ES2644422T3 - Cepas modificadas genéticamente que producen metabolitos de antraciclina útiles como fármacos para el cáncer - Google Patents

Description

5

10

15

20

25

DESCRIPCION

Cepas modificadas geneticamente que producen metabolitos de antraciclina utiles como farmacos para el cancer Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a cepas geneticamente modificadas de Streptomyces peucetius y al uso de tales cepas en la production de mezclas de alto trtulo de metabolitos de antraciclina, tales como 4'-epidaunorrubicina, 13- dihidro-epidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona por fermentation en lotes individuales, utiles en procesos aguas abajo de acuerdo con la presente invencion para producir los ingredientes farmaceuticos activos epirrubicina y/o idarrubicina.

Antecedentes de la invencion

Las daunomicinas son un grupo de antibioticos antitumorales producidos por varios Streptomyces sp. , tales como S. peucetius, S. coerulorubidus, S. griseus, Streptomyces sp. C5 , S. peucetius var. caesius y S. bifurcus. El compuesto basico del grupo es la daunomicina (DiMarco et al., 1964).

La daunomicina y su derivado hidroxilado en la position 14, doxorrubicina se han utilizado en la quimioterapia contra el cancer desde 1967 y 1971, respectivamente. La daunomicina se utiliza particularmente para neoplasias malignas hematologicas, mientras que la doxorrubicina exhibe un amplio espectro anticancerigeno. Teniendo en cuenta todas las antraciclinas conocidas actualmente en uso clmico, seis de cada siete son miembros del grupo de la daunomicina. Los procedimientos de fabrication de estos compuestos utilizan daunorrubicina o su aglicona, daunomicinona, como material de partida para la smtesis qmmica.

Las antraciclinas han estado en uso para la quimioterapia del cancer durante mas de treinta anos. La doxorrubicina sigue siendo hoy en dia el farmaco citotoxico mas utilizado debido a su espectro extraordinariamente amplio de neoplasias malignas. La epirrubicina, el segundo antibiotico antitumoral mas importante poco despues de la doxorrubicina, se esta volviendo aun mas importante.

Las daunomicinas se pueden describir por la formula general I

imagen1

y sus derivados mas importantes se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

R4 R14 Sustituyente 2' 4'

Daunorubicina

OCH3 H

Doxorrubicina

OCH3 OH

Epirrubicina

OCH3 OH epi-isomero 4'

Idarrubicina

H H

Anamicina

H OH I epi-isomero 4'

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

R4 R14 Sustituyente 2' 4'

Pirarrubicina

OCH3 OH 4'-O-tetrahidropiranilo

Valrubicina

OCH3 valerato grupo trifluoroacetilo

La epirrubicina se utiliza clmicamente para muchos tipos de cancer. El mercado esta creciendo a medida que compite con la doxorrubicina. Nuevas formulaciones, productos conjugados y nuevas combinaciones con otros farmacos contra el cancer tambien expanden el uso de la epirrubicina. La epirrubicina se fabrica mediante un procedimiento que comprende la produccion de daunorrubicina por fermentacion y la modificacion sintetica del radical aglicona y azucar, descrita por ejemplo en la patente de los Estados Unidos 5.874.550.

La idarrubicina (4-desmetoxi-daunorrubicina) se utiliza para tratar ciertos tipos de cancer, incluyendo leucemia, linfoma y otras enfermedades de la medula osea. Se afirma que causa menos efectos secundarios que la doxorrubicina. Sin embargo, el mercado mundial anual de idarrubicina no supera los 20 kg, presumiblemente debido a su precio excepcionalmente elevado, debido a un procedimiento de fabricacion muy complicado. La idarrubicinona se fabrica a partir de daunomicinona, obtenida de la fermentacion de daunorrubicina con hidrolisis acida subsiguiente. La daunorubicinona se modifica de manera sintetica adicionalmente a idarrubicinona. Un residuo de azucar, la daunosamina, esta unido por una serie de reacciones sinteticas complicadas, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Num. 4.325.946.

Antes de la ingeniena genetica, la generacion de cepas que produdan las sustancias no endogenas deseadas era casi imposible. Aun cuando las modificaciones en la estructura qmmica son menores, p. ej., la epidaunorrubicina difiere de la daunorrubicina solo en la estereoqmmica del grupo OH 4' en el radical de daunosamina; son necesarias varias mutaciones para causar las alteraciones. Esto significa que se necesitan varias rondas de mutagenesis y se necesita seleccionar y probar millones de clones con el fin de encontrar un cambio deseado en una estructura qmmica.

Hoy en dfa es bien sabido que la modificacion genetica de las cepas bacterianas facilita la produccion de metabolitos no endogenos. Sin embargo, tambien es bien sabido que estas cepas acumulan los metabolitos extranos, compuestos tubridos, en cantidades pequenas aunque se producen metabolitos endogenos en un nivel relativamente alto. Este hecho da como resultado una econoirna pobre y los procedimientos a menudo no son comercialmente factibles.

La Publicacion de patente europea EP1123310 describe una modificacion satisfactoria del radical de azucar de las antraciclinas introduciendo el gen snogC en una cepa productora de antraciclina que da como resultado la formacion de aklavinona-4'-epi-2-desoxifucosa. Sin embargo, los tftulos de produccion permanecen bajos como se ha discutido anteriormente.

Ademas, la purificacion de un metabolito deseado de la matriz compleja que comprende tfpicamente 10-20 productos similares a menudo no tiene exito. Otra razon mas para obtener bajos rendimientos es una escasa resistencia frente a compuestos no endogenos por las cepas productoras. La adaptacion de la cepa productora a un metabolito no endogeno por medio de la adicion por etapas de un producto toxico, tal como epidaunorrubicina, epirrubicina o idarrubicina al caldo de cultivo, consume tiempo y, preferentemente, da como resultado la acumulacion de un metabolito que es menos toxico para la cepa productora.

Recientemente se ha informado de algunos progresos en cuanto al rendimiento y la economfa de la produccion biotecnologica de la epirrubicina de antraciclina, por ejemplo en la Publicacion de Patente Internacional WO 2006/111561 A1. Mediante la mutagenizacion de una cepa de la especie Streptomyces peucetius se obtuvo una cepa microbiana que produce epidaunorrubicina (un precursor de la epirrubicina) y/o la propia epirrubicina a concentraciones de al menos 0,1 g/l de caldo de cultivo.

La ruta biosintetica para las antraciclinas y las especificidades del sustrato se describen en varias publicaciones (para una revision reciente veanse Niemi et al., 2002, o K. Madduri, Nature Biotechnology, Nature, New York, NY, Us vol. Num. 1, Enero 1988, pags. 69-74), aunque no se comprenden completamente las etapas finales de la biosmtesis de daunomicina, las reacciones que modifican el radical aglicona despues de la glicosilacion y la genetica molecular de la misma. La ruta biosintetica se muestra en la Figura 1.

El triunfo de las antraciclinas parece ser continuo. Varias nuevas formulaciones, productos conjugados, nuevas moleculas y profarmacos de la clase de la daunomicina estan en desarrollo para farmacos contra el cancer. La produccion de antraciclina a partir de la daunorrubicina por medio de smtesis qmmica es un procedimiento de multiples etapas que da como resultado rendimientos relativamente bajos, lo que sugiere que se necesitan mejores procedimientos. Por lo tanto, existe una necesidad bien reconocida de mejores cepas productoras y procedimientos de produccion eficaces y comercialmente viables.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una presentacion esquematica de la ruta biosintetica para la clase de antraciclinas de la daunomicina.

La Figura 2 es una presentacion esquematica de un procedimiento para producir y aislar epidaunomicinas en bruto y £-rodomicinona a partir de un lote de fermentacion.

La Figura 3 muestra un cromatograma tipico que identifica los metabolitos obtenidos a partir de una cepa microbiana con capacidades para la produccion de alto tttulo de epidaunomicinas y £-rodomicinona relacionadas con la presente invencion. Perfil tfpico del metabolito: Rt = 6,950 13-DHED, Rt=7,850 4'-epi-feudomicina, Rt=8,725 4'- Epidaunorrubicina, Rt=15,842 £-rodomicinona

Breve descripcion de la invencion

A lo largo de esta descripcion, las epidaunomicinas, tales como la epidaunorrubicina (CAS num. 56390-08-0), 13- dihidro-epidaunorrubicina = 4'-epi-daunorrubicinol (denominada en lo sucesivo 13-DHED) y epi-feudomicina (designada analogamente a Feudomicina B) se denominan colectivamente epidaunomicinas.

La presente invencion se refiere a cepas productoras geneticamente modificadas mejoradas, preferiblemente cepas derivadas de Streptomyces peucetius, que producen una mezcla de metabolitos de antraciclina, incluyendo metabolitos no endogenos, tales como epidaunomicinas, con un tttulo de al menos 0,5 g por litro de caldo de cultivo, y que producen al menos 0,1 g/l de caldo de fermentacion de cada uno de los compuestos epidaunorrubicina, 13- dihidro-epidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona. Estos metabolitos de antraciclina se pueden utilizar para la produccion subsiguiente de antibioticos de antraciclina, particularmente epirrubicina e idarrubicina.

En el presente trabajo los autores de la presente invencion han utilizado una cepa mutante de S. peucetius var. caesius, depositada en DSMZ con el Num. de deposito DSM 12245, que esta bloqueada en la biosmtesis de baumicinas, y es capaz de producir daunomicina a un titulo mas de cien veces mayor que la cepa de tipo salvaje. La cepa tambien produce mayores cantidades de £-rodomicinona. Adicionalmente la cepa fue modificada geneticamente reemplazando el gen funcional dnmV (Otten et al., 1997) por el gen ekr8 dando como resultado una estereoqmmica opuesta en la posicion 4' de los metabolitos de daunomicina proporcionando asf la familia de metabolitos de epidaunomicina. El gen utilizado para el reemplazo se encontro sorprendentemente en un experimento de clonacion con pistola genica relacionado con el aislamiento de genes a partir de cultivos bacterianos con una sonda derivada de snog C (Torkkell et al., 2001). La cepa geneticamente modificada, denominada G001/pB70dv, acumulo los metabolitos de epidaunorrubina, aproximadamente 800 mg por 1 litro de caldo de cultivo y simultaneamente se produjo £-rodomicinona a un nivel relativamente elevado; 200-300 mg/l.

Sin embargo, una mezcla de metabolitos de epidaunomicina encontrada contema compuestos 4-OH llamados epi- carminomicinas haciendo algo complicado el procedimiento de purificacion.

Se introdujeron diferentes constructos genicos disponibles en una cepa obtenida por eliminacion del plasmido pB70dv de la cepa anfitriona G001 y, sorprendentemente, el plasmido pB89rdmB produjo metabolitos de epidaunomicina sin epi-carminomicinas. Ademas, se obtuvo un incremento inesperado en el tftulo de produccion cuando este cultivo de cepa se trato una vez mas con un mutageno. Se estudiaron 200 mutantes en cultivos de tubos de ensayo para la produccion de epidaunomicinas y £-rodomicinona y se identificaron cepas de alta produccion que produdan mas de 1 g de metabolitos de antraciclina por litro de caldo de cultivo. Estas cepas producen buenas mezclas de los metabolitos de la epidaunomicina y la £-rodomicinona: Tfpicamente epidaunorrubicina:13-DHED:4'-epi-feudomicina:£-rodomicinona con tttulos de 600 mg/l: 500 mg/l 200 mg/l 200 mg/l, respectivamente.

La glicosilacion del radical aglicona no prosigue completamente con estas cepas y el intermedio biosintetico critico, la £-rodomicinona, se encuentra en cantidades notables en el caldo de cultivo. El cultivo de estas cepas modificadas geneticamente utilizando una resina en caldo de fermentacion da lugar a tftulos aun mas altos de metabolitos y facilita el procedimiento aguas abajo.

La presente invencion se refiere adicionalmente a un metodo para producir y aislar epidaunomicinas en bruto, incluyendo epidaunorrubicina, 13-dihidro-epidaunorrubicina (13-DHED), 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona a partir de un unico lote de fermentacion. El esquema del procedimiento de acuerdo con la presente invencion se describe generalmente en la Figura 2.

La presente invencion tiene como objetivo maximizar la produccion de epidaunomicina y £-rodomicinona, minimizando la produccion de productos secundarios no endogenos y simplificar de esta manera el procedimiento aguas abajo subsiguiente. Los aspectos importantes de una cepa productora adecuada para su uso en el procedimiento de produccion de la presente invencion son

i) que el perfil del metabolito bruto sea adecuado para el procesamiento aguas abajo y;

ii) que la capacidad de produccion en exceso no este limitada por una sensibilidad de la cepa a las epidaunomicinas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

y la £-rodomicinona.

En el procedimiento de acuerdo con la presente invencion, se utiliza un solo lote de fermentacion como fuente de material sintetico tanto para la epirrubicina como para la idarrubicina, es decir, ambas antraciclinas comercialmente importantes.

Descripcion detallada de la invencion

Teniendo en cuenta el inconveniente conocido de la tecnica anterior, tendna un interes economico esencial, poder proporcionar en una fermentacion discontinua individual un alto titulo de una mezcla de metabolitos no endogenos, adecuada para la posterior fabricacion de mas de un antibiotico de antraciclina, particularmente epirrubicina e idarrubicina. Para simplificar los procesamientos aguas abajo subsiguientes, un aspecto aun mas economico consiste en evitar la formacion adicional de compuestos endogenos en la medida de lo posible. Todo esto es objeto de la presente invencion.

La produccion de una antraciclina, tal como la epirrubicina, mediante fermentaciones discontinuas individuales utilizando cepas microbianas optimizadas es un comienzo para obtener propositos de produccion mas eficientes. Sin embargo, la mejor solucion para los procedimientos de produccion comercialmente viables sena trabajar con cepas microbianas modificadas que suministren en una fermentacion discontinua individual en un momento dado, un alto titulo de una mezcla de metabolitos utiles como material de partida para la produccion de mas de un antibiotico de antraciclina.

La presente invencion proporciona cepas productoras mejoradas para su uso en un procedimiento para producir epidaunomicinas y £-rodomicinona por medio de fermentacion. Estas cepas producen metabolitos de antraciclina con un titulo de al menos 0,5 g/l, en donde las cepas producen al menos 0,1 g/l de caldo de fermentacion de cada uno de los compuestos epidaunorrubicina, 13-dihidro-epidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona.

Varias cepas de Streptomyces son capaces de producir daunomicina, mientras que S. peucetius se utiliza preferiblemente como cepa productora para las epidaunomicinas en la presente invencion. A lo largo de la presente descripcion, incluyendo los ejemplos de trabajo, se utiliza S. peucetius var. caesius G001 (DSM12245) como cepa parental que se utiliza para modificaciones geneticas para obtener la cepa que acumula epidaunomicinas y £- rodomicinona.

Sin embargo, cualquier cepa que comparta las siguientes caractensticas es adecuada para este procedimiento:

1. Capacidad de alta produccion de metabolitos de epidaunomicina; superior a 0,1 g/l en total.

2. Un sistema incompleto de glicosilacion para obtener £-rodomicinona en el procedimiento de fermentacion; mas de 10% de la fraccion total de metabolitos de antraciclina.

3. Todos los metabolitos epidaunorrubicina, 13-DHED, epi-feudomicina y £-rodomicinona se producen en cantidades de al menos 10% de la fraccion total de metabolitos de antraciclina.

3. La via biosintetica para producir daunorrubicina y metabolitos relacionados esta bloqueada.

Se utilizo una cepa mutante de S. peucetius var. caesius G001 como cepa parental de esta invencion. Sin embargo, son igualmente adecuadas otras cepas que comparten maquinaria biosintetica para la produccion de daunomicinas. La cepa se bloqueo en la produccion de baumicinas mediante un mutageno qmmico, NTG (N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina), y el gen correspondiente, dnrH, se secuencio con el fin de identificar la mutacion puntual dando como resultado el bloqueo de la produccion de baumicinas. La mutacion puntual causo el cambio en el aminoacido; Gly fue sustituido por Asp. Aunque cualquier productor de daunorrubicina es adecuado, una cepa de alta produccion bloqueada en la biosmtesis de baumicinas es una cepa anfitriona preferida para esta invencion.

La clonacion de los genes para la 4'-cetorreductasa se puede realizar por medio de cualquier metodo conocido que de lugar a la disponibilidad del gen que se expresara en un anfitrion seleccionado. Los autores de la presente invencion utilizaron un fragmento de ADN derivado del gen snogC, que Ylihonko et al. (1999) demostraron previamente que creaba 4'epi-antraciclinas, como una sonda para escrutar los correspondientes genes de cetorreductasa con una mejor accion concomitante con glicosil transferasas de la via de la daunosamina, p. ej., ekr8. Utilizando E. coli como una cepa anfitriona para una biblioteca genica, la hibridacion es una estrategia de escrutinio ventajosa. La sonda para la hibridacion puede ser cualquier fragmento derivado de snogC o un gen similar y generado por subclonacion con sitios de restriccion adecuados o por amplificacion mediante PCR. Las colonias para la biblioteca genica se transfieren a membranas para la hibridacion en filtro, y se utilizan tfpicamente membranas de nailon. Se puede utilizar cualquier metodo de deteccion para la hibridacion pero, en particular, es util el Sistema DIG (Boehringer Mannheim, GmbH, Alemania). Dado que la sonda es heterologa con respecto al ADN hibridado, es preferible llevar a cabo lavados rigurosos de hibridacion a 65°C a una concentracion baja de sal, de acuerdo con el manual de Boehringer Mannheim, DIG System User's Guide for Filter hybridization. La funcionalidad del gen se demostro mediante experimentos para detectar epidaunomicinas (ademas de £-rodomicinona) en el caldo de cultivo por la cepa que porta ekr8 clonado en un vector de expresion de alto numero de copias,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

pIJE486. Cualquier gen de 4'-cetorreductasa que pueda convertir la estereoqmmica del grupo 4'-OH en daunosamina es adecuado para la clonacion en una cepa productora de daunorrubicina para generar la produccion de epidaunomicina (ademas de £-rodomicinona) de acuerdo con la presente invencion, pero se prefiere que el gen sea expresado a un alto nivel.

De acuerdo con la ruta biosintetica para las daunomicinas, el gen dnmV (Otten et al., 1997) es responsable de la etapa de cetorreduccion en la ruta de la daunosamina. Este gen particular es un competidor para un gen transferido y es, por lo tanto, preferiblemente inactivado o eliminado. La inactivacion del gen dnmV se puede conseguir por medio de cualquier tecnica conocida para interrumpir una funcion genica. Con este fin se prefiere la recombinacion homologa para la inactivacion genica. Tambien es posible causar una mutacion en el gen mediante tecnicas aleatorias tales como la mutagenizacion qmmica.

El gen ekr8 se clono en diferentes constructos en una cepa, obtenida por disminucion del plasmido de la cepa parental G001, y se analizaron los metabolitos de las cepas obtenidas. El perfil del metabolito de un clon se considero prometedor para los efectos aguas abajo. Este clon lleva el plasmido pB89rdmB (rdmB , vease Jansson et al., 2003) y produce epidaunomicinas y £-rodomicinona a un titulo que corresponde aproximadamente a 50% de la cantidad de daunomicinas producidas por la cepa G001. El plasmido pB89rdmB contiene los genes ekr8 y rdmB. Este clon se designo como G005a. El constructo del gen podna expresarse en cualquier vector capaz de replicar en estreptomicetos. Sin embargo, se utiliza preferiblemente como vector un plasmido de alto numero de copias. Para esta invencion se encontro que era ventajoso el vector plasirndico pIJE486 (Ylihonko et al., 1996).

Se han descrito varios metodos para introducir ADN en celulas anfitrionas. Un procedimiento altamente preferido consiste en la transformacion de protoplastos y se utiliza a lo largo de todo este trabajo. Sin embargo, son utiles cualquier metodo y cualquier vector utilizados para generar una cepa que tenga las caractensticas de una cepa de acuerdo con la presente invencion, y descrita anteriormente.

Se encontro que la cepa mencionada anteriormente, que contema el plasmido pB89rdmB, era algo sensible a las epidaunomicinas puesto que la resistencia endogena contra las daunomicinas no era suficiente y daba como resultado una escasa estabilidad de la cepa como se observo por los cambios en los tttulos de produccion encontrados en cultivos repetidos. El aumento de la resistencia mediante la adaptacion con epirrubicina o epidaunorrubicina dio lugar a mayores tftulos de 13DHED. El cultivo de la cepa se trato en condiciones rigurosas con un mutageno y aunque se podnan utilizar mutagenos qmmicos, se prefiere NTG. Se obtuvo un clon procedente del tratamiento de mutagenesis con aumento de la produccion de los mismos metabolitos en comparacion con el clon que contema pB89rdmB, se observo la estabilidad a largo plazo. La estabilidad es crucial para la produccion comercial y por lo tanto era extremadamente ventajosa aunque sorprendente.

El nuevo clon logra el pico del nivel de produccion en el octavo dfa, mientras que el sexto dfa es el mejor para la cepa parental G001. Tfpicamente, la cepa mutante produce epidaunorrubicina, 13-DHED, epi-feudomicina y £- rodomicinona como productos principales, mientras que el resto de la fraccion de antraciclina cubre menos de 10% del rendimiento. La Tabla 2 proporciona informacion sobre los perfiles tfpicos de los metabolitos de las cepas para la presente invencion. Las cantidades se indican en mg/l

Tabla 2.

Cepa

4'-epi- daunorrubicina 13-DHED 4'-epi- feudomicina B Otras epidaunomicinas (no especificadas)* £- rodomicinona

G001/pB70dv

250-350 50 -150 na 350 - 450 200 - 300

Clon que contiene pB89rdmB

350 - 450 250 - 400 150 -250 <100 150 - 300

Mutagenizacion NTG

500 - 700 400 - 600 150 - 300 <100 150 - 300

* principalmente epicarminomicinas

Una dificultad bien conocida cuando se intenta utilizar S. peucetius o cepas relacionadas en la fabricacion de antraciclinas para uso clinico es la escasa estabilidad, los cambios en el tttulo de produccion de cultivos de las cepas en terminos de productividad. No es economicamente viable utilizar dichas cepas y, como mucho, provoca desventajas economicas apreciables y, en el peor de los casos, conduce a una falta de farmacos citotoxicos deseados para pacientes con cancer. El efecto de la inestabilidad de las cepas en su productividad es una consecuencia de la mutagenicidad de la daunorrubicina y los metabolitos relacionados. Por lo tanto, una cepa productora estable de acuerdo con la presente invencion es ventajosa para la fabricacion de antraciclinas, y una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

garantia para el suministro continuo de farmacos anticancerosos citotoxicos importantes.

El cultivo de una cepa productora modificada de acuerdo con la presente invencion, preferiblemente una cepa de Streptomyces, mas preferiblemente una cepa de Streptomyces peucetius, se puede llevar a cabo en un medio que contiene fuentes nutrientes adecuadas. Un medio preferido es el medio E1, que se describe en el Experimento 2. El cuerpo del plasmido de pIJE486 incluye un gen responsable de la resistencia al tioestrepton. Por lo tanto, los protocolos experimentales generales sugerinan un mantenimiento de la presion de seleccion para mantener la cepa que contiene el plasmido en los cultivos. Sorprendentemente, sin embargo, los cultivos de dicha cepa en ausencia de tioestrepton no provocaron la perdida del plasmido clonado, lo que sugiere que se prefiere el medio E1 sin el antibiotico suministrado en los cultivos.

La adicion de una resina adsorbente a un caldo de cultivo se describe en procedimientos para antraciclinas (Torkkell et al., 2001 y Metsa-Ketela et al., 2003). El producto toxico que es tambien un mutageno afecta de dos maneras; (i) menor produccion causada por el efecto toxico y (ii) mutagenizacion de una cepa productora. Por tanto, es preferible un adsorbente que no interfiera en el producto o la bacteria en el cultivo, pero adsorba tanto los metabolitos excretados como los acumulados en las celulas.

En una realizacion preferida de la presente invencion, se anade un adsorbente no ionico al medio antes o durante el cultivo para recoger los metabolitos del caldo de fermentacion, aumentando la recuperacion por lote. Una resina de poliestireno, tal como Amberlite XAD-7 (CAS num. 37380-43-1) (Rohm & Haas Alemania GmbH, Frankfurt) o Diaion HP-20 en un medio adecuado, tal como E1 descrito con mas detalle en la seccion experimental, aumenta la recuperacion de epidaunorrubicina13-DHED y de epi-feudomicina. La £-rodomicinona es tambien adsorbida del caldo de fermentacion. El mayor rendimiento se debe a la capacidad de adsorcion extremadamente fuerte del XAD-7 para los metabolitos de la epidaunomicina por entrecruzamiento de las moleculas. Las epidaunomicinas brutas obtenidas como rendimiento de recuperacion contienen aproximadamente 500 - 700 mg/l de epidaunorrubicina, 400 - 600 mg/l de 13-DHED, 150 - 300 mg/l de 4'-epi- feudomicina y 150 - 300 mg/l de £-rodomicinona. Si se utiliza Diaion HP-20 como adsorbente, se recuperan los mismos rendimientos, pero la cantidad de adsorbente anadido como suplemento al medio E1 tiene que ser significativamente mayor.

El procedimiento de fermentacion se puede llevar a cabo en cualquier condicion que permita la maxima produccion de epidaunomicinas y £-rodomicinona. Sin embargo, resulta ventajoso llevar a cabo fermentaciones en un intervalo de temperatura de 26°C a 34°C a pH 6,5-7,5 durante 7 a 14 dfas. El adsorbente se puede anadir en cualquier momento del cultivo, pero el mejor rendimiento se obtiene si el adsorbente se anade al cultivo al comienzo del cultivo.

Las sustancias adsorbidas en la resina adsorbente, que comprenden principalmente epidaunomicinas y £- rodomicinona, se separaron del caldo de cultivo por decantacion. La resina se extrajo utilizando disolventes organicos, siendo preferidos el metanol y el butanol. Se recomienda una cantidad de disolvente de 10-50% del volumen del caldo de cultivo en un fermentador. La extraccion repetida de 1 a 5 veces libera el adsorbente utilizado de todos los metabolitos de la antraciclina, y la resina es reciclable despues del lavado con agua.

La separacion de la fraccion de aglicona, que contiene £-rodomicinona, es ventajosa despues de la recuperacion de todos los metabolitos del adsorbente.

Procesamiento adicional de las antraciclinas brutas

Conversion de 13-DHED en epidaunorrubicina

La 13-DHED, se separa facilmente de la fraccion glicosfdica por medio de cromatograffa seguida de cristalizacion junto con la separacion de epidaunorrubicina. La 13-DHED se podna adsorber en una resina anadida al caldo de cultivo de la cepa Streptomyces con capacidades para la smtesis de daunomicina y especialmente las ultimas etapas. Aun cuando cualquier cepa es adecuada, resulta ventajoso utilizar la cepa que esta bloqueada en la ruta biosintetica temprana y no es capaz de acumular metabolitos de daunomicina.

Conversion de epidaunorrubicina en epirrubicina

La epidaunorrubicina bruta (pureza > 80%) se utiliza como material de partida para la qmmica sintetica para obtener epirrubicina, que es un farmaco para el cancer de uso frecuente. Se puede utilizar cualquier serie de reacciones sinteticas o biocataltticas para la hidroxilacion de la posicion 14.

Existen varias posibilidades de convertir la epidaunorrubicina en su forma hidroxilada en la posicion 14, la epirrubicina. El producto genetico endogeno, la 14-hidroxilasa, no es suficientemente activo en las condiciones de cultivo para convertir toda la epidaunorrubicina formada en epirrubicina aunque se encuentran cantidades menores de epirrubicina en el caldo de cultivo. De acuerdo con los experimentos de los autores de la presente invencion (datos no mostrados), incluso el elevado numero de copias del gen para la 14-hidroxilasa, fracaso al completar el procedimiento para la produccion de epirrubicina. Sin embargo, dos publicaciones de patentes de los Estado Unidos, US 5.955.319 y US 6.210.930 describen la conversion de daunorrubicina en doxorrubicina a un nivel bajo por el producto genico de doxA. Al parecer, la byconversion es altamente dependiente de las condiciones, y los autores de

la presente invencion no han logrado repetir el procedimiento.

Existen varias posibilidades de anadir un grupo hidroxilo en el C-14 de la epidaunorrubicina intacta, analogamente a la smtesis de doxorrubicina a partir de daunorrubicina.

La purificacion de la epirrubicina se lleva a cabo por medio de cromatograffa y/o cristalizacion despues de la 5 extraccion de epirrubicina de la mezcla de smtesis. Sin embargo, para lograr la calidad requerida para el ingrediente farmaceutico activo, es esencial la separacion por cromatograffa para proporcionar epirrubicina con una pureza > 97%.

Conversion de £-rodomicinona en idarrubicina

Se sabe que la biosmtesis prosigue en la secuencia mostrada en la Figura 1. La aklavinona, un precursor ffpico de 10 varias antraciclinas, esta hidroxilada en la posicion 11 para formar la £-rodomicinona, que esta glicosilada. Las modificaciones en la posicion 10 necesitan una forma glicosilada aunque otros residuos de azucar, tales como la rodosamina, son sustratos aceptados. Despues de 10 modificaciones, tiene lugar la oxigenacion en la posicion 13 y la ultima etapa para la biosmtesis de daunorrubicina es una O-metilacion en C-4. Por lo tanto, las modificaciones en 10 y 13 asf como la glicosilacion tienen exito a pesar de la forma 4-desoxi. Tanto la 4-desoxiaclavinona como la 415 desoxi-£-rodomicinona se convierten en idarrubicina.

El procedimiento de la presente invencion es, en efecto, eficaz ya que permite la produccion y recuperacion de £- rodomicinona, epidaunorrubicina, 13 DHED y 4'-epi-feudomicina a partir de una sola fermentacion.

Por las razones enumeradas anteriormente, resulta ventajoso utilizar una cepa de acuerdo con la presente invencion en la fermentacion para producir epirrubicina e idarrubicina para uso comercial. El procedimiento de acuerdo con la 20 presente invencion permite la produccion de las antraciclinas importantes con un alto rendimiento con bajo coste. El diagrama del procedimiento de fermentacion se describe en la Figura 2.

Se proporciona una descripcion mas detallada de la presente invencion en los ejemplos siguientes.

Resultara obvio para un experto en la tecnica que, a medida que avanza la tecnologfa, el concepto de la invencion se puede implementar de diversas maneras. La invencion y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos 25 anteriormente, pero pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construccion de cepas microbianas que producen altos fftulos de epidaunomicinas y £-rodomicinona

La manipulacion del ADN de Streptomyces se realizo en E. coli y el ADN propagado se introdujo a continuacion 30 en cepas de Streptomyces. Las cepas bacterianas y los plasmidos utilizados en este trabajo se describen en la Tabla 3 a continuacion.

Tabla 3. Cepas bacterianas y plasmidos.

Cepa/plasmido

Descripcion Referencia o Fuente

E. coli XL1-Blue

Anfitrion de clonacion de E. coli Stratagene

G001

Cepa de Streptomyces productora de daunomicina DSM12245

G001/pB70dv

Cepa de Streptomyces productora de epidaunomicinas y epi- carminomicinas DSM 19076

Los cultivos de Streptomyces y cepas de E. coli asf como los aislamientos y las manipulaciones de ADN se llevaron 35 a cabo como se describe en los manuales de laboratorio de Hopwood et al. (1985) y Sambrook et al. (1989), respectivamente. Los plasmidos se introdujeron en cepas de E. coli mediante electroporacion de alta tension y en Streptomyces mediante transformacion de protoplastos (Ylihonko et al., 1996).

El gen snog C se utilizo como una sonda para la clonacion de los genes correspondientes de las bibliotecas de genes de estreptomicetos. Los genes clonados y propagados en E. coli se transfirieron a G001 en un vector pIJE486 40 y los productos obtenidos en cultivos a pequena escala se estudiaron mediante la comparacion con los productos de G001. De esta manera se encontro que el clon que portaba ekr8 produda epidaunomicinas ademas de daunomicinas. Se selecciono el clon que era incapaz de producir metabolitos ffpicos de daunorrubicina mientras que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

acumulaba epidaunomicinas y se denomino G001/pB70dv (num. de deposito: DSM 19076). Los productos obtenidos en el cultivo del clon en las condiciones descritas en el Ejemplo 2, revelaron tanto epidaunomicinas como epi- carminomicinas.

El plasmido que contema el clon G001/pB70dv se cultivo varias rondas en medio TSB (Caldo de Triptona de Soja modificado Oxoid en polvo de 30 g por 1 litro) para eliminar el plasmido. La cepa obtenida no portaba el plasmido y produda agliconas. El gen ekr8 se clono en diferentes constructos que portaban los genes implicados en etapas tardfas de biosmtesis de antraciclina y se introdujeron en la cepa productora de aglicona mencionada anteriormente. Se estudio el analisis de muestras de cultivos a pequena escala en las condiciones descritas en el ejemplo 2 y el clon obtenido que portaba el plasmido pB89rdmB podfa producir metabolitos de epidaunomicina mientras que las epi-carminomicinas ya no se acumulaban en el caldo de cultivo. Las cantidades se muestran en la Tabla 2 anterior.

La produccion de epi-carminomicinas puede ser el resultado de una actividad incompleta de la 4-O-metilasa en el clon G001/pB70dv. Por lo tanto, se sugirio que el gen rdmB que habfa sido clonado en el constructo pB89rdmB era responsable de la biosmtesis completa para evitar las epi-carminomicinas. rdmB (ACCESO U10405) muestra una alta similitud de secuencia con dnrK, aunque la actividad O-metil transferasa no ha sido demostrada (vease Jansson et al., 2003).

La cepa que portaba pB89rdmB se mutagenizo adicionalmente mediante NTG (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina) (Sigma-Aldrich). Se recogieron aproximadamente 200 colonias sobre placas de agar despues de la mutagenizacion y se cultivaron primero en 3 ml de medio E1. Para mas detalles de las condiciones de cultivo, vease el ejemplo 2 a continuacion. Los clones obtenidos mediante mutagenizacion aleatoria con una mejor produccion de epidaunomicinas y un perfil de producto identico al de la cepa portadora de pB89rdmB se cultivaron varias veces. Finalmente, se seleccionaron cepas microbianas que eran capaces de producir metabolitos de epidaunomicina mas que el clon portador de pB89rdmB en las mismas proporciones y sin tioestrepton en el medio para la presion de seleccion.

La estabilidad de tales cepas para su idoneidad en la produccion comercial se demostro mediante catorce cultivos repetidos (datos no mostrados).

Ejemplo 2.

Cultivo y perfil de producto de cepas microbianas que producen altos tftulos de epidaunomicinas y £-rodomicinona

Las cepas, obtenidas como se describe en el ejemplo 1, se cultivaron en 50 ml de medio E1 con un suplemento de XAD-7 (15 g/l). (E1: Por litro de agua del grifo: glucosa 20 g; almidon soluble 20 g; Peptido 5 g, Extracto de levadura 2,5 g; K2HPOr3H2O 1,3 g; MgSOW^O 1 g; NaCl 3 g; CaCO3 3 g; pH 7-7,5).

Para determinar el titulo de produccion se extrajeron los compuestos desde el cuarto dfa de crecimiento hasta el decimo dfa. Para determinar la cantidad de metabolitos de antraciclina producida, se decanto XAD-7 con agua de un matraz de cultivo y se extrajo XAD-7 con 40 ml de metanol agitando durante al menos 30 min. La HPLC se utilizo para analizar las muestras. El uso de XAD-7 en medio E1 aumento el rendimiento de epidaunomicina a 500-700 mg/l desde aproximadamente 400-500 mg/l. Veanse otros productos de la Tabla 2. El tiempo de produccion optimo fue de once dfas. No se encontraron cambios en la morfologfa de las colonias al final del cultivo en presencia del adsorbente, lo que sugiere que es posible prevenir el efecto toxico y mutageno de los metabolitos de epidaunomicina adsorbiendolos en XAD durante el cultivo.

Un cromatograma tfpico de los productos obtenidos se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 3

Produccion de metabolitos de epidaunomicina y £-rodomicinona en fermentacion

El cultivo de siembra se realizo cultivando una cepa con la capacidad de producir un alto tttulo de epidaunomicinas y £-rodomicinona en cuatro matraces con 60 ml de medio E1 con un suplemento de tioestrepton (5 mg/l) durante cuatro dfas. Se combinaron los cultivos y se utilizaron los 240 ml del caldo de cultivo para inocular un medio E1 de 20 I con un suplemento de XAD-7 (15 g/l) en el fermentador. La fermentacion se llevo a cabo en un volumen de 20 litros durante 11 dfas a la temperatura de 30°C y 34°C, 350 rpm con aireacion de 10 l/min.

Ejemplo 4

Recuperacion y purificacion de epidaunomicinas brutas y £-rodomicinona.

4.1. Purificacion de epidaunomicinas bruta

Los sustituyentes que conteman epidaunorrubicina y £-rodomicinona adsorbidas en XAD-7 se decantaron a partir del caldo de cultivo de 20 litros obtenido de la fermentacion. La resina se lavo para eliminar los restos celulares con agua. El sedimento se extrajo con 1 litro de metanol durante dos a cinco veces.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Las agliconas se extrajeron con cloroformo anadiendo 1 l de cloroformo a los 3 litros de extractos de metanol combinados. Se separaron las capas de disolvente y agua. Los glucosidos de la fase acuosa se extrajeron a cloroformo a un pH ligeramente alcalino y el pH se estabilizo con NaHCO3 saturado. Las sales se eliminaron lavando con agua. Finalmente, la fase de cloroformo se filtro a traves de un filtro de cartucho. El rendimiento de epidaunomicina utilizando dicho procedimiento correspondfa al 70% del extracto bruto.

4.2 Purificacion de £-rodomicinona

La fraccion de disolvente obtenida de la extraccion en el parrafo 4.1. anterior se seco y se concentro hasta un volumen pequeno. La cromatograffa instantanea se realizo utilizando cloroformo como eluyente. La fraccion purificada se cristalizo disolviendola en una mezcla de cloroformo-metanol y se concentro hasta un volumen pequeno y se obtuvo una pureza >90% de £-rodomicinona. El producto precipitado seco se disolvio y la purificacion se realizo mediante cromatograffa instantanea utilizando un sistema disolvente con CHCl3:acetona:metanol. Se extrajeron los glicosidos. Esto se realizo dos veces para maximizar el rendimiento.

Despues de extraer todos los glicosidos al cloroformo, el pH se estabilizo mediante la extraccion con NaHCO3 saturado. A continuacion, las sales se eliminaron extrayendo con agua RO dos o cuatro veces. Las fases se separaron con un separador bifasico.

Ejemplo 5.

Separacion de compuestos individuales de la fraccion de epidaunomicinas

Para separar la epidaunorrubicina, la 13-DHED y la epi-feudomicina de las epidaunomicinas obtenidas en el Ejemplo 4.1, se llevo a cabo una cromatograffa. El cloroformo filtrado se bombeo a una columna de silice y se purifico por medio de cromatograffa utilizando una solucion de cloroformo-metanol como fase movil.

Se recogieron fracciones puras de cada uno de los tres metabolitos y se reunieron las fracciones de cada producto. A las fracciones de epidaunorrubicina, se les anadio butanol y se ajusto el pH acido. Despues de esto se inicio la evaporacion. Cuando la evaporacion fue continua, la epidaunorrubicina comenzo a cristalizar. Los cristales se filtraron y se secaron en una cabina de vacfo. Las fracciones de 13-DHED se cristalizaron por medio de soluciones de etanol-agua.

Ejemplo 6.

Conversion sintetica de epidaunomicina bruta en epirrubicina

La epidaunorrubicina purificada se convirtio en epirrubicina por medio de smtesis qrnmica en forma de reaccion en un solo recipiente que constaba de dos reacciones; bromacion e hidrolisis. En la primera, la posicion C-14 se sustituye con bromo y en la segunda etapa se hidroxila C-14 dando lugar a la formacion de epirrubicina. La epidaunorrubicina obtenida como se describe en el Ejemplo 5 se disolvio en metanol y se anadio bromo. La reaccion se realizo a menos de 10°C y se analizo por medio de HPLC. La reaccion de bromacion se detuvo despues de un dfa por adicion de tampon de formiato sodico. El pH se ajusto a <3 y la temperatura de la mezcla se ajusto a 50- 60°C. La reaccion se controlo con HPLC y cuando la cantidad de epirrubicina no se incrementaba mas, la reaccion se detuvo por enfriamiento de la mezcla de reaccion.

La purificacion se realizo por cromatograffa de silice de fase inversa. Las fracciones se recogieron y se analizaron con HPLC y se reunieron las fracciones puras (pureza> 97%). Despues de la cristalizacion se obtuvo una pureza superior al 98%.

Ejemplo 7.

Medicion analftica de agliconas y antraciclinas HPLC:

Equipo: Jasco HPLC.

Columna: Phenomenex, Aqua, 150 x 4. 6 mm, 3 pm Disolvente A: TEA al 0,05% (pH = 2,0 con TFA) Disolvente B: MeOH al 10% en THF Temperatura de la columna: temperatura ambiente Velocidad de la corriente: 1 ml/min Deteccion: UV-Vis, 480 nm

5

10

15

20

25

Volumen de inyeccion: 5 yl

Gradiente:

tiempo (min)

Disolvente A [%] Disolvente B [%]

0

80 20

10

60 40

27

45 55

28

10 90

30

10 90

31

80 20

36

80 20

Microorganismos depositados

El siguiente microorganismo se deposito bajo las normas del Tratado de Budapest en DMSZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania

Microorganismo

Numero de acceso Fecha de deposito

G001/pB70dV

DSM 19076

Lista de referencias

Di Marco A, Silvestrini R, Gaetani M, Soldati M, Orezzi P, Dasdia T, Scarpinato BM, Valentini L: 1964, 'daunomycin' , a new antibiotic of the rhodomycin group. Nature 15: 706-707.

Hopwood DA, Bibb MJ, Chater KF, Kieser T, Bruton CJ, Kieser HM, Lydiate DJ, Smith CP, Ward JM y Schrempf H (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich.

Jansson A, Niemi J, Lindqvist Y, Mantsala P y Schneider G (2003) Crystal structure of aclacinomycin-10-hydroxylase, a S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase homolog involved in anthracycline biosynthesis in Streptomyces purpurascens. J Mol Biol 334:269-280.

Metsa-Ketela M, Palmu K, Kunnari T, Ylihonko K y Mantsala P (2003) Engineering Anthracycline Biosynthesis toward Angucyclines. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47 (4), 1291-1296

Niemi J, Kantola J, Ylihonko K, Mantsala, P. (2002) Anthracycline biosynthesis: stps, enzymes and genes (revision) in Microbial secondary metabolites: biosynthesis, genetics and regulation (eds. Francisco Fierro & Juan Francisco Martin). Research Signpost 37/661, Kerala, India.

Otten SL, Gallo MA, Madduri K, Liu X, Hutchinson CR. (1997) Cloning and characterization of the Streptomyces peucetius dnmZUV genes encoding three enzymes required for biosynthesis of the daunorubicin precursor thymidine diphospho-L-daunosamine. J Bacteriol. 179 (13), 4446-50.

Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Torkkell S, Kunnari T, Palmu K, Mantsala P, Hakala J y Ylihonko K (2001) The entire nogalamycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces nogalater. characterization of a 20-kb DNA region and generation of hybrid structures. Molecular Genetics and Genomics 266:276-288.

Torkkell S. 2001, Anthracycline antibiotics: Biosynthetic pathway and molecular genetics of nogalamycin, a product of Streptomyces nogalater. Publications in Annales Universitatis Turkuensis-series nr: 275.

Ylihonko K, Tuikkanen J, Jussila S, Cong L y Mantsala P (1996) A gene cluster involved in nogalamycin biosynthesis from Streptomyces nogalater: sequence analysis and complementation of early blocked mutations of the 5 anthracycline pathway. Mol Gen Genet 251:113-120

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Una cepa microbiana de la especie Streptomyces peucetius var. caesius, que produce metabolites de antraciclina con un tttulo de al menos 0,5 g/l, en donde la cepa produce al menos 0,1 g/l de caldo de fermentacion de cada uno de los compuestos epidaunorrubicina, 13-dihidro-epidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona, pudiendose obtener dicha cepa (i) proporcionado la cepa de Streptomyces peucetius var. G001/pB70dv, depositada con el numero de acceso DSM 19076, (ii) retirando el plasmido de dicha cepa mediante cultivo de dicha cepa varias rondas en medio TSB (30 g de Caldo de Triptona de Soja Oxoid en polvo por 1 litro), y (iii) transformando dicha cepa con un plasmido que contiene los genes ekr8 y rdmB.
2. 2. La cepa de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde esta cepa es productora de cualquiera de los compuestos epidaunorrubicina, 13-dihidro-epidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona en al menos 10% de la fraccion total de metabolito de antraciclina.
3. 3. La cepa de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde la biosmtesis de metabolitos endogenos de daunomicina esta bloqueada.
4. 4. La cepa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en donde dicha produccion de baumicina esta bloqueada por mutagenizacion aleatoria.
5. 5. Un procedimiento para producir metabolitos de antraciclina por fermentacion utilizando una cepa productora microbiana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde dichos metabolitos de antraciclina se seleccionan del grupo que consiste en epidaunomicinas y £-rodomicinona.
7. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en donde dichos metabolitos de antraciclina se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en epidaunorrubicina, 13- dihidroepidaunorrubicina, 4'-epi-feudomicina y £-rodomicinona.
8. 8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 - 7, en donde las epidaunomicinas brutas y la £-rodomicinona se absorben a partir del caldo de fermentacion anadiendo una resina en cualquier momento.
9. 9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicha resina se selecciona del grupo de adsorbentes ionicos y no ionicos.
10. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde dicha resina se selecciona del grupo de poliestirenos.
11. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde dicha resina se selecciona del grupo que consiste en XAD-7 y Diaion HP-20.
12. 12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 - 11, en donde dicha resina se anade en una cantidad de 1 -100 g/l.
13. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde dicha resina se anade preferiblemente en una cantidad de 15 - 40 g/l.