TWI374187B - Genetically modified strains producing anthracycline metabolites useful as cancer drugs - Google Patents

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TWI374187B
TWI374187B TW097136944A TW97136944A TWI374187B TW I374187 B TWI374187 B TW I374187B TW 097136944 A TW097136944 A TW 097136944A TW 97136944 A TW97136944 A TW 97136944A TW I374187 B TWI374187 B TW I374187B
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Description

1374187 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於波賽鏈黴菌（《Sirepiomyce·? pewce/z.M·?)之基 因改造株及該等菌株在藉由單批礙酵產生諸如4'·表柔紅徵 素（4'-epidaunorubicin)、13-二氫-表柔紅黴素、4，_表非多 黴素（4’-epi-feudomycin)及 ε-紫紅黴酮（s_rh〇d〇mycinone)之
蒽環代謝物的高效價混合物中之用途，該等蒽環代謝物適 用於本發明之產生活性醫藥成份表柔比星（epirubicin)及/ 或伊達比星（idarubicin)之下游過程。 【先前技術】 柔紅黴素（daunorubicin)為一組由諸如波赛鏈黴菌、天藍 淡紅鏈黴菌（51.⑽、灰色鏈黴菌（(S州卿4、 鏈黴菌C5、波賽鏈黴菌表灰變種（iS p㈣var 及雙又鏈黴菌（51· 之若干種鏈黴菌產生之抗腫瘤 抗生素。該群組之基本化合物為柔紅黴素（DiMarc〇等人， 196句。分別自1967年及1971年以來，柔紅黴素及其14_羥 基衍生物阿黴素（doxorubicin)已用於癌症化學療法中。柔 紅黴素特別用於血液科惡性疾病中，而阿黴素展示廣抗癌 譜。考量當前臨床使用之所有已知蒽環黴素，6/7為柔紅 黴素群組之成員。該等化合物之製造方法使用柔紅黴素或 其糖苷配基柔紅黴酮（daunomycin〇ne)作為化學合成之起始 材料。 蒽％•徽素用於癌症化學療法 現今主要使用之細胞毒性藥物 已有30年以上。阿黴素仍為 ’此係因為其惡性疾病譜極 J34304.doc 1374187 寬。重要性僅次於阿黴素之抗腫瘤抗生素表柔比星變得甚 至更重要。 柔紅黴素可由通式I描述：
RV 且其最重要之衍生物顯示於表1中 表1 R4
R 14
柔紅黴素 阿黴素 表柔比星 伊達比星 脂質體蒽環黴 (Annamycin) °比柔比星(Pirarubicin) 戊柔比星(Valrubicin) 素
3 3 3 Η Η Ηc c c ο ο ο Η H
HOHOHHOH och3 oh och3 戊酸酯基 4'表型異構體 十表型異構體 4'-0-四氫痕喃基 三氟乙醯基 表柔比星臨床上用於許多類型之癌症。隨著其與阿黴素 競爭，銷售量不斷增長。與其他癌症藥物之新穎調配物、 結合物及新穎組合亦擴展表柔比星之用途。表柔比星係由 包含藉由醱酵產生柔紅黴素及合成改造糖苷配基及糖部分 之方法來製造，該方法揭示於（例如）美國專利5,874,550 中。 134304.doc 1374187 伊達比星（4-去甲氧基-柔紅黴素 乐用以治療某些類型之 癌症，包括白血病、淋巴瘤及其他骨 "他月髓疾病。據稱其與阿 黴素相比產生較小副作用。然而，伊 伊違比星全球每年銷售 量不超過20 kg，大概係由於Jt劁生 ，、I &過程極複雜因而價格
極高。伊達比明係由柔紅黴嗣起始製造，柔紅黴酮係獲自 柔紅徽素之輯及隨後之酸性水解。將柔紅_進一步合 成改造S伊達比_。藉由如（例如）美國專利第4,325,946號 中所述之複雜合成反應系列連接糖殘餘物柔紅糖胺 在基因工程化之前，產生所要非内源性物質之菌株的產 生幾乎不可能。雖然化學結構之改造較小，例如表柔紅黴 素與柔紅黴素的不同之處僅在於柔紅糖胺部分中4，基 團之立體化學；但仍需要若干突變以引起變異。此意謂需 要若干輪誘變且需選擇及測試數百萬純系以找到所要之化 學結構改變。 現今，熟知菌株之基因改造有利於產生非内源性代謝 物。然而，亦熟知該等菌株雖然產生相對較高含量之内源 性代謝物，但積聚少量外來代謝物、雜合化合物。由此導 致經濟上不良且方法通常並非商業上可行的。 歐洲專利公開案EP1 1233 10描述對蒽環黴素糖部分之成 功改造’其係藉由將基因wogC引入產生蒽環黴素之菌株 中從而形成阿克拉菌酮_4'·表-2-去氧海藻糖（aklavinone-4'-epi-2-deoxyfucose)來達成。然而，如上所討論產生效價仍 較低。 此外’自通常包含10-20種類似產品之複合基質中純化 134304.doc 1374187 所要之代謝物通常不成功。低產量之另一原因為生產菌株 對非内源性化合物之不良抗性。藉由將諸如表柔紅黴素、 表柔比星或伊達比星之毒性產物逐步添加至培養肉湯中以 • 使生產菌株適應非内源性代謝物係耗時的且較佳引起對生 產菌株具有較小毒性之代謝物的積聚。 ' 近來已（例如）於國際專利公開案WO 2006/1 1 1561 A1中 ： 報導關於惹環黴素表柔比星之生物技術產生之產量及經濟 性的一些進展。藉由來自物種波赛鏈黴菌之菌株的誘變， 一 €得產生每公升培養肉湯至少0.1公克之濃度的表柔紅黴 素（表柔比星之前驅體）及/或表柔比星本身之微生物菌株。 蒽環黴素之生物合成路徑及受質特異性描述於若干公開 案（對於近來之評述參見Niemi等人，2002)中，但柔紅黴素 生物合成之最終步驟、糖基化之後改造糖普配基部分之反 應及其中之分子遺傳學未得以充分理解。生物合成路徑顯 示於圖1中。 蒽％黴素之成功似乎為持續的。柔紅黴素類之若干新穎 調配物、結合物、新穎分子及前藥為癌症藥物之來源。藉 - 由化學合成自柔红黴素起始產生蒽環黴素為產量相對較低 之夕步方法’其表明需要改良方法。因此，切實需要改良 之生產菌株及有效、商業上可行之生產方法。 【發明内容】 貫穿本說明書，諸如表柔紅黴素（cas#56390 08 0)、 二氫·表柔紅黴素=4，-表-柔紅黴素醇（在下文中稱為13_ DHED)及表非多黴素（指定類似於非多黴素之表柔紅黴 134304.doc 1374187 素統稱為表柔紅黴素類。 本發明係關於改良、基因改造之生產菌株，較佳來源於 波賽鏈黴菌之菌株，其以每公升培養肉湯至少0.5公克之 效價產生蒽環代謝物（包括非内源性代謝物，諸如表柔紅 徵素）的混合物，該混合物用於隨後產生蒽環抗生素，尤 其表柔比星及伊達比星。 在本發明之研究中，吾人已使用以寄存編號DSM 12245
寄存於DSMZ之波賽鏈黴菌表灰變種之突變株，其在巴尤 黴素（baumycin)之生物合成中經阻斷且能夠以高於野生型 菌株數百倍以上之效價產生柔紅黴素。該菌株亦產生增加 量之ε-紫紅黴酮。藉由用基因置換功能基因 (Otten等人，1997)來對該菌株進一步基因改造以便使柔紅 黴素代謝物之4’-位置產生相反立體化學，因此提供表柔紅 黴素代謝物家族。用於置換之基因意外地見於與用來源於 之探針自細菌培養物分離基因相關之鳥搶選殖實驗 中（丁〇此丨丨等人，咖）。基因改造S株（指定為 G001/PB7Gdv)積聚每丨公升培養肉湯約副毫克之表柔紅徽 素代謝物，且同時连攻λ 吁座生相對較向含量（200-300 mg/L)之ε_ '^紅徽嗣。然而，發規矣+ 赞見表柔紅黴素代謝物之混合物含有稱 為表洋紅黴素的卜八仏 , 匕&物，由此使得純化方法略微複 將可得之不同基因椹筮 築體引入一種由宿主菌株G001去除 質體pB70dv而獲得之_ 之菌株中，令人驚奇地，質體pB89 rdmB使得表柔紅黴辛 胃骽PB89 京代謝物產生而不含表洋紅黴素。此 134304.doc 1374187 外，當用誘變劑再次處理此菌株培養物時，產生效價出乎 意料地增加。在試管培養中研究2〇〇種突變體之產生表柔 紅黴素類及ε-紫紅黴酮，且鑑別每公升培養肉湯產生！: 克以上蒽環代謝物之高產菌株。該等菌株產生表柔紅黴素 代謝物與ε·紫紅黴酮之良好混合物：通常表柔紅徽素：^ DHED:4，-表-非多徽素：ε-紫紅黴酮之效價分別為_ mg/L: 500 mg/L:200 mg/L:200 mg/L。在所有培養中亦發現 少量之表柔比星副產物》
糖苷配基部分之糖基化不完全由該等菌株進行，且在培 養肉湯中發現顯著量之關鍵生物合成中間體^紫紅黴綱。 在醱酵肉湯_使用樹脂培養該等基因改造株產生甚至更高 效價之代謝物，且有利於下游過程。
本發明進一步係關於一種自單一醱酵批料中產生及分離 粗表柔紅黴素類，包括表柔紅黴素、13_二氫_表柔紅黴素 (13-DHED)、4'-表-非多黴素及8•紫紅黴酮的方法。本發明 之方法流程一般性描述於圖2中。 本發明之目的在於最大化表柔紅黴素及ε_紫紅黴酮產 量、最小化非内源性副產物之產量，及以此方式簡化隨後
之下游過程。適用於本發明生產方法的生產菌株之重要態 樣為： i) 粗代謝物概況適於下游加工，及； ii) 過度生產之能力不受菌株對表柔紅黴素類及卜紫紅黴_ 之敏感性的限制。 在本發明之方法中’使用單一醱酵批料作為表柔比星與 134304.doc 伊達比星（亦即兩種商業卜+亦 ^ /、上重要之总環黴素）之合成材料的 來源。 【實施方式】 考慮到先刖技術之已知缺點，能夠在單批醱酵中提供適 合隨後製造-種以上蒽環抗生素、尤其表柔比星及伊達比 星的非内源性代謝物之高效價之混合物將具有實質性經濟 利益。為簡化隨後之下游加工，一個甚至更經濟之態樣為 儘可能避免另外形成内源性化合物。此皆為本發明之目 的。 藉由單批醱酵使用最佳化微生物菌株產生一種蒽環黴素 (諸如表柔比星）為得到更有效產生目的之起始。但商業上 可行之產生方法的最佳解決辦法為使用在單批醱酵中一次 傳遞高效價之用作產生一種以上慧環抗生素之起始材料的 代謝物混合物之改造微生物菌株。 本發明提供用於藉由醱酵產生表柔紅黴素及8_紫紅黴_ 之方法的經改良生產菌株。若干鏈黴菌菌株能夠產生柔紅 黴素’而在本發明中波賽鏈黴菌較佳用作表柔紅黴素之生 產菌株。貫穿本說明書（包括工作實例），波賽鏈黴菌表灰 變種G001 (DSM12245)係用作用於基因改造以獲得積聚表 柔紅黴素及ε-紫紅黴酮之菌株的親本菌株。 然而，共有以下特徵之任何菌株適於此方法： 1. 能夠大量產生表柔紅黴素代謝物；總計超過〇.丨g/；L ^ 2. 在醱酵過程中獲得ε_紫紅黴酮之不完全糖基化系統；全 部蒽環代謝物部分之10%以上。 134304.doc 1374187 3.所有代謝物表柔红黴素、13_DHEd、表非多黴素及6_紫 紅徵酮各自以總蒽環代謝物部分之至少10%之量產生。 3 ·產生柔紅徵素及相關代謝物之生物合成路徑經阻斷。 . 將波赛鏈黴菌表灰變種G001之突變株用作本發明之親本 . 菌株。然而，共用產生柔红黴素之生物合成機構之若干其 . 他菌株同樣合適。在產生巴尤黴素之過程中由化學誘變劑 '， ntg(n·曱基硝基·Ν_亞硝基胍）阻斷菌株且對相應基因 進行測序以鑑別導致阻斷巴尤黴素產生之點突變。點 突變使得胺基酸改變；Gly經Asp置換。儘管任何柔紅黴素 生產物均合適，但在巴尤黴素之生物合成過程中經阻斷的 南產菌株為本發明之較佳宿主菌株。 4’-酮還原酶之基因的選殖可藉由使該基因有效於所選宿 主中表現之任何已知方法進行。吾人使用來源於先前已由 Ylihonko等人（1999)顯示產生4'表-蒽環黴素之基因之 DNA片段作為筛檢與柔紅糖胺路徑之糖基轉移酶之伴隨作 用較佳之相應酮還原酶基因（例如ekr8)的探針。使用大腸 桿菌（五· w…作為基因庫之宿主菌株，雜交為有益的篩檢 策略。用於雜交之探針可為來源於或類似基因及藉 由用合適限制性位點次選殖或藉由pCR擴增產生之任何片 … 段。將基因庫之菌落轉移至用於濾膜雜交之膜上，且通常 使用耐綸（nylon)膜。可使用用於偵測雜交之任何方法，但 DIG System(Boehringer Mannheim，GmbH，Germany)尤其 適用。因為對於雜交DNA而言探針為異種的，故根據 Boehringer Mannheim's manual « DIG System User's Guide 134304.doc 1374187 for Filter hybridization ’較佳在65°c下在低鹽濃度中進行 嚴格的雜交洗滌。藉由在培養肉湯中由帶有在高複製數表 現載體PIJE486中選殖之以1*8的菌株偵測表柔紅黴素（除ε· 紫紅黴酮之外）之實驗來證明基因之功能性。可轉換柔紅 糖胺之t-OH-基團的立體化學之任何4，-酮還原酶基因適於 選殖至柔紅黴素生產株中以使本發明之表柔紅黴素（除£_紫 紅黴酮外）產生，但較佳該基因以高含量表現。 根據柔紅黴素之生物合成路徑，基因^wV(Otten等人， 1997)負責柔紅糖胺路徑中之酮還原步驟。此特定基因為 所轉移基因之競爭者且因此較佳失活或缺失。基因如 之失活可藉由用於破壞基因功能之任何已知技術來達成。 為達到此目的，用於基因失活之同源重組較佳。亦可藉由 諸如化學誘變之無規技術引起基因突變。 基因ekr8以不同構築體選殖至藉由親本菌株G〇〇1之質體 滴落獲得之菌株中，且分析所得菌株之代謝物。將一種純 系之代謝物概況視為有望用於下游目的。此純系帶有質體 pB89rdmB(ri/w5，參見jansson等人2〇〇3)且以大致相當於 由菌株G001產生的柔紅黴素量之5〇%的效價產生表柔紅黴 素及ε-紫紅黴酮。質體pB89rdmB含有基因及μ讲召。此 純系指定為G005a。基因構築體可在能夠在鏈黴菌中複製 之任何載體中表現。然巾，高複製數質體較佳用作載體。 對於本發明而言，發現質體載體等人， 1996)為有益的。 已描述將DNA引人宿主細胞中之若干方法^極佳程序為 134304.doc 1374187 原生質體轉型且其貫穿於此研究中使用。然而，用於產生 具有本發明及如上所述菌株之特徵的菌株之任何方法及任 何載體為適用的β 發現當如由重複培養中所發現之產生效價改變所注意 到，針對柔紅黴素之内源性抗性不足且導致菌株之穩定性 不良時，以上所提及之含有質體pB89rdmB之菌株對表柔 紅黴素略敏感。藉由用表柔比星或表柔紅黴素適應增加抗 陘來產生較高13DHED效價。將菌株培養物在嚴格條件下 用誘變劑處理且儘管可使用任何化學誘變劑，但較佳為 NTG。獲得與含有pB89rdmB之純系相比相同代謝物產生 增加的得自致突變處理之純系，&意到長期穩定性。穩定 性對於商業生產而言係關鍵的且因此儘管令人驚奇但極為 有益。在無選擇壓力下基因改造株為穩定的。 新賴純系在第八天達到生產量之峰值，而對於親本菌株 G001而言第六天為最佳。it常突變株產生表柔紅黴素、 ⑽咖、表非多黴素及ε_紫紅黴_作為主要產物，而葱 環黴素部#之其餘部分所佔小於產量之1 〇 %。 表2提供關於對於本發明而言菌株之典型代謝物概況之 資訊。量係以mg/L給出。 表2 菌株 G001/pB70dv f表柔 紅黴素 250-350 13- DHED SO-1 so 表-非多 黴素Β 其他表柔 紅徽素 (未定型)* ε-紫紅擻酮 含有 pB89rdmB 之純系 350-450 J\Jm I JU 250-400 不適用 ΓΪ50-250~ 350-450 <100 ~~~ 200-300 150-300 IN 1 天變 500-700 400-600 150-300 <100 150-300 134304.doc δ/ 主要為表洋紅黴素 以圖在製造供臨床使用之f環徽素中使用波賽鍵徵菌 或相關ϋ株時通常遇狀_為不良穩定性，依據生產力 培養“之產生效價的改變。使用該等菌株並非經濟學上 可仃的’且最嚴重地，引起顯而易見的經濟缺點且，在最 嚴重之情況下，導致缺乏癌症患者所要之細胞毒性藥物。 菌株對其生產力之不穩定性效應為柔紅黴素及相關代謝物 之誘變性的結果。因此，本發明之穩定生產菌株有益於製 造蒽環黴素且保證重要細胞毒性抗癌藥之持續供應。 本發明之改造生產菌株、較佳鏈黴菌菌株'最佳波赛鏈 黴菌g株的料可在含有合適養分來源之培養基中進行。 較佳培養基為E1培養基，其描述於實驗2中。pu娜之質 體主體包括造成對硫鏈絲菌之抗性之基因。因A，一般實 驗方案將建議維持選擇壓力以在培養中保持含有質體之菌 株。然而’令人驚奇地，該菌株在不存在硫鍵絲菌下之培 養並不導致經選殖之質體缺失，其表明在培養中不提供有。 抗生素之E1培養基較佳。 將吸附性樹脂添加至培養肉湯中描述於用於蒽環黴素之 方法中（TorkkeU等人200^Metsa_Ke感等人，2〇〇3)。亦 為誘變劑之秦性產物以兩種方法產生影響；⑴由毒性作用 引起之產量較少及（ii)生產菌株之誘變。因此，在培養中 不干擾產物或細菌，但吸附所分泌之代謝物與積聚於細胞 中之彼等代謝物的吸附劑較佳。 在本發明之-較佳實施例中，在培養之後或期間將非離 I34304.doc •16· 丄374187 子型吸附劑添加至培養基中以自醱酵肉湯中收集代謝物， 從而增加每批之回收率。更詳細描述於實驗部分之於合適 培養基（諸如E1)中之聚苯乙烯樹脂（諸如Amberiite Xad-7 (CAS#37380-43-l)(R〇hm & Haas Germany GmbH, Frankfurt)或
Ehaion HP-20)增加表柔紅黴素、13_DHED及表非多黴素之 回收率。ε-紫紅黴酮同樣一起自醱酵肉湯中吸附。較高產 置係由於XAD-7對於表柔紅黴素代謝物之吸附能力極強 (藉由使分子交聯）。作為回收產物獲得之粗產物表柔紅黴 素含有約500-700 mg/L之表柔紅黴素、4〇〇·6〇〇 mg/L213_ DHED’ 150-300 mg/L之4，-表-非多黴素及150_300叫几之 ε-1紅黴酮。若Diai〇n HP-20用作吸附劑，則回收相同產 量，但補充至E1 -培養基之吸附劑的量必須顯著較高。 醱酵過程可在能夠產生最多表柔紅黴素及ε_紫紅黴酮之 任何條件下進行。然而，在26。〇至34艽之溫度範圍内在 6-5-7.5之pH值下進行醱酵7至14天係有益的。可在培養之
任何時候添加吸附劑，但若在培養起始時將吸附劑添加至 培養物中則獲得最佳產量。
藉由傾析將吸附樹脂中所吸附之主要包含表柔紅黴素類 及ε紫紅黴酮之物質自培養肉湯分離。樹脂用有機溶劑、 較佳用甲醇及丁醇萃取。推薦溶劑量為醱酵器中培養肉湯 體積之10-50°/〇。重複萃取1_5次使所用吸附劑自所有蒽環 代謝物釋出，樹脂用水洗後可再循環。 自吸附劑令回收所有代謝物之後，分離含有心紫紅黴酮 之糖苷配基部份有益。 134304.doc 1374187 工 粗蒽環黴素之進一步加 13-DHED轉化為表柔紅黴素 13-DHED易於藉由層析然後結晶㈣糖*部份分離，同 時分離表柔紅徵素。可將n_DHED吸附於一種添加至能夠 ，丁柔紅黴素合成且尤其後期步驟的鏈黴菌菌株之培養肉 场的樹脂上。儘管任何菌株均合適，但有利使用早期生物 合成路徑經阻斷且不能積聚柔紅徵素代謝物之菌株。 表柔紅擻素轉化為表柔比星
使用粗表柔紅黴素（純度養〇)作為合成化學之起始物質 以獲得常用之癌症藥物表柔比星。任何合成或生物催化反 應系列可用於14-羥基化。 表柔紅黴素轉化為其14•减化形式表柔比星有幾種可 能性。儘管在培養肉湯中發現少量表柔比星’但單獨内源 性基因產物M-經化酶在培養條件下之活性不足以將所形 成之所有表柔紅黴素轉化成表柔比星。根據吾人之實驗 (資料未顯示），其5古, 甚至间複本數之14 -羥化酶基因仍不能完成
產生表柔比星之過程。然而，兩個美國專利公開案US 5,955,319及US 6,210,930揭示柔紅黴素藉由d〇xA之基因產 物以低程度轉化為阿黴素。顯然，生物轉化高度依賴於條 件，吾人在重複該過程時並未成功。 類似由柔紅黴素合成阿黴素，在完整表柔紅黴素之C-14 上添加一個羥基有各種可能性。 在自合成混合物萃取表柔比星之後，表柔比星之純化係 藉由層析及/或藉由結晶而進行。然而，為達成活性醫藥 ! 34304.doc 1374187 成份之品質要求，必需層析分離以得到純度297%之表柔 比星。 ε-紫紅黴明至伊達比星之轉化 . 已知生物合成以圖1中所示之順序進行。將若干蒽環黴 素之典型前驅體阿克拉菌酮U_羥基化以形成ε_紫紅黴酮， 、 將卜紫紅黴酮糖基化。儘管諸如紫紅黴胺之其他糖殘餘物 .. 為公認受質，但位置10上之改造仍需要糖基化形式。在 10-改造之後，進行13_氧化且柔紅黴素生物合成之最終步 φ 驟為C-4上之〇-甲基化。因此，儘管為4·去氧形式但丨〇·改 造及13-改造以及糖基化仍為成功的。4_去氧阿克拉菌酮與 4-去氧-ε-紫紅黴酮均轉化為伊達比星。 本發明之方法為切實有效的，此係因為其允許自單一醱 酵批料中產生並回收ε-紫紅黴酮、表柔紅黴素，n_DHED 及4'-表-非多徽素。 出於以上列舉之原因，在醱酵中使用本發明之菌株以產 生用於商業用途之表柔比星及伊達比星係有益的。本發明 • t方法能夠以高產量低成本產生重要的蒽環黴素。醱酵過 程之圖表描述於圖2中。 在以下實例中給出本發明之更詳細描述。 V' 熟習此項技術者將顯而易見隨著技術進步，本發明之概 念可以各種方法實施。本發明及其實施例並不限於以上所 述之實例，但可在申請專利範圍之範疇内改變。 實例 實例1. 134304.doc 19 1374187 產生高效價表柔紅黴素及ε-紫紅黴酮之微生物菌株的構築 鏈黴菌DNA之處理係在大腸桿菌中進行且隨後將所繁殖 之DNA引入鏈黴菌菌株中。用於此研究之細菌株及質體描 述於下表3中。 表3.細菌菌株及質體 菌株/質體 描述 參考或來源 大腸桿菌XL1-藍 大腸桿菌選殖宿主 Stratagene G001 產生柔紅黴素之鏈黴菌菌株 DSM12245 G001/pB70dv 產生表柔紅黴素及表洋紅黴素之鏈黴菌菌株 DSM 19076
分別如Hopwood等人（1985)及Sambrook等人（1989)中所 述進行鏈黴菌及大腸桿菌菌株之培養以及DNA之分離及處 理。將質體藉由高壓電穿孔將質體引入大腸桿菌菌株中且 藉由原生質體轉型引入鏈黴菌中（Ylihonko等人，1996)。
將基因用作來自鏈黴菌基因庫之相應基因選殖之 探針。將在大腸桿菌中選殖及繁殖之基因轉移至G001中之 載體pIJE486中且藉由與G001產物相比研究在小規模培養 中所獲得之產物。以此方式發現帶有之純系除產生柔 紅黴素外亦產生表柔紅黴素。選擇不能產生典型柔紅黴素 代謝物但積聚表柔紅黴素之純系且將其指定為 G001/pB70dv(寄存編號：DSM 19076)。在如實例2中所述 條件下培養該純系所獲得之產物顯示為表柔紅黴素與表洋 紅黴素。 將含有質體之純系G001/pB70dv在TSB-培養基（每1公升 Oxoid膜蛋白脉大豆肉湯粉末（Oxoid Tryptone Soya Broth powder)30 g)中培養若干週期以脫去質體。所獲得之菌株 134304.doc -20- 1374187 不帶有質體且產生糖苷配基。將基因選殖至帶有蒽環 徽素生物合成之後期步驟中所涉及之基因的不同構築體 中’且引入以上所提及之產生糖苷配基之菌株中。研究來 . 自在實例2中所述之條件下小規模培養之樣品的分析且所 • 獲得之帶有質體PB89rdmB之純系能夠產生表柔紅黴素代 " 謝物，而培養肉湯中不再積聚表洋紅黴素。量顯示於以上 ， 表2中。 表洋紅徽素之產生可為在純系GOOl/pB70dv中4-0-甲基 ^ 冑不完全活化之結果。因此’表明在構築體pB89rdmB _ 選殖之基因rdniB負責完全生物合成以避免表洋紅黴素。 ri/wB(寄存編號U10405)顯示與心以之高序列相似性，儘管 未證明Ο-曱基轉移酶活性（參見Janss〇n等人2〇〇3)。 帶有pB89rdmB之菌株進一步由NTG(N_曱基_N，硝基_N_ 亞硝基胍）（Sigma-Aldrich)誘變《誘變之後在瓊脂板上獲得 約200個菌落，且將其首先在3 mi E1培養基中培養。對於 φ 培養條件之進一步詳述，參見以下實例2。將藉由無規誘 變獲得之表柔紅黴素產生得以改良且產物概況與帶有 . pB89rdmB之菌株相同的純系培養若干次。最終選擇能在 / 培養基中無琉鏈絲菌選擇壓力之情況下且相較於相同比例 - 之帶有PB89rdmB之純系更多地產生表柔紅黴素代謝物的 微生物菌株。 藉由十四次重複培養證明該等菌株適於大規模生產之穩 定性（資料未顯示）。 實例2. 134304.doc •21 · 1374187
產生高效價表柔紅黴素及ε_紫紅擻酮之微生物菌株的培養 及產物概況 將如實例1中所述獲得之菌株在補充有XAD-7(15 g/L)之 50 ml El-培養基中培養。（E1 :每公升自來水：葡萄糖2〇 g ;可溶性澱粉20 g ;肽5 g ;酵母萃取物2.5 g ; K2HP〇4.
3H20 1.3 g ; MgS04.7H20 1 g ; NaCl 3 g ; CaC03 3 g ; pH 7-7.5)。 為測定產生效價，自生長第4天至第丨0天萃取化合物。 為測定所產生之蒽環代謝物的量，用水自一個培養燒瓶中 傾析XAD-7且將經洗滌之XAD-7用40 ml甲醇萃取，同時震 盪至少30 min。使用HPLC分析樣品。在E1-培養基中使用 XAD-7將表柔紅黴素產量由約400-500 mg/L增加至500-700 mg/L。參見表2中之其他產物。最佳產生時間為丨丨天。在 吸附劑存在下培養結束時未發現菌落形態之改變，表明藉 由在培養期間將表柔紅黴素代謝物吸附至XAD中可能阻止 彼等代謝物之毒性及誘變效應。 所獲得之產物的典型層析圖顯示於圖3中。 實例3. 發酵過程中表柔紅黴素代謝物及ε-紫紅擻酮之產生 藉由在4個具有60 ml補充有硫鏈絲菌（5 mg/L)之Ε1培養 基的燒瓶中培養能夠高效價產生表柔紅黴素及ε_紫紅黴酮 之菌株歷時4天來產生種子培養物。合併培養物且在醋酵 罐中使用240 ml培養肉湯來接種20 L補充有XAD-7( 15 g/L))之El培養基。在3〇°C及34°C之溫度，350 rpm及1〇 134304.doc -22· 1374187 L/mi η之通氣率下在20公升體積中進行擬酵11天。 實例4. 粗產物表柔紅黴素及ε-紫紅黴酮之回收及純化。 4·1·粗產物表柔紅黴素之純化
將含有吸附至XAD-7之表柔红黴素及ε-紫紅黴酮之取代 物自20公升由醱酵獲得之培養肉湯中傾析。由水洗滌樹脂 以移除細胞碎片。用1公升曱醇萃取細胞小球2至5次。藉 由將1公升氯仿添加至3公升合併之甲醇萃取物中來由氣仿 萃取糖苷配基。分離溶劑及水層。在弱鹼性ρΗ值下將水相 中之苷類萃取至氣仿中且用飽和NaHC03穩定ΡΗ值。藉由 用水洗滌移除鹽。最終使氣仿相經由筒式過濾器過濾。使 用該方法之表柔紅黴素的產量等於粗萃取物之7〇0/〇。 4·2 ε-紫紅擻酮之純化
將由以上ί又落4.1中之萃取獲得之溶劑部份乾燥且濃縮 至小體積。使用氣仿作為溶離劑進行急驟層析。藉由溶解 至氣仿_曱醇混合物中來使經純化部份結晶且將其濃縮至 小體積且獲得純度>90%之ε-紫紅黴酮。溶解經乾燥之沈激 且使用CHCh:丙酮：曱醇之溶劑系統藉由急驟層析進行純 化。萃取苷類。將此步驟進行兩次以最大化產率。在將所 有苷類萃取至氣仿中之後，藉由用飽和NaHc〇3萃取來穩 定PH值。隨後藉由用r〇_水萃取2至4次來移除鹽。用兩相 分離器分離各相。 實例S. 自表柔紅黴素部份分離個別化合物 I34304.doc -23· 為自實例4‘1中獲得之表 衣系紅域素中分離表柔紅黴素、 U-DHED及表非多黴素’進行層析。將經過渡之氣仿泉入 二氧切管柱中且藉由層析使用氯仿-甲醇溶液作為移動 相來純化。收集三種代謝物夂 代滿物各自之純部份且混合各產物之 部份。向表柔紅黴素部份φ n _ > ^物中添加丁醇且調節酸性pH值。之 後’開始蒸發。當繼續蒸發捭 *咽Μ，备赞吁，表柔紅黴素開始結晶。將 晶體過濃且在真空箱中齡焯
相保用乙醇-水溶液使13-DHED 之部份結晶。 實例6. 粗產物表柔紅黴素至表柔比星之合成轉化 藉由化學合成按照由兩步反應（溴化及水解）組成之一鍋 式反應將純化之表柔紅黴素轉化為表柔比星。在第一步反 應中，C-14-位置經溴取代且在第二步反應中，將^14羥 基化從而形成表柔比星。將如實例5中所述獲得之表柔紅 黴素溶解於曱醇中且添加溴。在丨〇°c下進行反應且藉由 HPLC分析。在一天之後藉由添加甲酸鈉緩衝液來終止溴 化反應。調節pH<3且將混合物之溫度調節至5〇-60°C。由 HPLC監控反應且當表柔比星之量不能再升高時，藉由冷 卻反應混合物來終止反應。 藉由RP-二氧化矽層析進行純化。收集各部份並將其用 HPLC分析且將純部份（純度>97%)混合。在結晶之後，獲 得超過98%之純度。 實例7. 糖苷配基及蒽環擻素之分析量測 134304.doc •24- 1374187
HPLC ： 設備：Jasco HPLC。 管柱·* Phenomenex, Aqua, 150 x 4.6 mm, 3 μηι 溶劑A : 0.05% TEA(用 TFA 調節至ρΗ=2·0) 溶劑B :於THF中之10% MeOH 管柱之溫度：室溫 氣流速度：1 ml/min 偵測：UV-Vis, 480 nm 注入體積：5 μΐ 梯度： 時間(min) 溶劑糊 溶劑B[%] 0 80 20 10 60 40 27 45 55 28 10 90 30 10 90 31 80 20 36 80 20 寄存之微生物 按照布達佩斯條約（Budapest Treaty)之規則將以下微生 物寄存於DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany o 微生物 寄存編號 寄存日期 G001/pB70dV DSM 19076 2007-02-23 參考文獻清單
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圖3顯示鎧別自能夠高效價產生本發明之表柔紅黴素及 卜紫紅黴㈣微生物菌株獲得之代謝物的典型層析圖。典 型代謝物概兄：Rt=6.950 13-DHEd，Rt=7 85〇 4,表非多 黴素，㈣.725 4，-表柔紅黴素’ Rt=l5.842 e_紫紅黴嗣。户
134304.doc 28-

Claims (1)

1374187 第097136944號專利申請案 . 中文肀請專利範圍替換本Π01备本#)^-- 十、申:專利範圍： 1’ 種微生物菌株，其以每公升擬酵肉湯至少0.5公克之效 價（Utre)產生蒽環代謝物，其宁該微生物菌株帶有姑μ及 万基因，其中内源性柔紅黴素（daunorubicin)代謝物及 巴尤彳致素（baumycin)之產生經阻斷。 2.如明求項1之菌株，其中該菌株每公升醱酵肉湯產生至 少0.1公克之各化合物表柔紅黴素（epidaunorubicin)、π_ 一氫-表柔紅黴素（13-dihydroepidaunorubicin)、4·-表-非 多徽素（4i-epi-feud〇mCyin)及 紫紅黴酮（s_rh〇d〇_ mycinone) °
如明求項1及2中任-項之菌株，其中該菌株產生總葱環 代謝物部份之至少10%的表柔紅黴素、13_二氫-表柔紅 黴素、4’-表-非多黴素及ε-紫紅黴_中之任一化合物。 如咕求項1或2之菌株，其中内源性柔紅黴素 (daUn〇mycin)代謝物之生物合成經阻斷。 如請求項丨或2之菌株，其中該巴尤黴素之產生經任意 (random)突變阻斷。 6. 如請求項丨或2之菌株，其中該菌株係選自鏈黴菌屬 {St^eptomyces) ° 7. 如請求項丨或2之菌株，其中該菌株選自波賽鏈黴菌 («SirepiO 所少 菌種。 8. 如請求項7中任一項之菌株，其中該菌株選自波赛鍵黴 菌表灰變種var cfle们·wj)菌種。 9. -種由㈣產生蒽環代謝物之方法，其使用如請求項卜8 134304-1010427.doc 1374187 ίο. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 如請求項16之方法 中任一項之微生物生產菌株。 如明求項9之方法’其中該等蒽環代謝物係選自由表柔 紅黴素類（epidaunomycins)&e紫紅黴酮組成之群。 如明求項9及1〇中任一項之方法，其中該等蒽環代謝物 較佳選自由表柔紅黴素、13二氫表柔紅黴素、4·_表非 多Μ素及ε-紫紅徽_組_成之群。 如明求項9或1〇之方法，其中由在任何時候添加樹脂而 自醱酵肉湯吸收粗表柔紅黴素類及ε•紫紅黴_。 月长項12之方法，其中該樹脂係選自離子型吸附劑及 非離子型吸附劑之群。 如β求項13之方法，其中該樹脂係選自聚笨乙烯之群。 如凊求項14之方法，其中該樹脂係選自由XAD-7及 Diaion ΗΡ-20組成之群。 如吻求項12之方法，其中該樹脂係以i i 〇〇邑几之量添 加。 ’其中該樹脂以15-40 g/L之量添加。 134304-1010427.doc
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