y la bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2 mediante una mejora en las condiciones de fermentación, inducción de mutación, o similar, se denominan a continuación en el presente documento conjuntamente “bacterias etc. de la presente invención”.
<Método para producir UK-2>
La presente invención proporciona un método para producir UK-2, que comprende la etapa de:
cultivar las bacterias etc. de la presente invención, y recoger UK-2 de un cultivo de las bacterias etc..
Las bacterias etc. pueden cultivarse seleccionando el medio, la condición de cultivo, y similares según sea apropiado según un método convencional. Como medio, pueden usarse componentes comúnmente usados. Por ejemplo, 55 como fuente de carbono, es posible usar glucosa, sacarosa, celulosa, jarabe de almidón, dextrina, almidón, glicerol, melazas, aceites animales y vegetales, o similares. Además, como fuente de nitrógeno, es posible usar harina de soja, germen de trigo, Pharmamedia, líquido de maceración de maíz, harina de semilla de algodón, caldo, peptona, polipeptona, extracto de malta, extracto de levadura, sulfato de amonio, nitrato de sodio, urea, o similares. Además, si es necesario, es eficaz añadir sales inorgánicas que pueden producir sodio, potasio, calcio, magnesio, cobalto,
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cloro, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y otros iones; los ejemplos de las sales inorgánicas incluyen cloruro de potasio, carbonato de calcio, hidrogenofosfato de dipotasio, sulfato de magnesio, fosfato de monopotasio, sulfato de zinc, sulfato de manganeso y sulfato de cobre. Adicionalmente, si es necesario, también es posible añadir diversas vitaminas tales como tiamina (clorhidrato de tiamina y similares), aminoácidos tales como ácido glutámico (glutamato
5 de sodio y similares) y asparagina (DL-asparagina y similares), nutrientes traza tales como nucleótidos, y fármacos selectivos tales como antibióticos. Además, pueden añadirse según sea apropiado sustancias orgánicas e inorgánicas para promover el crecimiento de la bacteria y la producción de UK-2. El pH del medio no está particularmente limitado, y puede ajustarse según el tipo de la bacteria etc. que va a cultivarse. Por ejemplo, el pH es de aproximadamente 6 a 8.
10 Los expertos en la técnica pueden seleccionar y establecer según sea apropiado las condiciones de cultivo según el tipo de las bacterias etc. que van a cultivarse, el tipo del medio que va a usarse, y así sucesivamente. Por ejemplo, el método de cultivo puede seleccionarse de cualquier método de cultivo conocido tal como un método de cultivo de agitación en una condición aerobia, un método de cultivo aireado y agitado y un método de cultivo sumergido aerobio. Es preferible el método de cultivo aireado y agitado. Una temperatura de cultivo apropiada es de 15ºC a
15 40ºC. En muchos casos, la temperatura de cultivo se establece alrededor de 26ºC a 37ºC. Además, el periodo de cultivo es preferiblemente de 2 días a 25 días cuando se logra la acumulación máxima de UK-2.
En la presente invención, el “cultivo” se refiere a un medio obtenido cultivando las bacterias etc. de la presente invención, conteniendo el medio las bacterias proliferadas etc., una secreción y un metabolito de las bacterias etc., y similares. El cultivo también incluye una dilución y un concentrado de estos.
20 En el cultivo, se acumula UK-2 tanto en las bacterias etc. como en el medio. Por tanto, un ejemplo del método para recoger UK-2 del medio del cultivo es un método de extracción usando un disolvente orgánico tal como acetato de etilo, cloroformo y diclorometano que no se mezclan con agua libremente, y que pueden extraer eficazmente UK-2. Mientras tanto, a partir de las bacterias etc. del cultivo, por ejemplo, puede recogerse UK-2 mediante extracción, con un disolvente orgánico tal como acetona, sobre las bacterias etc. que se ha obtenido por medios tales como filtración
25 o centrifugación. Además, puede recogerse UK-2 mediante extracción del mismo modo que la extracción descrita anteriormente a partir del medio, tras haberse roto las bacterias etc. del cultivo usando perlas de vidrio o similares.
Además, al recoger UK-2 del cultivo, puede aislarse y purificarse UK-2 sometiendo una fracción de extracción así preparada tal como disolvente orgánico a técnicas de purificación conocidas tales como disolución de transferencia con disolvente, cromatografías de fase normal y de fase inversa, cromatografía de filtración en gel y cristalización en
30 combinación.
<Método para producir derivado de UK-2>
Tal como se describió anteriormente, la presente invención hace posible la producción en masa de UK-2 a bajo coste. Por consiguiente, también se hace posible la producción en masa de derivados de UK-2 a bajo coste usando UK-2 obtenida mediante el método de producción de la presente invención como material de la misma.
35 Por tanto, la presente invención también puede proporcionar un método para producir un derivado de UK-2, que comprende las etapas de:
cultivar las bacterias etc. de la presente invención, y recoger UK-2 (UK-2A, UK-2B, UK-2C o UK-2D) de un cultivo de las bacterias etc.; y
sintetizar un derivado de UK-2 representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas (1) a partir de la UK-2 40 recogida
[Fórm. quím. 9]
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[en la fórmula (1),
R representa uno cualquiera de un grupo 2 metilpropanoílo, un grupo trans-2-metil-2-butenoílo, un grupo 3metilbutanoílo y un grupo 2-metilbutanoílo.
R1 representa uno cualquiera de un grupo alquilo C1-6, un grupo bencilo, un grupo alquilcarbonilo C1-10 (el grupo alquilcarbonilo C1-10 puede estar sustituido con uno cualquiera de grupo carboxilo, un grupo benciloxicarbonilo, un grupo alquiloxicarbonilo C1-4 y grupo benciloxicarbonilamino), un grupo benzoílo, un grupo alquiloxicarbonilo C1-4, un grupo alquiloxicarbonilo (C1-4)-alquilo (C1-4), un grupo benciloxicarbonilalquilo (C1-4) puede estar sustituido con un grupo nitro, un grupo alquilsulfonilo C1-6, dialquil (C1-6)-fosforilo, un grupo difenilfosforilo y un sustituyente representado por la siguiente fórmula (2);
[Fórm. quím. 10]
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(en la fórmula (2), Q se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 y un ciclopropilo. M se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 y un ciclopropilo. T se selecciona del grupo que consiste en O, OC(O ), OC(O)O, S, SC(O), SC(O)O y un sustituyente representado
por la siguiente fórmula (3); [Fórm. quím. 11]
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G se selecciona del grupo que consiste en H, grupo alquilo C1-6, un grupo alquiloxi C1-6-alquilo C1-6, un grupo alquenilo C2-6, un grupo alquinilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo arilo y un grupo heteroarilo.
G y M pueden formar un anillo de isobenzofurano que tiene opcionalmente un grupo oxo.
M y Q pueden formar un sistema carbocíclico de 3-8 miembros.].
En el sustituyente representado por la fórmula (2), el grupo alquilo, el grupo alquinilo, el grupo alquenilo, el grupo cicloalquilo, el grupo arilo y el grupo heteroarilo pueden estar sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes grupos de sustituyentes;
un grupo alquilo C1-6, un grupo alquenilo C2-6, un grupo alquinilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo cicloalquenilo C5-6, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo hidroxilo, un grupo ciano, un grupo alcoxilo C1-6, un grupo alqueniloxilo C2-6, un grupo cicloalcoxilo C3-6, un grupo ariloxilo, un grupo heteroariloxilo, un grupo aciloxilo, un grupo alquil C1-6-aciloxilo, un grupo cicloalquil C3-6-aciloxilo, un grupo arilaciloxilo, un grupo heteroarilaciloxilo, un grupo alquil C1-6-oxiacilo, un grupo cicloalquil C3-6-oxiacilo, un grupo ariloxiacilo, un grupo heteroariloxiacilo, un grupo alquil C1-6-acilo, un grupo cicloalquil C3-6-acilo, un grupo arilacilo, un grupo heteroarilacilo, un grupo alquil C1-6-acilamino, un grupo cicloalquil C3-6-acilamino, un grupo arilacilamino, un grupo heteroarilacilamino, un grupo alquil C1-6-aminoacilo, un grupo cicloalquil C3-6-aminoacilo, un grupo arilaminoacilo, un grupo heteroarilaminoacilo, un grupo alquil C1-6-tio, un grupo cicloalquil C3-6-tio, un grupo ariltio, un grupo heteroariltio, un grupo alquil C1-6-sulfonilo, un grupo cicloalquil-C3-6-sulfonilo, un grupo arilsulfonilo, un grupo heteroarilsulfonilo, un grupo alquil C1-6-sulfinilo, un grupo cicloalquil C3-6-sulfinilo, un grupo arilsulfinilo, un grupo heteroarilsulfinilo y -C(NORx)RY en el que Ry y Rx son independientemente uno cualquiera de H, un grupo alquilo C16, un grupo alquenilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo arilo y un grupo heteroarilo en los que cualquier sustituyente que contenga alquilo o cicloalquilo puede estar sustituido con uno o más halógenos.
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Obsérvese que el sustituyente también puede estar sustituido con al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes grupos de sustituyentes;
5 un grupo alquilo C1-6, un grupo alquenilo C2-6, un grupo alquinilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo cicloalquenilo C5-6, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un átomo de halógeno, un grupo nitro, un grupo hidroxilo, un grupo ciano, un grupo alcoxilo C1-6, un grupo alqueniloxilo C2-6, un grupo cicloalcoxilo C3-6, un grupo ariloxilo, un grupo heteroariloxilo, un grupo aciloxilo, un grupo alquil C1-6-aciloxilo, un grupo cicloalquil C3-6-aciloxilo, un grupo arilaciloxilo, un grupo heteroarilaciloxilo, un grupo alquil C1-6-oxiacilo, un grupo cicloalquil C3-6-oxiacilo, un grupo
10 ariloxiacilo, un grupo heteroariloxiacilo, un grupo alquil C1-6-acilo, un grupo cicloalquil C3-6-acilo, un grupo arilacilo, un grupo heteroarilacilo, un grupo alquil C1-6-acilamino, un grupo cicloalquil C3-6-acilamino, un grupo arilacilamino, un grupo heteroarilacilamino, un grupo alquil C1-6-aminoacilo, un grupo cicloalquil C3-6-aminoacilo, un grupo arilaminoacilo, un grupo heteroarilaminoacilo, un grupo alquil C1-6-tio, un grupo cicloalquil C3-6-tio, un grupo ariltio, un grupo heteroariltio, un grupo alquil C1-6-sulfonilo, un grupo cicloalquil-C3-6-sulfonilo, un grupo arilsulfonilo, un grupo
15 heteroarilsulfonilo, un grupo alquil C1-6-sulfinilo, un grupo cicloalquil C3-6-sulfinilo, un grupo arilsulfinilo, un grupo heteroarilsulfinilo y -C(NORx)RY en el que Ry y Rx son independientemente uno cualquiera de H, un grupo alquilo C16, un grupo alquenilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo arilo y un grupo heteroarilo en los que cualquier sustituyente que contenga alquilo o cicloalquilo puede estar sustituido con uno o más halógenos.
Además, la presente invención también puede proporcionar un método para producir un derivado de UK-2A, que 20 comprende las etapas de:
cultivar las bacterias etc. de la presente invención, y recoger UK-2A de un cultivo de las bacterias etc.; y
sintetizar un derivado de UK-2A representado por una cualquiera de las siguientes fórmulas (4) a (7) a partir de la UK-2A recogida.
[Fórm. quím. 12]
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[Fórm. quím. 13]
[Fórm. quím. 14]
[Fórm. quím. 15]
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Al recoger UK-2A, UK-2B, UK-2C o UK-2D del cultivo, pueden aislarse y purificarse UK-2A, UK-2B, UK-2C o UK-2D, por ejemplo, tal como se describió anteriormente, sometiendo la fracción de extracción tal como disolvente orgánico a técnicas de purificación conocidas tales como disolución de transferencia con disolvente, cromatografías de fase normal y de fase inversa, cromatografía de filtración en gel y cristalización en combinación. Más específicamente, la 10 fracción de extracción tal como disolvente orgánico se concentra a presión reducida. El resultante se transfiere a y se disuelve en cloroformo, y se somete cromatografía en gel de sílice, que entonces se eluye gradualmente con cloroformo/metanol. Por tanto, puede obtenerse una fracción que contiene UK-2A y UK-2D a una razón de aproximadamente 3:1, y que también contiene cantidades traza de UK-2B y UK-2C. Además, la fracción se trata mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (HPLC) usando una columna a C-18, y por
15 tanto pueden aislarse UK-2A, UK-2B, UK-2C o UK-2D (véase el documento de patente 1).
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Entonces, puede sintetizarse el derivado de UK-2A, UK-2B, UK-2C o UK-2D representado por una cualquiera de las fórmulas (1) y (4) a (7) usando UK-2A, UK-2B, UK-2C o UK-2D así recogida como material de la misma mediante, por ejemplo, el método de síntesis descrito en la publicación internacional n.º 2003/035617 o la publicación internacional n.º 1999/40081.
Ejemplos
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente basándose en los ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a los ejemplos a continuación.
Obsérvese que el microorganismo descrito en los presentes ejemplos está depositado tal como sigue. Se depositó Streptoverticillium sp. 3-7 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, código postal 305-8566, Japón) el 9 de noviembre, Heisei 23 (2011) con el número de registro de FERM BP-11437. Casualmente, al depósito de los microorganismos de patente por el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (antiguo nombre: IPOD) le sucedió el National Institute of Technology and Evaluation (NITE, n.º 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, código postal 292-0818) en abril de 2012.
Se estableció Streptoverticillium sp. 3-7 a partir de la cepa SAM 2084 descrita en la publicación de solicitud de patente japonesa examinada n.º Hei 07-233165, que se mutó artificialmente a través de una única irradiación con luz ultravioleta por los presentes inventores. La cepa SAM 2084 es una cepa bacteriana que produce UK-2 obtenida del suelo en la prefectura de Kyoto de Japón y se identificó con el número de depósito internacional FERM BP-6446.
(Ejemplo 1) <Preparación de una biblioteca de ADN genómico>
Para aislar genes necesarios para la biosíntesis de UK-2, en primer lugar, se preparó la biblioteca de ADN genómico de Streptoverticillium sp. 3-7 que puede producir UK-2 mediante un método descrito a continuación.
Se inoculó Streptoverticillium sp. 3-7 en 50 ml de YEME modificado (extracto de levadura de Difco al 0,3%, peptona Bacto de Difco al 0,5%, extracto de malta de Oxoid al 0,3%, sacarosa al 3,0%, glucosa al 1,0%, MgCl2·6H2O 5 mmol/l) y se cultivó con agitación a 220 rpm a 30ºC durante 18 horas. Tras completarse el cultivo, se recogieron las células bacterianas mediante centrifugación a 7500 rpm durante 10 minutos. A partir de las células bacterianas así obtenidas, se preparó el ADN genómico empleando el método de precipitación con sales [véase “Practical Streptomyces Genetics”, The John Innes Foundation, (RU), Norwich, 2000].
Se digirió parcialmente el ADN genómico obtenido con la enzima de restricción MboI, y luego se trató con fosfatasa alcalina para desfosforilar el extremo terminal del ADN. Se ligó este fragmento de ADN al vector de cósmido disponible comercialmente SuperCos1 (fabricado por Stratagene Corporation) que se había sometido de antemano a digestión con la enzima de restricción XbaI, un tratamiento con fosfatasa alcalina para la desfosforilación y además digestión con la enzima de restricción BamHI. Por tanto, se preparó un vector de cósmido recombinante. Se sometió este vector de cósmido recombinante a empaquetamiento in vitro usando extractos de empaquetamiento de fago lambda MAXPLAX fabricados por Epicentre Biotechnologies. Se infectó Escherichia coli XLI-Blue MRA con los mismos para preparar la biblioteca de ADN genómico de cósmido.
(Ejemplo 2) <Estimación del gen de biosíntesis de UK-2>
Basándose en el ADN genómico preparado mediante el método descrito en el ejemplo 1, se confió la construcción de la biblioteca de parejas acopladas para el secuenciador GS FLX Titanium de Roche a Genaris, Inc. Entonces, se usó este secuenciador para determinar la secuencia. Por separado de esto, basándose en el ADN genómico, se construyó la biblioteca de fragmentos para este secuenciador. Entonces, se usó este secuenciador para determinar la secuencia. La secuencia obtenida a partir de la biblioteca de parejas acopladas y la secuencia obtenida a partir de la biblioteca de fragmentos se coensamblaron entre sí para obtener la secuencia de cóntigo y la secuencia de armazón.
UK-2 tiene un esqueleto de ácido 3-hidroxipicolínico característico. Mientras tanto, la virginiamicina tiene también un esqueleto de ácido hidroxipicolínico. Se han dado a conocer dos genes (visA, visB) implicados en la biosíntesis de virginiamicina (véase el documento no de patente 2). Por tanto, se realizó un análisis de homología entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por estos dos genes y la secuencia de aminoácidos propuesta obtenida a partir del genoma de la bacteria que produce UK-2 para examinar la existencia de genes implicados en la formación del esqueleto de ácido hidroxipicolínico. Las tablas 1 y 2 muestran el resultado obtenido.
[Tabla 1] [Tabla 2]
Nombre del
SEQ ID NO: Ubicación en la Sentido Proteína codificada por el ORF
ORF
secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 del ORF SEQ ID NO: El número de residuos de aminoácido
ORF1
2 1-681 + 3 226
ORF2
4 674-2560 - 5 628
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ORF3
6 2590-4200 - 7 536
ORF4
8 4377-4559 - 9 60
ORF5
10 4550-5686 - 11 378
ORF6
12 5800-7485 - 13 561
ORF7
14 7637-8884 + 15 415
ORF8
16 9109-9654 + 17 181
ORF9
18 9671-10201 - 19 176
ORF10
20 10302-11078 - 21 258
ORF11
22 11121-12422 - 23 433
ORF12
24 12814-16644 - 25 1276
ORF13
26 16649-26383 - 27 3244
ORF14
28 26814-27986 - 29 390
ORF15
30 28051-29112 - 31 353
ORF16
32 29275-29904 + 33 209
ORF17
34 29978-31318 + 35 446
Nombre del ORF
SEQ ID NO: Proteína conocida que tiene alta homología con la proteína codificada por el ORF Supuesta proteína funcional que va a codificarse por el ORF
Nombre de la proteína
Especie Número de registro de GenBank Homología (%)
ORF1
2 Regulador transcripcional de la familia LuxR Streptomyces Avermitilis NP_821584.1 60 Regulador transcripcional
ORF2
4 Ácido graso de cadena larga-CoA ligasa Pseudonocardia Dioxanivorans YP_004335893.1 53 Ácido graso de cadena larga-CoA ligasa
ORF3
6 Histidina amoniaco-liasa Rubrobacter Xylanophilus YP_644511.1 55 Fenilalanina/histidina amoniaco-liasa
ORF4
8 4-oxalocrotonato tautomerasa Streptomyces pristinaespiralis CBW45760.1 47 4-oxalocrotonato tautomerasa
ORF5
10 L-lisina 2aminotransferasa Streptomyces pristinaespiralis ZP_06913862.1 58 L-lisina 2aminotransferasa
ORF6
12 Ácido 3hidroxipicolínico:AMP ligasa Streptomyces Pyridomyceticus AEF33098.1 60 Ácido 3-hidroxipicolínico AMP ligasa
ORF7
14 Citocromo P450 Streptomyces Albus ZP_06593022.1 46 Citocromo P450
ORF8
16 Tioesterasa de tipo II Verrucosispora Maris YP_004406133.1 41 Tioesterasa
ORF9
18 Proteína ribosómicaserina acetiltransferasa Streptomyces Hygroscopicus ZP_07300520.1 90 Acetiltransferasa
ORF10
20 Oxidorreductasa, deshidrogenasa de cadena corta/reductasa Streptomyces Griseoflavus ZP_07314911.1 58 Deshidrogenasa de cadena corta
ORF11
22 Proteína asociada a policétido supuesta Streptomyces Ambofaciens CAJ89364.1 40 Proteína de dominio de condensación
ORF12
24 Proteína relacionada con policétido sintasa supuesta Streptomyces Ambofaciens CAJ89362.1 58 Policétido sintasa
ORF13
26 Péptido sintetasa supuesta Streptomyces Ambofaciens CAJ89363.1 52 Péptido sintetasa no ribosómica
ORF14
28 Sarcosina oxidasa Streptomyces Griseoflavus ZP_07310135.1 49 N-metiltriptófano oxidasa
ORF15
30 Oxidorreductasa dependiente de flavina Streptomyces Pyridomyceticus AEF33076.1 53 Oxidorreductasa dependiente de flavina
ORF16
32 O-metiltransferasa Mycobacterium Marinum YP_001848635.1 52 O-metiltransferasa
ORF17
34 Crotonil-CoA reductasa Streptomyces Hygroscopicus AAR32675.1 67 Crotonil-CoA reductasa
Como resultado del examen, se encontró la posición en la que estaban ubicados consecutivamente genes que tenían una alta homología con VisA y VisB como una única posición en el genoma derivado de Streptoverticillium sp. 3-7 (véase la tabla 1). Además, se encontró que genes asociados con una péptido sintetasa no ribosómica (NRPS) y una policétido sintasa (PKS) que se pensaba que eran necesarios para formar el esqueleto de UK-2 estaban ubicados cerca de estos genes (véase la tabla 2). Se esperaba que una región alrededor de los genes fuese una agrupación génica de biosíntesis de UK-2 porque los genes de metabolitos secundarios de actinobacterias forman una agrupación. Además, hay una alineación entre los genes (ORF) ubicados en la agrupación génica de biosíntesis de UK-2 y supuestas funciones de proteínas codificadas por los respectivos genes tal como sigue.
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ORF1 es un gen implicado posiblemente en la regulación de la agrupación génica de biosíntesis. ORF5, ORF6, ORF7 y ORF16 son genes implicados en la biosíntesis del esqueleto de ácido 3-hidroxipicolínico. ORF2, ORF3 y ORF17 son genes implicados en la biosíntesis de un esqueleto de ácido bencilmalónico. ORF13 es un gen implicado en la biosíntesis de un esqueleto de ácido picolínico, serina y ácido láctico. ORF11 y ORF12 son genes implicados en la biosíntesis de ácido bencilmalónico y el metabolismo de ácido picolínico, serina y ácido láctico. ORF8 es un gen implicado en la escisión de un enlace tioéster de una policétido sintasa (PKS) y el metabolismo de ácido picolínico, serina, ácido láctico y ácido bencilmalónico.
(Ejemplo 3) <Examen de la biblioteca de ADN genómico>
Se usó una parte de la secuencia de ORF5 ubicada en el sentido de 5’ de los genes de biosíntesis de UK-2 como sonda para examinar la biblioteca de ADN genómico preparada en el ejemplo 1, y se preparó mediante PCR tal como se describe a continuación.
Se llevó a cabo PCR usando el ADN genómico descrito en el ejemplo 1 como molde y oligo ADN de visA’-F: 5’-GGGGCAGCCTGCTCGGCGAG-3’ (SEQ ID NO: 36) y visA’-R: 5’-GGTGAGCTCCCCGATCAGGG-3’ (SEQ ID NO: 37) como cebadores. Se realizó la PCR usando LA Taq ADN polimerasa (fabricada por Takara Bio Inc.) como ADN polimerasa y el sistema de PCR GeneAmp 9700 de PERKIN ELMER. Se ajustó la cantidad de la disolución de reacción a 50 l mediante la adición de: 0,5 l (correspondiente a una cantidad de 0,5 g) del ADN genómico, 25 l de un tampón para reacción de concentración de dos veces que acompaña a la enzima, 2,5 l de una disolución de DMSO, 5 l de una disolución de dNTP 2,5 mM, 0,25 l de cada uno de los cebadores cuya concentración se ajustó a 100 pmol/l, 0,3 l de la enzima y 16,2 l de agua esterilizada. Se llevó a cabo la reacción tal como sigue: el pretratamiento a 95ºC durante 10 minutos; incubación en 30 ciclos que consisten cada uno en 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos; incubación adicional a 72ºC durante 5 minutos. Tras completarse la reacción, se sometió a electroforesis una parte de la disolución de reacción sobre un gel de agarosa. Como resultado, se confirmó que se amplificó específicamente un fragmento de ADN de aproximadamente 1,3 kpb. Entonces, se sometió la disolución de reacción restante a extracción con una disolución de mezcla (fenol:cloroformo:alcohol isoamílico=25:24:1, V/V) para la purificación de ácido nucleico, seguido por precipitación con etanol. Se disolvió el precipitado de nuevo en agua esterilizada, y se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa. Se cortó una banda de aproximadamente 1,3 kpb según un método convencional, y se recogió un fragmento de ADN.
Se llevó a cabo la hibridación de colonias usando el fragmento de ADN como sonda y el sistema de marcaje y detección de ADN/ARN ECL Direct (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech Inc.), y se examinaron aproximadamente 5000 colonias. Se obtuvieron varios clones positivos. Se aisló el plásmido pUK2-B44 de uno de los clones.
Además, se usó una parte del ORF13 ubicada en el sentido de 3’ de los genes de biosíntesis de UK-2 como sonda, y se preparó mediante PCR tal como se describe a continuación.
Se llevó a cabo PCR usando el ADN genómico descrito en el ejemplo 1 como molde y oligo ADN de caiCF: 5’-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3’ (SEQ ID NO: 38) y caiC-R: 5’-CGGGCTCGGTGGTGAGCAGG-3’ (SEQ ID NO: 39) como cebadores. Se realizó la PCR usando LA Taq ADN polimerasa (fabricada por Takara Bio Inc.) como ADN polimerasa y el sistema de PCR GeneAmp 9700 de PERKIN ELMER. Se ajustó la cantidad de la disolución de reacción a 50 ml mediante la adición de: 0,5 l (correspondiente a una cantidad de 0,5 g) del ADN genómico, 25 l de un tampón para reacción de concentración de dos veces que acompaña a la enzima, 2,5 l de una disolución de DMSO, 5 l de una disolución de dNTP 2,5 mM, 0,25 l de cada uno de los cebadores cuya concentración se ajustó a 100 pmol/l, 0,3 l de la enzima y 16,2 l de agua esterilizada. Se llevó a cabo la reacción tal como sigue: el pretratamiento a 95ºC durante 10 minutos; incubación en 30 ciclos que consisten cada uno en 95ºC durante 30 segundos, 59ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos y 20 segundos. Tras completarse la reacción, se sometió a electroforesis una parte de la disolución de reacción sobre un gel de agarosa. Como resultado, se confirmó que se amplificó específicamente un fragmento de ADN de aproximadamente 2,3 kpb. Entonces, se sometió la disolución de reacción restante a extracción con la disolución de mezcla descrita anteriormente para purificación de ácido nucleico, seguido por precipitación con etanol. Se disolvió el precipitado de nuevo en agua esterilizada, y se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa. Se cortó una banda de aproximadamente 2,3 kpb según un método convencional, y se recogió un fragmento de ADN.
Se llevó a cabo la hibridación de colonias usando el fragmento de ADN como sonda y el sistema de marcaje y detección de ADN/ARN ECL Direct (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech Inc.), y se examinaron aproximadamente 5000 colonias. Se obtuvieron varios clones positivos. Se aisló el plásmido pUK2-E4 de uno de los clones.
(Ejemplo 4) <Construcción del plásmido pUK2-3 que comprende la agrupación génica de biosíntesis>
Usando los plásmidos pUK2-B44 y pUK2-E4 así obtenidos que comprenden respectivamente la región en el sentido de 5’ 1 a 21531 y la región en el sentido de 3’ 16211 a 34641 de la agrupación de biosíntesis esperada, se construyó un plásmido que comprende toda la región de agrupación de biosíntesis. En primer lugar, se digirieron ambos plásmidos con las enzimas de restricción ClaI y PspXI, seguido por electroforesis sobre geles de agarosa, y se cortaron respectivamente bandas de aproximadamente 28 kpb y aproximadamente 19 kpb según un método convencional, y se recogieron fragmentos de ADN. Se ligaron los fragmentos de ADN usando el kit de ligación de ADN <Mighty Mix> (fabricado por Takara Bio Inc.) para preparar pUK2-16.
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5 A continuación, usando la tecnología de redireccionamiento descrita en [Gust, B., et al, “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States de America”, (US), 2003, vol. 100, págs. 1541-1546], se usó el plásmido pUK2-16 como vector que podía realizar transferencia por conjugación a actinobacterias. En primer lugar, se introdujo el plásmido pUK2-16 en la cepa de E. coli BW25113/pIJ790 mediante electroporación, y se obtuvo la cepa de E. coli BW25113/pIJ790/pUK2-16. Se inoculó esta cepa en 100 ml de un medio líquido LB (triptona Bacto al 1%,
10 extracto de levadura al 0,5%, cloruro de sodio al 0,5%) que contenía cloramfenicol, kanamicina y ampicilina respectivamente a concentraciones de 25 g/ml, 50 g/ml y 50 g/ml, y se cultivó a 30ºC durante la noche. Entonces, se inocularon 100 l de la disolución de cultivo en 10 ml de un medio SOB (triptona Bacto al 2%, extracto de levadura al 0,5%, cloruro de sodio al 0,05%, cloruro de potasio al 0,0186%) preparado en un tubo de ensayo de 65 ml que contenía cloramfenicol, kanamicina, ampicilina y L-arabinosa respectivamente a concentraciones de
15 25 g/ml, 50 g/ml, 50 g/ml y 10 mM. Se cultivó con agitación el cultivo resultante a 30ºC durante 4 horas. Se recogieron las células bacterianas de toda la disolución de cultivo, se lavó dos veces con una disolución de glicerina al 10% enfriada con hielo y se resuspendió hasta 100 l de la disolución de glicerina al 10% como células para la electroporación. Mientras tanto, se purificó un fragmento de SspI de 5,2 kb que contenía oriT, attP, IntC31 y un gen de resistencia a apramicina derivado del plásmido pMJCOS1 (John Innes Centre (Norwich)). Se transfirieron el
20 fragmento de ADN (aproximadamente 100 ng) y 50 l de las células así preparadas a una cubeta ya enfriada con hielo con un hueco de 2 mm, y se sometió a electroporación (usando el instrumento Electro Cell Manipulator 600: fabricado por BM Equipment Co., Ltd.). Tras el tratamiento, se añadió 1 ml de un medio líquido LB enfriado a la disolución resultante, que se permitió que reposara a 37ºC durante 1 hora para el cultivo. Entonces se aplicó a un medio de agar LB que contenía ampicilina y apramicina, y se cultivó a 37ºC durante la noche. Se cultivó la cepa
25 hecha crecer en un medio líquido LB que contenía ampicilina y apramicina, y se aisló el plásmido pUK2-3. Este pUK2-3 es un plásmido que puede realizar transferencia por conjugación a actinobacterias, y que tiene oriT, attP, IntC31 y el gen de resistencia a apramicina en la parte de vector y toda la región que se espera que sea la agrupación de biosíntesis de UK-2.
(Ejemplo 5) <Construcción de un vector deficiente en genes de biosíntesis>
30 Se preparó una cepa con genes alterados deficiente en aproximadamente 7,5 kpb correspondientes a partes de ORF12 y ORF13 a partir del ADN genómico de Streptoverticillium sp. 3-7 mediante el método descrito a continuación.
Se llevó a cabo PCR usando el ADN genómico descrito en el ejemplo 1 como molde y oligo ADN de caiCF: 5’-GCGCTCGTACGCCTCGCTGAT-3’ (SEQ ID NO: 38) y 41c29-R: 5’-GTCCGTGGCGCCGCCGGATT-3’ (SEQ ID NO: 35 40) como cebadores. Se realizó la PCR usando LA Taq ADN polimerasa (fabricada por Takara Bio Inc.) como ADN polimerasa y el sistema de PCR GeneAmp 9700 de PERKIN ELMER. Se ajustó la cantidad de la disolución de reacción a 50 l mediante la adición de: 0,5 l (correspondiente a una cantidad de 0,5 g) del ADN genómico, 25 l de un tampón para reacción de concentración de dos veces que acompaña a la enzima, 2,5 l de una disolución de DMSO, 5 l de una disolución de dNTP 2,5 mM, 0,25 l de cada uno de los cebadores cuya concentración se ajustó 40 a 100 pmol/l, 0,3 l de la enzima y 16,2 l de agua esterilizada. Se llevó a cabo la reacción tal como sigue: el pretratamiento a 95ºC durante 10 minutos; incubación en 30 ciclos que consisten cada uno en 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 7 minutos. Tras completarse la reacción, se sometió a electroforesis una parte de la disolución de reacción sobre un gel de agarosa. Como resultado, se confirmó que se amplificó específicamente un fragmento de ADN de aproximadamente 7,5 kpb. Se insertó el fragmento de ADN en
45 un vector de plásmido pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen Corporation) según el protocolo adjunto al mismo. De ese modo, se obtuvo el plásmido TOPO-41c29.
Posteriormente, se insertó un gen de resistencia apramicina en el fragmento insertado del plásmido TOPO-41c29 para preparar el plásmido TOPO-41c29-Am tal como sigue.
Se digirió de manera doble el plásmido pIJ773 [Gust, B., et al., “Proceedings of the National Academy of Sciences de
50 of United States of America”, (US), 2003, vol. 100, págs. 1541-1546] con HindIII y EcoRI, seguido por electroforesis sobre un gel de agarosa. Entonces, se cortó un fragmento de ADN según un método convencional y se recogió. Por tanto, se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1,3 kb que comprende el gen de resistencia a apramicina diana. Se llevó a cabo PCR usando este fragmento como molde y dos tipos de cebadores sintéticos de 41c30-apraF: 5’-GTCACCGTCCCCGCCTACGGCGACGGCGTCGTCCTGGTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’
55 (SEQ ID NO: 41) y 41c30-apraR: 5’-GGTCGCGGGCGAAGGCGTAGCCGGGCAGGTCGGGCAGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 42). Se realizó la PCR usando LA Taq ADN polimerasa (fabricada por Takara Bio Inc.) como ADN polimerasa y el sistema de PCR GeneAmp 9700 de PERKIN ELMER.
Se ajustó la cantidad de la disolución de reacción a 50 l mediante la adición de: 0,5 l (correspondiente a una cantidad de 0,5 g) del ADN genómico, 25 l de un tampón para reacción de concentración de dos veces que acompaña a la enzima, 2,5 l de una disolución de DMSO, 5 l de una disolución de dNTP 2,5 mM, 0,25 l de cada uno de los cebadores cuya concentración se ajustó a 100 pmol/l, 0,3 l de la enzima y 16,2 l de agua esterilizada. Se llevó a cabo la reacción tal como sigue: el pretratamiento a 94ºC durante 2 minutos; incubación en 10 ciclos que
imagen23
5 consisten cada uno en 94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos; entonces, incubación en 15 ciclos que consisten cada uno en 94ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos; un reacción adicional a 72ºC durante 5 minutos. Tras completarse la reacción, se sometió a electroforesis una parte de la disolución de reacción sobre un gel de agarosa. Como resultado, se confirmó que se amplificó específicamente un fragmento de ADN de aproximadamente 1,4 kpb.
10 A continuación, se introdujo TOPO-41c29 en E. coli BW25113/pIJ790 [Gust, B., et al., “Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, (US), 2003, vol. 100, págs. 1541-1546] para obtener la cepa de E. coli BW25113/pIJ790/TOPO-41c29. Se inoculó esta cepa en 100 ml de un medio líquido LB que contenía cloramfenicol, kanamicina y ampicilina respectivamente a concentraciones de 25 g/ml, 25 g/ml y 50 g/ml, y se cultivó a 30ºC durante la noche. Entonces, se alimentaron 10 ml de un medio SOB a un tubo de ensayo de 65 ml
15 complementado con cloramfenicol, kanamicina, ampicilina y L-arabinosa respectivamente a concentraciones de 25 g/ml, 25 g/ml, 50 g/ml y 10 mM. A esto, se transfirieron 100 l de una disolución de cultivo de la cepa de E. coli BW25113/pIJ790/TOPO-41c29 cultivada durante la noche, y se cultivó con agitación a 30ºC durante 4 horas. Se centrifugó toda la disolución de cultivo a 3000 rpm a 4ºC durante 5 minutos para recoger las células bacterianas que entonces se suspendieron en 10 ml de una disolución de glicerina al 10% enfriada con hielo. Tras repetirse esta
20 operación, se resuspendieron las células bacterianas resultantes en 100 l de una disolución de glicerina al 10% enfriada. A continuación, se recogieron 50 l de la suspensión de células bacterianas en un tubo Eppendorf al que se le añadieron 5 l de una disolución de aproximadamente 1,4 kb de un fragmento de ADN que contenía el gen de resistencia a apramicina descrito anteriormente derivado a partir de pIJ773. Se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación ya enfriada con hielo con un hueco de 2 mm (BM6200: fabricada por BM Equipment Co., Ltd.). Se
25 realizó la electroporación usando el instrumento Electro Cell Manipulator 600 (fabricado por BM Equipment Co., Ltd.) en condiciones de 12,5 kV, 25 mF y 128 . Tras el tratamiento, se añadió 1 ml de un medio líquido LB ya enfriado con hielo a las células bacterianas, que entonces se permitió que reposaran a 37ºC durante 1 hora para el cultivo. Se aplicó esto a un medio de agar LB complementado con ampicilina y apramicina cada una a una concentración de 50 g/ml. Se cultivó la disolución resultante a 37ºC toda la noche para obtener una cepa que tenía resistencia a
30 tanto de ampicilina como apramicina. Se cultivó esta cepa en un medio líquido LB complementado con ampicilina y apramicina cada una a una concentración de 50 g/ml. Por tanto, se aisló el plásmido TOPO-41c29-Am.
(Ejemplo 6) <Creación de cepas deficientes en genes de biosíntesis>
Se introdujo el plásmido TOPO-41c29 en la cepa de E. coli ET12567/pUZ8002 [“Practical Streptomyces Genetics” The John Innes Foundation, (RU), Norwich, 2000] según un método convencional para obtener E. coli
35 ET12567/pUZ8002/TOPO-41c29.
Se conjugó Streptoverticillium con E. coli ET12567/pUZ8002/TOPO-41c29 tal como sigue. En primer lugar, se inoculó la cepa de Streptoverticillium en 10 ml de un medio líquido (S#1) [Ueki, M, et al, “The Journal of Antibiotics”, (Japón), 1996, vol. 49, págs. 639-643] preparado en un tubo de ensayo de 65 ml, y se cultivó a 30ºC durante 24 horas. Se aplicó la disolución resultante a un medio de agar MS (harina de soja al 2%, manitol al 2%, agar al 2%), y
40 se cultivó a 30ºC durante 2 días. Tras el cultivo, se recogieron los micelios raspando con 3 ml de glicerol al 20% para preparar una disolución de micelio huésped.
Tras recogerse las células bacterianas mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos, se suspendieron las células bacterianas en 3 ml de una disolución de glicerina al 20%. Mientras tanto, se cultivó E. coli ET12567/pUZ8002/TOPO-41c29-Am a 37ºC durante 18 horas en un medio líquido LB complementado con 45 ampicilina y apramicina cada una a una concentración de 50 g/ml. Entonces, se transfirió 1 ml de la disolución de cultivo a 100 ml de un medio líquido LB (que contenía ampicilina y apramicina cada una a una concentración de 50 g/ml), y se cultivó a 37ºC durante 4 horas. Posteriormente, se centrifugaron 50 ml de la disolución de cultivo a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger las células bacterianas. Se suspendieron las células bacterianas en 20 ml de un medio líquido LB. Tras repetirse esta operación dos veces, se suspendieron las células bacterianas en 2 ml de
50 un medio líquido LB.
A continuación, se combinaron entre sí 100 l de la suspensión de células de Streptoverticillium y 100 l de una suspensión de células bacterianas de E. coli ET12567/pUZ8002/cosmid203-7 en un tubo de 1,5 ml, y se centrifugó para recoger células bacterianas. Tras suspender en 100 l de una disolución de glicerina al 20%, se aplicó esto a un medio de agar MS que tenía un volumen de 20 ml y que contenía MgCl2 10 mM. Tras el cultivo a 30ºC durante 18 55 horas, se dispuso sobre el mismo 1 ml de agua esterilizada que contenía 400 g de apramicina y 1500 g de ácido nalidíxico. Tras cultivarse a 30ºC durante 5 días, se sometieron colonias de Streptoverticillium hechas crecer sobre el medio de agar a cultivo puro y se cultivaron a 30ºC durante 2 días en un medio de agar 1/2 MS (agar: 2%, manitol: 1%, harina de soja: 1%, MgCl2 10 mM) complementado con 250 g/ml de apramicina y 250 g/ml de kanamicina. Creció una colonia en cualquier placa y se subcultivó durante varios pases mediante: inoculación en un medio S#1,
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seguido por cultivo a 30ºC durante 24 horas, inoculación en un medio YEME modificado (10 ml en un tubo de ensayo de 65 ml), seguido por cultivo con agitación a 30ºC durante 1 día, e inoculación adicional de 1 ml del cultivo resultante en otro medio YEME modificado nuevo (50 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml). Tras repetirse esta operación cinco veces, se diluyó el cultivo resultante de una manera tal como para obtener un número apropiado de
5 células bacterianas vivas. Se aplicó esta disolución de cultivo a un medio de agar 1/2 MS que contenía 250 g/ml de apramicina, y se cultivó a 30ºC durante 4 días. Se replicó una colonia hecha crecer así en un medio de agar 1/2 MS complementado con 250 g/ml de apramicina y 250 g/ml de kanamicina. Se seleccionaron dos cepas susceptibles a kanamicina (cepa D1, cepa D2) que no crecían en un medio que contenía kanamicina pero que crecían en un medio que contenía apramicina.
10 Se prepararon los ADN genómicos de las dos cepas obtenidas, y se llevó a cabo una reacción PCR usando una combinación de cebadores de 41c30F4: 5’-CGTGACCGAGGTGGCGCG-3’ (SEQ ID NO: 43) y 41c30RR2: 5’-GTCGTCGGATGCGCCGTGCG-3’ (SEQ ID NO: 44). Se confirmó que las dos cepas eran cepas alteradas tal como se diseñaron porque no se obtuvo un fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 0,5 kpb.
(Ejemplo 7) <Cultivo de cepas deficientes en genes de biosíntesis, y cuantificación de UK-2A en disolución de 15 cultivo>
Las cepas alteradas, cepa D1 y cepa D2, se inocularon cada una en 50 ml de un medio S#1 [Ueki, M, et al, “The Journal of Antibiotics” (Japón), 1996, vol. 49, págs. 639-643] preparado en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, y se cultivaron con agitación a 30ºC durante 24 horas. Entonces, se inoculó 1 ml de la disolución de cultivo en un medio de producción, y se cultivó con agitación a 30ºC durante 4 días. Entonces, se añadieron 4 ml de acetona a 1 ml de la 20 disolución de cultivo resultante para extraer de ese modo UK-2A que entonces se filtró para obtener un líquido de extracción. De éste, se sometieron 5 l a análisis de HPLC. En el análisis de HPLC, se usó el sistema de HPLC LC2010C (fabricado por Shimadzu Corporation) para el análisis. Como condiciones de análisis, la columna era Inertsil ODS-3 4,6X250 mm, la fase móvil era acetonitrilo:agua:ácido fosfórico= 60:40:0,1, la velocidad de flujo era de 1,1 ml/min, la temperatura de la columna era de 40ºC y la longitud de onda de UV era de 340 nm. Se comparó el
25 patrón obtenido con el del patrón de referencia de UK-2A. Se identificó el pico derivado de UK-2A. Basándose en el área del mismo, se cuantificó UK-2A.
Al mismo tiempo, se llevaron a cabo el mismo cultivo y cuantificación de UK-2A en una disolución de cultivo también para Streptoverticillium sp. 3-7, que era la cepa original de los transformantes. Como resultado, la productividad de UK-2A por las cepas D1 y D2 era de 0 g/ml.
30 (Ejemplo 8) <Creación de transformante con agrupación génica de biosíntesis introducida>
Se introdujo pUK2-3 construido en Streptoverticillium sp. 3-7 según un método usado generalmente para actinobacterias [“Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, (RU), Norwich, 2000, págs. 311-338]. En primer lugar, se introdujo el plásmido pUK2-3 en la cepa de E. coli ET12567/pUZ8002 mediante electroporación según un método convencional para obtener E. coli ET12567/pUZ8002/pUK2-3. Se cultivó esta cepa a 37ºC durante 35 18 horas en un medio líquido LB complementado con cloramfenicol, kanamicina y apramicina respectivamente a concentraciones de 25 g/ml, 50 g/ml y 50 g/ml. Entonces, se transfirió 1 ml de la disolución de cultivo a 100 ml de un medio líquido LB (que contenía cloramfenicol, kanamicina y apramicina respectivamente a concentraciones de 25 g/ml, 25 g/ml y 50 g/ml), y se cultivó a 37ºC durante 4 horas. Posteriormente, se centrifugaron 50 ml de la disolución de cultivo a 3000 rpm durante 5 minutos para recoger las células bacterianas. Se suspendieron las células
40 bacterianas en 50 ml de un medio líquido LB. Tras repetirse esta operación dos veces, se suspendieron las células bacterianas en 100 l de un medio líquido LB.
Mientras tanto, se aplicó Streptoverticillium sp. 3-7 a un medio de agar MS, y se cultivó a 30ºC durante 2 días. Tras el cultivo, se rasparon los micelios con 1 ml de glicerol al 20% para preparar una disolución de micelio huésped.
A continuación, se mezclaron entre sí 500 l de la disolución de micelio huésped y 500 l de la disolución de
45 Escherichia coli que comprendía el plásmido pUK2-3 preparadas tal como se describió anteriormente, y se recogieron las células bacterianas. Entonces, se aplicaron las células bacterianas a un medio de agar MS que se había diluido mediante la adición de MgCl2 10 mM de una manera tal como para llevar la concentración final a 10 mmol/l. Tras el cultivo a 30ºC durante 20 horas, se dispusieron sobre el mismo 0,5 ml de agua esterilizada que contenía 6 mg de apramicina y 0,5 mg de ácido nalidíxico. Tras cultivar adicionalmente a 30ºC durante 5 días, se
50 obtuvo un transformante como cepa resistente a apramicina.
(Ejemplo 9) <Cultivo del transformante con genes introducidos, y cuantificación de UK-2A en disolución de cultivo>
Se cultivó el transformante con genes introducidos mediante el método descrito en el ejemplo 7. Como resultado, tal como se muestra en la tabla 3, se mejoró la productividad de UK-2A del transformante con genes introducidos de 58 a 77 veces en comparación con la de la cepa original.
55 [Tabla 3]
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Cepas
Productividad en disolución de cultivo (g/ml) Productividad relativa
UK-2A
Cepa original (3-7)
2 1
Transformante 1 (3-7-1)
116 58
Transformante 2 (3-7-2)
153 77

(Ejemplo 10) <Cultivo de transformante con genes introducidos, y cuantificaciones de UK-2A, UK-2B, y suma de UK2C y UK-2D en disolución de cultivo>
Se cultivó el transformante con genes introducidos mediante el método descrito en el ejemplo 7. Específicamente, se añadieron 4 ml de acetona a 1 ml de la disolución de cultivo resultante para extraer de ese modo UK-2A, UK-2B, UK5 2C y UK-2D que entonces se filtraron para obtener un líquido de extracción. De éste, se sometieron 5 l a análisis de HPLC. En el análisis de HPLC, se usó un sistema de disolución de HPLC (fabricado por Shimadzu Corporación) para el análisis. Como condiciones del análisis, la columna era Inertsil ODS-3 4,6X150 mm; la fase móvil era una disolución obtenida disolviendo 7,8 g de dihidrogenofosfato de sodio dihidratado en aproximadamente 800 ml de agua, ajustando el pH de la disolución resultante a 4,0 usando ácido fosfórico, añadiendo agua a la misma para 10 preparar 1000 ml de una disolución acuosa de ácido fosfórico y añadiendo 650 ml de acetonitrilo para la cromatografía de líquidos a 350 ml de la disolución acuosa de ácido fosfórico; la velocidad de flujo era de 1,0 ml/min; la temperatura de la columna era de 40ºC; y la longitud de onda de UV era de 230 nm. Se comparó el patrón obtenido con los de los patrones de referencia de UK-2A, UK-2B, y UK-2C y UK-2D. Se identificaron los picos respectivos derivados de UK-2A, UK-2B, UK-2C y UK-2D. Basándose en las áreas de los mismos, se determinaron
15 la cantidad de UK-2A, la cantidad de UK-2B, y la suma de UK-2C y UK-2D.
Como resultado, tal como se muestra en la tabla 4, las productividades de UK-2A, UK-2B, y la suma de UK-2C y UK2D del transformante con genes introducidos se mejoraron respectivamente de 37 a 57 veces, de 10 a 11 veces y de 12 a 13 veces en comparación con las de la cepa original.
[Tabla 4]
Cepas
UK-2A UK-2 B UK-2C y UK-2D (suma)
Productividad en disolución de cultivo (g/ml)
Productividad relativa Productividad en disolución de cultivo (g/ml) Productividad relativa Productividad en disolución de cultivo (g/ml) Productividad relativa
Cepa (3-7)
10 1 1 1 7 1
Transformante (3-7-1)
368 37 11 11 86 12
Transformante (3-7-2)
565 57 10 10 89 13
20 (Ejemplo 11) <Cuantificación del número de copias de la agrupación génica de biosíntesis de UK-2 en el
transformante> Se prepararon ADN genómicos de las dos cepas del transformante que se confirmó en el ejemplo 9 que tenía la productividad de UK-2 mejorada y Streptoverticillium sp. 3-7, que era la célula huésped, mediante el método descrito en el ejemplo 1. Se llevaron a cabo reacciones de PCR usando los ADN genómicos como moldes y el sistema de
25 PCR en tiempo real StepOnePlus (fabricado por Applied BioSystems Inc.) según el protocolo adjunto al mismo. Se
cuantificaron los fragmentos amplificados así obtenidos. La tabla 5 muestra el resultado obtenido. Obsérvese que, en las reacciones PCR, se diseñó, sintetizó y usó el siguiente conjunto de cebadores para amplificar una región en la agrupación génica de biosíntesis de UK-2 introducida.
UK-2 F2 (RT): 5’-GCACCTTCATGTCCGGGTTG-3’ (SEQ ID NO: 45) 30 UK-2 R2 (RT): 5’-ATCGCCGCGTACACCATGAC-3’ (SEQ ID NO: 46).
Además, se diseñó, sintetizó y usó el siguiente conjunto de cebadores como control interno para amplificar una región distinta de la agrupación génica de biosíntesis de UK-2. cont F1 (RT): 5’-CGAAGGTCCGGTTGATGGTG-3’ (SEQ ID NO: 47) Cont R1 (RT): 5’-ATCGCTGCGACACCCTGGAG-3’ (SEQ ID NO: 48)
35 [Tabla 5]
Cepas
Número de copias
Cepa original (3-7)
1,00
Transformante (3-7-1)
2,35
Transformante (3-7-2)
2,08

Claims (12)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Ácido nucleico aislado que induce la biosíntesis de UK-2 y mejora la productividad de UK-2, el ácido nucleico es al menos un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (q):
    (a)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 2;
    (b)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 4;
    (c)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 6;
    (d)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 20 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 8;
    (e)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 10;
    (f)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 12;
    (g)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 14;
    (h)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 16;
    (i)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 18;
    (j)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 20;
    (k)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 22;
    (l)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 24;
    (m)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 26;
    (n)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 28;
    (o)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 30;
    (p)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 32; y
    (q)
    un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, un ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 en la que se sustituyen, delecionan, añaden y/o insertan de uno a 50 aminoácidos, un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 34.
    imagen2
  2. 2.
    Ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende todos los ácidos nucleicos de (a) a (q).
  3. 3.
    Ácido nucleico según la reivindicación 2, que comprende la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1.
  4. 4.
    Vector en el que se inserta el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para inducir la biosíntesis de UK-2 y mejorar la productividad de UK-2.
  5. 5.
    Método para determinar la productividad de UK-2, que comprende detectar, en una bacteria de prueba, la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de bases del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una secuencia de bases complementaria a la secuencia.
  6. 6.
    Método según la reivindicación 5, en el que el método para detectar la presencia del ácido nucleico es un
    método de PCR.
  7. 7.
    Método según la reivindicación 6, en el que el método de PCR es un método en el que el ácido nucleico se amplifica usando un cebador que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 45 y un cebador que comprende una secuencia de bases de SEQ ID NO: 46.
    imagen3
    5 8. Bacteria en la que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2 introduciendo el vector según la reivindicación 4.
  8. 9.
    Transformante bacteriano en el que se induce la biosíntesis de UK-2 y se mejora la productividad de UK-2, y en el que se introduce el ácido nucleico según la reivindicación 1 en el genoma del mismo.
  9. 10.
    Transformante bacteriano en el que se introducen una o dos o más copias de un ácido nucleico que
    10 comprende una secuencia de bases del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 por célula.
  10. 11. Bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que es cualquiera de entre Streptoverticillium, Streptomyces, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levaduras, hongos filamentosos y Corynebacterium glutamicum.
    15 12. Método para producir UK-2, que comprende la etapa de:
    cultivar la bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y recoger UK-2 de un cultivo de la bacteria.
  11. 13. Método para producir un derivado de UK-2, que comprende las etapas de: cultivar la bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y recoger UK-2 de un cultivo de la 20 bacteria; y
    sintetizar un derivado de UK-2 representado por cualquiera de las siguientes fórmulas (1) a partir de la UK-2 recogida [Fórm. quím. 1]
    imagen4
    25 [en la fórmula (1),
    R representa cualquier grupo elegido entre 2 metilpropanoílo, un grupo trans-2-metil-2-butenoílo, un grupo 3-metilbutanoílo y un grupo 2-metilbutanoílo,
    R1 representa cualquier grupo elegido entre alquilo C1-6, un grupo bencilo, un grupo alquilcarbonilo C1-10 (el grupo alquilcarbonilo C1-10 puede estar sustituido con cualquier grupo elegido entre carboxilo, un grupo
    30 benciloxicarbonilo, un grupo alquiloxicarbonilo C1-4 y grupo benciloxicarbonilamino), un grupo benzoílo, un grupo alquiloxicarbonilo C1-4, un grupo alquiloxicarbonilo (C1-4)-alquilo (C1-4), un grupo benciloxicarbonilalquilo (C1-4) puede estar sustituido con un grupo nitro, un grupo alquilsulfonilo C1-6, un grupo dialquil (C1-6)-fosforilo, un grupo difenilfosforilo y un sustituyente representado por la siguiente fórmula (2);
    35 [Fórm. quím. 2]
    imagen5
    (en la fórmula (2), Q se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 y un ciclopropilo, M se selecciona del grupo que consiste en H, CH3, CH2CH3, CF3, Ph, CH=CH2 y un ciclopropilo, T se selecciona del grupo que consiste en O, OC(O), OC(O)O, S, SC(O), SC(O)O y un sustituyente
    representado por la siguiente fórmula (3); [Fórm. quím. 3]
    imagen6
    G se selecciona del grupo que consiste en H, grupo alquilo C1-6, un grupo alquiloxi C1-6-alquilo C1-6, un
    10
    grupo alquenilo C2-6, un grupo alquinilo C2-6, un grupo cicloalquilo C3-6, un grupo arilo y un grupo heteroarilo,
    G y M pueden formar un anillo de isobenzofurano que tiene opcionalmente un grupo oxo,
    M y Q pueden formar un sistema carbocíclico de 3-8 miembros.].
  12. 14.
    Método para producir un derivado de UK-2A, que comprende las etapas de:
    cultivar la bacteria según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y recoger UK-2A de un cultivo de la
    15
    bacteria; y
    sintetizar un derivado de UK-2A representado por cualquiera de las siguientes fórmulas (4) a (7) a partir de
    la UK-2A recogida.
    [Fórm. quím. 4]
    imagen7
    [Fórm. quím. 5]
    imagen8
    [Fórm. quím. 6]
    [Fórm. quím. 7]
    imagen9
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