ES2299240T3 - Genes biosinteticos para la produccion de insecticidas de espinosina. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ADN aislada que consiste en una secuencia de ADN que codifica una enzima biosintética de espinosina, en donde dicha enzima está definida por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nºs: 2-6, 7-24, 26, 27, 29, 33, o dicha enzima está definida por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nºs: 2-6, 7-24, 26, 27, 29, 33, en que se han hecho una o más sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades funcionales de la enzima.
Description
Genes biosintéticos para la producción de
insecticidas de espinosina.
La presente invención proporciona nuevos genes
biosintéticos, vectores que incorporan los genes biosintéticos,
cepas de Saccharopolyspora spinosa transformadas con los
genes biosintéticos, métodos que utilizan estos genes para
incrementar la producción de macrólidos insecticidas de espinosina y
métodos que utilizan los genes o fragmentos de los mismos para
cambiar los productos producidos por cepas de Saccharopolyspora
spinosa productoras de espinosina.
Según se describe en la patente de EE.UU. nº
5.362.634, el producto de fermentación A83543 es una familia de
compuestos relacionados, producidos por Saccharopolyspora
spinosa. A los miembros conocidos de esta familia se ha aludido
como factores o componentes, y a cada uno se les ha dado una
designación de letra identificativa. A estos compuestos se les
alude aquí en lo que sigue como espinosina A, B, etc. Los compuestos
de espinosina son útiles para el control de arácnidos, nematodos e
insectos, en particular especies de Lepidoptera y
Diptera, y son bastante respetuosos con el medio ambiente y
tienen un perfil toxicológico atractivo. Las Tablas 1 y 2
identifican las estructuras de una diversidad de compuestos de
espinosina conocidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de espinosina que se producen de
forma natural consisten en un sistema de anillos
5,6,5-tricíclico, condensado a una lactona
macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutro (ramnosa) y un
aminoazúcar (forosamina) (véase Kirst et al. (1991)). Si el
aminoazúcar no está presente, a los compuestos se les ha aludido
como la pseudoaglicona de A, D, etc., y si el azúcar neutro no está
presente, entonces a los compuestos se les ha adudido como la
pseudoaglicona inversa de A, D, etc. Una nomenclatura más preferida
es aludir a las pseudoagliconas como espinosina A
17-Psa, espinosina D 17-Psa, etc. y
a las pseudoagliconas inversas como espinosina A
9-Psa, espinosina D 9-Psa, etc.
Los compuestos de espinosina que se producen de
forma natural se pueden producir a través de fermentación a partir
de cultivos NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719, 18720, 18743 y
18823. Estos cultivos se han depositado y se han hecho parte de la
colección de cultivos patrón de Midwest Area Northern Regional
Research Center, Agricultural Research Service, Departamento de
Agricultura de EE.UU., 1815 North University Street, Peoria, IL
61804.
La patente de EE.UU. nº 5.362.634 y la
correspondiente solicitud de patente europea nº 375316 A1 describen
espinosinas A, B, C, D, E, F, G, H y J. Estos compuestos se
describen como producidos al cultivar una cepa del nuevo
microorganismo Saccharopolyspora spinosa seleccionado de NRRL
18395, NRRL 18537, NRRL 18538 y NRRL 18539.
El documento WO 93/09126 describía espinosinas
L, M,. N, Q, R, S y T. También se describen en esa memoria dos
cepas productoras de espinosina J: NRRL 18719 y NRRL 18720, y una
cepa que produce espinosinas Q, R, S y T: NRRL 18823.
El documento WO 94/20518 y US 5.6704.486
describen espinosinas K, O, P, U, V, W e Y, y derivados de los
mismos. También se describe una cepa productora de espinosina K:
NRRL 18743.
Un reto en la producción de compuestos de
espinosina surge del hecho de que se requiere un volumen de
fermentación muy grande para producir una cantidad muy pequeña de
espinosinas. Se desea grandemente aumentar la eficacia de
producción de espinosina y, con ello, aumentar la disponibilidad de
las espinosinas al tiempo de reducir su coste. Un fragmento clonado
de ADN que contiene genes para enzimas biosintéticas de espinosina
permitiría la duplicación de genes que codifiquen enzimas
limitantes de la velocidad en la producción de espinosinas. Esto
podría utilizarse para aumentar el rendimiento en cualquier
circunstancia cuando una de las actividades codificadas limitaban
la síntesis de la espinosina deseada. Un incremento en el
rendimiento de este tipo se alcanzó en fermentaciones de
Streptomyces fradiae duplicando el gen que codifica una
metiltransferasa limitante de la velocidad que convierte macrocina
en tilosina (Baltz et al., 1997). En otro ejemplo, el
documento WO 97/06266 muestra la inserción de una segunda copia de
ery G en una región no esencial del cromosoma de Sac. erythraea para
mejorar la conversión de 6-desoxieritromicina D en
6,12-didesoxieritromicina A.
Genes biosintéticos clonados también
proporcionarían un método para producir nuevos derivados de las
espinosinas que pueden tener un espectro diferente de actividad
insecticida. Son deseables nuevos derivados, ya que, a pesar de que
espinosinas conocidas inhiben un amplio espectro de insectos, no
controlan todas las plagas. Se pueden proporcionar diferentes
patrones de control por parte de compuestos intermedios
biosintéticos de espinosinas, o por parte de sus derivados
producidos in vivo, o por parte de derivados que resultan de
su modificación química in vitro. Compuestos intermedios
específicos (o sus derivados naturales) podrían ser sintetizados
por parte de cepas mutantes de S. spinosa en las que se han
interrumpido determinados genes que codifican enzimas para la
biosíntesis de espinosina. Cepas de este tipo se pueden generar
integrando, a través de una recombinación homóloga, un plásmido
mutagénico que contiene un fragmento interno de gen diana ot me.
Tras la integración del plásmido, se forman dos copias incompletas
del gen biosintético, eliminando con ello la función enzimática que
lo codificaba. El sustrato para esta enzima, o algún derivado
natural del mismo, debería acumularse tras la fermentación de la
cepa mutante. Una estrategia de este tipo se utilizó eficazmente
para generar una cepa de Saccharopolyspora erythraea
productora de nuevos derivados de
6-desoxieritromicina (Weber & McAlpine,
1992).
Nuevos compuestos intermedios también se podían
sintetizar por cepas mutantes de S. spinosa en las que
determinados genes que codifican enzimas para la biosíntesis de
espinosina han sido reemplazadas por partes del mismo gen que han
sido específicamente mutadas in vitro o con correspondientes
partes de genes de otros organismos. Cepas de este tipo se podrían
generar intercambiando la región diana, a través de una doble
recombinación homóloga, por un plásmido mutagénico que contiene el
nuevo fragmento entre las secuencias no mutadas que flanquean la
región diana. El gen híbrido produciría proteínas con funciones
alteradas, que carecían de actividad o realizaban una nueva
transformación enzimática. Se acumulaba un nuevo derivado tras la
fermentación de la cepa mutante. Una estrategía de este tipo se
utilizaba para generar una cepa de Saccharopolyspora
erythraea y producir un nuevo derivado de anhidroeritromicina
(Donadio et al., 1993). Los ácidos nucleicos de la invención
se pueden utilizar en la producción de policetida sintasas tratadas
mediante ingeniería del tipo descrito en los documentos WO 93/13663
y US 5.824.513, en la producción de policetida sintasas híbridas
del tipo descrito en los documentos WO 98/01546, WO 98/49315 y WO
98/51695, y en la construcción de genotecas de policetida sintasa y
genotecas de policetida según se describe en los documentos WO
96/40968, WO 98/49315, WO 98/27203, US 5.783.431, US 5.824.485 y US
5.811.238.
La biosíntesis de espinosinas prosigue a través
de una condensación y modificación escalonadas de precursores de
ácidos 2- y 3-carbonocarboxílicos, generando una
policetida lineal que se cicla y puentea para producir la aglicona
tetracíclica. A continuación se forma pseudoaglicona (que contiene
ramnosa tri-O-metilada), luego se
añade forosamina di-N-metilada para
completar la biosíntesis (Broughton et al., 1991). Otros
macrólidos, tales como la eritromicina antibiótica, la avemectina
antiparasitaria y la rapamicina inmunosupresora se sintetizan de
una manera similar. En las bacterias que producen estos compuestos,
la mayoría de los genes biosintéticos macrólidos se agrupan juntos
en una región de 70-80 kb del genoma (Donadio et
al., 1991; MacNeil et al., 1992; Schwecke et al.,
1995). En los centros de estas agrupaciones se encuentran
3-5 genes muy conservados que codifican las
proteínas multifuncionales muy grandes de una policetida sintasa
(PKS - siglas en inglés) de tipo I. Juntos, los polipéptidos forman
un complejo que consiste en un módulo iniciador y varios módulos
extendedores, cada uno de los cuales añade un precursor
acil-CoA específico a una cadena de policetida en
desarrollo, y modifica el grupo \beta-ceto de una
manera específica. La estructura de una policetida es determinada,
por lo tanto, por la composición y el orden de los módulos en la
PKS. Un módulo comprende varios dominios, cada uno de los cuales
realiza una función específica. El módulo iniciador consiste en un
dominio de acil transferasa (AT) para la adición del grupo acilo
procedente del precursor a un dominio de una proteína
transportadora de acilos (ACP - siglas en inglés). Los módulos
extendedores contienen estos dominios, junto con un dominio de
\beta-cetosintasa (KS - siglas en inglés) que
añade la cadena de policetida pre-existente a la
nueva acil-ACP mediante condensación
descarboxilativa. Dominios adicionales también pueden estar
presentes en los módulos extendedores para llevar a cabo
modificaciones \beta-ceto específicas: un dominio
\beta-cetorreductasa (KR - siglas en inglés) para
reducir el grupo \beta-ceto en un grupo hidroxilo,
un dominio dehidratasa (DH) para separar el grupo hidroxilo y dejar
un doble enlace, y un dominio enoil reductasa (ER) para reducir el
doble enlace y dejar un carbono saturado. El último módulo
extendedor termina con un dominio tioesterasa (TE) que libera la
policetida de la enzima PKS en forma de una lactona
macrocíclica.
Los macrólidos se derivan de lactonas
macrocíclicas mediante modificaciones adicionales, tal como
metilación y cambios en estado reductor, y la adición de azúcares
inusuales. La mayoría de los genes requeridos para estas
modificaciones y para la síntesis y unión de los azúcares se agrupan
en torno a los genes PKS. Los genes que codifican enzimas
biosintéticas desoxiazúcar son similares a los productores de
antibióticos macrólidos tales como eritromicina y tilosina (Donadio
et al., 1993; Merson-Davies & Cundiffe,
1994) y productores de polisacáridos extracelulares, tales como los
antígenos-O de Salmonella y Yersinia
(Jiang et al., 1991; Kessler et al., 1993). Todas
estas síntesis implican la activación de glucosa mediante la adición
de un nucleótido difosfato, seguido de deshidratación, reducción
y/o epimerización. El azúcar resultante podría verse sometida a una
o más modificaciones tales como desoxigenación, transaminación y
metilación, dependiendo del tipo de resto azúcar presente en el
macrólido. Los azúcares se incorporan en macrólidos mediante la
acción de glicosiltransferasas específicas. Los genes implicados en
la síntesis y unión de un azúcar pueden estar estrechamente
agrupados - incluso transcritos en forma de un operón sencillo - o
pueden estar dispersados (Decker & Hutchinson, 1993; Jarvis
& Hutchinson, 1994). La síntesis de espinosina implica también
el puenteo del núcleo de lactona, una actividad que es rara en los
productores de macrólidos. Por lo tanto, la agrupación biosintética
de espinosina puede contener únicamente genes adicionales que
codifican enzimas para esta función.
\newpage
\global\parskip0.970000\baselineskip
Los términos y expresiones siguientes se
utilizan en esta memoria según se define más abajo:
- \quad
- AmR - el gen conferidor de resistencia a apramicina
- \quad
- ApR - el gen conferidor de resistencia a ampicilina
- \quad
- ACP - proteína transportadora de acilo
- \quad
- AT - aciltransferasa
- \quad
- pb - pares de bases
- \quad
- Clonación - el proceso de incorporar un segmento de ADN en un vector de clonación de ADN recombinante y transformar una célula hospedante con el ADN recombinante
- \quad
- CmR - el gen conferidor de resistencia a cloranfenicol
- \quad
- Sesgo de codones - la propensión a utilizar un codón particular para especificar un aminoácido específico. En el caso de S. spinosa la propensión a utilizar un codón con citosina o guanina como la tercera base
- \quad
- Complementación - la restauración de una cepa mutante a su fenotipo normal por parte de un gen clonado
- \quad
- Conjugación - un proceso en el que material genético se transfiere de una célula bacteriana a otra
- \quad
- cos - la secuencia del extremo cohesivo lambda
- \quad
- Cósmido - un vector de clonación de ADN recombinante que es un plásmido que no solamente se puede replicar en una célula hospedante de la misma manera que un plásmido, pero que también se puede empaquetar en cabezas de fagos
- \quad
- DH - deshidratasa
- \quad
- ER - enoil reductasa
- \quad
- Exconjugante - cepa recombinante derivada de un apareamiento conjugante
- \quad
- Gen - una secuencia de ADN que codifica un polipéptido
- \quad
- Genoteca genómica - un conjunto de vectores de clonación de ADN recombinante en el que se han clonado segmentos de ADN que representan esencialmente todas las secuencias de ADN en un organismo particular
- \quad
- Homología - grado de semejanza entre secuencias
- \quad
- Hibridación - el proceso de reasociar dos moléculas de ADN de cadena sencilla para forma una molécula de ADN de cadena doble que puede o no estar apareada en bases por completo
- \quad
- Empaquetado in vitro - la encapsulación in vitro de ADN en proteína de recubrimiento para producir una partícula similar a virus que puede introducir ADN en una célula hospedante mediante infección
- \quad
- kb - pares de kilobases
- \quad
- KR - \beta-ceto reductasa
- \quad
- KS - cetosintasa
- \quad
- Mutagénesis - creación de cambios en la secuencia de ADN. Estos cambios pueden ser aleatorios o dirigidos, generados in vivo o in vitro. Las mutaciones pueden ser silenciosas, o pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos del producto de traducción que alteran las propiedades de la proteína y producen un fenotipo mutante
- \quad
- NmR - el gen conferidor de resitencia a neomicina
- \quad
- ORF - marco de lectura abierto
- \quad
- ori - un origen de replicación (oriR) o de transferencia (oriT) del plásmido
- \quad
- PKS - policetida sintasa
- \quad
- Promotor - una secuencia de ADN que dirige el inicio de la transcripción
- \quad
- Vector de clonación de ADN recombinante - cualquier agente replicante o integrante de forma autónoma que incluye, pero no se limita a plásmidos, que comprende una molécula de ADN a la que se pueden añadir o se han añadido una o más moléculas de ADN adicionales
\global\parskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Metodología de ADN recombinante - técnicas utilizadas para la creación, caracterización y modificación de segmentos de ADN clonados en vectores de ADN recombinante
- \quad
- Fragmento de restricción - cualquier molécula de ADN lineal generada por la acción de una o más enzimas de restricción
- \quad
- Espinosina - un producto de fermentación, típicamente caracterizado por un sistema de anillo 5,6,5-tricíclico, condensado a una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutro (ramnosa) y un aminoazúcar (forosamina) o un producto de la fermentación de lactona macrocíclica, producida por un microorganismo que utiliza la totalidad o la mayoría de los genes espinosina
- \quad
- Genes espinosina - las secuencias de ADN que codifican los productos requeridos para la biosíntesis de espinosina, más específicamente los genes spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre, según se describe aquí en lo que sigue o equivalentes funcionales de los mismos
- \quad
- Subclon - un vector de clonación con un ADN inserto derivado de otro ADN de tamaño igual o mayor
- \quad
- TE - tioesterasa
- \quad
- Transformación - la introducción de ADN (heterólogo u homólogo) en una célula hospedante receptora que cambia el genotipo y da como resultado un cambio en la célula receptora.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1 es un diagrama que ilustra la vía de
biosíntesis de espinosina.
Fig. 2 es un mapa que ilustra la disposición de
fragmentos BamHI y marcos de lectura abiertos en la región
clonada de ADN de S. spinosa.
Fig. 3 es un sitio de restricción y mapa
funcional del cósmido pOJ436.
Fig. 4 es un sitio de restricción y mapa
funcional del cósmido pOJ260.
Fig. 5 es un sitio de restricción y mapa
funcional del cósmido pDAB 1523.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron genes de biosíntesis de espinosina y
ORFs relacionados y se determinó la secuencia de ADN de cada uno.
Los genes clonados y los ORFs se designan aquí en lo que sigue como
spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK,
spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, ORFL15, ORFL16,
ORFR1, ORFR2, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi
y S. spinosa kre. Las funciones propuestas de los genes
clonados en la biosíntesis de espinosina se identifican como FZG. 1
y en la discusión aquí en lo que sigue.
En uno de sus aspectos, la invención proporciona
una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que
codifica una enzima de biosíntesis de espinosina, en donde dicha
enzima se define por una secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste en SEQ ID Nºs 2-6,
7-24, 26, 27, 29 y 33, o dicha enzima se define por
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID Nºs 2-6, 7-24, 26, 27, 29,
33, en que se han efectuado una o más sustituciones de aminoácidos
que no afectan a las propiedades funcionales de la enzima. En una
realización preferida, la secuencia de ADN se selecciona del grupo
de genes que consiste en spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF,
spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ,
spnR, spnS, ORFL15, ORFL16, ORFR1, ORFR2, S. spinosa gtt, S.
spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre,
describiéndose dichos genes por, respectivamente, las bases
21111-28898, 28916-35374,
35419-44931, 44966-59752,
59803-76589, 20168-20995,
18541-19713, 17749-18501,
16556-17743, 14799-16418,
13592-14785, 12696-13547,
11530-12492, 10436-11434,
8967-10427, 7083-8450,
5363-6751, 4168-5325,
3416-4165, 2024-2791,
1135-1971, 76932-77528 y
77729-79984 de SEQ ID Nº: 1, bases
334-1119 de SEQ ID Nº: 28, bases
88-1077 de SEQ ID Nº: 25, bases
226-834 de SEQ ID Nº: 32 y bases
1165-1992 de SEQ ID Nº: 25.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia
de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa de espinosina,
en que dicho dominio se selecciona de KSi, ATi, KS1, AT1, KR1 y
ACP1 que corresponden, respectivamente, a las secuencias de
aminoácidos 6-423, 528-853,
895-977, 998-1413,
1525-1858, 2158-2337 y
2432-2513 de SEQ ID Nº: 2, o dicho dominio es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio. En una realización preferida, la secuencia
de ADN se selecciona del grupo que consiste en las bases
21126-22379, 22692-23669,
23793-24041, 24102-25349,
25683-26684, 27582-28121 y
28404-28649 de SEQ ID Nº: 1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia
de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa de espinosina,
en que dicho dominio se selecciona de KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 y
ACP2 que corresponden, respectivamente, a las secuencias de
aminoácidos 1-424, 536-866,
892-1077, 1338-1683,
1687-1866 y 1955-2034 de SEQ ID Nº:
3, o dicho dominio es una de dichas secuencias de aminoácidos en
las que se han hecho una o más sustituciones de aminoácidos que no
afectan a las propiedades funcionales del dominio. En una
realización preferida, la secuencia de ADN se selecciona del grupo
que consiste en las bases 29024-30295,
30629-31621, 31697-32254,
33035-34072, 30482-34621,
34886-35125 de SEQ ID Nº: 1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia
de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa de espinosina,
en que dicho dominio se selecciona de KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4,
AT4, KR4 y ACP4 que corresponden, respectivamente, a las secuencias
de aminoácidos 1-423, 531-860,
1159-1337, 1425-1506,
1529-1952, 2066-2396,
2700-2880 y 2972-3053 de SEQ ID Nº:
4, o dicho dominio es una de dichas secuencias de aminoácidos en
las que se han hecho una o más sustituciones de aminoácidos que no
afectan a las propiedades funcionales del dominio. En una
realización preferida, la secuencia de ADN se selecciona del grupo
que consiste en las bases 35518-36786,
37108-38097, 38992-39528,
39790-40035, 40102-41373,
41713-42705, 43615-44157 y
44431-44676 de SEQ ID Nº: 1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia
de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa de espinosina,
en que dicho dominio se selecciona de KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5,
KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 y ACP7 que corresponden,
respectivamente, a las secuencias de aminoácidos
1-424, 539-866,
893-1078, 1384-1585,
1645-1726, 1748-2172,
2283-2613, 2916-3095,
3188-3269, 3291-3713,
3825-4153, 4344-4638 y
4725-4806 de SEQ ID Nº: 5, o dicho dominio es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio. En una realización preferida, la secuencia
de ADN se selecciona del grupo que consiste en las bases
45077-46348, 46691-47674,
47753-48310, 49226-49771,
50009-50254, 50318-51592,
51923-52915, 53822-54361,
54368-54883, 54947-56215,
56549-57535, 58106-58990 y
59249-59494 de SEQ ID Nº: 1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia
de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa de espinosina,
en que dicho dominio se selecciona de KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8,
KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 y TE10 que
corresponden, respectivamente, a las secuencias de aminoácidos
1-424, 530-848,
883-1070, 1369-1552,
1648-1726, 1749-2173,
2287-2614, 2540-2800,
3157-3341, 3422-3500,
3534-3948, 4060-4390,
4413-4597, 4900-5078,
5172-5253 y 5302-5555 de SEQ ID Nº:
6, o dicho dominio es una de dichas secuencias de aminoácidos en las
que se han hecho una o más sustituciones de aminoácidos que no
afectan a las propiedades funcionales del dominio. En una
realización preferida, la secuencia de ADN se selecciona del grupo
que consiste en las bases 59902-61173,
61489-62445, 62458-63111,
64006-64557, 64843-65079,
65146-66420, 66760-67743,
67819-68301, 69370-69924,
70165-70401, 70471-71745,
72079-73071, 73138-73692,
74599-75135, 75415-75660 y
75805-76566 de SEQ ID Nº: 1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia
de ADN que codifica un módulo de policetida sintasa de espinosina,
en que dicho módulo se selecciona del grupo que consiste en las
secuencias de aminoácidos 6-1413 de SEQ ID Nº: 2,
1525-2513 de SEQ ID Nº: 2, 1-2034 de
SEQ ID Nº: 3, 1-1506 de SEQ ID Nº: 4,
1529-3053 de SEQ ID Nº: 4, 1748-3269
de SEQ ID Nº: 5, 3291-4806 de SEQ ID Nº: 5,
1-1726 de SEQ ID Nº: 5, 1-1726 de
SEQ ID Nº: 6, 1749-3500 de SEQ ID Nº: 6 y
3524-5555 de SEQ ID Nº: 6, o dicho módulo es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio. En una realización preferida, la secuencia
de ADN se selecciona del grupo que consiste en las bases
21126-24041, 24102-28649,
29024-35125, 35518-40035,
40102-44676,
45077-50254, 50318-54883, 54947-59494, 59902-65079, 65146-70401 y 70471-76566 de SEQ ID Nº: 1.
45077-50254, 50318-54883, 54947-59494, 59902-65079, 65146-70401 y 70471-76566 de SEQ ID Nº: 1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un vector de ADN recombinante que comprende una
secuencia de ADN de la invención según se describe antes.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una célula hospedante transformada con un vector
recombinante de la invención según se describe antes.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un método para producir espinosina, que comprende las
etapas de
- 1)
- transformar con un vector o porción de ADN recombinante un microorganismo que produce espinosina o un precursor de espinosina por medio de una vía de biosíntesis, comprendiendo dicho vector o porción una secuencia de ADN de la invención, según se describe antes, que codifica la expresión de una actividad que es limitante de la velocidad en dicha vía, y
- 2)
- cultivar dicho microorganismo transformado con dicho vector en condiciones adecuadas para el crecimiento y división de las células, expresión de dicha secuencia de ADN y producción de espinosina.
Preferiblemente, la etapa 1) comprende
transformar dicho microorganismo con un vector o porción del mismo
que comprende una secuencia de ADN que codifica S. spinosa
gtt y S. spinosa gdh, correspondiente a SEQ ID Nºs 29 y
26, respectivamente.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un microorganismo productor de espinosina transformado,
con genes biosintéticos de espinosina, en donde se ha duplicado al
menos uno de los genes biosintéticos de espinosina spnA, spnB,
spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM,
spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh,
S. spinosa epi y S. spinosa kre, describiéndose dichos
genes por las bases 21111-28898,
28916-35374, 35419-44931,
44966-59752, 59803-76569,
20168-20995, 18541-19713,
17749-18501, 16556-17743,
14799-16418, 13592-14785,
12696-13547, 11530-12492,
10436-11434, 8967-10427,
7083-8450, 5363-6751,
4168-5325, 3416-4165,
2024-2791, 1135-1971,
76932-77528 y 77729-79984 de SEQ ID
Nº: 1, las bases 334-1119 de SEQ ID Nº: 28, las
bases 88-1077 de SEQ ID Nº: 25, las bases
226-834 de SEQ ID Nº: 32 y las bases
1165-1992 de SEQ ID Nº: 25.
Preferiblemente, S. spinosa gtt y S.
spinosa gdh están duplicadas, describiéndose dichos genes por
las bases 334-1119 de SEQ ID Nº: 28 y las bases
88-1077 de SEQ ID Nº: 25, respectivamente.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un procedimiento para producir un compuesto de
espinosina, que comprende cultivar un microorganismo productor de
espinosina transformado según se describe antes.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un microorganismo productor de espinosina transformado
según se describe antes, en donde S. spinosa gtt, S. spinosa
gdh y S. spinosa kre están duplicadas, describiéndose
dichos genes por las bases 334-1119 de SEQ ID Nº:
28, las bases 88-1077 de SEQ ID Nº: 25 y las bases
1165-1995-1992 de SEQ ID Nº: 25,
respectivamente.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un procedimiento para producir un compuesto de
espinosina, que comprende cultivar un microorganismo productor de
espinosina transformado según se describe antes.
La invención proporciona también espinosinas,
producidas mediante el cultivo de los nuevos microorganismos de la
invención.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un procedimiento para aislar genes biosintéticos de
macrólidos, que comprende crear una genoteca genómica de un
microorganismo productor de macrólidos y utilizar un fragmento
marcado de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 28, SEQ ID Nº: 32, que tiene una
longitud de al menos 20 bases en calidad de sonda de
hibridación.
Preferiblemente, el microorganismo es un
microorganismo productor de espinosina.
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Una genoteca de cósmidos de ADN de S.
spinosa (NRRL 18395) se construyó a partir de fragmentos
generados mediante digestión parcial con Sau3A I. Estos
fragmentos se clonaron en el sitio BamHI del vector pOJ436
(Bierman et al., 1992) y se introdujeron en células de E.
coli mediante empaquetamiento in vitro y transducción.
La genoteca de bacterias recombinantes, así preparada, se rastreó en
cuanto a homología con dos sondas de ADN radiomarcadas mediante
hibridación utilizando los métodos de Solenberg & Burgett
(1989). Una sonda era el fragmento SpeI de 400 kb que, a
menudo, está suprimido en cepas de S. spinosa no
productoras, generadas mediante transformación o mutagénesis con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(Matsushima et al., 1994). La segunda sonda era un trozo de
300 pb de ADN de S. spinosa que codifica parte de una
cetosintasa no implicada en la biosíntesis de espinosina (B.E.
Schoner, comunicación personal). Incluye una región que está muy
conservada en todos los genes de policetida y de ácidos grasos y,
por lo tanto, era de esperar que se hibridara cruzadamente con los
genes PKS de espinosina. Los cósmidos 9A6 y 2C10 eran dos de siete
clones que se hibridaban a las dos sondas. El cósmido 3E11 se
seleccionó de la genoteca genómica mediante hibridación a un
fragmento SgrA1-BamH1 radiomarcado del cósmido 9A6
(bases 26757-26936 en SEQ ID Nº: 1). Para
determinar la secuencia de nucleótidos del inserto en el cósmido
9A6, los fragmentos BamHI se subclonaron en el sitio
BamHI del plásmido pOJ260 (véase la fig. 4) (Bierman et
al., 1992). Las secuencias de los insertos en estos plásmidos
se determinaron por uno cualquiera de dos métodos. En un método,
fragmentos subclonados se digerieron parcialmente con Sau3A
I, y trozos de tamaño seleccionado se clonaron en el sitio
BamHI de ADN procedente del fago M13mp19. ADN de cadena
sencilla se preparó a partir de recombinantes seleccionados al azar
y se secuenció mediante secuenciación de ciclo fluorescente
utilizando reactivos y equipo de ABI (Applied Biosystems, Inc.,
Foster, CA) de acuerdo con los métodos de Burget & Rosteck
(1994)). Las secuencias procedentes de subclones de fagos de cada
plásmido se reunieron en uan secuencia contigua. En el otro método
de secuenciación, los ADNs de plásmidos de doble cadena se cebaron
reiterativamente con oligonucleótidos de cadena sencilla, cada uno
de ellos diseñado para complementar una región próxima al extremo de
la secuencia previamente determinada. Así, la secuencia completa se
compiló a partir de una serie de secuencias parcialmente
solapantes. Kits Prism-Ready Sequencing (ABI) se
utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se
analizaron en un secuenciador ABD73A. La misma estrategia se empleó
para secuenciar en los sitios BamHI de ADN de 9A6 de doble
cadena. Estos datos permitían alinear y orientar una con relación a
otra las secuencias subclonadas, utilizando el módulo AssemblyLIGN
del programa MacVector (Oxford Molecular, Campbell, NY) y, con
ello, permitió reunir la secuencia de nucleótidos completa del ADN
de S. spinosa en el cósmido 9A6. Las secuencias completas de
los cósmidos 2C10 y 3E11 se determinaron por el método de la
secuenciación de ciclo fluorescente de fragmentos de ADN al azar
clonados en el fago M13 (SeqWright, Houston, TX). Los insertos en
los cósmidos 2C10 y 3E11 se solaparon y el inserto en 3E11 solapó el
extremo del inserto en el cósmido 9A6. Véase la fig. 2. Juntos, los
tres insertos de cósmidos abarcaron aproximadamente 80 kb de una
secuencia única (SEQ ID Nº: 1). La siguiente Tabla 3 identifica las
porciones de SEQ ID Nº: 1 incluidas en cada uno de los tres
insertos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La fig. 2 da una representación gráfica de la
relación de los tres insertos a las 80 kb de la secuencia.
Debe señalarse que el cósmido 2C10 carecía de
las bases G41877, C45570, C57845 y G73173 de SEQ ID Nº: 1. Se
determinó que estas deleciones eran artefactos de clonación. Las
deleciones generaron codones de terminación en marco que truncaban
polipéptidos PKS. Uno de ellos se produjo en una región también
clonada en el cósmido 3E11, pero no estaba presente en la región de
3E11 para la cual se obtuvo la secuencia. Por lo tanto, el ADN no
clonado que abarca todos los 8 codones de terminación en la región
de PKS se secuenció directamente a partir de regiones amplificadas
por PCR del genoma de S. spinosa (NRRL 18395). Las secuencias
procedentes de ADN no clonado confirmaron la existencia de los 4
codones de terminación en el extremo de dominios ACP, y demostró
que los 4 desplazamientos del marco dentro de otras regiones
codificantes eran artefactos de clonación únicos para el cósmido
2C10.
\vskip1.000000\baselineskip
La SEQ ID Nº: 1 incluye una región central de
aproximadamente 55 kb con una homología llamativa con el ADN que
codifica la policetida sintasas de productores de macrólidos
conocidos (Donadio et al., 1991; MacNeil et al.,
1992; Schwecke et al., 1995; Dehoff et al., 1997). La
región del ADN de PKS de espinosina consiste en 5 ORFs (marcos de
lectura abiertos) con codones de terminación en marco en el extremo
de dominios ACP, similares a los ORFs de PKS en las otras bacterias
productoras de macrólidos. Los cinco genes PKS de espinosina están
dispuestos de la cabeza a la cola (véase la fig. 2), sin ninguna
función no PKS intermedia tal como el elemento de inserción que se
encuentra entre los genes PKS de eritomicina Al y AII (Donadio et
al., 1993). Estos se designan spnA, spnB, spnC, spnD y
spnE. La secuencia de nucleótidos para cada uno de los cinco
genes PKS de espinosina, y los correspondientes polipéptidos se
identifican en la siguiente Tabla 4:
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
spnA codifica el módulo iniciador (SEQ ID
Nº: 1, bases 21126-24041) y el módulo extendedor 1
(SEQ ID Nº: 1, bases 24102-28649). La secuencia de
nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos para cada
uno de los dominios funcionales dentro del módulo iniciador y del
módulo extendedor 1 se identifican en la siguiente Tabla 5:
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
spnB codifica el módulo extendedor 2 (SEQ
ID Nº: 1, bases 29024-35125). La secuencia de
nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos para cada
uno de los dominios funcionales dentro del módulo extendedor 2 se
identifican en la siguiente Tabla 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
spnC codifica el módulo extendedor 3 (SEQ
ID Nº: 1, bases 35518-40035) y el módulo extendedor
4 (SEQ ID Nº: 1, bases 40102-44676). La secuencia de
nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos para cada
uno de los dominios funcionales dentro de los módulos extendedores 3
y 4 se identifican en la siguiente Tabla 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
spnD codifica el módulo extendedor 5 (SEQ
ID Nº: 1, bases 45077-50254), el módulo extendedor 6
(SEQ ID Nº: 1, bases 50318-54883) y el módulo
extendedor 7 (SEQ ID Nº: 1, bases 54947-59494). La
secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de
aminoácidos para cada uno de los dominios funcionales dentro de los
módulos extendedores 5, 6 y 7 se identifican en la siguiente Tabla
8:
\vskip1.000000\baselineskip
spnE codifica el módulo extendedor 8 (SEQ
ID Nº: 1, bases 59902-65079), el módulo extendedor 9
(SEQ ID Nº: 1, bases 65146-70401) y el módulo
extendedor 10 (SEQ ID Nº: 1, bases 70471-76566). La
secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de
aminoácidos para cada uno de los dominios funcionales dentro de los
módulos extendedores 8, 9 y 10 se identifican en la siguiente Tabla
9:
Los límites y funciones de los 50 dominios
identificados en las Tablas 5-9 precedentes se
pronostican en base a similitudes con las secuencias de aminoácidos
conservadas de los dominios en otras policetida sintasas, en
particular la policetida sintasa eritromicina (Donadio et
al., 1992). Se presume que el dominio KSi inesperado en el
extremo amino del módulo iniciador es no funcional, ya que contiene
un residuo glutamina en el aminoácido 172 en lugar de la cisteína
requerida para la actividad de \beta-cetosintasa
(Siggard-Andersen, 1993). Se ha descubierto un
dominio KS no funcional similar en el módulo iniciador de la PKS
tilosina (Dehoff et al., 1997). Los otros dominios de la PKS
espinosina son funcionales. Ninguno de ellos tiene las
características de secuencia de los dominios inactivos encontrados
en los genes de PKS eritromicina y rapamicina (Donadio et
al., 1991; Aparicio et al., 1996). Se demostró que los
genes de PKS clonados eran esenciales para la biosíntesis de
espinosina mediante el descubrimiento de que cepas de S.
spinosa en las que se habían interrumpido estos genes eran
incapaces de producir espinosinas mediante fermentación. La
interrupción de los genes se consiguió clonando un fragmento
interno del gen en el plásmido pOJ260 (fig. 4), utilizando procesos
bien conocidos para los expertos en la técnica. Los plásmidos
recombinantes se introdujeron luego en S. spinosa mediante
conjugación a partir de E. coli utilizando los procesos de
Matsushima et al. (1994), y seleccionando los exconjugantes
resistentes a apramicina. Plásmidos basados en pOJ260 no se replican
independientemente en S. spinosa y se mantienen establemente
integrando el plásmido en el cromosoma a través de recombinación
entre el ADN clonado y su secuencia homóloga en el genoma. La
integración crea dos versiones incompletas del gen fijado como
objetivo (una que carece de secuencias 5' y una que carece de
secuencias 3') en el cromosoma, con el ADN de pOJ260 entre ellas. La
biosíntesis de espinosina fue bloqueada mediante la interrupción del
ORF de spnA con los fragmentos V, N o K de BamH1, que
corresponden, respectivamente, a los siguientes segmentos de SEQ ID
Nº: 1 21365-22052, 22052-24338 ó
24338-26227. La biosíntesis de espinosina también
fue bloqueada interrumpiendo el ORF de spnD con los
fragmentos G, E o K de BamH1, que corresponden,
respectivamente, a los siguientes segmentos de SEQ ID Nº: 1: bases
48848-50578, 50578-52467 ó
55207-55888. La biosíntesis de espinosina también
fue bloqueada interrumpiendo el ORF de spnE con los
fragmentos J, I, D, H y F de BamH1, que corresponden,
respectivamente, a los siguientes segmentos de SEQ ID Nº:
63219-63989, 65406-66733,
66733-68997, 69369-70731 y
70731-72675. La biosíntesis de espinosina no fue
bloqueada mediante la integración de los fragmentos C (bases
44612-47565 en SEQ ID Nº: 1) o B (bases
55936-63219 en SEQ ID Nº: 1) de BamH1, ya
que no son internos a ningún gen; el fragmento C de BamH1
abarca la unión entre spnC y spnD, y el fragmento B
de BamH1 abarca la unión entre spnD y spnE. En
estos casos la integración deja una versión completa de cada
gen.
En el ADN situado arriba de los genes de PKS
(clonados en el cósmido 9A6) existían 16 marcos de lectura abiertos
(ORFs), cada uno de los cuales consistente en al menos 100 codones,
que comienzan con ATG o GTG y que terminan con TAA, TAG o TGA y que
tienen la desviación del codón esperada de regiones codificantes de
proteínas en un organismo, cuyo ADN contiene un alto porcentaje de
residuos guanina y citosina (Bibb et al., 1984). Véase el
lado derecho inferior de la fig. 2 para una representación gráfica
de los 16 ORFs en 9A6. Basado en la evidencia que se comentará aquí
en lo que sigue, 14 de los ORFs han sido designados como genes
biosintéticos de espinosina, a saber: spnF, spnG, spnH, spnI,
spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR y
spnS (marcados F a S en la fig. 2). En la siguiente Tabla 10,
la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos para el
correspondiente polipéptido se identifican para cada uno de estos
genes, así como para dos ORFs (ORFL15 y ORFL16), que se encuentran
inmediatamente más arriba de spnS. También identificadas en
la Tabla 10 se encuentran las secuencias de nucleótidos para ORFR1 y
ORFR2 más abajo de los genes de PKS (en el cósmido 2C10) y las
secuencias de aminoácidos correspondientes a ellos.
(C) indica que en el listado de secuencias se da
la cadena complementaria
\vskip1.000000\baselineskip
Para asignar funciones de los polipéptidos
identificados en la Tabla 10 se utilizaron tres líneas de evidencia:
similitud con las secuencias de función conocida, resultados de
experimentos de interrupción del gen fijado como objetivo y
resultados de experimentos de bioconversión.
Las secuencias de aminoácidos de los
polipéptidos predichos se compararon con las secuencias depositadas
en las bases de datos en el Centro Nacional de Información
Biotecnológica (NCBI, Washington, DC), utilizando el algoritmo
BLAST para determinar lo bien que están relacionadas con proteínas
conocidas. Las investigaciones BLAST de las bases de datos del NCBI
también se repitieron periódicamente para obtener nuevas visiones a
partir de homologías adicionales. La Tabla 11 proporciona los
mejores emparejamientos de una investigación básica mediante BLAST
el 12 de enero de 1998:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En interrupciones de genes fijados como
objetivo, fragmentos internos se generaron mediante amplificación
por PCR a partir de los ADNs del cósmido, y se clonaron en el
plásmido pOJ260. Los plásmidos resultantes fueron luego conjugados
en S. spinosa (NRRL 18395) y exconjugantes resistentes a
apramicina se aislaron y fermentaron. Como se ha establecido antes,
la base de los experimentos de interrupción es que cuando se integra
un plásmido que porta un fragmento de gen interno, resultan dos
copias incompletas del gen biosintético, eliminando con ello la
función enzimática. Se analizaron los productos de la fermentación
resultantes para determinar que espinosinas se acumulaban. Los
resultados de los experimentos de interrupción de los genes fijados
como objetivo se resumen en la Tabla 12.
En estudios de bioconversión, cepas en las que
se alteró la síntesis de espinosina se testaron en cuanto a su
capacidad de convertir compuestos intermedios de espinosina en otras
espinosinas. Los compuestos intermedios utilizados eran espinosina
A aglicona (AGL), espinosina P (P), espinosina K (K) y espinosina A
9-Psa (PSA). Los resultados de los experimentos de
bioconversión están también resumidos en la Tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
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Las conclusiones sacadas de las investigaciones
BLAST, los experimentos de la interrupción de los genes y los
estudios de bioconversión se discutirán ahora con mayor detalle
sobre una base de gen por gen.
Se demostró que los 11 genes situados más arriba
de la PKS estaban implicados en la biosíntesis de espinosina, ya
que las cepas en las que estaban interrumpidos no fueron capaces de
acumular las espinosinas A y D principales (Tabla 12). Los
siguientes 2 genes situados más arriba (ORFL15, ORFL16) y el gran
gen situado más abajo (ORFR2) de la PKS no contribuyen en la
producción de espinosinas, debido a que la fermentación no se vio
afectada por la interrupción (Tabla 12). No se intentó la
interrupción del ORF situado inmediatamente más abajo de los genes
de PKS (ORFR1), ya que era demasiado pequeño para proporcionar un
fragmento interno que se recombinaría a una frecuencia aceptable.
No se intentó la interrupción de los genes de spnQ, spnR y
spnS, ya que investigaciones BLAST iniciales demostraron que
estos genes tenían una similitud destacada con enzimas de las que
se sabe están implicadas en la biosíntesis de desoxiazúcares no
usuales. spnQ tenía un 53% de identidad entre el producto
génico y la
CDP-4-ceto-6-desoxi-D-glucosa-3-deshidratasa
implicada en la síntesis del resto abecuosa del lipopolisacárido de
la superficie celular de Salmonella enterica (Jiang et
al., 1991); spnR tenía un 40% de identidad entre su
producto y un grupo de proteínas que se propone funcione como
desoxiazúcar transaminasas (Thorson et al., 1993); y
spnS tenía un 42% de identidad entre su producto y el
producto SmX de Streptomyces ambofaciens, un organismo
que sintetiza la espiramicina antibiótica con contenido en
forosamina (Geistlich et al., 1992). Han surgido similitudes
incluso más fuertes de recientes investigaciones BLAST (Tabla 11).
En base a estas similitudes y a la estrecha unión de los genes con
otros genes biosintéticos de espinosina, se saca la conclusión que
spnQ, spnR y spnS están implicados en la producción
del resto forosamina de espinosinas.
Cepas interrumpidas en genes spnF, spnJ,
spnL o spnM no acumulaban espinosinas en niveles
significativos (el bajo nivel de espinosina A en el mutante
spnM resultaba, presumiblemente, de una cierta actividad
residual en el producto génico suprimido en su extremo carboxi). Sin
embargo, bioconvertieron aglicona suministrada de forma exógena en
espinosina A y, por lo tanto, contenían todas las enzimas necesarias
para las etapas posteriores en la biosíntesis de espinosina. Estos
genes particulares deben estar implicados en la generación de la
aglicona a partir del producto lactona monocíclico putativo de los
genes de PKS. Los papeles de spnF y spnL en la
formación de puentes carbono-carbono son
consistentes con sus similitudes con enzimas que metilan átomos de
carbono (Tabla 11). La ausencia de productos intermedios
parcialmente modificados en los mutantes bloqueados puede resultar
de la inestabilidad de los compuestos o de una biosíntesis reducida
debido a la carencia de moléculas glicosiladas para actuar como
reguladores positivos, análogos a los de la vía de tilosina (Fish y
Cundiffe, 1997).
La interrupción de spnG también evitó la
producción de espinosina, pero la cepa mutante no podía bioconvertir
aglicona, de modo que se requiere este gen para una etapa posterior
en la vía (Tabla 12). Su similitud de la secuencia con genes de
glicosil transferasa conocidos (Tabla 11) sugiere que spnG
codifica la ramnosil transferasa requerida para la adición del
primer azúcar a la aglicona. El mutante con un spnG
interrumpido carecía también de de una
4'-O-metiltransferasa (OMT)
funcional, ya que convertía la 3',4'-didesmetil
espinosina (P) en la 4'-desmetil espinosina (K),
pero no la espinosina A totalmente metilada. Presumiblemente, la
actividad de 4'-OMT no se expresaba en el mutante,
ya que el gen codificante (spnH) se encuentra más abajo de la
integración interrumpidora en el mismo operón. La existencia de
este operón fue confirmada interrumpiendo el fragmento T de
BamH1, que abarca la unión entre spnG y spnH,
pero no es interno a ningún marco de lectura abierto. No obstante,
su intrerrupción alteró la síntesis de espinosina, de manera que
este fragmento debe ser interno a un transcrito sencillo que
comprende los dos genes. Además de la pérdida esperada de la
actividad de 4'-OMT codificada por spnH, esta
interrupción también determinó la pérdida inesperada de la función
de 3'-OMT, lo que conduce a la acumulación de
espinosina P (Tabla 12). La actividad de 3'-OMT
parece ser codificada por el gen convergente situado más abajo,
spnI. Este gen tiene la mayor similitud de la secuencia con
el gen ORF Y de Streptomyces nogalator (Tabla 11). La función
del producto ORF Y es desconocida, pero el organismo produce un
desoxiazúcar tetrametilado inusual (nogalosa) que es similar a la
ramnosa trimetilada de espinosina A, de manera que,
presumiblemente, los dos genes están implicados en la metilación del
azúcar. Consistente con esta hipótesis, la interrupción de
spnI creó un mutante que bioconvertía espinosina P solamente
en la 3'-desmetil espinosina (J), no la espinosina A
(Tabla 12). La interrupción evitó cualquier acumulación de
espinosina en fermentaciones no suplementadas, spnK tiene una
secuencia similar a spnI y ORF Y y, presumiblemente,
codifica la 2'-OMT. Su interrupción también evitaba
la acumulación de cualesquera espinosinas en fermentaciones no
suplementadas (Tabla 12).
La interrupción de genes spnN, spnO y
spnP condujo a la acumulación de de la pseudoaglicona (Tabla
12). Por lo tanto, estos genes están implicados en la biosíntesis o
adición del azúcar forosamina. La similitud de spnP con
glicosil transferasas (Tabla 11) indica que codifica la espinosina
forosamil transferasa. El alto grado de similitud entre spnO
y una 2,3-dehidratasa (Tabla 11) indica que está
implicado en la etapa de 2'-desoxigenación de la
síntesis de forosamina.
Los insertos solapantes clonados en los cósmidos
9A6, 3E11 y 2C10 no contienen genes que codifican las cuatro
enzimas requeridas para producir ramnosa a partir de glucosa (Li y
Thorson, 1994). La primera enzima es una glucosa timidilato
transferasa (gtt), o enzima equivalente, que activa glucosa
mediante la adición de un nucleotidil difosfato (NDP - siglas en
inglés). La segunda es una glucosa deshidratasa (gdh) para
producir
NDP-4-ceto-6-desoxi-glucosa,
un producto intermedio común a muchas vías de biosíntesis de
desoxiazúcares. También se requieren una epimerasa (epi) y
una cetorreductasa (kre) específicas para la síntesis de
ramnosa para convertir la
NDP-4-ceto-6-desoxi-glucosa
en NDP-L-ramnosa, el azúcar
activado, que es el sustrato de la glicosil transferasa que añade
ramnosa a la aglicona. Genes que codifican estas enzimas en S.
spinosa se clonaron a partir de una genoteca separada de
fragmentos Sau3A Iparciales de 7-12 kb en el
vector \lambda ZAP Express^{TM} (Stratagene, LaJolla, CA). Se
prepararon sondas radiomarcadas mediante extensión aleatoria del
cebador (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) de fragmentos
procedentes del plásmido pESC1 que contiene los genes de gdh
de Saccharopolyspora erythraea (Linton et al., 1995) y
gtt. Se realizaron hibridaciones de placas para rastrear la
genoteca de fagos con un lavado estricto de O.Sx SSC, SDS al 0,1% a
65ºC durante 1 h. Las porciones de plásmido (pDAB1620 y pDAB1621)
del vector que contenía insertos se escindieron a partir de dos de
los tres fagos hibridantes, y se secuenciaron parcialmente
utilizando kits de secuenciación Prism-Ready (ABI)
y múltiples cebadores. La parte secuenciada del inserto en pDAB1620
(SEQ ID Nº: 25) incluye un ORF que codificaría un polipéptido de
329 aminoácidos (SEQ ID Nº: 26) con una identidad del 82% con el
producto gdh de S. erythraea. Junto a este gen se
encuentra un ORF que codifica un polipéptido de 275 aminoácidos (SEQ
ID Nº: 27) con una identidad del 72% con el producto génico
kre de S. erythraea. La parte secuenciada del inserto
en pDAB1621 (SEQ ID Nº: 28) contiene un ORF que codifica un
polipéptido de 261 aminoácidos (SEQ ID Nº: 29) con una identidad
del 83% con el producto gtt de S. erythraea. Se
preparó una segunda sonda para genes de ramnosa mediante
amplificación por PCR de ADN genómico de S. spinosa
utilizando cebadores de oligonucleótidos degenerados (SEQ ID Nº: 30
y SEQ ID Nº: 31), en base a regiones de aminoácidos conservados en
proteínas epi conocidas (Jiang et al., Linton et
al., 1995). Se realizaron reacciones por PCR en un
termociclador GeneAmp 9600 con AmpliTaq polimerasa
(Perkin-Elmer) utilizando 30 ciclos de 30 s a 94ºC,
30 s a 60ºC y 45 s a 72ºC. La sonda se hibridó a un fago en en la
genoteca de 7-12 kb; la porción de plásmido del
vector que contenía el inserto (pDAB1622) se escindió y se secuenció
parcialmente (SEQ ID Nº: 32). Incluye un ORF para un polipéptido de
202 aminoácidos (SEQ ID Nº: 33) con una homología del 57% con la
proteína epi de S. erythraea. Los genes se
interrumpieron mediante recombinación con plásmidos que contenían
fragmentos internos (bases 382-941 en SEQ ID Nº:
25, 1268-1987 en SEQ ID Nº: 25,
447-994 en SEQ ID Nº: 28 ó 346-739
en SEQ ID Nº: 32). En todos los casos se obtuvieron exconjugados
resistentes a apramicina, pero solamente eran capaces de
desarrollarse en medios estabilizados por ósmosis tales como CSM
suplementado con sacarosa a 200 g/L, o R6 (Matsushima et
al., 1994). Incluso bajo estas condiciones, los exconjugados se
desarrollaron más lentamente que la S. spinosa parental
(NRRL 18395) y eran morfológicamente distintos, con micelios muy
fragmentados. Estos resultados podrían ser debidos a la presencia de
ramnosa en la pared de la célula en S. spinosa y a un
requisito que estos cuatro genes estén presentes para la síntesis de
la pared de la célula en este organismo. Mutantes interrumpidos en
estos genes se desarrollaron demasiado lentamente como para ser
fermentados bajo condiciones conocidas para producir espinosinas.
Sin embargo, hibridaciones Southern de ADN genómico de S.
spinosa con la sonda gttgdh de S. erythraea
(lavada en 2x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 1 h) o con la sonda
epi degenerada (lavada en 0,1x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC
durante 1 h) indicaban que no existen otros homólogos de estos
genes presentes en el genoma de S. spinosa. Por lo tanto,
los cuatro genes de S. spinosa clonados deben ser la única
fuente de ramnosa tanto para la formación de la pared celular como
para la biosíntesis de espinosina.
La secuencia de nucleótidos y la correspondiente
secuencia de aminoácidos para cada uno de los cuatro genes de S.
spinosa requeridos para producir ramnosa se identifican en la
siguiente Tabla 13:
Así, a 23 genes de S. spinosa se les
puede asignar papeles en la biosíntesis de espinosina: 5 genes de
PKS para producir una lactona macrocíclica, 4 genes para modificar
esto a la aglicona, 5 genes para sintetizar y añadir ramnosa, 3
genes para metilar la ramnosa y 6 genes para sintetizar y añadir
forosamina. La hipotética vía de biosíntesis se resume en la fig.
1.
Existen muchos usos para el ADN de
Saccharopolyspora spinosa clonado. Los genes clonados se
pueden utilizar para mejorar los rendimientos de espinosinas y para
producir nuevas espinosinas. Se pueden obtener rendimientos
mejorados integrando en el genoma de una cepa particular una copia
duplicada del gen para cualquier enzima que limite la velocidad en
la cepa. En el caso extremo en el que la vía de biosíntesis está
bloqueada en una cepa mutante particular debido a la carencia de
una enzima requerida, la producción de las espinosinas deseadas se
puede restaurar integrando una copia del gen requerido. La mejora en
el rendimiento, obtenida al integrar copias de genes de espinosina,
se ilustra aquí en lo que sigue en los Ejemplos 1-3
y 6.
Se pueden producir nuevas espinosinas utilizando
fragmentos del ADN clonado para interrumpir etapas en la
biosíntesis de espinosinas. Una interrupción de este tipo puede
conducir a la acumulación de precursores de productos "de
desviación" (los derivados procesados de forma natural de
precursores). Los fragmentos, útiles para llevar a cabo
interrupciones son los internos a un gen con bases omitidas los
extremos tanto 5' como 3' del gen. Sucesos de recombinación
homólogos que utilizan fragmentos de este tipo dan como resultado
dos copias parciales del gen: uno que carece de las bases omitidas
desde el extremo 5' y uno que carece de las bases omitidas desde el
extremo 3'. El número de bases omitido en cada extremo del fragmento
debe ser lo suficientemente grande, de modo que las copias
parciales del gen conservan la actividad. Normalmente, al menos se
omitirán 50 bases de cada extremo y, más preferiblemente, al menos
se omitirán 100 bases de cada extremo. La longitud del fragmento de
gen parcial debería ser lo suficientemente grande, de manera que la
frecuencia de recombinación es lo suficientemente alta para un
experimento práctico. Fragmentos útiles para las interrupciones
tienen deseablemente una longitud de al menos 300 bases y, más
preferiblemente, al menos una longitud de aproximadamente 600
bases. Espinosinas modificadas, producidas al interrumpir genes,
pueden ser agentes de represión de insectos por sí mismos, o pueden
servir como sustratos para una modificación química ulterior,
creando nuevas espinosinas semi-sintéticas con
propiedades y espectros de actividad únicos. El Ejemplo 4 que figura
aquí en lo que sigue ilustra el uso de la interrupción.
Espinosinas nuevas también se pueden producir
mediante mutagénesis de los genes clonados y sustitución de los
genes mutados por sus homólogos no mutados en un organismo productor
de espinosina. La mutagénesis puede implicar, por ejemplo: 1)
deleción o inactivación de un dominio KR, DH o ER, de manera que una
o más de estas funciones está bloqueada y la cepa produce una
espinosina que tiene un núcleo de lactona con un doble enlace, un
grupo hidroxilo o un grupo ceto que no está presente en el núcleo de
espinosina A (véase Donadio et al., 1993); 2) reemplazo de
un dominio AT, de manera que en el núcleo de lactona se incorpora un
ácido carboxílico diferente (véase Ruan et al., 1997); 3)
adición de un dominio KR, DH o ER a un módulo de PKS existente, de
manera que la cepa produce una espinosina que tiene un núcleo de
lactona con un enlace saturado, un grupo hidroxilo o un doble
enlace que no está presente en el núcleo de espinosina A; ó 4)
adición o sustracción de un módulo de PKS completo, de manera que
el núcleo de lactona cíclica tiene un número mayor o menor de
átomos de carbono. El Ejemplo 5 ilustra el uso de la mutagénesis
para producir una espinosina con funcionalidad modificada.
El ADN procedente de la región del grupo de
genes de espinosina se puede utilizar como una sonda de hibridación
para identificar secuencias homólogas. Así, el ADN clonado aquí
podría utilizarse para localizar plásmidos adicionales de las
genotecas de genes de Saccharopolyspora spinosa que solapan
la región descrita aquí, pero también contienen ADN no clonado
previamente procedente de regiones adyacentes en el genoma de
Saccharopolyspora spinosa. Además, ADN procedente de la
región clonada aquí puede utilizarse para identificar secuencias no
idénticas pero similares en otros organismos. Sondas de hibridación
tienen normalmente una longitud de al menos aproximadamente 20 bases
y están marcadas para permitir la detección.
Se pueden cultivar las cepas modificadas
proporcionadas por la invención para proporcionar espinosinas
utilizando protocolos convencionales tales como los descritos en la
patente de EE.UU. nº 5.362.634.
Se proporcionan los siguientes ejemplos con el
fin de poder comprender más completamente la invención. No deberían
considerarse como limitaciones de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivos vegetativos de la cepa NRRL 18538 de
S. spinosa se desarrollaron en 50 ml de medio CSM (caldo de
tripticasa de soja 30 g/l, extracto de levaduras 3 g/l, sulfato de
magnesio 2 g/l, glucosa 5 g/l, maltosa 4 g/l) en matraces
Erlenmeyer de 250 ml sacudidos a 300 rpm a 30ºC durante 48 h. Los
cultivos de fermentación contenían un inóculo de 1 ml de este
cultivo vegetativo en 7 ml de INF202, un medio registrado similar al
descrito en Strobel y Nakatsukasa (1993). Los cultivos se
desarrollaron en frascos de plástico de 30 ml dispuestos en 10x10
módulos, sacudidos a 300 rpm en un recinto a 30ºC durante 3, 5 ó 7
días. Los caldos se extrajeron con 4 volúmenes de acetonitrilo,
luego se analizaron en cuanto a espinosinas A + D mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) isocrática a través
de una columna de fase inversa C-18 (Strobel y
Nakatsukasa, 1993). La cantidad de espinosinas se determinó a
partir de absorbancia a 250 nm. Para cada instante, las espinosinas
A + D se determinaron a partir de 10 frascos de fermentación. Dos
muestras representativas de cada conjunto de réplicas se analizaron
también mediante un sistema de HPLC ligeramente modificado para
pseudoaglicona (PSA), el precursor de espinosina que carece de
forosamina. En este sistema la fase móvil es 35:35:30
acetonitrilo/metanol/acetato de amonio acuoso al 0,5% (p/v) (R.
Wijayaratne, no publicado).
Los cultivos contienen no solamente las
espinosinas A y D activas contra insectos, sino también
pseudoaglicona (Tabla 14).
\vskip1.000000\baselineskip
La acumulación de la pseudoaglicona, un
precursor de espinosina A deficiente en forosamina, sugiere que en
esta cepa desarrollada bajo estas condiciones, el rendimiento de
espinosinas A + D está limitado por el suministro y/o la adición de
forosamina.
El cósmido 9A6 se conjugó a partir de la cepa
S17-1 de E. coli (Simon et al., 1983)
en la cepa NRRL 18538 de S. spinosa utilizando el método de
Matsushima et al. (1994). Subsiguientemente, se desarrollaron
seis aislados independientes transformados con el cósmido 9A6 y se
analizaron en cuanto a la producción de factor de espinosina bajo
las condiciones de fermentación arriba descritas. El rendimiento
medio de espìnosinas A + D porcedentes de estas cepas era mayor que
el de su parental, en 35 \mug/ml después de 3 días de fermentación
y en 37 \mug/ml después de 5 días. La cantidad de pseudoaglicona
en los cultivos transformados era menor que en la cepa parental a
lo largo de la fermentación (Tabla 15).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa NRRL 18538 y 6 aislados independientes
transformados con el cósmido 9A6 se analizaron en cuanto al
contenido de espinosina en diferentes momentos durante la
fermentación. Para cada cepa, espinosinas A + D se determinaron a
partir de 10 frascos de fermentación (Tabla 16). Dos muestras de
cada conjunto de réplicas también se analizaron en cuanto al
contenido en pseudoaglicona (Tabla 17).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, se ha demostrado que la
transformación con el cósmido 9A6 puede mejorar la eficacia con la
que el precursor pseudoaglicona es procesado en espinosinas. En NRRL
18538, las mejoras en el rendimiento de espinosinas A + D eran del
35% después de 3 días de fermentación y del 14% después de 5 días
(Tabla 15). Parece ser que el proceso limitador de la velocidad sea
el suministro y/o la adición de forosamina, ya que la
pseudoaglicona estaba presente en el parental a aproximadamente 120
\mug/ml a lo largo de la fermentación, pero en los
transconjugados se redujo hasta aproximadamente 30 \mug/ml a los 3
días y se agotó en esencia después (Tabla 15). A pesar de que la
conversión no era cuantitativa, los datos eran consistentes con una
eficacia mejorada en el procesamiento de pseudoaglicona para dar
espinosinas A + D en cepas transformadas con el cósmido 9A6. El
efecto podría ser el resultado de duplicar un gen biosintético de
forosamina, un gen de forosaminiltransferasa o una combinación de
mejoras. No existía ninguna diferencia estadísticamente
significativa entre los rendimientos en espinosinas A + D
procedentes de las cepas NRRL 18538 con o sin el cósmido 9A6 después
de 7 ó 9 días de fermentación. La pseudoaglicona seguía estando
reducida en los transconjugados, pero la espinosina A + D extra
producida por su conversión puede no haber sido detectable frente al
fondo más elevado de espinosinas acumuladas por esta fase de
fermentación.
\vskip1.000000\baselineskip
A pesar de que la síntesis de espinosina está
limitada por el suministro/adición de forosamina en la cepa NRRL
18538, otras funciones biosintéticas pueden ser limitantes en otras
cepas. La cepa NRRL 18823 de S. spinosina acumula la
espinosina H (2'-desmetil-espinosina
A; Kirst et al., 1992) más que la espinosina A. La
espinosina H no es un producto intermedio en la vía de biosíntesis
de espinosina A, sino un producto "de desviación" sintetizado
de forma natural cuando no se produce una
2'-O-metilación. El cósmido 9A6 se
conjugó a partir de la cepa S17-1 de E. coli
en la cepa 18823 utilizando el método arriba descrito. Dos de los
exconjugados resultantes, cuando se fermentaban, producían
predominantemente espinosina A con un poco de espinosina H (Tabla
18).
\vskip1.000000\baselineskip
Esto demuestra que la transformación con el
cósmido 9A6 es capaz de superar un segundo tipo de limitación a la
producción de espinosina - la deficiencia de metilación en la cepa
NRRL 18823.
La cepa NRRL 18743 de S. spinosina
acumula espinosina K
(4'-desmetil-espinosina A), un
producto intermedio en la vía de biosíntesis de espinosina A. Dos
de los exconjugados de la cepa NRRL 18743 que contenían el cósmido
9A6 producían predominantemente espinosina A con un poco de
espinosina K, mientras que el tercero producía nada de espinosina K
detectable (Tabla 19).
\vskip1.000000\baselineskip
Esto demuestra que la transformación con el
cósmido 9A6 es capaz de superar un tercer tipo de limitación a la
producción de espinosina - la deficiencia de metilación en la cepa
NRRL 18743.
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento interno de spnP (bases
7391-8150) se amplificó en una reacción en cadena de
la polimerasa utilizando los cebadores dados en SEQ ID Nº: 34 y SEQ
ID Nº: 35. Se utilizó AmpliTaq polimerasa (Perkin Elmer, Foster
City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en una
reacción de 100 \mul con 20 pmol de cada cebador y 1 \mug de
ADN de 9A6. La mezcla se sometió a 25 ciclos de 60 s a 94ºC, 60 s a
37ºC y 120 s a 72ºC. El producto de amplificación se clonó en forma
de un fragmento HindIII de EcoR1 en el vector de
plásmido pOJ260 (Bierman et al., 1992), luego se conjugó a
partir de S17-1 de E. coli en NRRL 18538 de
S. spinosa. Exconjugados estables, que resultan de un solo
suceso de recombinación homólogo entre las secuencias portadas por
el plásmido y cromosómicas, contienen una copia del ADn del vector
integrado en el cromosoma entre dos copias incompletas de
spnP. Cuando se fermentaban, estos exconjugados acumulan el
precursor pseudoaglicona deficiente en forosamina más que los
productos finales espinosinas A y D (Tabla 20).
\vskip1.000000\baselineskip
Las pseudoagliconas son productos intermedios
útiles en la preparación de insecticidas conocidos (solicitud
internacional WO 93/49126).
Se diseñaron los oligonucleótidos solapantes
complementarios SEQ ID Nº: 36 y SEQ ID Nº: 37 para modificar el gen
que codifica la función enoil reductasa en el módulo 2 de la
espinosina PKS. Estos cebadores mutagénicos proporcionan la
sustitución de la secuencia TCACC en lugar de GGTGG en las bases
33563-33567 de SEQ ID Nº: 1, de manera que la
secuencia codifica un dipéptido de serina-prolina en
lugar de un dipéptido de glicina-glicina en el
putativo motivo de unión NAD(P)H. Se utilizó con éxito
una sustitución similar para inactivar una eritromicina ER sin
afectar a cualesquiera otras funciones de PKS (Donadio et
al., 1993). La sustitución introducía simultáneamente un nuevo
sitio de restricción PinA1 y eliminabba un sitio SgA1
para facilitar la detección del ADN tratado por ingeniería en
organismos recombinantes.
En la primera etapa de la mutagénesis se
realizaron dos amplificaciones por PCR separado, una utilizando el
cebador mutagénico SEQ ID Nº: 36 y el cebador flanqueante SEQ ID
Nº: 38 y la otra utilizando el cebador mutagénico SEQ ID Nº: 37 y
el cebador flanqueante SEQ ID Nº: 39. En la segunda etapa, los
productos de las primeras reacciones se diluyeron 100 veces, se
agruparon y se amplificaron solamente con los cebadores flanqueantes
SEQ ID Nº: 38 y SEQ ID Nº: 39. En la tercera etapa, los productos
de la segunda reacción PCR se clonaron en el plásmido pCRII de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (InVitrogen, San Diego,
CA). Una parte del dominio ER2 mutado (que abarca las bases
32424-33626 en SEQ ID Nº: 1) se escindió en forma de
un fragmento Van911-NheI y se insertó en lugar del
fragmento Van911-NheI de tipo salvaje en un fragmento
EcoR1 de 3,5 kb del cósmido 3E11 (bases
32162-35620 en SEQ ID Nº: 1) clonado en el plásmido
pBluescript SK (Stratagene). El fragmento EcoR1 mutado se
transfirió luego en el plásmido conjugado pDAB 1523 (fig. 5), un
derivado de pOJ260 que contiene el gen rpsL de
Streptomyces roseosporus que confiere un fenotipo sensible a
estreptomicina contra-seleccionable (Hosted y Baltz,
1997). El plásmido resultante que contiene el fragmento
EcoR1 mutado se conjugó a partir de S17-1 de
E. coli (Simon et al., 1983). en SS 15, un derivado
espontáneo, resistente a estreptomicina, de la cepa NRLL 18538 de
S. spinosa, utilizando el método de Matsushima et al.
(1994). (Derivados espontáneos, resistentes a estreptomicina, de la
cepa NRLL 18538 de S. spinosa se pueden aislar fácilmente
por los expertos en la técnica). Se demostró que exconjugados
resistentes a apramicina contienen versiones, tanto de tipo salvaje
como mutada, del dominio ER2 mediante hibridación de Southern con
sondas marcadas con digoxigenina (Boehringer Mannheim). También
contenían el gen rpsL de Streptomyces roseosporus y,
por consiguiente, en agar BHI (Difco, Detroit, MI) que contenía
estreptomicina a razón de 150 mg/L se desarrollaba deficientemente y
no consiguió producir micelio aéreo. Revertantes espontáneos a la
resistencia a estreptomicina se seleccionaron sobre la base de su
capacidad de desarrollarse y producir micelio aéreo blanco en agar
BHI que contenía estreptomicina a razón de 150 mg/L. El análisis
Southern indicó que estas cepas no contenían el gen rpsL de
Streptomyces roseosporus o cualesquiera otras secuencias de
pDAB 1523. Algunas cepas habían perdido el grupo completo de genes
de biosíntesis de espinosina, incluido el dominio ER2, así como
pDAB 1523. En otras cepas, las secuencias de pDAB 1523 se habían
escindido a lo largo del dominio ER2 mutante, volviendo a crear la
estructura de gen parental. En un tercer tipo de cepa resistente a
estreptomicina, el pDAB 1523 se había escindido con el dominio ER2
de tipo salvaje, dejando a la versión mutada en su lugar. Cuando se
fermenta, una cepa de este tipo producía un nuevo metabolito,
separable de espinosina A mediante cromatografía líquida en una
columna C18 (ODS-AQ, YMC, Wilmington, NC)
utilizando una fase móvil de acetonitrilo:metanol:acetato de amonio
al 2% (44:44:12). La nueva entidad se analizó mediante ionización
por electroproyección y espectrometría de masas en tándem (Balcer
et al., 1996) utilizando un espectrómetro de masas
cuadrupolo triple (TSQ700, Finnigan MAT, San Jose, CA), Tenía las
propiedades esperadas de la
C18-C19-anhidroespinosina A, con una
masa de 729,5 dalton y producía el fragmento de forosamina de 142
dalton. Los autores de la invención concluyeron que la modificación
de los dominios de PKS codificantes de ADN da como resultado la
producción de nuevos productos de fermentación.
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Fragmentos que contenían los genes biosintéticos
de ramnosa se clonaron independientemente en el vector conjugativo
pOJ260 (Bierman et al., 1992). Los plásmidos resultantes
están listados en la Tabla 21.
Cada plásmido se conjugó a partir de
S17-1 de E. coli (Simon et al., 1983)
en NRRL 18538 de S. spinosa mediante el método de Matsushima
et al. (1994). Exconjugados resistentes a apramicina, que
presumiblemente contenían un plásmido integrado en el cromosoma
mediante recombinación homóloga, se seleccionaron y fermentaron
(Tabla 22).
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En derivados de NRRL 15328 transformados con
gtt o epi, o la combinación de gdh y
kre, no existía ningún incremento consistente en el
rendimiento de espinosinas.
Los fragmentos que contienen los genes
gtt y gdh + kre se combinaron en un solo
plásmido. Dos plásmidos que contienen los genes gtt, gdh y
kre combinados (pDAB 1654 y pDAB 1655) se aislaron y
conjugaron a partir de S17-1 de E. coli
(Simon et al., 1983) en NRRL 18538 de S. spinosa por
el método de Matsushima et al. (1994). Exconjugados
resistentes a apramicina se seleccionaron y fermentaron (Tabla
23).
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En derivados de NRRL 15328 transformados con los
genes gtt, gdh y kre, se observaron incrementos
significativos en los rendimientos de espinosinas. Esto resulta,
posiblemente, de superar un suministro limitador de la velocidad de
NDP-4-ceto-6-desoxi-glucosa
al aumentar simultáneamente las cantidades de productos génicos
tanto gtt como gdh, las enzimas necesarias para su
biosíntesis (véase la fig. 1). Un mayor suministro del producto
intermedio
NDP-4-ceto-6-desoxi-glucosa
conduciría a la producción incrementada tanto de ramnosa como de
forosamina, la hipótesis de que el suministro de desoxiazúcar es
limitante de la producción de espinosina en NRRL 18538, muchos
mutantes bloqueados en la síntesis de forosamina o, adicionalmente,
acumulan PSA hasta niveles muy elevados. Se puede preparar más de
este producto intermedio, ya que requiere solamente un desoxiazúcar,
en comparación con los dos requeridos para las espinosinas A o
D.
La presente invención no está limitada a un
vector particular que comprende genes de espinosina de la invención,
sino que, más bien, abarca los genes biosintéticos en los que se
utiliza cualquier vector para introducir los genes en una célula
huésped recombinante.
Además, debido a la degeneración del código
genético, los expertos en la técnica están familiarizados con
métodos sintéticos para preparar secuencias de ADN que pueden
codificar la misma, o funcionalmente la misma actividad que la de
la secuencia de genes natural. De igual manera, los expertos en la
técnica están familiarizados con técnicas para modificar o mutar la
secuencia de genes para preparar nuevas secuencias que codifican la
misma, o sustancialmente la misma actividad del polipéptido que las
secuencias naturales. Por consiguiente, pretenden estar abarcados
por la presente invención estos mutantes sintéticos y formas
modificadas de los genes y productos de expresión de estos
genes.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Baltz, Richard H
\hskip1cmBroughton, Mary C
\hskip1cmCrawford, Kathryn P
\hskip1cmMadduri, Krishnamurthy
\hskip1cmTreadway, Patti J
\hskip1cmTurner, Jan R
\hskip1cmWaldron, Clive
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes biosintéticos para
insecticidas que contienen epinosina
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<130> 50489
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/36987
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
09-03-1998
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 39
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 80161
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<212> ADN
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 2595
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 2152
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 3170
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 4928
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 5588
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 275
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 390
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 250
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 395
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 539
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 397
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 283
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 320
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 332
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 486
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 455
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 462
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 18
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<210> 19
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<211> 385
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 19
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<210> 20
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<211> 249
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 20
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<210> 21
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<211> 255
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 21
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<210> 22
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<211> 278
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 198
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 23
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<210> 24
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<211> 751
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 24
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<210> 25
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<211> 2310
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<212> DNA
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<213> Saccharopolyspora spinosa
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> CDS
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<222> (88)..(1077)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1165)..(1992)
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<400> 25
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<210> 26
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<211> 329
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
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<400> 26
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<210> 27
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<211> 275
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<212> PRT
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<213> Saccharopolyspora spinosa
\newpage
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<400> 27
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1272
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharopolyspora spinosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (334)..(1119)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharopolyspora spinosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n is a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n is a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipngsgtsggsn ssccaccttc cgg
\hfill23
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n is a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> poco fiable
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n is a, t, c, o g
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatsangtcg tcytcsansg csacgaacgc gtg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (226)..(834)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pDAB1622
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgaattcg agctgctgtc aatcaact
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaagcttg ttgaccgtgg cggtttcct
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador mutagénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggttcatt cggccgcctc accggtgggg atggccgcga tc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador mutagénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgcggcc atccccaccg gtgaggcggc cgaatgaacc ag
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador flanqueante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgctcgaa atcgcacgtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador flanqueante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatcgctgg gcagtgagg
\hfill19
Claims (26)
1. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica una enzima biosintética de
espinosina, en donde dicha enzima está definida por una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nºs:
2-6, 7-24, 26, 27, 29, 33, o dicha
enzima está definida por una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en SEQ ID Nºs: 2-6,
7-24, 26, 27, 29, 33, en que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales de la enzima.
2. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 1, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que genes que consiste en spnA, spnB, spnC, spnD, spnE,
spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP,
spnQ, spnR, spnS, ORFL15, ORFL16, ORFR1, ORFR2, S. spinosa
gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre,
estando descritos dichos genes por las bases
21111-28898, 28916-35374,
35419-44931, 44966-59752,
59803-76589, 20168-20995,
18541-19713, 17749-18501,
16556-17743, 14799-16418,
13592-14785, 12696-13547,
11530-12492, 10436-11434,
8967-10427, 7083-8450,
5363-6751, 4168-5325,
3416-4165, 2024-2791,
1135-1971, 76932-77528 y
77729-79984 de SEQ ID Nº: 1, bases
334-1119 de SEQ ID Nº: 28, bases
88-1077 de SEQ ID Nº: 25, bases
226-834 de SEQ ID Nº: 32 y bases
1165-1992 de SEQ ID Nº: 25.
3. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa
de espinosina, en que dicho dominio se selecciona de KSi, ATi, KS1,
AT1, KR1 y ACP1 que corresponden, respectivamente, a las secuencias
de aminoácidos 6-423, 528-853,
895-977, 998-1413,
1525-1858, 2158-2337 y
2432-2513 de SEQ ID Nº: 2, o dicho dominio es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio.
4. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 3, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que consiste en las bases 21126-22379,
22692-23669, 23793-24041,
24102-25349, 25683-26684,
27582-28121 y 28404-28649 de SEQ ID
Nº: 1.
5. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa
de espinosina, en que dicho dominio se selecciona de KS2, AT2, DH2,
ER2, KR2 y ACP2 que corresponden, respectivamente, a las secuencias
de aminoácidos 1-424, 536-866,
892-1077, 1338-1683,
1687-1866 y 1955-2034 de SEQ ID Nº:
3, o dicho dominio es una de dichas secuencias de aminoácidos en las
que se han hecho una o más sustituciones de aminoácidos que no
afectan a las propiedades funcionales del dominio.
6. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 5, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que consiste en las bases 29024-30295,
30629-31621, 31697-32254,
33035-34072, 30482-34621,
34886-35125 de SEQ ID Nº: 1.
7. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa
de espinosina, en que dicho dominio se selecciona de KS3, AT3, KR3,
ACP3, KS4, AT4, KR4 y ACP4 que corresponden, respectivamente, a las
secuencias de aminoácidos 1-423,
531-860, 1159-1337,
1425-1506, 1529-1952,
2066-2396, 2700-2880 y
2972-3053 de SEQ ID Nº: 4, o dicho dominio es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio.
8. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 7, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que consiste en las bases 35518-36786,
37108-38097, 38992-39528,
39790-40035, 40102-41373,
41713-42705, 43615-44157 y
44431-44676 de SEQ ID Nº: 1.
9. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa
de espinosina, en que dicho dominio se selecciona de KS5, AT5, DH5,
KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 y ACP7 que
corresponden, respectivamente, a las secuencias de aminoácidos
1-424, 539-866,
893-1078, 1384-1585,
1645-1726, 1748-2172,
2283-2613, 2916-3095,
3188-3269, 3291-3713,
3825-4153, 4344-4638 y
4725-4806 de SEQ ID Nº: 5, o dicho dominio es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio.
10. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 9, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que consiste en las bases 45077-46348,
46691-47674, 47753-48310,
49226-49771, 50009-50254,
50318-51592, 51923-52915,
53822-54361, 54368-54883,
54947-56215, 56549-57535,
58106-58990 y 59249-59494 de
SEQ ID Nº: 1.
SEQ ID Nº: 1.
11. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica un dominio de policetida sintasa
de espinosina, en que dicho dominio se selecciona de KS8, AT8, DH8,
KR8, ACP8, KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 y
TE10 que corresponden, respectivamente, a las secuencias de
aminoácidos 1-424, 530-848,
883-1070, 1369-1552,
1648-1726, 1749-2173,
2287-2614, 2540-2800,
3157-3341, 3422-3500,
3534-3948, 4060-4390,
4413-4597, 4900-5078,
5172-5253 y 5302-5555 de SEQ ID Nº:
6, o dicho dominio es una de dichas secuencias de aminoácidos en las
que se han hecho una o más sustituciones de aminoácidos que no
afectan a las propiedades funcionales del dominio.
12. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 11, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que consiste en las bases 59902-61173,
61489-62445, 62458-63111,
64006-64557, 64843-65079,
65146-66420, 66760-67743,
67819-68301, 69370-69924,
70165-70401, 70471-71745,
72079-73071, 73138-73692,
74599-75135, 75415-75660 y
75805-76566 de SEQ ID Nº: 1.
13. Una molécula de ADN aislada que consiste en
una secuencia de ADN que codifica un módulo de espinosina PKS, en
que dicho módulo se selecciona del grupo que consiste en las
secuencias de aminoácidos 6-1413 de SEQ ID Nº: 2,
1525-2513 de SEQ ID Nº: 2, 1-2034 de
SEQ ID Nº: 3, 1-1506 de SEQ ID Nº: 4,
1529-3053 de SEQ ID Nº: 4, 1748-3269
de SEQ ID Nº: 5, 3291-4806 de SEQ ID Nº: 5,
1-1726 de SEQ ID Nº: 5, 1-1726 de
SEQ ID Nº: 6, 1749-3500 de SEQ ID Nº: 6 y
3524-5555 de SEQ ID Nº: 6, o dicho módulo es una de
dichas secuencias de aminoácidos en las que se han hecho una o más
sustituciones de aminoácidos que no afectan a las propiedades
funcionales del dominio.
14. Una molécula de ADN aislada de la
reivindicación 13, en donde dicha secuencia de ADN se selecciona del
grupo que consiste en las bases 21126-24041,
24102-28649, 29024-35125,
35518-40035, 40102-44676,
45077-50254, 50318-54883,
54947-59494, 59902-65079,
65146-70401 y 70471-76566 de SEQ ID
Nº: 1.
15. Un vector de ADN recombinante que comprende
una secuencia de ADN según se define en la reivindicación 1.
16. Una célula huésped transformada con un
vector recombinante según la reivindicación 15.
17. Un método para producir espinosina, que
comprende las etapas de:
- 1)
- transformar con un vector o porción de ADN recombinante un microorganismo que produce espinosina o un precursor de espinosina por medio de una vía de biosíntesis, comprendiendo dicho vector o porción una secuencia de ADN de la invención, según se describe antes, que codifica la expresión de una actividad que es limitante de la velocidad en dicha vía, y
- 2)
- cultivar dicho microorganismo transformado con dicho vector en condiciones adecuadas para el crecimiento y división de las células, expresión de dicha secuencia de ADN y producción de espinosina.
18. Un método de la reivindicación 17, en el que
la etapa 1) comprende transformar dicho microorganismo con un vector
o porción del mismo que comprende una secuencia de ADN que codifica
S. spinosa gtt y S. spinosa gdh, correspondiente a SEQ
ID Nºs 29 y 26, respectivamente.
19. Un microorganismo productor de espinosina
transformado, con genes biosintéticos de espinosina en su genoma, en
donde se ha duplicado al menos uno de los genes biosintéticos de
espinosina spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI,
spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S.
spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa
kre, describiéndose dichos genes por las bases
21111-28898, 28916-35374,
35419-44931, 44966-59752,
59803-76569, 20168-20995,
18541-19713, 17749-18501,
16556-17743, 14799-16418,
13592-14785, 12696-13547,
11530-12492, 10436-11434,
8967-10427, 7083-8450,
5363-6751, 4168-5325,
3416-4165, 2024-2791,
1135-1971, 76932-77528 y
77729-79984 de SEQ ID Nº: 1, las bases
334-1119 de SEQ ID Nº: 28, las bases
88-1077 de SEQ ID Nº: 25, las bases
226-834 de SEQ ID Nº: 32 y las bases
1165-1992 de SEQ ID Nº: 25.
20. Un microorganismo productor de espinosina
transformado de la reivindicación 19, en donde S. spinosa gtt
y S. spinosa gdh están duplicadas, describiéndose dichos
genes por las bases 334-1119 de SEQ ID Nº: 28 y las
bases 88-1077 de SEQ ID Nº: 25, respectivamente.
21. Un procedimiento para producir un compuesto
de espinosina, que comprende cultivar un microorganismo productor de
espinosina transformado de la reivindicación 20.
22. Un microorganismo productor de espinosina
transformado de la reivindicación 19, en donde S. spinosa gtt, S.
spinosa gdh y S. spinosa kre están duplicadas,
describiéndose dichos genes por las bases 334-1119
de SEQ ID Nº: 28, las bases 88-1077 de SEQ ID Nº: 25
y las bases 1165-1995-1992 de SEQ ID
Nº: 25, respectivamente.
23. Un procedimiento para producir un compuesto
de espinosina, que comprende cultivar un microorganismo productor de
espinosina transformado de la reivindicación 22.
24. Un procedimiento para producir un compuesto
de espinosina, que comprende cultivar un microorganismo productor de
espinosina transformado de la reivindicación 19.
25. Un procedimiento para aislar genes
biosintéticos de macrólidos, que comprende crear una genoteca
genómica de un microorganismo productor de macrólidos y utilizar un
fragmento marcado de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 28, SEQ ID Nº: 32, que
tiene una longitud de al menos 20 bases en calidad de sonda de
hibridación.
26. Un procedimiento de la reivindicación 25, en
donde el microorganismo es un microorganismo productor de
espinosina.
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