CN101978043A - 产生可用作抗癌药的蒽环类代谢物的遗传修饰菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微生物菌株，其以至少0.5g/升发酵液的滴度产生蒽环代谢物。

Description

产生可用作抗癌药的蒽环类代谢物的遗传修饰菌株
技术领域
本发明涉及波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)的遗传修饰菌株及其用途，即将这种菌株用于通过单批发酵来产生高滴度(titre)的蒽环类代谢物(如4′-表道诺红菌素(4′-epidaunorubicin)、13-二氢-表道诺红菌素、4′-表-领地霉素和ε-紫红霉酮)的混合物，该混合物可用在本发明的下游工艺中，来生产活性药用成分表阿霉素和/或去甲柔毛霉素。
背景技术
道诺霉素类化合物是一类由多种链霉菌(如波赛链霉菌、天兰淡红链霉菌(S.coerulorubidus)、灰色链霉菌(S.griseus)、链霉菌C5(Streptomyces sp.C5)、波塞链霉菌表灰变种(S.peucetius var.caesius)和分枝链霉菌(S.Bifurcus))产生的抗肿瘤抗生素。这类抗肿瘤抗生素中的基本化合物为道诺霉素(DiMarco等人，1964)。自从1967年和1971年起，道诺霉素及其14-羟基衍生物阿霉素分别开始被用于癌症化疗。道诺霉素尤其被用于血癌的治疗，而阿霉素展示出了较宽的抗瘤谱。在目前已知被用于临床应用的所有七种蒽环类药物中，有六种属于道诺霉素类。在这些化合物的生产工艺中，使用道诺红菌素(daunorubicin)或其糖苷配基-道诺红菌素酮作为起始物料以进行化学合成。
蒽环类化合物被用于癌症化疗中已超过三十年的时间。阿霉素由于具有非常宽的抗瘤谱，因此目前仍为主要使用的细胞毒素类药物。表阿霉素是重要程度仅次于阿霉素的抗肿瘤抗生素，现在表阿霉素变得更为重要了。
道诺霉素类化合物可由通式I表述，
Figure G200880015212XD00021
其最重要的衍生物示于表1中。
表1
Figure G200880015212XD00022
表阿霉素在临床中被用于治疗多种癌症。随着表阿霉素与阿霉素的竞争，其市场不断增长。新配方、缀合物以及与其他抗癌药物的新组合也扩大了表阿霉素的应用范围。例如，美国专利5,874,550中披露了表阿霉素的生产工艺，其包括通过发酵制备道诺红菌素，并对糖苷配基和糖部分进行合成修饰。
去甲柔毛霉素(4-去甲氧道诺红菌素)被用于治疗某些类型的癌症，包括白血病、淋巴瘤、以及其他骨髓疾病。据称，去甲柔毛霉素所造成的副作用小于阿霉素。然而，去甲柔毛霉素每年的全球市场份额不超过20kg，这可能是由于其生产工艺极为复杂，从而导致价格过高。由道诺霉素酮(daunomycinone)生产去甲柔毛霉酮(idarubicinone)，其中道诺霉素酮是通过道诺红菌素的发酵以及随后的酸水解而获得的。继续对道诺红菌素酮(daunorubicinone)进行合成修饰，以得到去甲柔毛霉酮。按照(例如)美国专利No.4,325,946中所述，通过一系列复杂的合成反应连接糖残基道诺糖胺(daunosamine)。在基因工程以前，几乎不可能生成可生产所需的非内源性物质的菌株。尽管对化学结构的修饰是微小的，例如表道诺红菌素与道诺红菌素的区别仅在于道诺糖胺部分中的4′OH基团的立体化学结构的不同，但是仍需要多次突变以造成这些改变。这意味着需要进行多次诱变，并且选取并测试百万个克隆，以找到化学结构的所需改变。
现在，人们深知细菌菌株的遗传修饰简便了非内源性物质的生产。然而，人们也认识到，尽管这些菌株以相对较高的水平产生内源性代谢物，但是其所累积的外源代谢物、杂合化合物的量较低。这使得其经济效益不高，因而该工艺通常不具备商业可行性。
欧洲专利公开EP1123310描述了这样一种对蒽环类化合物的糖部分的成功修饰，其将基因snogC导入可产生蒽环的菌株，从而形成了阿克拉菌酮-4′-表-2-脱氧岩藻糖。然而，如上述那样，其生产滴度较低。
此外，通常不能由复杂的基质(complex matrix)的纯化得到所需代谢物，其中复杂的基质通常包含10到20种类似产物。而产率低的另一原因是生产菌株对非内源性化合物的耐性较差。通过向发酵液中逐步加入毒性产物(例如表道诺红菌素、表阿霉素或去甲柔毛霉素)以使生产菌株适应非内源性代谢物的这种做法耗时很长，并且优选导致对生产菌株毒性较低的代谢物的累积。
目前，在(例如)国际专利公开WO 2006/111561 A1中公布了关于以生物技术产生蒽环表阿霉素的产率及经济效益方面的一些进步。通过对链霉菌属中波赛链霉菌的菌株进行诱变处理，可获得这样的微生物菌株，该菌株以至少0.1g/升发酵液的浓度产生表波赛链霉菌(表阿霉素前体)和/或表阿霉素本身。
在多个出版物中描述了蒽环类化合物的生物合成路径以及底物特异性(最近的一篇综述可参见Niemi等人，2002)，不过对于道诺霉素生物合成的最终步骤、在糖基化后进行的糖苷配基修饰反应以及其中的分子遗传学，人们尚未充分理解。其生物合成路径示于图1中。蒽环类化合物的合成看来是连续的。正在开发道诺霉素类的一些新配方、缀合物、新分子以及前体药物，以用于抗癌药物。由道诺红菌素开始，通过化学合成来生产蒽环是一种多步工艺，其最终产率较低，这表明需要对工艺进行改进。因此，非常需要经改进的生产菌株以及高效且商业上可行的生产工艺。
附图说明
图1为属于蒽环类化合物的道诺霉素类药物的生物合成路径示意图。
图2为生产并从发酵批料中分离出表道诺霉素类化合物粗品以及ε-紫红霉酮的示意图。
图3示出了识别由微生物菌株获得的代谢物的典型层析谱，其中该菌株为本发明的能够以高滴度产生表道诺霉素以及ε-紫红霉酮的菌株。典型的代谢物分布：Rt＝6.95013-DHED，Rt＝7.8504′-表领地霉素，Rt＝8.7254′-表道诺红菌素，Rt＝15.842ε-紫红霉酮
发明内容
在本说明书中，将诸如表道诺红菌素(CAS#56390-08-0)、13-二氢-表道诺红菌素(即，4′-表-柔毛霉素醇，下文中称为13-DHED)、以及表领地霉素(由于其与Feudomycin B类似而获此命名)之类的表道诺霉素统称为表道诺霉素类化合物。
本发明涉及经遗传修饰改善的生产菌株，优选为衍生自波赛链霉菌的菌株，其以至少0.5g/升发酵液的滴度产生包含非内源性代谢物(如表道诺霉素类化合物)在内的蒽环代谢物混合物，这种蒽环代谢物混合物随后可用以生产蒽环抗生素，尤其是表阿霉素和去甲柔毛霉素。
在本发明中，我们使用了波塞链霉菌表灰变种(S.peucetius var.caesius)的突变菌株(其保藏于DSMZ，保藏号为No.DSM 12245)，其为巴尤霉素的生物合成阻断菌株，并且能够以超过野生型菌株上百倍的滴度产生道诺霉素。该菌株还产生大量的ε-紫红霉酮。通过用基因ekr8来替换功能基因dnmV(Otten等人，1997)，以进一步对该菌株进行基因修饰，这样使得道诺霉素代谢物在4′位上具有相反的立体化学结构，从而提供了表道诺霉素代谢物类。用于替换的基因是在鸟枪法克隆实验中意外发现的，该实验涉及利用得自snogC的探针从细菌培养物中分离基因(Torkkell等人，2001)。该命名为G001/pB70dv的遗传修饰菌株以约800mg/升发酵液的滴度累积表道诺红菌素代谢物，同时以200mg/升至300mg/升的相对较高的水平产生ε-紫红霉酮。然而，经发现，表道诺霉素代谢物的混合物含有被称作表洋红霉素的4-OH化合物，使得纯化工艺变得有些复杂。
从宿主菌株G001中除去质粒pB70dv，并向由此获得的菌株中导入可获得的不同基因构建体，令人惊讶的是，质粒pB89rdmB使得菌株可产生表道诺霉素代谢物，而未产生表洋红霉素。此外，当用诱变剂对该菌株培养物进行再次处理时，生产滴度得到了出人意料的提高。通过试管培养对产生表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的200个突变体进行研究，从而识别出高产菌株，即所产生的蒽环代谢物超过1g/升发酵液。这些菌株产生了良好的表道诺霉素代谢物和ε-紫红霉酮的混合物：典型的为表道诺红菌素∶13-DHED∶4′-表领地霉素∶ε-紫红霉酮的滴度分别为600mg/l∶500mg/l∶200mg/l∶200mg/l。在全部的培养物中，还发现了少量副产物表阿霉素。
对于这些菌株，糖苷配基部分的糖基化并未进行完全，并且在发酵液中发现了大量的关键的生物合成中间物ε-紫红霉酮。在发酵液中使用树脂，并对这些经遗传修饰菌株进行培养，产生了更高滴度的代谢物，并且简化了下游工艺。
本发明还涉及产生并从单批的发酵物料中分离出表道诺霉素类化合物粗品以及ε-紫红霉酮的方法，其中表道诺霉素类化合物包括表道诺红菌素、13-二氢-表道诺红菌素(13-DHED)、4′-表领地霉素。
本发明的工艺流程大致描述于图2中。
本发明的目的在于使表道诺霉素和ε-紫红霉酮的产生最大化，并使非内源性副产物的产生最小化，从而以这种方式简化随后的下游工艺。适用于本发明生产工艺中的生产菌株的重要方面为：
i)其粗代谢物分布适于下游工艺处理，并且
ii)其过生产(overproduction)能力不受菌株对表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮敏感性的限制。
在本发明工艺中，将单批的发酵物料用作表阿霉素和去甲柔毛霉素(两种都是具有重要商业价值的蒽环类化合物)的合成材料的来源。
发明详述
考虑到现有工艺的已知缺陷，能够在单批发酵中提供高滴度的非内源性代谢物的混合物是具有重大的经济利益的，该非内源性代谢物的混合物适于进行随后的多于一种的蒽环抗生素的生产，尤其是表阿霉素和去甲柔毛霉素的生产。为了简化随后的下游加工工序，本发明在经济上更重要的方面是尽可能地避免其他的内源性化合物的形成。所有这些即为本发明的目的。
为了达到更为高效的生产目的，最初使用经优化的菌株并通过单批发酵来产生一种蒽环，如表阿霉素。但是进行具有商业可行性的生产工艺的最佳方案是利用这样的修饰菌株，该修饰菌株能够在单批发酵中在同一时间以高滴度产生代谢物混合物，该代谢物混合物可用作生产多于一种的蒽环抗生素的起始物料。
本发明提供了经改善的生产菌株，其用于通过发酵来产生表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的工艺中。若干种链霉菌菌株可产生道诺霉素，而优选将波赛链霉菌用作本发明中表道诺霉素类化合物的生产菌株。在本发明说明书(包括实施例)中，波塞链霉菌表灰变种G001(DSM12245)被用作亲本菌株，该亲本菌株被用以进行遗传修饰，从而获得能够累积表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的菌株。
然而，任何具有如下特征的菌株均适用于该工艺：
1.具有较高的表道诺霉素代谢物产生能力：总量超过0.1g/升。
2.不完全的糖基化体系，从而在发酵过程中获得ε-紫红霉酮：其份额超过总蒽环代谢物部分的10％。
3.分别以总蒽环代谢物部分的至少10％的量产生表道诺红菌素、13-DHED、表领地霉素和ε-紫红霉酮所有这些代谢物。
4.产生道诺红菌素及相关代谢物的生物合成路径被阻断。
波塞链霉菌表灰变种G001的突变菌株被用作本发明的亲本菌株。然而，具备产生道诺霉素类化合物的生物合成机理的一些其他菌株同样适用。该菌株中的产生鲍霉素的过程被化学诱变剂NTG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)阻断，对相应基因dnrH进行测序，以识别出造成阻断鲍霉素生产的点突变。该点突变引起氨基酸发生改变；Gly被Asp替换。尽管任何道诺红菌素生产菌株都是适合的，然而鲍霉素的生物合成受到阻断的高产菌株为本发明的优选宿主菌株。
可通过能得到在受选宿主(selected host)中进行表达的基因的任何已知方法，来进行4′-酮还原酶基因的克隆。我们将得自基因snogC的DNA片段(Ylihonko等人(1999)报道示出其能够产生4′表蒽环类化合物)用作探针以筛选相应的酮还原酶基因，该酮还原酶基因与道诺糖胺路径中的糖基转移酶(例如ekr8)具有较好的协同作用。使用大肠杆菌作为基因文库的宿主菌株，杂交是有利的筛选策略。用于杂交的探针可以是任何得自snogC或类似基因的片段，其可通过具有合适的限制位点的亚克隆或通过PCR扩增来产生。将基因文库用的菌落转移至膜上，以进行滤膜杂交，通常使用尼龙膜。可使用任何方法来检测杂交，然而尤其可使用DIG系统(Boehringer Mannheim，GmbH，Germany)。由于探针与杂交DNA是异源的，因此根据Boehringer Mannheim手册：DIS System User’s Guide for Filterhybridization，优选在65℃以及较低的盐浓度下进行杂交的严谨洗涤。利用带有ekr8的菌株来监测发酵液中的表道诺霉素类化合物(除了ε-紫红霉酮以外)，从而通过该实验来证实基因的功能，其中ekr8被克隆于高拷贝数表达载体pIJE486中。任何能够改变道诺糖胺中4′-OH基团的立体化学结构的4′-酮还原酶均适于被克隆至产生道诺红菌素的菌株中，以使其根据本发明产生表道诺霉素(除了ε-紫红霉酮以外)，然而优选的是，该基因能够高效表达。根据道诺霉素类化合物的生物合成路径，基因dnmV(Otten等人，1997)主管道诺糖胺路径中的酮还原步骤。这个特别的基因是被转入基因的竞争者，因此优选使基因dnmV失活或将其除去。可通过任何已知扰乱基因功能的技术来实现基因dnmV的失活。为达到该目的，优选的是同源重组以进行基因失活。也可通过诸如化学诱变的随机技术来造成基因的突变。
将基因ekr8克隆于不同构建体中，并将这些构建体导入通过除去亲本菌株G001中的质粒而获得的菌株中，并对所获菌株的代谢物进行分析。从一个克隆的代谢物分布来看，它有望用于下游工艺。该克隆载有质粒pB89rdmB(rdmB，参见Jansson等人，2003)，并且表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的生产滴度几乎相当于菌株G001产生的道诺霉素类化合物滴度的50％。质粒pB89rdmB含有基因ekr8和rdmB。将该克隆称作G005a。该基因构建体可在任何能够在链霉菌中复制的载体中进行表达。然而，优选将高拷贝数质粒用作载体。对于本发明而言，经发现质粒载体pIJE486(Ylihonko等人，1996)是有利的。
已经有关于将DNA导入宿主细胞中的若干方法的描述。极为优选的方法为原生质体转化，本发明中一直使用了该方法。然而，任何被用以产生菌株、以使该菌株具有本发明菌株特征的方法和载体、以及上述方法和载体均可使用。
经发现，上述含有质粒pB89rdmB的菌株对道诺霉素类化合物不具有足够的内源抗性，因此对表道诺霉素类化合物有些敏感，从而导致菌株的稳定性较差，这可由重复培养中所发现的生产滴度的改变而看出。通过使其适应表阿霉素或表道诺红菌素可增强其耐受性，从而提高13DHED的滴度。用诱变剂在严谨条件下对该菌株培养物进行处理，尽管可使用任何化学诱变剂，然而优选的是NTG。与含有pB89rdmB的克隆相比，通过诱变处理获得了这样的克隆，其产生的相同代谢物的量得以提高，并且还观察到其具有长期稳定性。稳定性对于商业化生产而言是很关键的因素，因此尽管这一点很令人意外，但仍然是非常有利的。在无选择压力的条件下，该遗传修饰菌株是稳定的。该新克隆在第八天达到生产量的高峰，而亲本菌株G001则在第六天达到最高生产量。通常来说，突变菌株所产生的主要产物为表道诺红菌素、13-DHED、表领地霉素和ε-紫红霉酮，而其他种类的蒽环级分不足产量的10％。
表2提供了关于本发明菌株的典型代谢物分布的信息。含量单位为mg/l。
表2
菌株 4′-表道诺红菌素 13-DHED 4′-表领地霉素B   其他表道诺霉素类化合物(未具体指明)* ε-紫红霉酮
  G001/pB70dv   250-350   50-150   无   350-450   200-300
  含有pB89rdmB的克隆 350-450 250-400 150-250 ＜100 150-300
  经NTG诱变处理菌株 500-700 400-600 150-300 ＜100 150-300
*主要为表洋红霉素
在试图使用波赛链霉菌或相关菌株以生产用于临床应用的蒽环类化合物时，人们所熟知的困难是其稳定性较差，即从产率方面来看，菌株培养物的生产滴度会发生改变。使用这种菌株在经济上是不可行的，最糟糕时，其会造成很大的经济损失，在最坏的情况中，会导致癌症患者不能得到所需的细胞毒性药物。菌株在产率方面的不稳定性是由道诺红菌素以及相关代谢物的诱变所导致的。因此，本发明的稳定的生产菌株对于生产蒽环类化合物是有利的，并且能够保证持续地供应重要的细胞毒性抗癌药物。
可在含有适合的营养源的培养基中来进行本发明经修饰的生产菌株的培养，优选为链霉菌菌株，最优选为波赛链霉菌菌株。优选的培养基为E1培养基，在实验2中对E1培养基进行了描述。pIJE486的质粒体包含可使得菌株对硫链丝菌肽具有耐受性的基因。因此，一般的实验方案建议保留选择压力，以使含有质粒的菌株保持在培养液中。然而，令人惊讶的是，在没有硫链丝菌肽的条件下进行所述菌株的培养时，并未造成克隆质粒的丢失，这表明在培养中，优选的是未补加抗生素的E1培养基。
在蒽环类化合物的生产方法中，有人描述了将吸附性树脂添加到发酵液中(Torkkell等人，2001，以及
Figure G200880015212XD00101
等人，2003)。该毒性产品同样也是诱变剂，其从两方面造成影响：(i)由毒性而造成生产降低；以及(ii)使生产菌株发生诱变。因此，优选的是这样的吸附剂，该吸附剂不会对培养液中的产物或细菌造成干扰，而是会吸附那些被分泌出的代谢物以及那些累积在细胞中的代谢物。
在本发明的优选实施方案中，在培养之前或在培养过程中，将非离子型吸附剂加入到培养基中，以从发酵液中收集代谢物，从而提高每批的回收率。在诸如E1(在实验部分对其有更为详细的描述)之类的合适的培养基中，聚苯乙烯树脂(如Amberlite XAD-7(CAS #37380-43-1)(Rohm & Haas Germany GmbH，Frankfurt))或DiaionHP-20会提高表道诺红菌素、13-DHED以及表领地霉素的回收率。ε-紫红霉酮会一同从发酵液中被吸附出来。由于XAD-7通过分子的交联，从而对表道诺霉素代谢物具有极强的吸附能力，所以获得高产率。经回收获得的表道诺霉素类化合物粗品含有约500mg/l-700mg/l的表道诺红菌素、400mg/l-600mg/l的13-DHED、150mg/l-300mg/l的4′-表领地霉素、150mg/l-300mg/l的ε-紫红霉酮。如果将Diaion HP-20用作吸附剂，则可回收得到相同的产率，但是加入到E1培养基中的吸附剂的量需要大幅提高。
可在任何能使表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的产生最大化的条件下进行发酵。然而，有利的是在26℃-34℃以及pH为6.5至7.5的条件下，发酵7天至14天。可在发酵培养的任何时间添加吸附剂，但是若在发酵培养开始时向培养物中加入吸附剂，则能获得最佳的产率。
可通过滗析将吸附于吸附树脂中的物质与发酵液分离，其中所述吸附于吸附树脂中的物质主要包含表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮。使用有机溶剂来萃取出树脂，优选使用甲醇和丁醇。溶剂的建议用量为发酵罐中发酵液体积的10％至50％。重复萃取1至5次，以释放出用于所有蒽环代谢物的吸附剂，该树脂在用水洗涤后是可循环利用的。
在从吸附剂中回收了所有代谢物之后，对含有ε-紫红霉酮的糖苷配基部分进行分离是有利的。
对蒽环类化合物粗品的继续加工
13-DHED向表道诺红菌素的转化
可通过层析以及随后的结晶，从而轻松地将13-DHED从糖苷部分中分离出来，同时也会分离出表道诺红菌素。13-DHED可吸附于加入到链霉菌发酵液中的树脂上，该链霉菌能够进行道诺霉素的合成，尤其是合成的后期步骤。尽管任何菌株都是合适的，然而有利的是使用早期生物合成路径被阻断且不能累积道诺霉素代谢物的菌株。
表道诺红菌素向表阿霉素的转化
将表道诺红菌素粗品(纯度≥80％)用作合成化学的起始物料，以获得表阿霉素，其中表阿霉素是常用的抗癌药物。可使用任何合成反应或生物催化反应系列来进行14-羟基化。
将表道诺红菌素转化为其14-羟基化形式-表阿霉素存在多种可能性。尽管在发酵液中发现了微量的表阿霉素，但是内源性基因产物14-羟化酶自身在培养条件下不具有足够的活性，以将所有形成的表道诺红菌素转化为表阿霉素。根据我们的实验(数据未示出)，尽管有非常多的拷贝的14-羟化酶基因，但是仍不能完成表阿霉素生产过程。然而，两个美国专利公开US 5,955,319和US 6,210,930披露了通过基因产物doxA，从而以较低的水平将道诺红菌素转化为阿霉素。显而易见的是，生物转化深受环境的影响，因此我们尚未成功地重复该转化过程。
与由道诺红菌素合成阿霉素类似，将羟基加在完整的表道诺红菌素的C14上存在多种可能性。
在将表阿霉素从合成混合物中萃取出来之后，可通过层析和/或结晶来进行表阿霉素的纯化。然而，为了达到活性药用成分所需的质量，层析分离后表阿霉素的纯度必须≥97％。
ε-紫红霉酮向去甲柔毛霉素的转化
已知生物合成按照图1中所示出的顺序进行。使阿克拉菌酮(多种蒽环类化合物的典型前体)进行11-羟基化，以形成经糖基化的ε-紫红霉酮。对于糖基化形式，对10位的修饰需要使用例如道诺糖胺之类的糖物质，尽管其他的糖残基是可用的。在进行了10位修饰后，发生13-氧合，并且道诺红菌素生物合成的最终步骤为C-4上的O-甲基化。因此，尽管存在4-脱氧形式，仍可成功地进行10位修饰和13位修饰以及糖基化。4-脱氧阿克拉菌酮以及4-脱氧-ε-紫红霉酮均被转化成去甲柔毛霉素。
由于本发明工艺能够产生并由单批发酵料中回收ε-紫红霉酮、表道诺红菌素、13-DHED和4′-表-领地霉素，因此本发明工艺是确实高效的。
基于上述原因，可有利地将本发明的菌株用于发酵中，以生产用于商业应用的表阿霉素和去甲柔毛霉素。本发明的工艺能够以高产率和低成本生产重要的蒽环类化合物。该发酵工艺的流程示于图2中。通过下述实施例对本发明进行更为详细的描述。对本领域技术人员显而易见的是，随着技术的进步，可以不同的方式来实施本发明的概念。本发明及其实施方案并不仅限于上述具体例子，而是可在权利要求范围内进行改变。
实施例
实施例1
产生高滴度表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的微生物菌株的构建
在大肠杆菌中进行链霉菌DNA的操作，随后将扩增DNA导入链霉菌菌株中。本实验中所用的菌株和质粒列于下表3中。
表3.菌株和质粒
  菌株/质粒   说明   参考文献或来源
  大肠杆菌XL1-Blue   大肠杆菌克隆用宿主   Stratagene
  G001   产生道诺霉素的链霉菌菌株   DSM12245
  G001/pB70dv   产生表道诺霉素类化合物和表洋红霉素的链霉菌菌株   DSM 19076
分别按照Hopwood等人(1985)以及Sambrook等人(1989)的实验室手册中的描述进行链霉菌和大肠杆菌菌株的培养以及DNA的分离和操作。通过高压电穿孔将质粒导入大肠杆菌菌株中，并通过原生质体转化将质粒导入链霉菌中(Ylihonko等人，1996)。使用基因snogC作为探针，从而从链霉菌基因文库中克隆出相应的基因。将该被克隆出的基因在大肠杆菌中扩增并转移至G001中的载体pIJE486中，将通过小规模培养获得的产物与G001产物加以对比，以对其进行研究。通过这种方式，发现带有ekr8的克隆除了产生道诺霉素类化合物外，还会产生表道诺霉素类化合物。对克隆进行选择，使其不能产生典型的道诺红菌素代谢物，而是累积表道诺霉素类化合物，将该克隆命名为G001/pB70dv(保藏号：DSM 19076)。按照实施例2中所述条件对该克隆进行培养，发现所获产物含有表道诺霉素类化合物以及表洋红霉素类化合物。在TSB培养基(每升TSB培养基中使用30g胰酶大豆肉汤粉)中，对含有质粒G001/pB70dv的克隆进行多轮培养，以消除质粒。所获菌株不再带有该质粒，并产生糖苷配基。将基因ekr8克隆至带有参与蒽环生物合成的后期步骤的基因的不同构建体中，并导入上述产生糖苷配基的菌株中。对在实施例2中所述条件下进行小规模培养而获得的样品进行分析研究，所获带有质粒pB89rdmB的克隆能够产生表道诺霉素代谢物，而不会继续在发酵液中继续累积表洋红霉素。其含量示于上表2中。
表洋红霉素类化合物的产生可能是由于克隆G001/pB70dv中4-O-甲基化酶的不完全活性所造成的。因此，认为在构建体pB89rdmB中克隆的基因rdmB是进行完整生物合成的原因，从而避免了表洋红霉素类化合物的产生。尽管尚未证明它具有O-甲基转移酶活性，但是rdmB(ACCESSION U10405)与dnrK具有很高的序列相似性(参见Jansson等人，2003)。借助NTG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)(Sigma-Aldrich)继续对带有pB89rdmB的菌株进行诱变处理。诱变处理后，在琼脂板上挑取约200个菌落，并首先在3ml的E1培养基中进行培养。关于培养条件的其它细节，可参见下面的实施例2。对通过随机诱变处理而获得的、其表道诺霉素类化合物的产生得以改善、并且具有与带有pB89rdmB的菌株相同的产物分布谱的克隆进行多轮培养。最终选取那些与以相同比例带有pB89rdmB的克隆相比，能够产生更多表道诺霉素代谢物的微生物菌株，并且培养基中不含产生选择压力的硫链丝菌肽。
经过十四轮的重复培养，证实了这种菌株具有适于商业化生产的稳定性(数据未示出)。
实施例2
产生高滴度表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的微生物菌株的培养和产物分布
将按实施例1中所述方法获得的菌株在50ml E1培养基中培养，其中E1培养基中补加有XAD-7(15g/l)。(E1：每升自来水中含有：葡萄糖20g；可溶性淀粉20g；肽：5g；酵母提取物2.5g；K2HPO4·3H2O 1.3g；MgSO4·7H2O 1g；NaCl 3g；CaCO3 3g；pH 7-7.5)。
为了测定生产滴度，从培养的第四天开始提取化合物，直至第十天结束。为了测定所产生的蒽环代谢物的量，将XAD-7与水一同从一个培养瓶中倒出，洗涤XAD-7，并将之用40ml甲醇振荡至少30分钟以进行萃取。使用HPLC来分析样品。XAD-7在E1培养基中的使用使表道诺霉素的产率由约400mg/l-500mg/l增至500mg/l-700mg/l。其他产物参见表2。最佳生产时间为十一天。在吸附剂的存在下，在培养结束时未发现菌落形态的改变，这表明通过在培养期间使表道诺霉素代谢物吸收至XAD中，可防止表道诺霉素产生毒性和诱变作用。
所获产物的典型层析谱示于图3中。
实施例3
表道诺霉素代谢物和ε-紫红霉酮在发酵中的产生
按照如下方法进行种子培养：在四个盛有60ml E1培养基的烧瓶中，对能够以高滴度产生表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮的菌株进行四天的培养，其中所述E1培养基补加有硫链丝菌肽(5mg/l)。将培养物合并，并使用这240ml发酵液对发酵罐内的补加有XAD-7(15g/l)的20升E1培养基进行接种。在20升的体积内发酵11天，发酵条件为：30℃至34℃，350rpm，通气10升/分钟。
实施例4
表道诺霉素类化合物粗品和ε-紫红霉酮的回收和纯化
4.1表道诺霉素类化合物粗品的纯化
从由发酵获得的20升发酵液中，将吸附有各种被取代表道诺霉素和ε-紫红霉酮的XAD-7滗析出来。用水洗涤该树脂，以除去细胞碎片。树脂沉淀用1升甲醇萃取两次到五次。向3升合并后的甲醇萃取液中加入1升氯仿，以借助氯仿来萃取出糖苷配基。将溶剂层和水层分离。在微碱性条件下将位于水层中的糖苷萃取至氯仿中，用饱和NaHCO3使pH稳定。用水洗涤以除去盐。最终使氯仿相过滤通过筒式过滤器。使用所述方法得到的表道诺霉素的产率相当于粗萃取物的70％。
4.2ε-紫红霉酮的纯化
将在上述4.1中通过萃取而获得的溶剂部分干燥，并浓缩至较小的体积。使用氯仿作为洗脱液来进行快速层析。通过将纯化后的部分溶解至氯仿-甲醇混合物中、并浓缩至较小的体积，从而使其结晶，这样获得纯度＞90％的ε-紫红霉酮。将干燥后的沉淀物溶解，并使用CHCl3∶丙酮∶甲醇溶剂体系进行快速层析以将其纯化。萃取出糖苷。进行两次萃取以使产率最大化。在从氯仿中萃取出全部糖苷后，用饱和NaHCO3进行萃取以使pH稳定。随后用RO水萃取两至四次以除去盐。用两相分离器使相发生分离。
实施例5
各化合物从表道诺霉素类化合物级分中的分离
进行层析，以从实施例4.1中获得的表道诺霉素类化合物中分离出表道诺红菌素、13-DHED以及表领地霉素。将过滤后的氯仿泵入硅胶柱中，并使用氯仿-甲醇溶液作为流动相，以通过层析法进行纯化。分别收集这三种代谢物的纯级分，并分别将各级分汇集。向表道诺红菌素级分中加入丁醇，并调节为酸性pH。随后开始蒸发。当蒸发持续进行时，表道诺红菌素开始结晶。将晶体过滤并在真空干燥箱中干燥。借助乙醇-水溶液使13-DHED级分结晶。
实施例6
表道诺霉素粗品向表阿霉素的合成转化
通过作为一锅法反应(one spot reaction)的化学合成，将经纯化的表道诺红菌素转化为表阿霉素，该化学合成包括两个反应：溴化和水解。在第一个反应中，用溴在C-14位置上进行取代，在第二步骤中，在C-14位置上进行羟基化，以形成表阿霉素。将按照实施例5中所述获得的表道诺红菌素溶解在甲醇中，并加入溴。在10℃下进行反应，并用HPLC加以分析。在一天后，通过加入甲酸钠缓冲液从而使溴化反应停止。将pH调整为＜3，并且将反应混合物的温度调至50-60℃。反应进程由HPLC监测，当表阿霉素的量不再增加时，通过使反应混合物冷却从而将反应停止。
通过RP-硅胶层析来进行纯化。将各级分收集并用HPLC分析，并且将纯级分(纯度＞97％)汇集在一起。在结晶后，所获纯度超过98％。
实施例7
糖苷配基和蒽环类化合物的分析检测
HPLC
仪器：Jasco HPLC
柱：Phenomenex，Aqua，150×4.6mm，3μm
溶剂A：0.05％TEA(用TFA将pH调节至2.0)
溶剂B：THF，其中含有10％的MeOH
柱温：室温
流速：1ml/分钟
检测器：UV-Vis，480nm
注射量：5μl
梯度：
  时间(分钟)   溶剂A[％]   溶剂B[％]
  0   80   20
  10   60   40
  27   45   55
  28   10   90
  30   10   90
  31   80   20
  36   80   20
微生物的保藏
根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定，在DMSZ(全称为Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，地址为Mascheroder路1b，邮编：D38124，Braunscweig，德国)将如下微生物进行保藏。
微生物             编号             保藏日期
G001/Pb70dv        DSM 19076        2007-02-23
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Claims (19)

1.一种微生物菌株，其以至少0.5g/升发酵液的滴度产生蒽环代谢物。
2.根据权利要求1所述的菌株，其中该菌株以至少0.1g/升发酵液的滴度分别产生化合物表道诺红菌素、13-二氢-表道诺红菌素、4′-表-领地霉素和ε-紫红霉酮。
3.根据权利要求1和2中任意一项所述的菌株，其中该菌株所产生的表道诺红菌素、13-二氢-表道诺红菌素、4′-表-领地霉素和ε-紫红霉酮中的任意一种占全部蒽环代谢物部分的至少10％。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的菌株，其中内源性道诺霉素代谢物的生物合成被阻断。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的菌株，其中所述鲍霉素的生产被随机诱变阻断。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的菌株，其中所述菌株携带有编码4′-酮还原酶和进行O-甲基化所需的基因。
7.根据权利要求6所述的菌株，其中所述基因为ekr8和rdmB。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的菌株，其中该菌株选自链霉菌(Streptomyces)属。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的菌株，其中该菌株优选选自波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的菌株，其中该菌株更优选选自波塞链霉菌表灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius)。
11.一种通过发酵来生产蒽环代谢物的方法，其通过利用根据权利要求1至10中任意一项所述的生产菌株来进行发酵。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述蒽环代谢物选自表道诺霉素类化合物和ε-紫红霉酮。
13.根据权利要求11和12中任意一项所述的方法，其中所述蒽环代谢物优选选自表道诺红菌素、13-二氢-表道诺红菌素、4′-表-领地霉素和ε-紫红霉酮。
14.根据权利要求11至13中任意一项所述的方法，其中通过在任何时间添加树脂，从发酵液中吸附出表道诺霉素类化合物粗品和ε-紫红霉酮。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述树脂选自离子型吸附剂和非离子型吸附剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述树脂选自聚苯乙烯。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述树脂选自XAD-7和Diaion HP-20。
18.根据权利要求14至17中任意一项所述的方法，其中所述树脂的添加量为1克/升至100克/升。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述树脂的优选添加量为15克/升至40克/升。
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