CN115261291B - 一种生产uk 2a的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产UK 2A的基因工程菌及其制备方法和应用。一种生产UK 2A的基因工程菌，其为在白色链霉菌(Streptomyces albus)中表达包含如SEQ ID NO:1所示的生物合成基因簇的基因工程菌。本发明通过在白色链霉菌中导入UK 2A生物合成基因簇的表达载体，证实了UK 2A进行外源表达的可行性，并获得了含UK 2A生物合成基因簇的白色链霉菌BL‑UK‑20，且该白色链霉菌BL‑UK‑20能相对较高且稳定的表达UK 2A，在本发明一最佳实施方案中，UK 2A的产量可达1000mg/L以上。

Description

一种生产UK 2A的基因工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于生物发酵领域，具体涉及一种生产UK 2A的基因工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

UK 2A是一种大环内酯类抗生素，其化学式结构为C₂₆H₃₀N₂O₉，CAS号为167173-85-5，相对分子质量为514。1996年，Ueki等从Streptomycin sp.517-02的发酵液中分离得到4种九元双内酯结构的UK-2化合物，包括UK 2A、B、C、D，其中UK 2A为主要成分。由于其结构的不稳定性，陶氏益农公司联合日本明治制药株式会社开发了一种甲基醚取代的衍生物Fenpicoxamid(产品名Inatreq)，一种吡啶酰胺类杀菌剂，主要作用于农作物的真菌感染。

目前对提高UK 2A产量的研究包括：Ueki M等人通过发酵获得UK-2产物产量最高约70mg/L(Ueki M,Abe K,Hanafi M,et al.UK-2A,B,C and D,Novel AntifungalAntibiotics from Streptomyces sp.517-02.I.Fermentation,Isolation,andBiological Properties[J].The Journal of Antibiotics 49(7):639-643.)；Kobayashi等人通过对UK 2A产生菌中导入UK 2A生物合成基因簇，使UK2A产量提高10-60倍，最高产量565mg/L(Kobayashi,K.,Sumida,N.,and Yanai,K.(2016)UK-2biosynthetic gene andmethod for improving UK-2 productivity using the same.US9771606B2.)。

但目前的研究中通过微生物发酵的产量还不高，无法满足工业化生产的需求。

发明内容

为了解决目前通过微生物发酵生产UK 2A产量不高的问题，本发明提供一种生产UK 2A的基因工程菌及其制备方法和应用。本发明使用的出发菌白色链霉菌本身不产UK2A，但本发明的基因工程菌证实了UK 2A进行外源表达的可行性，并且在本发明一最佳实施方案中，UK 2A的产量可达1000mg/L以上。

本发明第一方面提供一种生产UK 2A的基因工程菌，其为在白色链霉菌(Streptomyces albus)中表达包含如SEQ ID NO:1所示序列的生物合成基因簇的基因工程菌；所述UK 2A的CAS号为167173-85-5。

所述白色链霉菌较佳地为白色链霉菌(Streptomyces albus)ATCC3004。

在某一较佳实施方案中，通过将含有所述生物合成基因簇的质粒导入所述白色链霉菌中得到所述基因工程菌。

所述质粒较佳地包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

本发明第二方面提供一种如本发明第一方面所述的基因工程菌的制备方法，其包括将含有所述生物合成基因簇的质粒导入所述白色链霉菌中。

所述质粒优选包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

在某一较佳实施方案中，通过接合转移将含有所述生物合成基因簇的质粒导入所述白色链霉菌中。

本发明第三方面提供一种发酵生产UK 2A的方法，其包括将如本发明第一方面所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养。

所述发酵培养基较佳地包括90g/L-130g/L的葡萄糖、20g/L-50g/L的豆粕粉、5g/L-10g/L的柠檬酸三铵、5g/L-10g/L的硫酸铵、3g/L-7g/L的酵母提取物、1g/L-3g/L的CaCO₃和0.5g/L-2g/L的NaCl。

在某一较佳实施方案中，所述葡萄糖的浓度为90g/L。

在某一较佳实施方案中，所述豆粕粉的浓度为35g/L。

在某一较佳实施方案中，所述柠檬酸三铵的浓度为5g/L。

在某一较佳实施方案中，所述硫酸铵的浓度为5g/L。

在某一较佳实施方案中，所述酵母提取物的浓度为5g/L。

在某一较佳实施方案中，所述CaCO₃的浓度为2g/L。

在某一较佳实施方案中，所述NaCl的浓度为1g/L。

本发明第四方面提供一种如本发明第一方面所述的基因工程菌在制备UK 2A中的应用。

所述基因工程菌表达所述生物合成基因簇的方式可为本领域常规，例如：同源重组到基因组中进行表达或者在质粒上表达。

本发明的积极进步效果在于：

本发明通过在白色链霉菌中导入UK 2A生物合成基因簇的表达载体，证实了UK 2A进行外源表达的可行性，并获得了含UK 2A生物合成基因簇的白色链霉菌BL-UK-20，且该白色链霉菌BL-UK-20能相对较高且稳定的表达UK 2A。在本发明一最佳实施方案中，UK 2A的产量可达1000mg/L以上。

附图说明

图1为BAC-BH质粒图谱，其为在pLC01质粒中插入生物合成基因簇的上下游片段。

图2为BAC-UK-簇质粒图谱，其中UK序列为UK 2A生物合成基因簇的序列。

图3为BL-UK-2A高效液相图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 BAC-BH、BAC-UK-CU质粒的构建

1.BAC-BH质粒的构建

通过全基因组测序获取菌种UK-1(即Streptomycin sp.517-02)的基因组信息，通过BLAST进行序列比较(将生物合成基因簇以及其周围部分序列约50Kb的片段同GenBank数据库进行同源性比对)，获得UK 2A生物合成基因簇序列(SEQ ID NO:1)。菌种UK-1参考文献Ueki M,Abe K,Hanafi M,et al.UK-2A,B,C and D,Novel Antifungal Antibiotics fromStreptomyces sp.517-02.I.Fermentation,Isolation,and Biological Properties[J].The Journal of Antibiotics 49(7):639-643.获取。用细菌基因组提取试剂盒提取基因组。利用基因簇上下游序列设计扩增上游引物UK-up-F/R(如SEQ ID NO:4和5所示)、下游引物UK-down-F/R(如SEQ ID NO:6和7所示)，通过PCR扩增扩增得到UK 2A生物合成基因簇的上下游片段，然后使用UK-up及UK-down两条同源臂通过重叠PCR将两条同源臂连接，上下游同源臂之间包含有一个酶切位点PmeI。最后将重叠PCR产物分别与EcoRI/SwaI酶切过的pLC01质粒(序列如SEQ ID NO:18所示)通过重组连接起来，即可得到捕获质粒pBAC-BH(其图谱如图1所示)。利用限制性内切酶PmeI对该捕获质粒进行酶切线性化，通过琼脂糖凝胶电泳回收得到线性化的捕获质粒。相关引物序列见表1。

表1引物序列

2.BAC-UK-CU质粒的构建

选择基因簇两端合适的gRNA位点，设计gRNA引物gRNA-UK-down和gRNA-UK-up(如SEQ ID NO:2和3所示)，PCR扩增并体外转录gRNA，gRNA引导CAS9(金斯瑞)在37℃金属浴过夜酶切，回收基因簇DNA片段，并与线性化的捕获质粒BAC-BH在酵母原生质体中同源重组，设计5对引物，up臂和簇段一对(如SEQ ID NO:8和9所示)，簇中间三对(如SEQ ID NO:10-15所示)，簇段和down臂端一对(如SEQ ID NO:16和17所示)，挑取酵母转化子PCR验证，确定阳性酵母单菌落，液体培养基培养，试剂盒抽提获得BAC-UK-CU质粒(其图谱见图2)。相关引物的序列见表1。

酵母原生质体的制备参考Li L,Wei K,Liu X,et al.aMSGE:advanced multiplexsite-specific genome engineering with orthogonal modular recombinases inactinomycetes[J].Metabolic Engineering,2019,52:153-167.的记载，具体步骤为：提前将保存于-80℃的酿酒酵母(S.cerevisiae)VL6-48在YPD固体培养基上活化，30℃培养3-4天；挑取单菌落接种至YPD液体培养基30℃过夜培养，第二天早上将菌液再次转接于50mL的YPD液体培养基中，使初始OD600约为0.2，继续30℃摇床培养3-4h，检测OD600处于0.6-1；4℃-1000×g，离心5min，弃上清；加30mL无菌去离子水轻轻上下颠倒悬浮后，4℃-2000×g，离心5min，弃上清；加20mL 1M山梨醇悬液，4℃-2000×g，离心5min，弃上清；加入20mL SPE溶液轻轻上下颠倒悬浮后，加入20μLZymolyase-20T，40μLβ-巯基乙醇，于30℃温育30min，每隔5min需轻轻摇晃溶液，4℃-570×g，离心10min，弃上清；加45mL 1M山梨醇轻轻上下颠倒混匀后，4℃-570×g，离心10min，弃上清；加45mL 1M STC溶液轻轻上下颠倒悬浮后，4℃-570×g，离心10min，尽量弃去上清，得到酵母原生质体。

实施例2 BL-UK-20工程菌株的构建

将已构建好的质粒BAC-UK-CU电转化到EPI300感受态(Epicentre)中，挑单菌落于LB液体培养基37℃过夜培养后，利用试剂盒提取质粒再转化到ET12567感受态(生工生物工程(上海)股份有限公司)中，然后通过接合转移的方式将其导入白色链霉菌Streptomycesalbus ATCC3004中，菌种来源于BioVector NTCC典型培养物保藏中心。挑选接合子并划线于固体平板上(含萘啶酮酸：50μg/mL，安普霉素：50μg/mL)，于28℃培养箱中培养5天，挑取单菌落PCR验证质粒上的Apr抗性基因，从而得到含有UK2A生物合成基因簇的工程菌株BL-UK。斜面培养7天后转接种子培养基(葡萄糖：30g/L，豆粕粉：25g/L，可溶性淀粉：10g/L，大豆蛋白胨：3g/L，酵母提取物：3g/L，CaCO₃：2g/L，NaCl：1g/L)，种子培养2天后，转接发酵(发酵培养基组成为：葡萄糖90g/L，酵母提取物5g/L，豆粕粉35g/L，CaCO₃2g/L，NaCl 1g/L)，发酵4天后，得到了UK 2A生物合成基因簇在白色链霉菌中的发酵数据，发酵实验结果表明(如图3中BL-UK-2A高效液相图谱所示)，UK 2A生物合成基因簇在白色链霉菌中成功表达，获得工程菌株BL-UK-20，UK 2A产量达到745mg/L。

实施例3 TK-23-UK工程菌株的构建

将BAC-UK-CU电转化到EPI300感受态中，挑取单菌落于LB液体培养基37℃过夜培养后，用试剂盒抽提质粒再转化到ET12567感受态中，然后通过接合转移的方式将其导入变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK23中，菌种来源于BioVector NTCC典型培养物保藏中心；挑选接合子并划线于固体平板上(含萘啶酮酸：50μg/mL，安普霉素：50μg/mL)，于28℃培养箱中培养5天，挑取单菌落PCR验证质粒上的Apr抗性基因，从而得到含有UK 2A生物合成基因簇的工程菌株TK-23-UK-1。发酵实验结果表明，变铅青链霉菌TK-23中未能成功表达出产物UK 2A。上述结果表明，虽然同属于链霉菌属，但是变铅青链霉菌的生物合成模块并不像白色链霉菌那样适用于UK 2A生物合成基因簇的表达。

实施例4不同比例葡萄糖的发酵结果

UK 2A产生菌的发酵培养基以葡萄糖为主要碳源，培养基中添加葡萄糖的比例分别在50g/L、90g/L、130g/L，其它成分不变(即酵母提取物5g/L，豆粕粉35g/L，CaCO₃ 2g/L，NaCl 1g/L)，菌种BL-UK-20用种子培养基培养48h后，转接上述添加不同葡萄糖比例的发酵培养基，4天后收集发酵液处理分析，结果如表2所示。

表2葡萄糖比例不同时发酵单位

实施例5不同氮源的发酵结果

选择豆粕粉、黄豆粉、麸质粉、豌豆粉作为氮源，首先对氮源在比例为35g/L时做发酵结果对比，其它成分不变(即酵母提取物5g/L，葡萄糖90g/L，CaCO₃ 2g/L，NaCl 1g/L)，菌种BL-UK-20用种子培养基培养48h后，转接上述添加不同的氮源的发酵培养基，4天后收集发酵液处理分析，结果如表3所示。

表3不同氮源35g/L时发酵单位

不同比例豆粕粉的发酵结果

发酵培养基中的氮源豆粕粉在20g/L、35g/L、50g/L时做发酵对比，发酵培养基中其它成分不变(即酵母提取物5g/L，葡萄糖90g/L，CaCO₃ 2g/L，NaCl 1g/L)，菌种BL-UK-20用种子培养基培养48h后，转接上述添加不同比例豆粕粉的发酵培养基，4天后收集发酵液处理分析，结果如表4所示。

表4主要氮源豆粕粉在不同比例时发酵单位

实施例6不同比例辅助氮源的发酵结果

选择豆粕粉作为主要氮源，柠檬酸三铵，硫酸铵分别作为辅助氮源，配方比例在1g/L、5g/L、10g/L，豆粕粉比例在35g/L进行发酵验证，其它成分不变(即酵母提取物5g/L，葡萄糖90g/L，CaCO₃ 2g/L，NaCl 1g/L)，菌种BL-UK-20用种子培养基培养48h后，转接上述添加不同比例的辅助氮源的发酵培养基，4天后收集发酵液处理分析，结果如表5所示。

表5辅助氮源在不同比例时的发酵单位

实施例7

初始菌种UK-1经过斜面培养7天后，经过种子培养48h，以10％的接种量转接发酵，发酵培养基中葡萄糖50g/L，豆粕粉20g/L，酵母提取物5g/L、CaCO₃ 2g/L、NaCl 1g/L，在此发酵培养基中培养，4天后收集发酵液处理分析，发酵单位为152mg/L。

实施例8

初始菌种UK-1经过斜面培养7天后，转接种子基培养48h，以10％的接种量转接发酵，发酵培养基中，葡萄糖90g/L、豆粕粉35g/L、酵母提取物5g/L、柠檬酸三铵5g/L、CaCO₃2g/L、NaCl 1g/L，4天后收集发酵液处理分析，发酵单位为273mg/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海医药工业研究院

中国医药工业研究总院

<120> 一种生产UK 2A的基因工程菌及其制备方法和应用

<130> P21013374C

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32292

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 生物合成基因簇

<400> 1

cctccggcga tgtcccttgt cggacgatcc acgtcgaatg actgatgcgt atgccggtgg 60

gttgctttag gccgccgcga tccgaccggc gagcgtggcc ggaactcggg ccgatgtccg 120

gaatcagccg gtcgacgaca agtcatgcga cggatgccgg ggttccggcg gctcgcgaag 180

actgacgatc agtgacaccg catcagacgg aggcaccgac cggatgcctc cgaggcgagg 240

agcagccatg cgcacggggg agtgcccttc ccacaggacc accgcggagg gcggcggccg 300

gccggaggcg cgccggccga gatgaccggg caccgtccgc ctcccggcgc cggtgtaccc 360

gtgcgccgtc cgcccgcgta gggcaccccg ctcgtcccgc caccccgccc ccgaaccatc 420

aggacgcccc cgcccgcgcc gacgccggcc gccgcgcgga gggccctgat ccgtacgtcc 480

gacaccggcg tcccgggcca cccccgcgcc gcccgtccac cgcgcggcgc gaggccggcg 540

gacccatcgg cgaccgcatc ctcgtcaccg cacgtgcccg aaaggcgatg agttccttgg 600

cgacccccac ccccactctc gagggcctcc tcacgacacc ggcggcgcag cacgccgaag 660

cacacccccc gctccaccgg ccgggctcgg ccacggcctg cctcgaccgg ggcctggtcc 720

tccggcaggc ggacgaggag ttcttccgcc ggttcggcgg ctcggccccg cgcctcgtcg 780

gccggtcctt caccgagctg gtgcaccccg gctgccggga gcccctgctg cggcagttcg 840

ccgggctcac cgagggccgg cgcgaccggt tcggcaccga ggtcatcgcg gtgggcccgg 900

acggcacccc gttccggacc gacctgacgg cgctggcggt acgcggcgga acccccgaca 960

tctcggccgt ctggctgacg ctggcggcgg ccggcgagac cgcgcagccc gccgccgcga 1020

cgccccgcaa gaagatcctc agcgagatcg acgcccgcat cctcgaaggc atcgcggccg 1080

gtgtctccac cgtccccctg gccgcacgcc tgtatctgag ccggcagggg gtcgagtacc 1140

acgtgaagag cctgttccgg cagctccgcg tgcccaaccg ggccgcgctc gtctcccgcg 1200

cctactccat gggcctgctc aaggtgggga cctggccgcc caaggtggcg ccggacttcg 1260

tcaagtgagc ccggaccgcg gggtgatgac gtgtcgcggc gcggggtccg cgtgcagccg 1320

ggcgaccagc ggcgcgcggg cggccagcac ccggcgctgg ttgacgtagc ccttgtcggt 1380

gatctcgccc gcgtccaggt cgggcgggtc cgcgagcacc agcagccgct ggacccggga 1440

cgcggacccg gcgccccggt tgagtcgctc cagtgccgcg ccgaggtggg cggccagcgc 1500

gtcggagtac agcaccccgc cgtccgcggc cggccgccgg ccgagcagcc gctcggcctc 1560

ggccgggtcg agccacgcca gcgcgcagac cgcgtcccgg tgctccccgg tgatcaccgc 1620

gtcggagagg accggcgcgg ccgaaagcag cgcgccgcgc acggcttcga cgtgcacgaa 1680

cgtaccggtg gacagcttga agtcctcggt cagccggccc cggaacacca gccccgcgcc 1740

cgcgtcgccg gggtcggcga acgcgacggc gtctcccggc cggtagtagc cctcctcgtc 1800

gaaggcgcgc gcgtcgaggt ccgggcggcc gaggtagccg ggcgtcacgt gcgggccgcg 1860

cacccggacc tcgtagccgt caccctccgc cggtacgagc ttcagctcca cccccggcag 1920

cggcacgccg atgcaccgcg ggtcggtgaa cgggaagtgc gcgctggtgg acgccggcga 1980

ggtctcggtg gcgccccacg agcccgtcac cggcacgtcc cgcccggtca cttcgcggcc 2040

cagcgcccgg agccgttcgc gcagggccgg ggccagcgcc gccgccgcgt tgaagacgag 2100

ccgcagccgg gcgaagaacc gctccgccag ctcccggtcg cgctccaggg cggggacgag 2160

ccgcgcgtac ccggccggga cgttgaacgc cagggtcggg gagacctcgc gcaggttggc 2220

cagggtgcgc ccgaacagct ccggggtcgg gcggccgtcg tcgaggtaca gagtgccgcc 2280

gttggccagc accaggttca cgttgtggtt gccgccgaag gtgtggctcc acggcagcca 2340

gtccagcagc accggccgct ccccggccag gaacggccac acctgccgca tcatccgctg 2400

gttggcacag agcatgccgt gcgtggtgac gacgcccttc ggcgctcccg tcgagcccga 2460

cgtgaagagg accttcgcga ccgtcgcgct cgtgacgccc gcacgggccg cctcgaacgc 2520

gcggcccggc accgtacgca gcagggcgtc cagcgagtgc tccgccggcc cgccccgcgc 2580

cgccacgacg atggctccac cgcccgccgc ggccagcgcg ggaccgaacg gcccggcgtc 2640

ctcggcgtac accgcgcccg gccgcagcag ttccgcgatc gcccggatcc gcgcgtggtc 2700

ccggctcagc agggagtagg cgacgctgac cggcgccacc gggatcccgg cgctcagcgc 2760

gccgagcgtc atcagcaggt gcccggtgga gttgccggac aggaccatca gcggccgccg 2820

cgccgacagc ccgcggtcga gcagcgcctg cccgaccgcc tccgccgccg ccagcacctc 2880

gccgtacgtg cggtgccccc accggccgtc ggccccgcgc tcggcgacca gcgggcggtc 2940

gggcccggcc tgggcccagg tgcggagatg gtcggtcacg gaggcgggat acacccccag 3000

cggctgcgcc gacgagagga gcacggtccc gtccggccgg tcccgccgga cggtccgggc 3060

gggcgcgaac agcggtgacg aggtctcccc ggcggtggtc ccaccggcgg cggagtgcgg 3120

ggcggtgcgc gtggtcgggt gcggcatcgg ggttccctcc cggtctcgcg gggctgtcag 3180

acgtgccgct cgaccgcgcg gcggagctcg cccgcgcgca gcagggcggc gacggtctcg 3240

atgtcggcgt ccagcggccg gtcggcggag aggaacggcg agtacccgcg gacgagcgtg 3300

tgcgcggccc gggtcgcgct ccccagccgc ccgaccccgg tgaggtccgc ggcctggcac 3360

agggcgagca ggtggatggc ggtgacctgg ctcgtcagcc ggaccaccgt gtgcgcgtgc 3420

cgcgcggcga tggtgcccat gctcaccttg tcctggttgt gcgcctcggt cgaacgggag 3480

aacgagctca cgggcatcgt caggtgcagc gcctcggcgg tcagcgcgga cgcggcgatc 3540

tgcgcgccct tgaacccgtg gtgcagccct gcctccgggt cgtcgggacc gaccgggacg 3600

accaggttcg gggtgaggcc gatgctgaac ttgtcgtcca ccaggatcgc cagctggcgg 3660

tcgagcaggt cggcgacccc ggccacggcg gcggagaccg cctgcgccgc ctgggcgacg 3720

tgcccgccgt agaagttgcc gctgtagtgg acggtgtcgg tggccgcctc gaagagcggg 3780

ttgtcgttcg aggagttgat ctcggtggtc agccagtcct cggcccagcc gagcgtgtcc 3840

cgcagcacgc cgacgacgtg cggcgcgcac cggatcgagt acgggtcctg gatgcggcgc 3900

tccagctcga cgtaccggcg ctcctcgctc gaaccggggc ccacgagatc ggtgtcggcg 3960

accacggcgg gggagtcgcc cagcatccgg tggacgttcg cggcgctcgc gagctggccg 4020

gggtgcggct tgtgctcgtg cgggaacgcg gtgaactggt cgcggctgct gcgccggacc 4080

tccgtcgaca gcacggtgca cagctcggcc gcccacgcca gctcggccgc ctcggcgacc 4140

gccagggcgg cgtaggcggc catgaaggac gtcccgttga cgagcgccag cccctccttg 4200

gcccggagcg tgacgggcgc gaggccgcag gcccggatgg cctcgcccgc gtcgagcgcc 4260

cggccctggc tgcgcagggt gccctcgccg gtgagcgcgg cggcgaggta gccgagcggc 4320

gcgaggtcgc cgctggcgcc gaccgaaccg cgctccggta tctgcggcag caggtccttc 4380

tccagcagtg acaggatcag ctccaccggc gccgtgcgga tgccggagtt gccccgcgcg 4440

gcactgttgg cgcggatcag catggtggcg cggacgacct cgtcgggtgc catgtccccg 4500

gtgccgaccc gcaggaagcg gagcaggttc cgttgcagcg ccccggcctt gtcggcgctg 4560

acctggcggc cgctgctgtc gccgaagccg gtcgtcaccc cgtagatcgg gatgccggag 4620

gcgacgatcc gctccgtggc ctcccgcgac gccgtcatgc gctcggccgc ggccgccgcg 4680

agggcgattc tctgcttgcc cggctgggtc gcgacccgcc gcacggcccg cagcgagagg 4740

ctgtggccgt ccagctcgat ggtggtgtcg tcggtgggcg aggccatgtc ggtccccttc 4800

ggtcggtggg cgatgggcgg tgggcgatcg accgcgtgcg ccgctccttg ccgggcggcc 4860

cgcggacgcc ggtccgcggt cgcggagccg tgggtgtgcg cgccggcggt acgggagagg 4920

ggcccgtcgc cgccggcggg atgggtgggc gtgggggcgt tgctcagccg ggcgttccgc 4980

cgatgcccca ctggtcgcgg gggatgccct ggagcgtcac ccacgtcacg tcgcggcact 5040

cggggccgag ggcgcggacc gccgcctcgg tgagctcccc gatcagggcg cggcgggtct 5100

cgggcgtgag gcggtcttcg tagaggctga cctggatcag gggcacgagg gttccttctc 5160

tcgtcgggcg ggtgcttccc ggccactcag cgcggcggcc aggttggcgc cgagggtctc 5220

gacctggcga tcggtcatgg cggggtggca gggcaggttg aggtgctcgc cgaaccacag 5280

gcgttcggcg accgggcact cgccctcgcc gtgcccgcgc agccgccact cgggcagcag 5340

gtgcaccggg tggtagcgca actgggcggg ggtaccggag cgttgcaggg cgtccagcac 5400

gcggtcgcgg cgtccgtcgc cggggacgag cgcggtgtag aggtggtacg ggtgcaccgc 5460

gtcgggcgcg gcggtcagcg gccggacgtc gaagcggcgg cacaccgcgt cgagttccgc 5520

ggcgatcgcc cgccggcggg cgacgaactc cggcagccgt cccagctgca ccaggcccac 5580

cgcgcaggcg gcctcggaga gcgcggcgtt ggtcccgctg ccccgcagcc ccgtgcagtc 5640

ctcccggtag gcgtagtcgg cgtacgccat ccacggcagc gccgcggggg gccggcggtg 5700

cgcggacgag gtgaaggtgc cgtccaccgc gttcgaccgg atccggtcga tcctgcgggc 5760

cagttcgggc gacggggtgc acaccatgcc gccctcgccg agggtggtga tgttcttgga 5820

cgcctggaag ctgaagcagg acaggtcgcc gagcgcgccg gggcggcggc cccggtactc 5880

ggcgccgatc gcgtgcgcgc agtcctccac cacgagggcg ccgtgcgcgt gcgcgatggc 5940

ggtgatccgg tccatgtcgg cggggttgcc gccgtagtgg acgaggatga cggccttcgt 6000

gcgctcgttg acgagagtct ccagcgcgtc cgggtccatg ttgaggctgc ccggctccac 6060

gtcgcagaat cgcaccgttg cctcggtcgc gagcagcggc tgcgcggtgg cgtggtacgt 6120

ctgcggcgtc acgacgacct cgtccccggc ccgcaggtcg agcagccgga tcgcgatctc 6180

cagcgcgacc gtcccgctgg tgaccgtcag ggcgtgcgcg gcgccgacgt gccgggcgaa 6240

ggcccgctcg aactcctcgc gcaccgggcc catcgacagg ggcgcgtccg cgcgcagcac 6300

ctcggccacg gcccgcacct ccgcctcgcc gagcaggctg ccccggtgcg ggtggacgtc 6360

gccggcgcgg tccgccgtcg cccggctcac gagcgggcac cggccggctc ggggtcggac 6420

ccggcggcgt ccgggcccgg cggcgcgtcg aggccgaggt cggccacgag gcgcttcttg 6480

tcgaccttgc cgaggccgct cttggggaac gcctcgacgc acacgacccg gtcggggaac 6540

ttgtaggacg ccagcccgcg gtcgcgcagg tagcggcgca gctcgcccag ggtcgggggc 6600

gtgccgaccg ggatgatcac ggcgcaggtg cgctcgccga ggacggcgtc ggccatcggc 6660

accacggcgg cctggtcgat ccgctcgtgg ccggtgaggt ggccctccag ctcgggggcg 6720

gacaccttgt cgccgccgcg gacgatgacg tccttcgcgc ggcccatcac cacgacgccg 6780

ccgtcgtcgg tgatccgcac caggtcgccg gtgcggtaga agccgtccgg ggtgaacgcc 6840

ccggcgttgt gctcctcggc ccggtagtag ccgcgcaggg tgtacgggcc ccgggtgagc 6900

agctcgcccg tcccgccggc cgccacctcg tcgcccgccg cgtccaccac ccgcagttcg 6960

tcgtgggggg agatgggccg gccctgggtg gtgaggacgg tctcgggcgc gtcctcgcgg 7020

cgcgtgaggc acagcaggcc ctcggacatc ccgaacacct gctggagacg ggccgtcagc 7080

gccggtccga cctcctcggc gagcgaccgg tgcaccaccg cgctgccgac ctgcaccagc 7140

tccagcgtcg ccagctcctc ccggcgcccg tcggcggcgg cgatccagga gtgcgcgatc 7200

gtcggcacga ccgacgtcgt ggtgaccccg tgccgggcga tgagcgggaa gcacacctgg 7260

gggtcgggca cggtgctcag cacgacggcg cccccgttgg cgaacacccc gaccacaccc 7320

gggcagcccc acgtgaagtt gaaggcgatc ggcagggtgg cgaggtagcg ggtgtcctcg 7380

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gggatgagct tcggcagcgc cgtggtgccg ccggacagca ggaagaaggc cacgtccgac 7500

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aactccccgg ggtcgccgac cacgaacacg tgccggagcg acgcgtgccg ctcgcgcagg 7620

gaccgggcca gcccgcggtg gtcgaacccc aggaaccggt cgagggtcac gtaggcgctc 7680

gccccggtca ggccgcagat gtggtccagc tccgccatgc ggtggttggg cagcgtgaag 7740

accggcagca caccgatgcg gaagaaggcg aacgacaccg ccacgtgctc ggcgacgttg 7800

ggcagttgga gcacggcccg gtcgcccgcc cgcaggccgg cggccgagaa cccggcggcc 7860

aggcggtcgg cccaccggtc gagggcggcg taggtgaagg accgctcccc gtcgatcaga 7920

gccacgttgt ccggggtgcg cgcggcctgg gaacgcagca gctcgcccag gggctcaccg 7980

gcccaggtgc cgtcggcccg gtagcgctcc gcggtctcgg ccggccaggg gacgaaacca 8040

tcgagtccat cgagtccatc gagaagaggc atggcagggg ctcaccttcg ttctgtgacg 8100

gctggcatcg gagaacggtc tatcaacgga gctctgagga attccttagt cctgccgcgg 8160

ctagcctcac gtcccggtcg ggccggtcgg gccggacgca ccggacagag gggagcaccc 8220

gtcatgaccg tcgacgaggc ttcggcgcac gagggccgcc tgccggcctt cgaggtgttc 8280

gaccagggct tcaagaccga tccgtacccg tggtaccgca agctgcgcga ggcggcgccg 8340

atccaccggg tacggatgac cctgggcgcg gacgtgtggc tggtgaccgg ctacgagctg 8400

gcgaagaccg tgctcgcgga cggccggttc tccaagatga ccgtcaacgc cgagcgcgcg 8460

tggcgctccc tggagctcat cccggacgac cccgacgccc tggtcaaccg gatgctgctg 8520

atgagcgatc cgcccgacca cgagcgcctc cgccgcctgg tgtcccgggc gttcacggcg 8580

cgctcgatgg aggcgatgcg gccccgcatc gccgaggtcg ccgacgaact cgtcgcacgg 8640

ttcgccggcc ggggccgcgt cgacctcatc cgcgagttcg cgttcccgct gcccgccatg 8700

atcatctgcg atctgctcgg cgtccccgcc gaacaccgca cccggttcga ggagtacctg 8760

cggctgctct gcctggccga acccgaggac gtccaccgga tgcccgccgt cttcgccgaa 8820

ctcacggcgg aactcgccga gttggtcgag cgcaagcggg ccgagcccga cgggcacctg 8880

ctctccgcgc tggtcgggat ccgggacggc agcgaccggc tcaccgacga cgaactggtc 8940

tccatggcct tccagctcat gtacggcgcc caggacacca ccgtcaacct catcggcaac 9000

ggcatgctcg ccctgctgga caaccccgcc gccatggccg aactgcggga gaacccggag 9060

ctcatcccgg gcgccgtcga ggagatcctc cgcttcgacc cgccggtgga gaccgccacc 9120

ccgcggtacg ccctggaacc gctcgacgtc ggcgggatgc gcgtggagaa gggcggggtc 9180

gtgctcgtct ccctcgcgag cgcctcccgc gaccccgggc agttcgagga ccccgacgtc 9240

ttcgacatcc accgcgaggt gcgcggacag ctcgcgttcg ggcacgggct gcactactgc 9300

ctcggggccg tgatggcccg cgtgaagggc gaggtcgccc tgcgggccct gctgtgcggc 9360

ctggacgacc tgcgcccgga cgaggacgcc gaaccgctcg cgcgccacgc cgggttcatc 9420

atgcgcgggc tgaaggcgct ccccgtccgc ttcaccccgc gcgccgcgtg aaccggacgc 9480

gcccgccccg caccgcctcg ggaccctggg tgccgcaccg gcccggcacc gccccgggac 9540

cggtgacgct gttctgcttc ccctacgggg gaggcggcag ccgcgcctac gccgaactgc 9600

tggaaccgct gcccccctgg gtggccgccg tgaccgcgcg gctgcccggc cgcgagagcg 9660

cgcggcggca gcccgtcctc accgacgtcg gcgccatggc cgacctgctc ctccccggcg 9720

tcctcgaagc ggccgaccgc ccgttcgtct tctacggcca ctcgctcggc gcgcgcgtcg 9780

cctacgagac ggcccaccgc ctcgcggaca ccggccggcc gctgcccgcc gcgctctgcg 9840

tctccggggc gcccgccccg gccctcggcg tccacacccc gtgccacgac cagccccgcg 9900

cggaattcct ccgcaccctg cgggcgatgg gcggcgtcgc cccggaggtg ctcgccgacg 9960

aggagctgtg cgactacgtc ctgccggtca tccgcgccga catgcgggcc gccgagacat 10020

accggccacc gcgccggacc ccgctgcgca caccgatcag ggcgctcgcc ggacgggacg 10080

acccccgggt gccggtggag cacgtgcggc ggtggtcgga cgaggccggt ggggagttcc 10140

gctgcacggt cttcgaggga ggccacttct tcttccgtga ccacccgtcg gaggtcgccg 10200

cggtgttgga cggcctgctg cgggaagtcg ccgggggata ggggcccggc ccgggcgtca 10260

gggccgcagc agtccgccca cccaccagtc gtgcggtacg ccgtcgttgg cgatgccgcg 10320

cttgcgcagt gtcccctcga cggtgaagcc gagtctctcg gcgacggcac gcgagccggc 10380

gttcccgacc atggcccacc actcgatgcg gtgcacgtcg agcgtggccc atccccagtc 10440

gcacagggct cgggcggcct ccaccgaata cccgtgaccg cgctgctcct tgaccgccca 10500

gtagccgagc tcccagacgc cgcggctgac gcgggtcagg cagtacgagc cggccagggc 10560

gccggtgtcc tcgcggaacg cgccgaaggt gtagtcctcg tccgcggccc actgggcggg 10620

cagcttctcg ccgacgagct tctccgcgtc cgcacgcagg tacggcaccg gcaccggggt 10680

gtagagctgg atgtcctcgt cctggcaggc ctcgtacacc gcatccacgt cggcaggcgt 10740

gaaggcccgc agcaccaggc ggtcggtccg aagggtcacc gggtccatcg cggcagtatg 10800

accgccgacg acaagcggcg gccagtggat ttccgaccgg ccgccgctcc gggccgggca 10860

ctgccctccc gtctggagcc cttcccgcct agagtccgag ccggacgccc cccgacgcct 10920

cgatgcgctg cccggtgacc cagcggccgc ccggtcccgc caggtaggcg acgacgtcgg 10980

cgacctcgcc gggcgtaccg acccggtgga gtgcggtggt ggcggccatg gcctcgcgct 11040

gggcgggcac cttcatgtcc gggttgatgt cggtgtcggt gtaccccggg gcgaccgcgt 11100

tgacggtgat gccgcgcggc cccagctcca gggcgaggtc gacggtgaag gtctccagcg 11160

ccgccttggt catggtgtac gcggcgatca ccggcatcgc cacccgggtc gcggcggtgg 11220

tgacgttgac gatccggccc ccgtcgcgca gccgcggcag cgcgccctgc accaggaaga 11280

acggggcctt ggcgttgacc gcgaacagcc ggtcccagtc ggcctcttcg aggtcccgta 11340

cgccacgcgg gacggtgatc ccggcgttgt tcacgaggat gtccaccggc gcgggacccg 11400

agccgccgcg gacggcggcg acgccctcgt cgtaaccgcg ccacagctcg tcgagggcgc 11460

cgagctcgcc gaactccgcg cggacgggga aggccgaccc gccggcttcg cggatctccc 11520

gcaccgtcga ccgcgcggct tcgtcgtccc gtccgtagtg gacggcgacc agcgcgccct 11580

ccgcggcgag gcggacggcg acggcacggc cgatgccgcg gccggccccg gtcaccaggg 11640

cgatgcggtc ggtcggatct gacatgggtt cctccgggag ggggtggtgg tcggatcagg 11700

caaggggtca gacggacagc gcggcacgcg ccccggcgtc cgcgacccgc tccagcgtcg 11760

ccagcgtccg cgcccgcacc cgctcgatct gggcgggcgg ggagcagacg ggggtgtacg 11820

ggatctccag cgagaacgcg ccgtccacgg tgctgacaca ggcgaagagc ggaccctgcc 11880

cgaacccggg gccgtagtcc tcgcgtccgg ccgtcagccg ggtgtcgcgc agccgcagcc 11940

cgggcgggga caccgggccg gcgatccggc ccatgttcga cacgatcacg gtggtggcca 12000

gcagctccgg gtggtcgacg aggcgggcga gcagagcggt ctccacggcc cagccgtcgc 12060

cggccagggc gccgcgcagc ccctcggtga cccggcgcgc cagcggaccc acgtgctccg 12120

ggccctcgcc cggcgcgacg tccaccacgt ccgggaaccc cgagaccagc ggcagcatca 12180

cgccggccgc cgccgggggc tcgacccggg agcgcaggtc cacgggcgag aagcagccga 12240

gggcggcggt accggaaccg ccgagctcct cccgtatcgc caggagcagc gccgcggcgg 12300

tcacgccgtg caccgaggtg cccaacctcc gtgcgcccgc cgcgagttcg ccggtcctgt 12360

cggcggacag ggcgacgcgg acgttgtgca ccggctgccg cccggccggc ggcgcaccgt 12420

ccccgcccgc ctccacgtac ggcaactgcg ccggcggacg gtcgcgcgcc tgttccaggc 12480

gctcggcgag cagcgccgcg acggcgtccc cggacacggc cggcagccgc tccgacaccg 12540

gggccggcca cgcggtcgcc gccgggcggg ccggttcgcc ggccagcacc gcggcgtagt 12600

gccgccagag ttccgtgtgg agggtgaggg cgctggtgcc gtcggtcacc acgtggtcca 12660

cgacgagccc cacgaccgtg tccgagcccc gcgcggccgt cgacagccgc gcgaccgggc 12720

cgccgacggg caagggggac gtggcgatct ccgtcatcac gtccttctcg ggcgccggtt 12780

cggccaggcc cgggcggccg gccgccccca gccgttcgag ggcgaaaccg ccgccgtgcg 12840

acacgatccg gctgtccgcc gtcggatgcg cgtcgagcgt ccgcgaccag gccgcggaca 12900

gcacgtcgag gtcgaggtcg ccctcgacct cgacggtgac caccgcccgg ctgcggtcgc 12960

cgacgtgcag ctcctcaagt gggcagaggg gacggaggga gtcgggcatc ggttgtgctc 13020

ctcgggtcgt tcgggcgggc ccgccatcgg gggagggccc gccggaagtg cgcggtgtcg 13080

cgcgtcagcc ggtggctgcc gcgtagtggc tcagggggat cgacggggaa cggccacggc 13140

gccggagcac cggaccgggc cgacggccgg gcgcccggcc ggggcccgcc gaagtggcgg 13200

gcgcgtgatg acgccgccgg ggtccgctgg gggccggacc ggccgtcggg ccgttctcgc 13260

cgtccggacc cggccggagc ggcgggcgcc gtgccggtgc cgcctcgggc gccggggcgt 13320

cgcggggccg gccggttgcc ggtccgtggc gccgccggat tccgcctcgt gcggggggct 13380

gcccatgggg gccgggccgg tcatccggcc gccacctccg cccgttcccc tccgccggcc 13440

cccgcgagac gcgcctcgac cgccttcgca atcacctcga tcgggccggc gtcggtcagg 13500

gcgtagtggg agcaggcgag aggaacctcc tcgaaggtgc cggtggtgaa cgggcgccag 13560

gacgcggccc ggtcggcgat cccgcccgcg acctccggtt cgtcgtcggc gacttcggtg 13620

gccgagacga agaggatgtc ggcgcgcagc cgttccggaa ccagatcggg ggcgatccgc 13680

agattgttgc ggaccacctt cgccacggtg atcgcctcct cacgcgtgag cgtgcccggc 13740

accgcctcgg ggtcccggcg ggaggagtcg agcagcgcga gcgacgcgtc gaccgtggcc 13800

ggcgcgggca tggtcaggcc ggccagccgc aggacgaggg cggcggcctg cgcctcgacc 13860

gcctcgccct ccagcgccgc cgcgtccggc tgcggcgtgt cgagcatggt cagcagcgcg 13920

acctcctcgc cggccgcctc cagggcggcg gccaggcggt gggcgacggc gccgccgaac 13980

gaccagccca gcaggtggta cgggccgtgg ggctggacgg cccggatccg ttccaggccg 14040

tcccggatca cgtcctcggc gcgcccggcg gcgggaaggg cgccgtccag gccaagggcc 14100

tggaggccgt acaccgggcg gcgcgggtcg aggtgcggca gcagccccgt gtagcgccag 14160

gcgacgccgc tgaccgggtg cacgcagaac agcggcggca gatcccccgc ggcccgcatc 14220

ggcagcatgg gggcgaacgc ctcctgcccg acggccccgc cgcgcccggc gcggtcgagc 14280

agtccggcga tcgtcggcgt ggcgagcagg gccgcggccg gcacgtcgag cacgcccgcg 14340

gtgcgcaggc gcccgccgag cagcacggcg cgcatcgaat cgccgccgag gtcgaagaag 14400

ttgtcgtcga gcccgatgcc gtcgacaccg agcacggcct cccactcggc cgccacggcc 14460

cgctccgcgt cggtgcccgg cggcacgtgc ggcacggcca gcggcggacg cgggacgcgg 14520

cgcgaggcgc ggtcgccggc gcggtcgtcg gatgcgccgt gcggggccgt ggtcgcccgg 14580

gcgccggggg cgtcgatcca gtgccggtcg cgggcgaagg cgtagccggg caggtcgggc 14640

agggaccgcc ggggcagtcg ggtgccctcc tccgacgcgt cgccgggcgg gacgatgtcc 14700

acctcggccc cggcggtcca caggtgcgcg agcgcctccg cccgcacccg gccgtcgggc 14760

ccggtcgccc gcgcgtggcg catcaccggg acggtgacgg gctccgggcc gccgtcgtcg 14820

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gcgcccccgg cggaggcggc gcgcagcgtc cgcaccccgt cggcgaagcg gaccgtgccg 14940

cgcgtgtgcg ccacccagtg ctccaccgag gtggcctgct cggcggtgac ccacgtgccg 15000

gtgacgttgg tgatgtacgg gacgcgcggc tcgcgcaggt cgacgccgcg gaaggcggcg 15060

gccaggtcgt ccaggaccgg gtcgagcatc gaggagtggg cggcggcggg cagccgcagc 15120

cgccggtggg tgacgccgtc ggcgacgagc cgctcgacca gcgcgtcgac ggcctccacc 15180

ggtccgccca ccgtgcacga ggacggcgag ttgaccgccg ccagggacaa cccaccgtcc 15240

aggagcggga ggacgtcccg ctcgggcagc gccacgccga ccgccgcccc gcccgccgag 15300

atcatcagcc ggacgcgggt gaccagcagc ggcagcatct cctccagggt catcaccccc 15360

gcgaggcacg ccgccacgta ctcgcccagg gagtgcccca tcagcgcgcc gggccggacc 15420

ccggaagccg ccagcgaggc ggccaaggcg tactcgacca ccgcgagcgc gcacatcgac 15480

tccacgctga agtggtcggc ccgctcgtgg agcgtgacgc ggatgtcgtg gtccaggacc 15540

ggctgaagga tggcggcgca ccggtcgacg gcctcgcggt aggcggggtc gtcgcggtac 15600

agctccgcgc ccatccccac gtactgggtg ccaccgccgg gcagcaggaa gaccacctcc 15660

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gcctcttccg ccggcccgat gggtaccggc aggcgcggtg cctcctccag gacgacgtgg 15960

gcgttggtgc ccccgacccc gaaggcgctc accgcggcgc gcagcgggcc gtcggccgtc 16020

cacggctcca gcgccgtcga gacgcggaac gggccgctcg cgaagtcgat gagggggttc 16080

ggggcgtcgt ggtgcaccgt gggcggcacg gcccggtgct cgagcgcgag gacggtcttg 16140

atgatgccgg cgatcccggc cgccgcgccg aggtggccga tgttgccctt gaccgagccg 16200

agcgcgcagt acccccgccg gtcggtggac tcccggaacg cctcggtgag ggccgcgacc 16260

tcgatcgggt cgccgaggcg cgtggcggtc ccgtgggcct cgacgtacgt caccgagccg 16320

gcgtcgacgc cggccgccac ctgggcggcc acgatgacct ccgcctgccc ggccgggctc 16380

ggggccgaga aaccgacctt gcgccggccg tcgttgttga tcgcggaacc ccggatgacg 16440

gcccggatcc ggtcgccgtc cgccagcgcg tcggacagcc ggcgcaggac gaggacgccg 16500

gccccgtcgc cgttgaacgt gcccgccgcg tccgcggcga acggccggca cgccccgtcg 16560

ggggagagcg ggccgtcggg cacgtggcgg tacccgagca tcgcctgcgg atccaccgac 16620

accgcgccga ccacggcgat gtcgcacgcg tacgcggcca gcgcctcgct ggcggtgtgc 16680

acggcgacga gcgcggtcga gcaggccgtg ttcatcgaga cgctcgggcc cgtcagctcc 16740

aggtcgtacg acagccgagt ggcgagcgtg ccaagggagt tggcggtggc cgcgtggatc 16800

agacccacgg aggcgggctc gccggcgtgc cgcgggtgca cgttgtagga gtagtagcgg 16860

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gcgtcctcca gcgcgtggta ggcggtctcc aggagcaccc gctgctgcgg gtcgatgagt 16980

tcggcctcgg ccgggccgta gccgaagaac gcggcgtcga agcggtcggc gtcgggcagc 17040

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gctccacgcc agcgactggg cgtccagccc ccgcgcccgc tgacggacgg ccagcgcgtc 18120

gaggaaggcg cacgccgccg cgtaaggggc gccgaacgcg gccccgaagg tgccgttgac 18180

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gtccgtcgcg gcggccacgg ccgcgtccag cgccgcctcg tcggtgacgt cggcggccgc 18420

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cccgggctcg gtggtgagca ggtgctcggc gaggtgggcc gcgacgccgc ccagcccgcc 18600

cgtcaccagg acgacgccgt cgccgtaggc ggggacggtg accgactcgg gcaccggtac 18660

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gtgcacgacg cgctccggac ggcggtcgtc ggccgccagc cggtcgagca gcgccgcgaa 19080

gtcggacgcc tcgtcggggc ggaccgtgta ccgggccgcg tcccgccgcc cgaagcccgt 19140

accggccacc gctgtcgtgg cgcgtccgcc ctcccggcgc accagggcgg cgagccgctc 19200

ggcgaccccc gcaccccgcg gccccgccgc cacgatcagc acggacgtgc cggccggggg 19260

agcggtggcc gggcgcgtca ccggcgacca gacgggacgc aggaaccagt gcggaaccgt 19320

cgccgccgtc ccgagcagca cctcggcggc gcgcgccacc gcgtcgaact caccggcctc 19380

gaaccgcttg cgcagctgcg tccgctggat cttgccgatc tcggtcttcg ggatcaccgc 19440

cgtctcgacg ggcagcacgt gcgcgggcgc cacgccgacc tcgcgggcca ccttgccccg 19500

gatcgcccgc agcgcggccg ccgcggcctc cccggagtcg tgcccggggg ccaggtgcac 19560

gaacagcgcg agctggtcgg tggcggccga ggcgtccgta cggaccgcga ccgccgcggt 19620

gaacgagcgc accaccaccg gcagttcctc gacgcacgcc tctatctcgt gactgaagtg 19680

gttgacgccg ttgacgatga tgacgtcctt ggcgcgcccg gtgatgtaca gctcgccgtc 19740

gcgcaggaac gccaggtcgc cggtgtcgaa ccagccgtcg gcggtgaacg cctcggcgtt 19800

ggccgccgcg ttgtcgtggt agcccgacgt caccgaggcg ccgcggacct ggaagcggcc 19860

gacctcgccc tccggcagca gccgcagctc ctcgtcgacc acgcgcatcg cgaacccggg 19920

gtacggccgc ccgcagctga cgaaggtctc gtcgccgccg ggcggcggct gcgggtcgag 19980

gaccgtgtcc gtgaccacgg agcacgtctc ggacatgccc cagccggggt gcatcacgtc 20040

ggacggcagc ccgtgcggcg ccagggcctg caggaaccgg cggttggtcg cgccgacgac 20100

gacctcgccc gcgttcatga tcagccgtac gggggagagg tcccactccc ggccggcgag 20160

ccggccggcc tgctcggcga cgaggccgaa ggcgaagttc ggcgcccacg tgacgctgac 20220

gcgccaccgg tccgccagct cccaccagcg cagcgggtcc tccagcaccc agcccgtcgg 20280

ggcgtgcacc tgccgggcgc cgaggtagac gtcgcgcagg tggaacatca ccacaccggt 20340

gacgtggtcg agcgggatcc agttcagcga gacgtcgtgc tcggtcaggg agttggccgc 20400

cgccgcggcg acggcccggc tcagcacgtt gccgtgcgtc agccgcaccg ccttcggaag 20460

tcccgtgctg ccggaggtga gcagcatgag cagcaggtcg tcggggcgtg cctgatgcca 20520

gtcgcggtcc ggggcggccg cgcgcagggc gtccacggtc acgatgcggg ggtccggcca 20580

ctcccggcgg gccgcgagct ccgccaggcc gtcggcacgg tccgcggagg tgacgacgac 20640

cggccggccc agcatgcgcc agacgccgtc gagcttgttc acggccgccg agtcggtggc 20700

gtacgtgggc ggcacggtga gcgggacgac ggtgaccccg gcggcgatcg cgccccagag 20760

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gcccagggcc cgcagcccgc ccaggacccg ctcggcctcc tcgatcagcg aggcgtacga 20880

gcgccggctc tcggtgccgt ccgcgcgcac gtgcacgatc tcggcgtggt cgccgcccgc 20940

cgcggcgcgg cgcagggcct cgggccagcc gccgacctcc gccgggggca gcggcgggcc 21000

ctcggagagc gacagcgcgc ggtccgcttg gtgaacggcg gccggtccgg cggtggccgc 21060

cacggtacgc gggcgggtcg ccggccggag cgcctccagc ccctcgggga cgtcctcgcg 21120

cccgaccgcc gccgcccgta cgccggtcac ggccgcgaga gcggcgcgcc agccgtcggc 21180

ggcggtgtcg tcgacgaccg gcagccggtg cagcgcggcc acgtcgaggt cgccggcggc 21240

ggtgcgcggg aggacggtca cggccgtcac ccggggtgcc ccgtcgccgc cttcgtccgc 21300

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accgccgtcg gagggccggg tgaccgcgac gtccgcgacg gcggacaggg agcgcacacg 21420

gctctccagc gccgcgtcgt cggacaccgc ctcgggtgcg gcgtcccgcc cggcgagcag 21480

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ggtgaccagg ccctcggcga gcaggcgcgc ggtgctcggg tcgaacaggt cgcgggcgaa 21600

ctcgacgtga caggtcagac cgccgggcgc cgagccgtcg tccccgacgt gctcggtgat 21660

gtcgaagaac aggtcgaact tcgcggtacc cgtcgcgctg ggccgcagcg gcaccggcgg 21720

gccgcccagc gacaccgccg cggcggcgtt gttctgcagc gccagcatca ccgtgaacag 21780

cggatgacgc cccggcacgc gcggcgggtt gaccagctcc accacctgct cgaacggcag 21840

gtcctcgtgc gcccaggcgg cccggtcggc ctcctggacg cgagccagca actcggcgac 21900

ggccggcgag ccggaggtgt cggtgcgcag cacgacggtg ttggtcacca gccccaccac 21960

gtcgtcgagc gcctggtcgt gccgcccggc gaccggggtg ccgatcgcca gatccgtacc 22020

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gacggcgccg ccccggccgg tcggccgggc gggccgcggc cggtcgaacg gcagcgcggt 22200

ctcctccggc agcccccgca gcgcggcgct ccagaactcc tcgtcgcgcc gggcggcggc 22260

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gacgtgcagc ggcacggccg ccggttcccg gacctcctgg tacggcacgc cggcctcggc 22620

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cgtggggacc atgtgctcgg gcagccgggc ggcgaggtgg tcgtgccagc gccgggcgcg 23220

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ctcggtcagc acggcctcga tctcgcccag ctcgacccgg aagccccgga tcttgacctg 23400

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gagttcacgg taggtgagct ccggcgagcc gtcggcgggc accagcgcta cggcgtccgg 24540

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gctgtcggac caggcggggt cgtcgggggc gtcgtccacc tggagtgcgc ggacgcggtc 24780

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gagcgtcgtg gtgcccgtga ggtccagcgg cagcgggacg ggggtgccat cggcggccgg 25020

gacgtacagc tcgaccgcgc cgctcccacg gcggcgagcg gtgaacatcg cgacggcggc 25080

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ggccgggcgc gccagctcgg cccgcatcca ggccagggcc gcgccggccg ggtcgctctc 25440

accggagaga tcgacgaatt cggccggccc gcatggcgcg ccctcgccgt ccgccgacgt 25500

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ctccagggtg gtcagctcgc cgtcctcggc gaggtccacg acgaacgcga tgtcgtcgac 25860

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gtaactcttg atgttgacct gggcggtggt gaactcggac tcgtcggtga cgcgcccgag 25980

gtcccggcgg atgtcctcga cgcggtaccg cccgtggcgg cgcagctccc gcatcgcctt 26040

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gccgaaggcg ggctcacccg gtgacccgcc cgtgcgcagc gcttcgtgga tctcctcgat 26520

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ggagaggtcg acgacctcca cgcggggtgc cgtgccggtc ccgcgctgga cggggacgtc 26760

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tcgcggtcag ggtcgtcagc agcgcgtcga acgtctcggg gacgtcgatg gtgtggggct 27360

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ccggccggcc gggcgcggcg aacggcaggg gagcgggccc cgcggcaccc agcacgatgt 27480

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tcgtgatccc gcagtgcagg atccgcgacg gtacgcgccc caccccgggg acggcggtgg 27660

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cgtcgccctg gccccagatg acggtgtccg cgtcgatctc ccgcatgaac accgggaaca 27840

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cccggccggc gaccaggtcg cgcccggcgg tgcggacccg tacgccgccg ccctccggct 28020

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tcggcgagct tctcgtaccc cgggtactgc gcggtcgcgg cgccctgcca gctcttgacg 28920

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tcgcggtccc ggtccaggta gcagctgtac ttgacctgga tgcgcggcgc gcggtccggg 29040

tggtgggcgg cgaaggcctc gcggtaggcc gcgagcatct ccgcgaactg ctcaccgctg 29100

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tcgaacgccg tgaactcgtg cggcaggaag gcccgtccga cgccgacgtc gacccggccg 29400

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acgtgctcgt agcccagccg gtcggcgtcg acggcgaggg ccaggcagtc gtcgaagtag 29640

tcgtgcggcg ccttgtcccg ctcgtcgagc gcggggaaga aggtcagacc gaaatccatg 29700

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ccgagcacga ccggtcgctg ttcgagcagg tgcgcgactc gctggcggtc gcggtgccgc 30000

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agtcgccgcg cgtgggccag gccgcgcgcc tggtgcgccg cggcccgcgc gggaagtccc 32280

cggagttcgg cg 32292

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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gactgacact gataatacga ctcactatag gagggcggcg gccggccggg ttttagagct 60

agaaata 67

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<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gRNA-UK-down

<400> 3

gactgacact gataatacga ctcactatag gcctgggcgt gaccgaccgt tttagagcta 60

gaaata 66

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<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UK-up-F

<400> 4

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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ttgtcggtga tctcgcccgc gtccaggttt aaaccacgtg atcggctccg actg 54

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UK-down-R

<400> 7

gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcacc gccgaactcc ggggacttc 49

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UK-upcu-R

<400> 9

gcgcgcactt cccgttcacc ga 22

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<212> DNA

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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cgtccttcat ggccgcctac gc 22

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<212> DNA

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cgccgccgaa cgaccagccc ag 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UK-cub-R

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acctggccgc cgccttccgc gg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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aggcgaagtt cggcgcccac gt 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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tcctcgcgga cgaaggcggc ga 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gccgacgacg tcaacctctt cg 22

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<211> 22

<212> DNA

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<223> UK-cudown-R

<400> 17

ccgaggggtc gccggtgagc cc 22

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<212> DNA

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<220>

<223> PLC01质粒

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gtgccacctg ggtccttttc atcacgtgct ataaaaataa ttataattta aattttttaa 60

tataaatata taaattaaaa atagaaagta aaaaaagaaa ttaaagaaaa aatagttttt 120

gttttccgaa gatgtaaaag actctagggg gatcgccaac aaatactacc ttttatcttg 180

ctcttcctgc tctcaggtat taatgccgaa ttgtttcatc ttgtctgtgt agaagaccac 240

acacgaaaat cctgtgattt tacattttac ttatcgttaa tcgaatgtat atctatttaa 300

tctgcttttc ttgtctaata aatatatatg taaagtacgc tttttgttga aattttttaa 360

acctttgttt attttttttt cttcattccg taactcttct accttcttta tttactttct 420

aaaatccaaa tacaaaacat aaaaataaat aaacacagag taaattccca aattattcca 480

tcattaaaag atacgaggcg cgtgtaagtt acaggcaagc gatccgtcta agaaaccatt 540

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt 600

ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 660

ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 720

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tcacgacatt actatatata taatatagga agcatttaat agaacagcat cgtaatatat 840

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cacgtgagta tacgtgatta agcacacaaa ggcagcttgg agtatgtctg ttattaattt 1080

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agaataccaa gagttcctcg gtttgccagt tattaaaaga ctcgtatttc caaaagactg 1440

caacatacta ctcagtgcag cttcacagaa acctcattcg tttattccct tgtttgattc 1500

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aaatggtgta aaagactcta acaaaatagc aaatttcgtc aaaaatgcta agaaataggt 1740

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cgcgctgatt gctggggcaa cacgtggagc ggatcgggga ttgtctttct tcagctcgct 3600

gatgatatgc tgacgctcaa tgccgtttgg cctccgacta acgaaaatcc cgcatttgga 3660

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gtcgacctgc aggtccccgg ggatcggtct tgccttgctc gtcggtgatg tacttcacca 3840

gctccgcgaa gtcgctcttc ttgatggagc gcatggggac gtgcttggca atcacgcgca 3900

ccccccggcc gttttagcgg ctaaaaaagt catggctctg ccctcgggcg gaccacgccc 3960

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cccaggcggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc ggacgtgctc atagtccacg 4140

acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt aggccgacag gctcatgccg 4200

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ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca tccgcttgcc ctcatctgtt 4320

acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc cgttgagcac cgccaggtgc 4380

gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg ggcctacttc acctatcctg 4440

cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac gaaccctttg gcaaaatcct 4500

gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg ctataatgac cccgaagcag 4560

ggttatgcag cggaaaagat ccgtcgacct gcaggcatgc aagctctagc gattccagac 4620

gtcccgaagg cgtggcgcgg cttccccgtg ccggagcaat cgccctgggt gggttacacg 4680

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attcgagcgc agcaagccca gcgacacagc gtagcgccaa cgaagacaag gcggccgacc 4980

ttcagcgcga agtcgagcgc gacgggggcc ggttcaggtt cgtcgggcat ttcagcgaag 5040

cgccgggcac gtcggcgttc gggacggcgg agcgcccgga gttcgaacgc atcctgaacg 5100

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cgacccgggg cgagacgatt gggaagaaga ccgcttcaag cgcctgggac ccggcaaccg 5700

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agaagccgga cggcacgccg accacgaaga ttgagggtta ccgcattcag cgcgacccga 5820

tcacgctccg gccggtcgag cttgattgcg gaccgatcat cgagcccgct gagtggtatg 5880

agcttcaggc gtggttggac ggcagggggc gcggcaaggg gctttcccgg gggcaagcca 5940

ttctgtccgc catggacaag ctgtactgcg agtgtggcgc cgtcatgact tcgaagcgcg 6000

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cacctgggca gcacgaaggc acgtgcaacg tcagcatggc ggcactcgac aagttcgttg 6120

cggaacgcat cttcaacaag atcaggcacg ccgaaggcga cgaagagacg ttggcgcttc 6180

tgtgggaagc cgcccgacgc ttcggcaagc tcactgaggc gcctgagaag agcggcgaac 6240

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gccctaagtc gtggtggggg cgcgcgtcag tagacgacaa gcgcgtgttc gtcgggctct 6540

tcgtagacaa gatcgttgtc acgaagtcga ctacgggcag ggggcaggga acgcccatcg 6600

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tattctatag tctcacctaa atagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 6840

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cgaaaaacat attctcaata aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg 7440

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atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca tacgaaattc cggatgagca ttcatcaggc 7620

gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta 7680

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atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt gggatatatc aacggtggta tatccagtga 7800

tttttttctc cattttagct tccttagctc ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc 7860

ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt 7920

ctcattttcg ccaaaagttg gcccagggct tcccggtatc aacagggaca ccaggattta 7980

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cgtaaccgtc gcacaggaag gacagagaaa gcgcggatct gggaagtgac ggacagaacg 8100

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tatggaaatg tggaactgag tggatatgct gtttttgtct gttaaacaga gaagctggct 8460

gttatccact gagaagcgaa cgaaacagtc gggaaaatct cccattatcg tagagatccg 8520

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ggatacctcg cggaaaactt ggccctcact gacagatgag gggcggacgt tgacacttga 8940

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gcacttatat attctgctta cacacgatgc ctgaaaaaac ttcccttggg gttatccact 9480

tatccacggg gatattttta taattatttt ttttatagtt tttagatctt cttttttaga 9540

gcgccttgta ggcctttatc catgctggtt ctagagaagg tgttgtgaca aattgccctt 9600

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gtgacaaatt gccctcagaa gaagctgttt tttcacaaag ttatccctgc ttattgactc 9720

ttttttattt agtgtgacaa tctaaaaact tgtcacactt cacatggatc tgtcatggcg 9780

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gttgaccaga tcagaaaatc tgatggcacc ctacaggaac atgacggtat ctgcgagatc 9960

catgttgcta aatatgctga aatattcgga ttgacctctg cggaagccag taaggatata 10020

cggcaggcat tgaagagttt cgcggggaag gaagtggttt tttatcgccc tgaagaggat 10080

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cagaaccggt ttacgcagtt tcggcttagt gaaacaaaag aaatcaccaa tccgtatgcc 10260

atgcgtttat acgaatccct gtgtcagtat cgtaagccgg atggctcagg catcgtctct 10320

ctgaaaatcg actggatcat agagcgttac cagctgcctc aaagttacca gcgtatgcct 10380

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atccgcgtgt gtacctctac ctggagtttt tcccacggtg gatatttctt cttgcgctga 10860

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aaataacccg gcgctggaga ataggtgaag cagcggattt agttggggtt tcttctcagg 11280

ctatcagaga tgccgagaaa gcagggcgac taccgcaccc ggatatggaa attcgaggac 11340

gggttgagca acgtgttggt tatacaattg aacaaattaa tcatatgcgt gatgtgtttg 11400

gtacgcgatt gcgacgtgct gaagacgtat ttccaccggt gatcggggtt gctgcccata 11460

aaggtggcgt ttacaaaacc tcagtttctg ttcatcttgc tcaggatctg gctctgaagg 11520

ggctacgtgt tttgctcgtg gaaggtaacg acccccaggg aacagcctca atgtatcacg 11580

gatgggtacc agatcttcat attcatgcag aagacactct cctgcctttc tatcttgggg 11640

aaaaggacga tgtcacttat gcaataaagc ccacttgctg gccggggctt gacattattc 11700

cttcctgtct ggctctgcac cgtattgaaa ctgagttaat gggcaaattt gatgaaggta 11760

aactgcccac cgatccacac ctgatgctcc gactggccat tgaaactgtt gctcatgact 11820

atgatgtcat agttattgac agcgcgccta acctgggtat cggcacgatt aatgtcgtat 11880

gtgctgctga tgtgctgatt gttcccacgc ctgctgagtt gtttgactac acctccgcac 11940

tgcagttttt cgatatgctt cgtgatctgc tcaagaacgt tgatcttaaa gggttcgagc 12000

ctgatgtacg tattttgctt accaaataca gcaatagcaa tggctctcag tccccgtgga 12060

tggaggagca aattcgggat gcctggggaa gcatggttct aaaaaatgtt gtacgtgaaa 12120

cggatgaagt tggtaaaggt cagatccgga tgagaactgt ttttgaacag gccattgatc 12180

aacgctcttc aactggtgcc tggagaaatg ctctttctat ttgggaacct gtctgcaatg 12240

aaattttcga tcgtctgatt aaaccacgct gggagattag ataatgaagc gtgcgcctgt 12300

tattccaaaa catacgctca atactcaacc ggttgaagat acttcgttat cgacaccagc 12360

tgccccgatg gtggattcgt taattgcgcg cgtaggagta atggctcgcg gtaatgccat 12420

tactttgcct gtatgtggtc gggatgtgaa gtttactctt gaagtgctcc ggggtgatag 12480

tgttgagaag acctctcggg tatggtcagg taatgaacgt gaccaggagc tgcttactga 12540

ggacgcactg gatgatctca tcccttcttt tctactgact ggtcaacaga caccggcgtt 12600

cggtcgaaga gtatctggtg tcatagaaat tgccgatggg agtcgccgtc gtaaagctgc 12660

tgcacttacc gaaagtgatt atcgtgttct ggttggcgag ctggatgatg agcagatggc 12720

tgcattatcc agattgggta acgattatcg cccaacaagt gcttatgaac gtggtcagcg 12780

ttatgcaagc cgattgcaga atgaatttgc tggaaatatt tctgcgctgg ctgatgcgga 12840

aaatatttca cgtaagatta ttacccgctg tatcaacacc gccaaattgc ctaaatcagt 12900

tgttgctctt ttttctcacc ccggtgaact atctgcccgg tcaggtgatg cacttcaaaa 12960

agcctttaca gataaagagg aattacttaa gcagcaggca tctaaccttc atgagcagaa 13020

aaaagctggg gtgatatttg aagctgaaga agttatcact cttttaactt ctgtgcttaa 13080

aacgtcatct gcatcaagaa ctagtttaag ctcacgacat cagtttgctc ctggagcgac 13140

agtattgtat aagggcgata aaatggtgct taacctggac aggtctcgtg ttccaactga 13200

gtgtatagag aaaattgagg ccattcttaa ggaacttgaa aagccagcac cctgatgcga 13260

ccacgtttta gtctacgttt atctgtcttt acttaatgtc ctttgttaca ggccagaaag 13320

cataactggc ctgaatattc tctctgggcc cactgttcca cttgtatcgt cggtctgata 13380

atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg 13440

gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acggtcccac tcgtatcgtc 13500

ggtctgataa tcagactggg accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct 13560

gggaccatgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact 13620

cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggaa ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat 13680

tattagtctg ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac 13740

gatcccactc gtgttgtcgg tctgattatc ggtctgggac cacggtccca cttgtattgt 13800

cgatcagact atcagcgtga gactacgatt ccatcaatgc ctgtcaaggg caagtattga 13860

catgtcgtcg taacctgtag aacggagtaa cctcggtgtg cggttgtatg cctgctgtgg 13920

attgctgctg tgtcctgctt atccacaaca ttttgcgcac ggttatgtgg acaaaatacc 13980

tggttaccca ggccgtgccg gcacgttaac cgggctgcat ccgatgcaag tgtgtcgctg 14040

tcgacgagct cgcgagctcg gacatgaggt tgccccgtat tcagtgtcgc tgatttgtat 14100

tgtctgaagt tgtttttacg ttaagttgat gcagatcaat taatacgata cctgcgtcat 14160

aattgattat ttgacgtggt ttgatggcct ccacgcacgt tgtgatatgt agatgataat 14220

cattatcact ttacgggtcc tttccggtga tccgacaggt tacggggcgg cgacctcgcg 14280

ggttttcgct atttatgaaa attttccggt ttaaggcgtt tccgttcttc ttcgtcataa 14340

cttaatgttt ttatttaaaa taccctctga aaagaaagga aacgacaggt gctgaaagcg 14400

agctttttgg cctctgtcgt ttcctttctc tgtttttgtc cgtggaatga acaatggaag 14460

tccgagctca tcgctaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat attcgatgcg 14520

gccgcaaggg gttcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 14580

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaatacca cacagatgcg 14640

taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag ctgcgcaact gttgggaagg 14700

gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 14760

gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 14820

tgaattgtaa tacgactcac tatagggc 14848

Claims (5)

1.一种发酵生产UK 2A的方法，其特征在于，其包括将基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养；

所述基因工程菌为在白色链霉菌(Streptomyces albus)中表达如SEQ ID NO:1所示序列的生物合成基因簇的基因工程菌；所述UK 2A的CAS号为167173-85-5；

所述发酵培养基包括90g/L-130g/L的葡萄糖、20g/L-50g/L的豆粕粉、5g/L-10g/L的柠檬酸三铵、5g/L-10g/L的硫酸铵、3g/L-7g/L的酵母提取物、1g/L-3g/L的CaCO₃和0.5g/L-2g/L的NaCl。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白色链霉菌为白色链霉菌(Streptomyces albus)ATCC3004。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过将含有所述生物合成基因簇的质粒导入所述白色链霉菌中得到所述基因工程菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述质粒的骨架序列如SEQ ID NO:18所示。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，

所述葡萄糖的浓度为90g/L；

和，所述豆粕粉的浓度为35g/L；

和，所述柠檬酸三铵的浓度为5g/L；

和，所述硫酸铵的浓度为5g/L；

和，所述酵母提取物的浓度为5g/L；

和，所述CaCO₃的浓度为2g/L；

和，所述NaCl的浓度为1g/L。