CN107541481B - 一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用。所述的产表阿霉素的基因工程菌，是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～9所示。所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，其含有核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示的dnmV基因破坏用质粒。所述产表阿霉素的基因工程菌拥有极高的产表阿霉素的能力，最高产量达到201mg/L，效率高、收率高。该基因工程菌获得后能够直接再培养基上发酵获得表阿霉素，操作步骤少而简便，环保节能。

Description

一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用。

背景技术

表阿霉素是一种蒽环类抗生素，分子式为C₂₇H₂₉O₁₁N，为细胞周期非特异性药，对处于S期细胞的作用最强，对M、G1和G2期也有作用，是目前临床应用最广泛的抗肿瘤药物之一。

表阿霉素与阿霉素的区别只是在氨基糖部分4’位的羟基构型不同，而这种立体结构的细微变化导致表阿霉素的心脏和骨髓毒性明显降低。表阿霉素与阿霉素的结构式参见式Ⅰ，其中阿霉素的R₁为H，R₂为OH；而表阿霉素的R₁为OH，R₂为H。

目前表阿霉素主要以柔红霉素或阿霉素为原料通过化学半合成进行生产。这种化学半合成方法不仅收率较低，而且反应步骤多，操作繁琐，并会造成环境污染。而目前还没有通过基因改造的方法，实现直接发酵生产表阿霉素的任何报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在只能通过化学半合成方法制备表阿霉素，收率低、步骤多、操作繁琐、会产生污染的缺陷，提供了一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用。

本发明人经过深入的研究和反复的试验，发现通过利用dnmV基因破坏用质粒构建波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)的dnmV破坏株不产阿霉素，以该dnmV破坏株为宿主，采用接合转移的方法导入特殊选择的、含有表位型酮基还原酶基因，得到能够高产表阿霉素的转化体，即得产表阿霉素的基因工程菌，完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种产表阿霉素的基因工程菌，其是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～9所示。

本发明中，核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～9所示的所述表位型酮基还原酶基因，分别为chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)来源的酮基还原酶基因chlE，万古霉素生产菌(Amycolatopsis orientales)来源的酮基还原酶基因vacE、阿维菌素生产菌(Streptomyces avermitilis)来源的酮基还原酶基因aveBIV、Saccharopolyspora erythraea来源的酮基还原酶基因EryBIV、Streptomycesmycarofaciens来源的酮基还原酶基因mycE、Streptomyces olivocromogenes来源的酮基还原酶基因oleU、Amycolatopsis decaplanina来源的酮基还原酶基因AmyE、不可培养的土壤细菌来源的酮基还原酶基因VEG33和不可培养的微生物CA878来源的酮基还原酶基因CA878-36。

本发明中，上述酮基还原酶基因编码的酮基还原酶的氨基酸序列依次如序列表SEQ ID No.10～18所示。

本发明所述的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)为本领域常规的波塞链霉菌，较佳地为保藏号为ATCC 27952的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)。波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 27952为本领域常规的波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)ATCC 27952，较佳地购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。

本发明中，较佳地，所述的重组载体含有Hind III、BamHI、XbaI和NdeI的酶切位点。较佳地，所述重组载体还含有ermE*启动子和/或终止子序列。

本发明所述的重组载体为本领域常规的重组载体，较佳地为质粒Pset152或质粒Pkc1139。

本发明中，较佳地，所述的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示。

更佳地，所述dnmV破坏株由包括以下步骤的制备方法制得：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

(2)、将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株。

本发明所述制备方法中，步骤(1)为：扩增获得波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示。其中，扩增dnmV基因的引物为本领域常规的引物，较佳地为DnmV点-5’和DnmV点-3’，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.29～30所示。获得所述插入终止密码子的dnmV基因的方法为本领域常规的方法，较佳地为重叠PCR法。更佳地，所述重叠PCR法包括三步反应，所使用的引物分别为引物Dau5-HindIII和dnmV3-84、引物dnmV5-84和Dau3-XbaI以及引物Dau5-HindIII和Dau3-XbaI。所述引物Dau5-HindIII、dnmV3-84、dnmV5-84和Dau3-XbaI的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.19～22所示。所述dnmV基因破坏用质粒的载体为本领域常规的载体，较佳地为质粒Pset152或质粒Pkc1139。

本发明所述制备方法中，步骤(2)为：将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株。其中，所述接合前，较佳地包括选择安普霉素抗性株的步骤。所述选择使用的安普霉素的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为50μg/mL。所述接合后，较佳地包括选择安普霉素敏感性菌株的步骤。所述选择使用的安普霉素的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为50μg/mL。

本发明的技术方案之二为：提供一种上述产表阿霉素的基因工程菌的制备方法，其包括以下的步骤：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

(2)、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株；

(3)、制备得到质粒pET22b(+)-E*，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.31所示；制备得到质粒pSP72-Ter，所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；

(4)、得到酮基还原酶基因，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQID No.1～9所示；

(5)、将步骤4所得的酮基还原酶基因用NdeI和HindIII双酶切后，插入到步骤3所得质粒pSP72-Ter，得到中间质粒A；

(6)、将步骤5所得的中间质粒A用NdeI和BamHI双酶切后，分别连接到步骤3所得的质粒pET22b(+)-E*上，得到中间质粒B；

(7)、将步骤6所得的中间质粒B用XbaI-BamHI双酶切后，插入质粒Pset152，得到接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；

(8)、将步骤2所得的不产阿霉素的dnmV基因破坏株作为宿主，采用接合转移的方法导入步骤7所得的接合转移质粒，即得产表阿霉素的基因工程菌。

较佳地，其包括以下的步骤：

1、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

2、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株；

3、制备得到质粒pET22b(+)-E*，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.31所示；制备得到质粒pSP72-Ter，所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.32所示；

4、全合成得到chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因chlE、万古霉素生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因vacE、阿维菌素生产菌(Streptomyces avermitilis)的酮基还原酶基因aveBIV、Saccharopolyspora erythraea的酮基还原酶基因EryBIV、Streptomyces mycarofaciens的酮基还原酶基因mycE、Streptomyces olivocromogenes的酮基还原酶基因oleU、Amycolatopsis decaplanina的酮基还原酶基因AmyE、不可培养的土壤细菌的酮基还原酶基因VEG33或不可培养的微生物CA878的酮基还原酶基因CA878-36，所述酮基还原酶基因chlE、vacE、aveBIV、EryBIV、mycE、oleU、AmyE、VEG33或CA878-36的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～9所示；

5、将步骤4所得的酮基还原酶基因用NdeI和HindIII双酶切后，插入到步骤3所得质粒pSP72-Ter，分别得到质粒pSP72-Ter-chlE、pSP72-Ter-vacE、pSP72-Ter-aveBIV，pSP72-Ter-EryBIV、pSP72-Ter-mycE、pSP72-Ter-oleU、pSP72-Ter-AmyE、pSP72-Ter-VEG33或pSP72-Ter-CA878-36，统称中间质粒A；

6、将步骤5所得的中间质粒A用NdeI和BamHI双酶切后，分别连接到步骤3所得的质粒pET22b(+)-E*上，得到pET22b(+)-E*-Ter-chlE、pET22b(+)-E*-Ter-vacE、pET22b(+)-E*-Ter-aveBIV、pET22b(+)-E*-Ter-avrE、pET22b(+)-E*-Ter-EryBIV、pET22b(+)-E*-Ter-mycE、pET22b(+)-E*-Ter-oleU、pET22b(+)-E*-Ter-AmyE、pET22b(+)-E*-Ter-VEG33或pET22b(+)-E*-Ter-CA878-36，统称中间质粒B；

7、将步骤6所得的中间质粒B用XbaI-BamHI双酶切后，插入质粒Pset152，分别得到质粒p-chlE、p-vacE、p-aveBIV、p-avrE、p-EryBIV、p-mycE、p-oleU、p-AmyE、p-VEG33或p-CA878-36，统称接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；

8、将步骤2所得的不产阿霉素的dnmV基因破坏株作为宿主，采用接合转移的方法导入步骤7所得的接合转移质粒，即得产表阿霉素的基因工程菌DoxN-1/p-chlE、DoxN-1/p-vacE、DoxN-1/p-aveBIV、DoxN-1/p-avrE、DoxN-1/p-EryBIV、DoxN-1/p-mycE、DoxN-1/p-oleU、DoxN-1/p-AmyE或DoxN-1/p-VEG33。

本发明的技术方案之三为：一种所述的产表阿霉素的基因工程菌在制备表阿霉素中的应用。

采用本发明所述产表阿霉素的基因工程菌制备表阿霉素的方法，包括如下的步骤：

(1)将所述产表阿霉素的基因工程菌接种到发酵培养基，发酵，得发酵液；

(2)将步骤(1)所得的发酵液pH调至1.5～1.8，超声，离心即可。

本发明所述的方法中，步骤(1)为将所述产表阿霉素的基因工程菌接种到发酵培养基，发酵，得发酵液。其中，所述发酵培养基为本领域常规的发酵培养基，能够使所述产表阿霉素的基因工程菌生长产生表阿霉素即可。所述接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为10％(v/v)。所述发酵的温度为本领域常规的温度，较佳地为28℃。所述发酵的时间为本领域常规的时间，较佳地为7天。较佳地，所述接种前还包括以下的步骤：将所述产表阿霉素的基因工程菌接种到种子培养基培养得种子液。所述种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地包含5g/L葡萄糖、30g/L黄豆粉、1g/L NaCl、1g/L KH₂PO₄和1g/L MgSO₄·7H₂O，pH值为7.2。所述接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为10％(v/v)。所述培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28℃。所述培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为2天。

本发明所述的方法中，步骤(2)为将步骤(1)所得的发酵液pH调至1.5～1.8，超声，离心即可。其中，所述超声的时间为本领域常规的时间，较佳地为30分钟。所述离心的时间为本领域常规的时间，较佳地为5分钟。所述离心的转速为本领域常规的转速，较佳地为12000rpm。

本发明的技术方案之四为：一种不产阿霉素的转化体，其为波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示。

较佳地，所述不产阿霉素的转化体由包括以下步骤的制备方法制得：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

(2)、将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的转化体。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明提供的转化体完全不产阿霉素，为进一步构建基因工程菌高产表阿霉素起到重要的积极作用。本发明提供的产表阿霉素的基因工程菌拥有极高的产表阿霉素的能力，最高产量达到201mg/L，效率高、收率高。同时，该基因工程菌获得后能够直接再培养基上发酵获得表阿霉素，操作步骤少而简便，环保节能。

附图说明

图1为波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 27951基因组的电泳图谱。

图2为dnmV基因破坏用质粒p153的质粒图谱。

图3为接合转移质粒p-chlE的质粒图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

阿霉素生物合成基因的酮基还原酶基因(dnmV)的克隆

将能够产阿霉素的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 27951(购自美国模式菌种收集中心，ATCC)接种于25mL TSB培养基(购自上海博微生物科技有限公司)中，28℃、220rpm振荡培养48小时，得培养液。将培养液用12000rpm离心5min，倒出上清，回收菌体。

按照细菌基因组提取方法进行基因组提取(参见《精编分子生物学实验指南》，F.M·奥斯伯等著，科学出版社，2008-05-01)，并进行电泳验证(参见图1)。结果说明，已经提取了该波塞链霉菌的基因组DNA。

合成引物，引物的序列如序列表SEQ ID No.20～21所示。

DnmV-5’：5’-ATGCGGGTCGTGGTTCTGGGG-3’；

DnmV-3’：5’-CTAGGCCGGGGCGCCGTGCG-3’。

PCR：使用约1μg上面提取的波塞链霉菌的基因组DNA和20μmol/L的引物DnmV-5’和DnmV-3’，使用primeSTAR GXL DNA polymerase(购自大连Takara公司)。按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃1分钟，其中98℃10秒后68℃1分钟的程序循环25次，68℃10分钟。

结果特异性地扩增出约0.9kb的DNA片段，对该DNA片段的碱基序列进行分析[由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成]，结果确认是阿霉素生物合成基因的酮基还原酶基因，即dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示。

实施例2

dnmV基因破坏用质粒pdnmV-152的构建

以实施例1中制备的波塞链霉菌的基因组DNA为模板，采用重叠PCR的方法，通过在翻译区域插入终止密码子来破坏dnmV基因，从而得到含有插入终止密码子的dnmV基因的DNA片段。

使用的引物如下，这些引物的序列如序列表SEQ ID No.19～22所示。

Dau5-HindIII：

5’-GGGAAGCTTGATCGCCCTCACGGAACTGCGCAGGCGCGG-3’

dnmV3-84：

5’-CGCAGATGCGACTACGTCATCTCCTCCTCGGTGTCGCC-3’

dnmV5-84：

5’-GGCGACACCGAGGAGGAGATGACGTAGTCGCATCTGCG-3’

Dau3-XbaI：

5’-GGGTCTAGAGCCGGCATGCGGATCGGCATGGAGGTG-3’

(1)重叠PCR的第一步反应：

在50μL的反应体系中，使用引物Dau5-HindIII和dnmV3-84各20μM以及基因组DNA模板1μL，利用primeSTAR GXL DNApolymerase(购自大连Takara公司)按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃1分钟30秒，并且该98℃10秒后68℃1分钟30秒的程序循环25次，再68℃10分钟。

PCR结束后，使用1％(w/w)琼脂糖凝胶120V下电泳45分钟。结果发现，特异性地扩增了约1.3kb的DNA片段，切胶，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收(购自生工生物工程有限公司，并按照说明书的记载进行胶回收)，得第一步反应的PCR产物，最后溶到30μL纯水中。

(2)重叠PCR的第二步反应：

在50μL的反应体系中，使用引物dnmV5-84和Dau3-XbaI各20μM以及基因组DNA模板1μL，利用primeSTAR GXL DNApolymerase(购自大连Takara公司)按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃2分钟30秒，并且该98℃10秒后68℃2分钟30秒的程序循环25次，再68℃10分钟。

PCR结束后，使用1％(w/w)琼脂糖凝胶120V下电泳45分钟。结果发现，特异性地扩增了约2.2kb的DNA片段，切胶，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收(购自生工生物工程有限公司)，得第二步反应的PCR产物，最后溶到30μL纯水中。

(3)重叠PCR的第三步反应：

在50μL的反应体系中，使用引物Dau5-HindIII和Dau3-XbaI各20μM，以第一步反应的PCR产物和第二步反应的PCR产物为模板(各加1μL)，利用primeSTAR GXL DNApolymerase(购自大连Takara公司)按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃3分钟30秒，并且98℃10秒后68℃3分钟30秒的程序循环25次，再68℃10分钟。

PCR结束后，使用1％(w/w)琼脂糖凝胶120V下电泳45分钟。结果发现，特异性地扩增了约3.5kb的DNA片段，切胶，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程有限公司)进行胶回收，最后溶到30μL纯水中，得纯化的DNA片段A。

将纯化的DNA片段A使用Pmd18-T Vector Cloning Kit得到带有纯化的DNA片段A的质粒(试剂盒购自大连Takara公司，并按照说明书记载的方法获得带有纯化的DNA片段A的质粒)。将带有纯化的DNA片段A的质粒转化DH5α大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，得携带质粒p153的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，即转化体A。其中，转化的方法参见《精编分子生物学实验指南》。

对纯化的DNA片段A的碱基序列进行测序，确定其包含插入有终止密码子的dnmV基因的DNA片段。

将放线菌的接合转移用质粒Pset152(所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示)为模板进行PCR，得到一段长度为3.1kb的DNA片段，即DNA片段B。

使用的引物如下，这些引物的序列如序列表SEQ ID No.23～24所示。

pSET152-XbaⅠ：5’-GACTCTAGAGGATCCGCGGCCG-3’；

pSET152-HindⅢ：5’-AAGCTTCTGCAGGTCGACGGATCTTT-3’

将Pset152来源的约3.1kb的DNA片段B与包含插入终止密码子的dnmV基因的约3.5kb的DNA片段A连接起来，得到了能够进行接合转移的dnmV基因破坏用质粒p153。

该dnmV基因破坏用质粒p153的图谱如图2所示。dnmV基因破坏用质粒p153的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示。

实施例3

利用dnmV基因破坏用质粒p153构建dnmV破坏株

(1)将能够产阿霉素的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 27951接种于25mL TSB培养基(购自上海博微生物科技有限公司)中，28℃、200rpm培养2天。然后按1％(v/v)的接种量转接到25mL TSB培养基中，28℃、200rpm培养1天，得培养液。将培养液离心、去上清，得菌丝体。用LB液体培养基洗涤菌丝体2次，最终悬浮于2mL的LB液体培养基中，即得宿主液。

(2)将实施例2制备的转化体A接种到含25μg/mL氯霉素、25μg/mL卡那霉素和50μg/mL安普霉素的5mL LB液体培养基中[其中，该LB液体培养基含有1％(w/w)胰蛋白胨、0.5％(w/w)酵母提取物和1％(w/w)NaCl，pH7.0-7.2]，37℃、200rpm过夜培养。按1％(v/v)的接种量接合转移到25mL相同的LB液体培养基中，37℃培养约4小时后，用该LB液体培养基洗涤2次，最终悬浮于2mL LB液体培养基中，即得大肠杆菌液。

(3)将步骤(1)制得的宿主液和步骤(2)制得的大肠杆菌液按体积比1:1的比例混合于离心管中。充分混合后，涂布于MS琼脂培养基(购自国药集团化学试剂有限公司)28℃培养20小时。再用1mL含50μg/mL安普霉素和50μg/mL奈啶酮酸的无菌水覆盖平板，于28℃培养一周，获得安普霉素抗性株。

(4)按照实施例1中提取基因组DNA的方法，提取步骤(3)获得的安普霉素抗性株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，设计安普抗性基因引物(引物Apr-5’和Apr-3’的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.25～26所示)，通过PCR分析确定dnmV基因破坏用质粒p153已经通过同源重组插入了宿主染色体的同源重组体。

(5)将步骤(4)获得的同源重组体接种于25mL TSB培养基中，28℃、200rpm培养2天得培养液甲，将培养液甲中的1mL再接种于新的25mL TSB培养基中，进行传代培养，重复该操作5～7次，得培养液乙。将培养液乙十倍稀释后涂布于MS琼脂平板培养基，28℃下培养一周。将生长出的菌落挑取接种到含有50μg/mL安普霉素的MS琼脂平板培养基和不含安普霉素的MS平板培养基上，从而挑选出20株在含有50μg/mL安普霉素的MS琼脂平板培养基上无法生长繁育的安普霉素敏感性菌株。

(6)按照实施例1中提取基因组DNA的方法，提取步骤(5)获得的安普霉素敏感性菌株的基因组DNA，并作为模板。进行PCR反应，获得约0.5kb的DNA扩增片段。

使用的引物如下，这些引物的序列如序列表SEQ ID No.29～30所示。

dnmV点-5’：5’-GGACATGCGGGTCGTGGTTCT-3’；

dnmV点-3’：5’-ATGCGGGCCCGACATGTT-3’

对这些扩增DNA片段的碱基序列进行测序(由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成)，结果发现，存在3株已经导入dnmV基因破坏用质粒p153的dnmV基因破坏株，即DoxN-1、dnmV破坏株2和dnmV破坏株3；而有17株仍然保持了原来的碱基序列的正常菌株。

实施例4

dnmV基因破坏株产阿霉素能力的测定

将实施例3获得的3株已经导入dnmV基因破坏用质粒p153的dnmV基因破坏株和正常菌株接种于25mL种子培养基(含有5g/L葡萄糖、30g/L黄豆粉、1g/L NaCl、1g/L KH₂PO₄和1g/L MgSO₄·7H₂O，pH值为7.2)中，28℃、200rpm培养2天，得种子液。

将种子液按10％(v/v)的接种量接种到25mL发酵培养基(含有50g/L糊精、30g/L酵母粉、2g/L NaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，pH值为6.2)中，28℃、200rpm培养7天，得发酵液。

使用6mol/L HCl将发酵液pH调至1.5～1.8，用无水乙醇稀释5倍于1.5ml离心管中，超声30分钟。12000rpm离心5分钟得上清，上清再用无水乙醇稀释2倍，用于HPLC分析。

HPLC分析条件如下，具体的梯度条件如表1所示，结果如表2所示。

A流动相：0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液

B流动相：0.1％(v/v)三氟乙酸乙腈溶液

柱子：Agilent Eclipse XDB-C18(购自Agilent)，3.5μm，150×4.6mm

柱温：40℃

波长：254nm

流速：0.8ml/min

表1梯度条件

表2阿霉素产量检测结果

菌株名称	阿霉素产量(mg/L)
		DoxN-1	0
dnmV破坏株2	0
		dnmV破坏株3	0
正常菌株1	305
		正常菌株2	350
正常菌株3	331

表2的结果说明，3株dnmV破坏株产生阿霉素为0，而正常菌株仍会产阿霉素。

实施例5

以dnmV破坏株为宿主表达各酮基还原酶基因

(1)通过全合成得到ermE*启动子，用XbaI和NdeI双酶切，电泳后切胶纯化，连接到质粒pET22b(+)的XbaI和NdeI位点，得到质粒pET22b(+)-E*。

通过全合成得到终止子，用HindIII和BamHI双酶切，电泳后切胶纯化，连接到质粒pSP72的HindIII和BamHI位点，得到质粒pSP72-Ter。其中，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.31所示；所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.32所示。全合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，连接等步骤参见《精编分子生物学实验指南》。

(2)通过全合成得到chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因chlE、万古霉素生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因vacE和阿维菌素生产菌(Streptomyces avermitilis)的酮基还原酶基因aveBIV，上述基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～3所示；上述酮基还原酶的氨基酸序列依次如序列表SEQ ID No.10～12所示。全合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

将所得的酮基还原酶基因chlE、酮基还原酶基因vacE和酮基还原酶基因aveBIV用NdeI和HindIII双酶切后，插入到所得质粒pSP72-Ter，依次得到质粒pSP72-Ter-chlE、pSP72-Ter-vacE、pSP72-Ter-aveBIV，统称中间质粒Ⅰ。其中，酶切和插入的步骤参见《精编分子生物学实验指南》。

(3)通过blast氨基酸序列获得其他具有表异构化的酮基还原酶，如下表3所示。

表3具有表异构化的酮基还原酶

来源菌株	基因名称
		Saccharopolyspora erythraea	EryBIV
Streptomyces mycarofaciens	mycE
		Streptomyces olivocromogenes	oleU
Amycolatopsis decaplanina	AmyE
		不可培养的土壤细菌	VEG33
不可培养的微生物CA878	CA878-36

全合成法合成EryBIV、mycE、oleU、AmyE、VEG33和CA878-36基因，并在这些基因序列的两端加入NdeI和HindIII酶切位点，得全合成基因片段。其中全合成以及加入酶切位点等步骤由北京唯尚立德生物科技有限公司完成。

表3中基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.4～9所示；表3中基因编码的酮基还原酶的氨基酸序列依次如序列表SEQ ID No.13～18所示。

将全合成基因片段用NdeI和HindIII双酶切后，分别插入步骤(1)所得的质粒pSP72-Ter的NdeI和HindIII位点，从而获得质粒pSP72-Ter-EryBIV、pSP72-Ter-mycE、pSP72-Ter-oleU、pSP72-Ter-AmyE、pSP72-Ter-VEG33和pSP72-Ter-CA878-36，统称中间质粒Ⅱ。

(4)将步骤(2)所得的中间质粒Ⅰ和步骤(3)所得的中间质粒Ⅱ用NdeI和BamHI双酶切后，连接到同样进行NdeI和BamHI双酶切的步骤(1)所得的质粒pET22b(+)-E*上，从而得到pET22b(+)-E*-Ter-chlE、pET22b(+)-E*-Ter-vacE、pET22b(+)-E*-Ter-aveBIV、pET22b(+)-E*-Ter-EryBIV、pET22b(+)-E*-Ter-mycE、pET22b(+)-E*-Ter-oleU、pET22b(+)-E*-Ter-AmyE、pET22b(+)-E*-Ter-VEG33或pET22b(+)-E*-Ter-CA878-36，统称中间质粒Ⅲ。

(5)用XbaI和BamHI分别将步骤(4)所得的中间质粒Ⅲ用XbaI-BamHI双酶切后，连到质粒Pset152的XbaI-BamHI酶切片段上，得到质粒p-chlE、p-vacE、p-aveBIV、p-EryBIV、p-mycE、p-oleU、p-AmyE、p-VEG33或p-CA878-36，统称接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示。

其中，接合转移质粒p-chlE质粒图谱参见图3。

(6)将实施例4中dnmV破坏株DoxN-1作为宿主，采用接合转移的方法导入上述9种接合转移质粒，获得表阿霉素生产菌株DoxN-1/p-chlE、DoxN-1/p-vacE、DoxN-1/p-aveBIV、DoxN-1/p-EryBIV、DoxN-1/p-mycE、DoxN-1/p-oleU、DoxN-1/p-AmyE或DoxN-1/p-VEG33。其中接合转移等步骤参见实施例3中接合转移的相关步骤。

效果实施例1

按实施例4中的发酵培养、发酵液处理和HPCL检测方法，分析实施例5所获得的表阿霉素生产菌株DoxN-1/p-chlE、DoxN-1/p-vacE、DoxN-1/p-aveBIV、DoxN-1/p-EryBIV、DoxN-1/p-mycE、DoxN-1/p-oleU、DoxN-1/p-AmyE或DoxN-1/p-VEG33和实施例4中dnmV破坏株DoxN-1的表阿霉素的生产量。

结果如表4所示，表4说明，上述表阿霉素生产菌株均高产表阿霉素。其中，导入chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因chlE的表阿霉素生产菌株DoxN-1/p-chlE生产表阿霉素的能力最好，将其命名为SIPI-ED01。

表4表阿霉素产量的检测结果

菌株	表阿霉素产量(mg/L)
		DoxN-1/p-chlE	201
DoxN-1/p-vacE	110
		DoxN-1/p-aveBIV	80
DoxN-1/p-EryBIV	11
		DoxN-1/p-mycE	23
DoxN-1/p-oleU	15
		DoxN-1/p-AmyE	35
DoxN-1/p-VEG33	17
		DoxN-1/p-CA878-36	15
DoxN-1	0

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No:2所示，所述波塞链霉菌为波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)ATCC 27952；

所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:28所示。

2.如权利要求1所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，所述dnmV破坏株由包括以下步骤的制备方法制得：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)的dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No:27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:28所示；

(2)、将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株。

3.如权利要求2所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中，获得所述插入终止密码子的dnmV基因的方法为重叠PCR法，所述重叠PCR法所使用的引物Dau5-HindIII、dnmV3-84、dnmV5-84和Dau3-XbaI的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No:19～22所示；步骤(2)中，所述接合前包括选择安普霉素抗性株的步骤；或者，所述接合后包括选择安普霉素敏感性菌株的步骤。

4.一种产表阿霉素的基因工程菌的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No:27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:28所示；

(2)、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株；

(3)、制备得到质粒pET22b(+)-E*，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQID No:31所示；制备得到质粒pSP72-Ter，所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQID No:32所示；

(4)、得到酮基还原酶基因，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示；

(5)、将步骤4所得的酮基还原酶基因用NdeI和HindIII双酶切后，插入到步骤3所得质粒pSP72-Ter，得到中间质粒A；

(6)、将步骤5所得的中间质粒A用NdeI和BamHI双酶切后，分别连接到步骤3所得的质粒pET22b(+)-E*上，得到中间质粒B；

(7)、将步骤6所得的中间质粒B用XbaI-BamHI双酶切后，插入质粒Pset152，得到接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:33所示；

(8)、将步骤2所得的不产阿霉素的dnmV基因破坏株作为宿主，采用接合转移的方法导入步骤7所得的接合转移质粒，即得产表阿霉素的基因工程菌。

5.如权利要求1-3任一项所述的产表阿霉素的基因工程菌在制备表阿霉素中的应用。

6.一种利用如权利要求1-3任一项所述的产表阿霉素的基因工程菌制备表阿霉素的方法，其特征在于，其包括如下的步骤：

(1)将所述产表阿霉素的基因工程菌接种到发酵培养基，发酵，得发酵液；

(2)将步骤(1)所得的发酵液pH调至1.5～1.8，超声，离心即可。

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