-
Die
vorliegende Erfindung liefert neue Biosynthesegene, Vektoren, die
die Biosynthesegene einbauen, Saccharopolyspora spinosa-Stämme, die
mit den Biosynthesegenen transformiert sind, Verfahren, die diese Gene
verwenden zum Erhöhen
der Produktion von Spinosyn-Insektizid-Makroliden und Verfahren,
die die Gene oder Fragmente davon verwenden zum Verändern der
Produkte, die durch Spinosyn-produzierende Stämme von Saccharopolyspora spinosa
produziert werden.
-
Wie
in
US Patent Nr. 5,362,634 offenbart,
ist das Fermentationsprodukt A83543 eine Familie von in Beziehung
stehenden Verbindungen, die durch Saccaropolyspora spinosa produziert
werden. Die bekannten Mitglieder dieser Familie sind als Faktoren
oder Komponenten bezeichnet worden und jedes hat eine Buchstabenbezeichnung
zur Identifizierung bekommen. Diese Verbindungen werden hier später als
Spinosyn A, B usw. bezeichnet. Die Spinosynverbindungen sind geeignet
zur Bekämpfung
von Arachniden, Nematoden und Insekten, insbesondere Lepidoptera-
und Diptera-Spezies und sie sind ziemlich umweltfreundlich und haben ein
attraktives toxikologisches Profil. Die Tabellen 1 und 2 geben die
Strukturen einer Vielzahl bekannter Spinosynverbindungen an:
-
-
-
-
Die
natürlich
produzierten Spinosynverbindungen bestehen aus einem 5,6,5-tricyclischen Ringsystem,
fusioniert an ein 12-gliedriges makrocyclisches Lacton, einen neutralen
Zucker (Rhamnose) und einen Aminozucker (Forosamin) (siehe Kirst
et al. (1991)). Wenn der Aminozucker nicht vorliegt, sind die Verbindungen
als die Pseudoaglycone von A, D usw. bezeichnet worden und wenn
der neutrale Zucker nicht vorliegt, dann sind die Verbindungen als
die reversen Pseudoaglycone von A, D usw. bezeichnet worden. Eine
bevorzugtere Nomenklatur ist die Bezeichnung der Pseudoaglycone
als Spinosyn A 17-Psa, Spinosyn D 17-Psa usw. und der reversen Pseudoaglycone
als Spinosyn A 9-Psa, Spinosyn D 9-Psa, usw.
-
Die
natürlich
produzierten Spinosynverbindungen können produziert werden durch
Fermentation der Kulturen NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719,
18720, 18743 und 18823. Diese Kulturen sind hinterlegt worden und
zu einem Teil der Stammkultursammlung des Midwest Area Northern
Regional Research Center, Agricultural Research Service, United
States Department of Agriculture, 1815 North University Street,
Peoria, IL 61604, gemacht worden.
-
U.S. Patent Nr. 5,362,634 und
die entsprechende
europäische Patentanmeldung
Nr. 375316 A1 offenbaren die Spinosyne A, B, C, D, E, F,
G, H und J. Es wird offenbart, dass diese Verbindungen produziert
wurden durch Kultivieren eines Stammes des neuen Mikroorganismus
Saccharopolyspora spinosa, ausgewählt aus NRRL 18395, NRRL 18537,
NRRL 18538 und NRRL 18539.
-
WO 93/09126 offenbarte
die Spinosyne L, M, N, Q, R, S und T. Ebenfalls sind darin zwei
Spinosyn-J-produzierende Stämme
offenbart: NRRL 18719 und NRRL 18720 und ein Stamm, der die Spinosyne
Q, R, S und T produziert: NRRL 18823.
-
WO 94/20518 und
US 5,6704,486 offenbaren
die Spinosyne K, O, P, U, V, W und Y und Derivate davon. Ebenfalls
offenbart wird der Spinosyn K-produzierende
Stamm NRRL 18743.
-
Eine
Herausforderung beim Herstellen von Spinosynverbindungen ergibt
sich aus der Tatsache, dass ein sehr großes Fermentationsvolumen erforderlich
ist, um eine sehr kleine Menge Spinosyne herzustellen. Es ist besonders
wünschenswert,
die Spinosynproduktionseffezienz zu erhöhen und dadurch die Verfügbarkeit der
Spinosyne unter Reduzierung ihrer Kosten zu erhöhen. Ein kloniertes DNA-Fragment,
enthaltend Gene für Spinosynbiosyntheseenzyme,
würde eine
Duplikation von Genen ermöglichen,
die für
Rate-limitierende Enzyme bei der Produktion von Spinosynen codieren.
Dies könnte
verwendet werden, um die Ausbeute in jedem Fall zu erhöhen wenn
eine der codierten Aktivitäten
Synthese des gewünschten
Spinosyns limitiert. Eine Ausbeuteerhöhung dieses Typs wurde erreicht
in Fermentationen von Streptomyces fradiae durch Duplizieren des Gens,
das für
eine Rate-limitierende Methyltransferase codiert, die Macrocin in
Tylosin umwandelt (Baltz et al, 1997). In einem anderen Beispiel
zeigt
WO 97/06266 Insertion
einer zweiten Kopie von ery G in eine nichtessenzielle Region des
Sac. erythraea-Chromosoms, um Umwandlung von 6-Deoxyerythromycin D in 6,12-Dideoxyerythromycin
A zu verbessern.
-
Klonierte
Biosynthesegene würden
ebenfalls ein Verfahren bereitstellen zum Produzieren neuer Derivate
der Spinosyne, die ein verschiedenes Spektrum insektizider Aktivität aufweisen.
Neue Derivate sind wünschenswert,
da, wenngleich bekannt ist, dass Spinosyne ein breites Spektrum
von Insekten inhibieren, sie nicht alle Schädlinge bekämpfen. Verschiedene Bekämpfungsmuster
können
bereitgestellt werden durch Biosynthesezwischenprodukte der Spinosyne
oder durch ihre Derivate, die in vivo produziert werden, oder durch Derivate,
die aus ihrer chemischen Modifikation in vitro resultieren. Spezifische
Zwischenprodukte (oder ihre natürlichen
Derivate) können
synthetisiert werden durch Mutantenstämme von S. spinosa, worin bestimmte Gene,
die für
Enzyme codieren, für
Spinosynbiosynthese zerstört
worden sind. Solche Stämme
können
erzeugt werden durch Integrieren über homologe Rekombination
eines mutagenen Plasmids, das ein internes Fragment des Targetgens
enthält.
Nach Plasmidintegration werden zwei unvollständige Kopien des Biosynthesegens
gebildet, wobei die enzymatische Funktion, für das es codierte, eliminiert
wird. Das Substrat für
dieses Enzym oder einige natürliche
Derivate davon sollten bei Fermentation des Mutantenstammes akkumulieren. Eine
solche Strategie wurde effektiv verwendet, um einen Stamm von Saccharopolyspora
erythraea zu erzeugen, der neue 6-Deoxyerythromycinderivate produziert
(Weber & McAlpine,
1992).
-
Neue
Zwischenprodukte könnten
auch synthetisiert werden durch Mutantenstämme von S. spinosa, worin Teile
bestimmter Gene, die für
Enzyme für
Spinosynbiosynthese codieren, ersetzt worden sind durch Teile des
gleichen Gens, die spezifisch in vitro mutiert worden sind, oder
mit entsprechenden Teilen von Genen von anderen Organismen. Solche Stämme könnten erzeugt
werden durch Austauschen der Targetregion über doppelte homologe Rekombination
mit einem mutagenen Plasmid, das das neue Fragment zwischen nicht
mutierten Sequenzen enthält,
die die Targetregion flankieren. Das Hybridgen würde Protein mit veränderten
Funktionen produzieren, wobei entweder eine Aktivität fehlt
oder eine neue enzymatische Umsetzung erfolgt. Ein neues Derivat
würde bei
Fermentation des Mutantenstammes akkumulieren. Eine solche Strategie
wurde verwendet, um einen Stamm von Saccaropolyspora erythraea,
der ein neues Anhydroerythromycinderivat produziert, zu erzeugen
(Donadio et al., 1993). Die Nukleinsäuren der Erfindung können verwendet
werden bei der Produktion von konstruierten Polyketidsynthasen des
Typs, der in
WO 93/13663 und
US 5,824,513 offenbart ist,
bei der Produktion von Hybridpolyketidsynthasen des Typs, der in
WO 98/01546 ,
WO 98/49315 und
WO 98/51695 offenbart ist, und bei
der Konstruktion von Polyketidsynthasebibliotheken und Polyketidbibliotheken, wie
in
WO 96/40968 ,
WO 98/49315 ,
WO 98/27203 ,
US 5,783,431 ,
US 5,824,485 und
US 5,811,238 beschrieben.
-
Biosynthese
von Spinosynen erfolgt über
schrittweise Kondensation und Modifikation von 2- und 3-Kohlenstoff-Carbonsäurevorläufern, Erzeugen
eines linearen Polyketids, das cyclisiert und verbrückt wird, um
das tetracyclische Aglycon zu erzeugen. Pseudoaglycon (enthalten
Tri-O-methylierte
Rhamnose) wird als nächstes
gebildet, dann wird di-N-methyliertes
Forosamin zugegeben, um die Biosynthese abzuschließen (Broughton
et al., 1991). Andere Macrolide, wie etwa das Antiobiotikum Erythromycin,
das Antiparasitenmittel Avermectin und das Immunsuppressionsmittel
Rapamycin werden auf eine ähnliche
Art synthetisiert. In Bakterien, die diese Verbindungen produzieren,
sind die meisten der Macrolidbiosynthesegene zusammen in einem Cluster
in einer 70–80
kb Region des Genoms (Donadio et al., 1991; MacNeil et al., 1992;
Schwecke et al., 1995). An den Zentren dieser Cluster sind 3–5 hoch
konservierte Gene, die für
sehr große
multifunktionale Proteine einer Typ-I- Polyketidsynthase (PKS) codieren. Zusammen
bilden die Polypeptide einen Komplex, bestehend aus einem Initiatormodul
und mehreren Extendermodulen, wobei jedes davon einen spezifischen Acyl-CoA-Vorläufer zu
einer wachsenden Polyketidkette hinzufügt und die β-Keto-Gruppe auf eine spezifische Art
modifiziert. Die Struktur eines Polyketids wird daher bestimmt durch
die Zusammensetzung und die Reihenfolge der Module in der PKS. Ein
Modul umfasst mehrere Domänen,
wobei jede davon eine spezifische Funktion ausführt. Das Initiatormodul besteht
aus einer Acyltransferase(AT)-Domäne für die Addition der Acylgruppe
aus dem Vorläufer
an eine Acylträgerprotein-(ACP)-Domäne. Die
Extendermodule enthalten diese Domänen, zusammen mit einer β-Ketosynthase(KS)-Domäne, die
die bereits existierende Polyketidkette an das neue Acyl-ACP durch
decarboxylierende Kondensation addiert. Zusätzliche Domänen können ebenfalls in den Extendermodulen
vorliegen, um spezifische β-Keto-Modifikationen auszuführen: eine β-Ketoreduktase(KR)-Domäne zum Reduzieren
der β-Ketogruppe
in eine Hydroxylgruppe, eine Dehydratase(DH)-Domäne zum Entfernen der Hydroxylgruppe
und Zurücklassen
einer Doppelbindung und eine Enoylreduktase(ER)-Domäne, um die
Doppelbindung zu reduzieren und einen gesättigten Kohlenstoff zurückzulassen.
Das letzte Extendermodul endet mit einer Thioesterase(TE)-Domäne, die
das Polyketid von dem PKS-Enzym in der Form eines macrocyclischen
Lactons freisetzt.
-
Macrolide
werden aus macrocyclischen Lactonen durch zusätzliche Modifikationen erhalten,
wie etwa Methylierung und Veränderungen
des Reduktionszustandes, und die Addition von unüblichen Zuckern. Die meisten
der Gene, die für
diese Modifikationen und zur Synthese und Bindung der Zucker erforderlich
sind, sind im Cluster um die PKS-Gene. Die Gene, die für Deoxyzuckerbiosyntheseenzyme
codieren, sind ähnlich den
Produzenten von Macrolidantibiotika, wie etwa Erythromycin und Tylosin
(Donadio et al., 1993; Merson-Davies & Cundliffe, 1994) und Produzenten
von extrazellulären
Polysacchariden, wie etwa die O-Antigene von Salmonella und Yersinia
(Jiang et al., 1991; Kessler et al., 1993). Alle diese Synthesen
umfassen Aktivierung von Glucose durch die Addition eines Nukleotiddiphosphats,
gefolgt von Dehydratisierung, Reduktion und/oder Epimerisierung.
Der resultierende Zucker könnte
eine oder mehrere Modifikationen eingehen, wie etwa Deoxygenierung,
Transaminierung und Methylierung, in Abhängigkeit vom Typ des Zuckerrestes,
der in dem Macrolid vorliegt. Die Zucker werden in Macrolide durch
die Wirkung spezifischer Glycosyltransferasen eingebaut. Gene, die
an der Synthese und Bindung eines Zuckers beteiligt sind, können eng
in Cluster zusammengefasst sein – selbst wenn als ein Einzeloperon
transkribiert – oder
sie können
verteilt sein (Decker & Hutchinson,
1993; Jarvis & Hutchinson,
1994). Spinosynsynthese umfasst auch Verbrücken der Lactonkerne, eine Aktivität, die selten
bei Macrolidproduzenten ist. Daher können die Spinosynbiosynthesecluster
einzigartig zusätzliche
Gene enthalten, die für
Enzyme für
diese Funktion codieren.
-
Die
folgenden Ausdrücke
werden hier wie unten definiert verwendet:
- AmR – das Apramycinresistenzübertragungsgen.
- ApR – das
Ampicillinresistenzübertragungsgen.
- ACP – Acylträgerprotein.
- AT – Acyltransferase.
- bp – Basepaare.
- Klonieren – das
Verfahren des Einbaus eines DNA-Segments in einen rekombinanten
DNA-Klonierungsvektor und Transformieren einer Wirtszelle mit der
rekombinanten DNA.
- CmR – das
Chloramphenicolresistenzübertragungsgen.
- Codonbevorzugung (Codon Bias) – die Neigung ein spezielles
Codon zum Spezifizieren einer spezifischen Aminosäure zu verwenden.
Im Falle von S. spinosa ist die Neigung die Verwendung eines Codons
mit Cytosin oder Guanin als die dritte Base.
- Komplementierung – die
Rückführung eines
Mutantenstammes auf seinen normalen Phänotyp durch ein kloniertes
Gen.
- Konjugation – ein
Prozess, in welchem genetisches Material von einer Bakterienzelle
auf eine andere übertragen
wird.
- cos – die
Lambdakohäsivendsequenz.
- Cosmid – ein
rekombinanter DNA-Klonierungsvektor, der ein Plasmid ist, das nicht
nur in einer Wirtszelle in der gleichen Art replizieren kann wie
ein Plasmid, sondern auch in Phagenköpfe gepackt werden kann.
- DH – Dehydratase.
- ER – Enoylreduktase.
- Exkonjugant – rekombinanter
Stamm, abgeleitet aus einer konjugativen Paarung.
- Gen – eine
DNA-Sequenz, die für
ein Polypeptid codiert.
- Genomische Bibliothek – ein
Satz von rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren,
in welche Segmente von DNA, die im Wesentlichen alle DNA-Sequenzen
in einem speziellen Organismus repräsentieren, kloniert worden
sind.
- Homologie – Ausmaß der Gleichheit
zwischen Sequenzen.
- Hybridisierung – das
Verfahren zum Annealen von zwei einzelsträngigen DNA-Molekülen, um
ein Doppelstrang-DNA-Molekül
zu bilden, das gegebenenfalls vollständig Base-gepaart sein kann.
- In vitro Verpackung – die
in vitro-Einkapselung von DNA in Hüllprotein, um einen Virus-ähnlichen
Partikel zu erzeugen, der DNA in eine Wirtszelle einführen kann
durch Infektion.
- kb – Kilobasepaare.
- KR – β-Ketoreduktase.
- KS – Ketosynthase.
- Mutagenese – Erzeugung
von Veränderungen
der DNA-Sequenz. Sie können
statistisch oder zielgerichtet in vivo oder in vitro erzeugt werden.
Mutationen können
still sein oder können
zu Veränderungen
der Aminosäuresequenz
des Translationsproduktes führen,
die die Eigenschaften des Proteins verändern und einen Mutantenphänotyp produzieren.
- NmR – das
Neomycinresistenz-Übertragungsgen.
- ORF – offener
Leserahmen.
- ori – ein
Plasmidursprung (origin) der Replikation (oriR) oder des Transfers
(oriT).
- PKS – Polyketidsynthase.
- Promotor – eine
DNA-Sequenz, die die Initiierung der Transkription steuert.
- Rekombinanter DNA-Klonierungsvektor – jedes autonom replizierende
oder integrierende Mittel, einschließlich, ohne darauf begrenzt
zu sein, Plasmide, umfassend ein DNA-Molekül, an welchem ein oder mehrere
zusätzliche
DNA-Moleküle
vorliegen können
oder hinzugefügt
worden sind.
- Rekombinante DNA-Methodologie – Technologien, die verwendet
werden zur Erzeugung, zur Charakterisierung und Modifizierung von
DNA-Segmenten, die
in rekombinanten DNA-Vektoren kloniert sind.
- Restriktionsfragment – jedes
lineare DNA-Molekül,
das durch die Wirkung eines oder mehrerer Restriktionsenzyme erzeugt
wird.
- Spinosyn – ein
Fermentationsprodukt, das typischerweise gekennzeichnet ist durch
ein 5,6,5-tricyclisches Ringsystem, fusioniert an ein 12-gliedriges
macrocyclisches Lacton, einen neutralen Zucker (Rhamnose) und einen
Aminozucker (Forosamin) oder ein ähnliches macrocyclisches Lactonfermentationsprodukt,
produziert durch einen Mikroorganismus unter Verwendung aller oder
der meisten der Spinosyngene.
- Spinosyngene – die
DNA-Sequenzen, die für
die Produkte codieren, die erforderlich sind für Spinosynbiosynthese, im Spezielleren
die Gene spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ,
spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa
gtt, S. spinosa gdh, S. spinos epi und S. spinos kre, wie hier nachfolgend
beschrieben oder funktionale Äquivalente
davon.
- Subklon – ein
Klonierungsvektor mit einer Insert-DNA, abgeleitet von einer anderen
DNA mit gleicher Größe oder
größer.
- TE – Thioesterase.
- Transformation – die
Einführung
von DNA (heterolog oder homolog) in eine Rezipientenwirtszelle,
die den Genotyp verändert
und zu einer Veränderung
der Rezipientenzelle führt.
-
Kurze Beschreibung der Figuren
-
1 ist ein Diagramm, das den Spinosynbiosyntheseweg
zeigt.
-
2 ist
ein Plan, der die Anordnung von BamHI-Fragmenten und den offenen
Leserahmen der klonierten Region von S. spinosa-DNA zeigt.
-
3 ist
eine Restriktionsstelle und eine funktionale Karte von Cosmid pOJ436.
-
4 ist
eine Restriktionsstelle und eine funktionale Karte von Cosmid pOJ260.
-
5 ist
eine Restriktionsstelle und eine funktionale Karte von pDAB 1523.
-
Kurze Beschreibung der Erfindung
-
Spinosynbiosynthesegene
und verwandte ORFs wurden kloniert und die DNA-Sequenz von jedem wurde
bestimmt. Die klonierten Gene und ORFs werden hier nachfolgend bezeichnet
als spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ,
spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, ORFL15, ORFL16,
ORFR1, ORFR2, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinos epi und
S. spinosa kre. Die vorgeschlagenen Funktionen der klonierten Gene
in der Spinosynbiosynthese sind in 1 und
in der hier nachfolgenden Diskussion angegeben.
-
In
einer Hinsicht liefert die Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, bestehend
aus einer DNA-Sequenz, die für
ein Spinosyn-biosynthetisches Enzym codiert, worin das Enzym definiert
ist durch eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 2–6, 7–24, 26, 27, 29, 33, oder worin
das Enzym definiert ist durch eine Aminosäure, ausgewählt aus SEQ ID NO: 2–6, 7–24, 26,
27, 29, 33, worin ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen erfolgt sind,
die die funktionellen Eigenschaften des Enzyms nicht beeinträchtigen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe von Genen, bestehend aus spnA, spnB, spnC, spnD,
spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, senK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP,
spnQ, spnR, spnS, ORFL15, ORFL16, ORFR1, ORFR2, S. spinosa gtt,
S. spinosa gdh, S. spinosa epi und S. spinosa kre, wobei die Gene
beschrieben sind durch die Basen 21111–28898, 28916–35374, 35419–44931,
44966–59752,
59803–76569,
20168–20995,
18541–19713,
17749–18501,
16556–17743, 14799–16418,
13592–14785,
12696–13547,
11530–12492,
10436–11434,
8967–10427,
7083–8450, 5363–6751, 4168–5325, 3416–4165, 2024–2791, 1135–1971, 76932–77528 und
77729–79984
der SEQ ID NO: 1, Basen 334–1119
der SEQ ID NO: 28, Basen 88–1077
der SEQ ID NO: 25, Basen 226–834
der SEQ ID NO: 32 und Basen 1165–1992 der SEQ ID NO: 25.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein isoliertes
DNA-Molekül umfassend
eine DNA-Sequenz, die für
eine Spinosyn-Polyketidsynthasedomäne codiert,
worin die Domäne
ausgewählt
ist aus KSi, ATi, ACPi, KS1, AT1, KR1 und ACP1, jeweils entsprechend
den Aminosäuresequenzen
6–423,
528–853, 895–977, 998–1413, 1525–1858, 2158–2337 und
2432–2513
von SEQ ID NO: 2 oder worin die Domäne eine der Aminosäuresequenzen
ist, worin eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt worden
sind, die die funktionellen Eigenschaften der Domäne nicht
beeinträchtigen.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Basen 21126–22379, 22692–23669,
23793–24041,
24102–25349,
25683–26684,
27582–28121
und 28404–28649
von SEQ ID NO: 1.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein isoliertes
DNA-Molekül, umfassend
eine DNA-Sequenz, die für
eine Spinosyn-Polyketidsynthasedomäne codiert,
worin die Domäne
ausgewählt
ist aus KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 und ACP2, jeweils entsprechend den
Aminosäuresequenzen
1–424,
536–866, 892–1077, 1338–1683, 1687–1866 und
1955–2034
von SEQ ID NO: 3 oder worin die Domäne eine der Aminosäuresequenzen
ist, worin eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt worden
sind, die die funktionellen Eigenschaften der Domäne nicht
beeinträchtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Basen 29024–30295, 30629–31621, 31697–32254,
33035–34072,
34082–34621,
34886–35125
von SEQ ID NO: 1.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein isoliertes
DNA-Molekül, umfassend
eine DNA-Sequenz, die für
eine Spinosyn-Polyketidsynthasedomäne codiert,
worin die Domäne
ausgewählt
ist aus KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4, AT4, KR4 und ACP4, jeweils entsprechend
den Aminosäuresequenzen
1–423, 531–860, 1159–1337, 1425–1506, 1529–1952, 2066–2396, 2700–2880 und
2972–3053
von SEQ ID NO: 4, oder worin die Domäne eine der Aminosäuresequenzen
ist, worin eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt worden
sind, die die funktionellen Eigenschaften der Domäne nicht
beeinträchtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Basen 35518–36786, 37108–38097,
38992–39528,
39790–40035,
40102–41373,
41713–42705,
43615–44157
und 44431–44676
von SEQ ID NO: 1.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein isoliertes
DNA-Molekül, umfassend
eine DNA-Sequenz, die für
eine Spinosyn-Polyketidsynthasedomäne codiert,
worin die Domäne
ausgewählt
ist aus KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7,
KR7 und ACP7, jeweils entsprechend den Aminosäuresequenzen 1–424, 539–866, 893–1078, 1384–1565, 1645–1726, 1748–2172, 2283–2613, 2916–3095, 3188–3269, 3291–3713, 3825–4153, 4344–4638 und
4725–4806
von SEQ ID NO: 5, oder worin die Domäne eine der Aminosäuresequenzen
ist, worin eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt worden sind,
die die funktionellen Eigenschaften der Domäne nicht beeinträchtigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Basen 45077–46348, 46691–47674,
47753–48310,
49226–49771,
50009–50254,
50318–51592,
51923–52915,
53822–54361, 54638–54883,
54947–56215,
56549–57535,
58106–58990
und 59249–59494
von SEQ ID NO: 1.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein isoliertes
DNA-Molekül, umfassend
eine DNA-Sequenz, die für
eine Spinosyn-Polyketidsynthase-Domäne codiert,
worin die Domäne
ausgewählt
ist aus KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10,
AT10, DH10, KR10, ACP10 und TE10, jeweils entsprechend den Aminosäuresequenzen
1–424,
530–848,
883–1070,
1369–1552,
1648–1726, 1749–2173, 2287–2614, 2640–2800, 3157–3341, 3422–3500, 3534–3948, 4060–4390, 4413–4597, 4900–5078, 5172–5253 und
5302–5555
von SEQ ID NO: 6, worin die Domäne
eine der Aminosäuresequenzen ist,
worin eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen
durchgeführt
worden sind, die die funktionellen Eigenschaften der Domäne nicht
beeinträchtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Basen 59902–61173, 61489–62445,
62548–63111, 64006–64557,
64843–65079,
65146–66420,
66760–67743,
67819–68301,
69370–69924,
70165–70401, 70471–71745,
72079–73071,
73138–73692,
74599–75135,
75415–75660,
und 75805–76566
von SEQ ID NO: 1.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein isoliertes
DNA-Molekül, bestehend
aus einer DNA-Sequenz, die für
ein Spinosyn-Polyketissynthase-Modul
codiert, worin das Modul ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäuresequenzen 6–1413 von
SEQ ID NO: 2, 1525–2513
von SEQ ID NO: 2, 1–2034
von SEQ ID NO: 3, 1–1506
von SEQ ID NO: 4, 1529–3053
von SEQ ID NO: 4, 1748–3269
von SEQ ID NO: 5, 3291–4806
von SEQ ID NO: 5, 1–1726
von SEQ ID NO: 5, 1–1726
von SEQ ID NO: 6, 1749–3500
von SEQ ID NO: 6 und 3524–5555
von SEQ ID NO: 6, oder worin das Modul eine der Aminosäuresequenzen
ist, worin eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt worden
sind, die die funktionellen Eigenschaften der Domäne nicht
beeinträchtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die DNA-Sequenz ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den Basen 21126–24041, 24102–28649, 29024–35125,
35518–40035,
40102–44676,
45077–50254,
50318–54883,
54947–59494,
59902–65079, 65146–70401 und
70471–76566
von SEQ ID NO: 1.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung einen rekombinanten
DNA-Vektor, der eine DNA-Sequenz der Erfindung, wie oben beschrieben,
umfasst.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung eine Wirtszelle,
transformiert mit einem rekombinanten Vektor der Erfindung, wie
oben beschrieben.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Verfahren
zum Produzieren von Spinosyn, umfassend die Schritte:
- 1) Transformieren eines Mikroorganismus, der Spinosyn oder einen
Spinosynvorläufer
mittels eines biosynthetischen Weges produziert, mit einem rekombinanten
DNA-Vektor oder einem Teil davon, wobei der Vektor oder ein Teil
davon eine DNA-Sequenz der Erfindung umfasst, wie oben beschrieben,
die für
die Expression einer Aktivität
codiert, die umsetzungsbegrenzend in dem Weg ist, und
- 2) Kultivieren des mit dem Vektor transformierten Mikroorganismus
unter Bedingungen, die geeignet sind für Zellwachstum und -teilung,
Expression der DNA-Sequenz und Produktion von Spinosyn.
-
Vorzugsweise
umfasst Schritt 1) Transformieren des Mikroorganismus mit einem
Vektor oder einem Teil, umfassend eine DNA-Sequenz, die für S. spinosa
gtt und S. spinosa gdh codiert, entsprechend SEQ ID NO: 29 bzw.
26.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung einen transformierten
Spinosyn produzierenden Mikroorganismus mit Spinosynbiosynthesegenen,
worin mindestens eines der Spinosynbiosynthesegene, ausgewählt aus
spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK,
spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa gtt,
S. spinosa gdh, S. spinosa epi oder S. spinosa Kre, dupliziert worden ist,
worin die Gene beschrieben sind durch die Basen 21111–28898,
28916–35374,
35419–44931, 44966–59752,
59803–76569,
20168–20095,
18541–19713,
17749–18501,
16556–17743,
14799–16418, 13592–14785,
12696–13547,
11530–12492,
10436–11434,
8967–10427,
7083–8450,
5363–6751,
4168–5325, 3416–4165, 2024–2791, 1135–1971, 76932–77528 und
77729–79984
von SEQ ID NO: 1, Basen 334–1119
von SEQ ID NO: 28, Basen 88–1077
von SEQ ID NO: 25, Basen 226–834
von SEQ ID NO: 32 und Basen 1165–1992 von SEQ ID NO: 25.
-
Vorzugsweise
sind S. spinosa gtt und S. spinosa gdh dupliziert, wobei die Gene
beschrieben sind durch die Basen 334–1119 von SEQ ID NO: 28 bzw.
die Basen 88–1077
von SEQ ID NO: 25.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Verfahren
zum Produzieren einer Spinosynverbindung, umfassend das Kultivieren
eines transformierten Spinosyn produzierenden Mikroorganismus, wie
oben beschrieben.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung einen transformierten
Spinosyn produzierenden Mikroorganismus, wie oben beschrieben, worin
S. spinosa gtt, S. spinosa gdh und S. spinosa kre dupliziert sind,
wobei die Gene beschrieben sind durch die Basen 334–1119 von
SEQ ID NO: 28, die Basen 88–1077 von
SEQ ID NO: 25 bzw. die Basen 1165–1992 von SEQ ID NO: 25.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Verfahren
zum Produzieren einer Spinosynverbindung, umfassend das Kultivieren
eines transformierten Spinosyn produzierenden Mikroorganismus, wie
oben beschrieben.
-
Die
Erfindung liefert auch Spinosyne, die produziert werden durch Kultivieren
der neuen Mikroorganismen der Erfindung.
-
Unter
einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Verfahren
zum Isolieren eines Macrolid-Biosynthesegens, umfassend das Aufbauen
einer genomischen Bibliothek eines Macrolids, das Mikroorganismen
produziert, und Verwenden eines markierten Fragments von SEQ ID
NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, das mindestens
20 Basen lang ist, als eine Hybridisierungssonde.
-
Vorzugsweise
ist der Mikroorganismus ein Spinosyn produzierender Mikroorganismus.
-
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
-
Eine
Cosmidbibliothek von S. spinosa(NRRL 18395)-DNA wurde konstruiert
aus Fragmenten, die durch partiellen Verdau mit Sau3A I erzeugt
wurden. Sie wurden kloniert in die BamHI-Stelle von Vektor pOJ436
(siehe
3) (Bierman et al., 1992) und
eingeführt
in E. coli-Zellen durch in vitro-Verpackung
und Transduktion. Die so hergestellte Bibliothek von rekombinanten
Bakterien wurde auf Homologie gegenüber zwei radiomarkierten DNA-Sonden
gescreent durch Hybridisieren unter Verwendung der Verfahren von
Solenberg & Burgett
(1989). Eine Sonde war das 400 kb SpeI-Fragment, das häufig deletiert
ist in nichtproduzierenden S. spinosa-Stämmen, erzeugt durch Transformation
oder Mutagenese mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(Matsushima et al., 1994). Die zweite Sonde war ein 300 bp-Stück der S.
spinosa-DNA, das für
einen Teil einer Ketosynthase codiert, das nicht an der Spinosynbiosynthese
beteiligt ist (B. E. Schoner, persönliche Mitteilung). Es umfasst
einen Bereich, der hoch konserviert ist hinsichtlich aller Polyketid-
und Fettsäuresynthasegene,
und von dem daher erwartet wurde, dass er kreuz-hybridisiert mit
den Spinosyn PKS-Genen. Die Cosmide 9A6 und 2C10 waren zwei von
sieben Klonen, die an beide Sonden hybridisierten. Cosmid 3E11 wurde
ausgewählt
aus der genomischen Bibliothek durch Hybridisierung an ein radiomarkiertes SgrA1-BamH1-Fragment von
Cosmid 9A6 (Basen 26757–26936
in SEQ ID NO: 1). Zum Bestimmen der Nukleotidsequenz des Inserts
in Cosmid 9A6 wurden BamHI-Fragmente subkloniert in die BamHI-Stelle
von Plasmid pOJ260 (siehe
4) (Bierman
et al., 1992). Die Sequenzen der Inserts in diese Plasmide wurden
durch eines aus zwei Verfahren bestimmt. In einem Verfahren wurden
subklonierte Fragmente partiell verdaut mit Sau3A I und Größen-selektierte
Teile wurden in die BamHI-Stelle von DNA aus dem Phagen M13mp19
kloniert. Einsträngige
DNA wurde hergestellt aus statistisch ausgewählten Rekombinanten und sequenziert
durch Fluoreszenzzyklussequenzieren unter Verwendung von Reagenzien
und einer Ausstattung von ABI (Applied Biosystems, Inc., Foster,
CA) entsprechend den Verfahren von Burgett & Rosteck (1994). Die Sequenzen von Phage-Subklonen
von jedem Plasmid wurden in einer zusammenhängenden Sequenz zusammengestellt.
In einem anderen Sequenzierungsverfahren wurden doppelsträngige Plasmid-DNAs
wiederholt geprimed mit einsträngigen
Oligonukleotiden, jeweils konstruiert, um mit einer Region nahe
dem Ende der zuvor bestimmten Sequenz zu komplementieren. Die vollständige Sequenz
wurde so zusammengestellt aus einer Reihe von teilweise überlappenden
Sequenzen. Prism-Ready Sequencing Kits (ABI) wurden entsprechend
den Anleitungen des Herstellers verwendet und auf einem ABI373A-Sequenzierer
analysiert. Die gleiche Strategie wurde verwendet zum Sequenzieren über die
BamHI-Stellen von doppelsträngiger
9A6-DNA. Diese Daten erlaubten das Alignment der subklonierten Sequenzen
und die Orientierung relativ zueinander unter Verwendung des AssemblyLIGN-Moduls
des MacVektor-Programms (Oxford Molecular, Campbell, KY) und dadurch
wurde erlaubt, dass die gesamte Nukleotidsequenz der S. spinosa-DNA
in Cosmid 9A6 aufgebaut wurde. Die vollständigen Sequenzen der Cosmide
2C10 und 3E11 wurden bestimmt durch das Verfahren des Fluoreszenzzyklussequenzierens
von statistischen DNA-Fragmenten, kloniert in Phage M13 (Seq Wright,
Houston, TX). Die Inserts in den Cosmiden 2C10 und 3E11 überlappten
und das Insert in 3E11 überlappte
das Ende des Inserts in Cosmid 9A6. Siehe
2. Zusammen überspannten
die drei Cosmid-Inserts etwa 80 kb der einzigartigen Sequenz (SEQ
ID NO: 1). Die folgende Tabelle 3 zeigt die Anteile von SEQ ID NO:
1 die in jedem der drei Inserts enthalten sind. Tabelle 3
| Insert | Basen
in SEQ ID NO: 1 |
| Cosmid
9A6 | 1–26941 |
| Cosmid
3E11 | 23489–57287 |
| Cosmid
2C10 (korrigiert) | 41429–80161 |
-
2 zeigt
eine graphische Darstellung der Beziehung von den drei Inserts zu
den 80 kb der Sequenz.
-
Es
sollte festgehalten werden, dass Cosmid 2C10 die Basen G41877, C45570,
C57845 und G73173 von SEQ ID NO: 1 fehlten. Diese Deletionen wurden
als Klonierungsartefakte bestimmt. Die Deletionen erzeugten in-frame stop-Codons,
die PKS-Polypeptide verkürzten.
Eines von ihnen trat in einer Region auf, die ebenfalls in Cosmid
3E11 kloniert ist, lag jedoch nicht vor in der Region von 3E11,
für welche
die Sequenz erhalten wurde. Unklonierte DNA, die alle 8 Stopp-Codons
in der PKS-Region überspannte
wurde daher direkt sequenziert aus PCR-amplifizierten Regionen des Genoms
von S. spinosa (NRRL 18395). Die Sequenzen von unklonierter DNA
bestätigen
das Vorliegen der vier Stopp-Codons am Ende von ACP-Domänen und
bewiesen, dass die vier Frameshifts innerhalb anderer Codierungsregionen
Klonierungsartefakte waren, die einzigartig sind für Cosmid
2C10.
-
PKS-Gene
-
SEQ
ID NO: 1 umfasst einen zentralen Bereich von etwa 55 kb mit bemerkenswerter
Homologie mit der DNA, die für
die Polyketidsynthasen bekannter Macrolidproduzenten codiert (Donadio
et al., 1991; MacNeil et al., 1992; Schwecke et al., 1995; Dehoff
et al., 1997). Die Spinosyn-PKS-DNA-Region besteht aus 5 ORFs mit in-frame-Stop-Codons
am Ende der ACP-Domänen, ähnlich den
PKS ORFs in den anderen Macrolid-produzierenden Bakterien. Die fünf Spinosyn
PKS-Gene sind Kopf-an-Schwanz angeordnet (siehe
2)
ohne intervenierende nicht-PKS-Funktionen, wie etwa das Insertionselement,
das zwischen den Erythromycin PKS-Genen AI und AII gefunden wird
(Donadio et al., 1993). Sie werden bezeichnet als spnA, spnB, spnC, spnD
und spnE. Die Nukleotidsequenz für
jedes der fünf
Spinosyn PKS-Gene und die entsprechenden Polypeptide sind in der
folgenden Tabelle 4 angegeben: Tabelle 4
| GEN | Basen
in SEQ ID NO: 1 | ENTSPRECHENDES
POLYPEPTID |
| spnA | 21111–28898 | SEQ
ID NO: 2 |
| spnB | 28916–35374 | SEQ
ID NO: 3 |
| spnC | 35419–44931 | SEQ
ID NO: 4 |
| spnD | 44966–59752 | SEQ
ID NO: 5 |
| spnE | 59803–76569 | SEQ
ID NO: 6 |
-
spnA
codiert für
das Initiatormodul (SEQ ID NO: 1, Basen 21126–24041) und Extendermodul 1
(SEQ ID NO: 1, Basen 24102–28649).
Die Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz
für jede der
funktionalen Domänen
innerhalb des Initiatormoduls und Extendermoduls 1 sind in der folgenden
Tabelle 5 angegeben: Tabelle 5
| spnA |
| DOMÄNE | BASEN
IN SEQ ID NO: 1 | AMINOSÄUREN IN
SEQ ID NO: 2 |
| KSi | 21126–22379 | 6–423 |
| ATi | 22692–23669 | 528–853 |
| ACPi | 23793–24041 | 895–977 |
| KS1 | 24102–25349 | 998–1413 |
| AT1 | 25683–26684 | 1525–1858 |
| KR1 | 27582–28121 | 2158–2337 |
| ACP1 | 28404–28649 | 2432–2513 |
-
spnB
codiert für
Extendermodul 2 (SEQ ID NO: 1, Basen 29024–35125). Die Nukleotidsequenz
und die entsprechende Aminosäuresequenz
für jede
der funktionalen Domänen
innerhalb von Extendermodul 2 sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben: Tabelle 6
| spnB |
| DOMÄNE | BASEN
IN SEQ ID NO: 1 | AMINOSÄUREN IN
SEQ ID NO: 3 |
| KS2 | 29024–30295 | 1–424 |
| AT2 | 30629–31621 | 536–866 |
| DH2 | 31697–32254 | 892–1077 |
| ER2 | 33035–34072 | 1338–1683 |
| KR2 | 34082–34621 | 1687–1866 |
| ACP2 | 34886–35125 | 1955–2034 |
-
spnC
codiert für
Extendermodul 3 (SEQ ID NO: 1, Basen 35518–40035) und Extendermodul 4
(SEQ ID NO: 1, Basen 40102–44676).
Die Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz
für jede der
funktionalen Domänen
innerhalb der Extendermodule 3 und 4 sind in der folgenden Tabelle
7 angegeben: Tabelle 7
| spnC |
| DOMÄNE | BASEN
IN SEQ ID NO: 1 | AMINOSÄUREN IN
SEQ ID NO: 4 |
| KS3 | 35518–36786 | 1–423 |
| AT3 | 37108–38097 | 531–860 |
| KR3 | 38992–39528 | 1159–1337 |
| ACP3 | 39790–40035 | 1425–1506 |
| KS4 | 40102–41373 | 1529–1952 |
| AT4 | 41713–42705 | 2066–2396 |
| KR4 | 43615–44157 | 2700–2880 |
| ACP4 | 44431–44676 | 2972–3053 |
-
spnD
codiert für
Extendermodul 5 (SEQ ID NO: 1, Basen 45077–50254), Extendermodul 6 (SEQ
ID NO: 1, Basen 50318–54883)
und Extendermodul 7 (SEQ ID NO: 1, Basen 54947–59494). Die Nukleotidsequenz
und die entsprechende Aminosäuresequenz
für jede
der funktionalen Domänen
innerhalb der Extendermodule 5, 6 und 7 sind in der folgenden Tabelle
8 angegeben: Tabelle 8
| spnD |
| DOMÄNE | BASEN
IN SEQ ID NO: 1 | AMINOSÄUREN IN
SEQ ID NO: 5 |
| KS5 | 45077–46348 | 1–424 |
| AT5 | 46691–47674 | 539–866 |
| DH5 | 47753–48310 | 893–1078 |
| KR5 | 49226–49771 | 1384–1565 |
| ACP5 | 50009–50254 | 1645–1726 |
| KS6 | 50318–51592 | 1748–2172 |
| AT6 | 51923–52915 | 2283–2613 |
| KR6 | 53822–54361 | 2916–3095 |
| ACP6 | 54638–54883 | 3188–3269 |
| KS7 | 54947–56215 | 3291–3713 |
| AT7 | 56549–57535 | 3825–4153 |
| KR7 | 58106–58990 | 4344–4638 |
| ACP7 | 59249–59494 | 4725–4806 |
-
spnE
codiert für
Extendermodul 8 (SEQ NO: 1, Basen 59902–65079), Extendermodul 9 (SEQ
ID NO: 1, Basen 65146–70401)
und Extendermodul 10 (SEQ ID NO: 1, Basen 70471–76566). Die Nukleotidsequenz und
entsprechende Aminosäuresequenz
für jede
der funktionalen Domänen
innerhalb der Extendermodule 8, 9 und 10 sind in der folgenden Tabelle
9 angegeben. Tabelle 9
| spnE |
| DOMÄNE | BASEN
IN SEQ ID NO: 1 | AMINOSÄUREN IN
SEQ ID NO: 6 |
| KS8 | 59902–61173 | 1–424 |
| AT8 | 61489–62445 | 530–848 |
| DH8 | 62548–63111 | 883–1070 |
| KR8 | 64006–64557 | 1369–1552 |
| ACP8 | 64843–65079 | 1648–1726 |
| KS9 | 65146–66420 | 1749–2173 |
| AT9 | 66760–67743 | 2287–2614 |
| DH9 | 67819–68301 | 2640–2800 |
| KR9 | 69370–69924 | 3157–3341 |
| ACP9 | 70165–70401 | 3422–3500 |
| KS10 | 70471–71745 | 3534–3948 |
| AT10 | 72079–73071 | 4060–4390 |
| DH10 | 73138–73692 | 4413–4597 |
| KR10 | 74599–75135 | 4900–5078 |
| ACP10 | 75475–75660 | 5172–5253 |
| TE10 | 75805–76566 | 5302–5555 |
-
Die
Grenzen und Funktionen der 50 Domänen, die in den vorhergehenden
Tabellen 5–9
angegeben sind, wurden vorausgesagt, basierend auf Ähnlichkeiten
der konservierten Aminosäuresequenzen
der Domänen
in anderen Polyketidsynthasen, insbesondere der Erythromycinpolyketidsynthase
(Donadio et al., 1992). Die unerwartete KSi-Domäne
am Aminoterminus des Initiatormoduls ist vermutlich nicht funktional,
da sie einen Glutaminrest an Aminosäure 172 enthält, anstelle
des Cysteins, das erforderlich ist für β-Ketosynthaseaktivität (Siggard- Andersen, 1993).
Eine ähnliche
nichtfunktionale KS-Domäne
ist entdeckt worden im Initiatormodul der Tylosin-PKS (Dehoff et
al., 1997). Die anderen Spinosyn-PKS-Domänen sind funktional. Keine
von ihnen hat die Sequenzcharakteristika der inaktiven Domänen, die
in Erythromycin- und Rapamcyin-PKS-Genen gefunden werden (Donadio
et al., 1991; Aparicio et al., 1996). Die klonierten PKS-Gene wurden
als essenziell für
Spinosynbiosynthese durch die Entdeckung nachgewiesen, dass Stämme von
S. spinosa, worin diese Gene disruptiert worden sind nicht in der
Lage waren zum Produzieren von Spinosyn durch Fermentation. Gen-Disruption
wurde erreicht durch Klonieren eines internen Fragments des Gens
in Plasmid pOJ260 (4), unter Verwendung von dem
Fachmann allgemein bekannten Verfahren. Die rekombinanten Plasmide wurden
dann in S. spinosa eingeführt
durch Konjugation von E. coli unter Verwendung der Verfahren von
Matsushima et al. (1994) und Auswählen von Apramycin-resistenten Exkonjugaten.
Plasmide, die auf pOJ260 basieren, replizieren nicht unabhängig in
S. spinosa und werden stabil aufrechterhalten durch Integrieren
des Plasmids in das Chromosom über
Rekombination zwischen der klonierten DNA und seiner homologen Sequenz
in dem Genom. Integration bildet zwei unvollständige Versionen des Targetgens
(eine, der 5'-Sequenzen fehlen
und eine, der 3'-Sequenzen
fehlen) im Chromosom, mit der pOJ260-DNA zwischen ihnen. Spinosynbiosynthese
wurde blockiert durch Zerstören
des spnA ORF mit den BamH1-Fragmenten V, N oder K, jeweils entsprechend
den folgenden Segmenten von SEQ ID NO: 1: 21365–22052, 22052–24338 oder 24338–26227.
Spinosynbiosynthese wurde ebenfalls blockiert durch Zerstören des
spnD ORF mit BamH1-Fragmenten G, E oder K, jeweils entsprechend
den folgenden Segmenten von SEQ ID NO: 1: Basen 48848–50578,
50578–52467
oder 55207–55888.
Spinosynsynthese wurde ebenfalls blockiert durch Zerstören von
spnE ORF mit BamH1-Fragmenten J, I, D, H und F, jeweils entsprechend
den folgenden Segmenten von SEQ ID NO: 1: 63219–63989, 65406–66733,
66733–68997,
69369–70731
und 70731–72675.
Spinosynbiosynthese wurde nicht blockiert durch Integration über BamH1-Fragmente
C (Basen 44612–47565
in SEQ ID NO: 1) oder B (Basen 55936–63219 in SEQ ID NO: 1), da
sie in keinem Gen vorliegen; BamH1-Fragment C überspannt die Verbindung zwischen
spnC und spnD und BamH1-Fragment B überspannt die Verbindung zwischen
spnD und spnE. In diesen Fällen
hinterlässt
Integration eine komplette Version von jedem Gen.
-
Gene, die benachbart sind zur PKS, die
verantwortlich sind für
zusätzliche
Modifikationen
-
Im
oberstromigen Bereich der PKS-Gene (kloniert in Cosmid 9A6) gab
es 16 offene Leserahmen (ORFs), jeweils bestehend aus mindestens
100 Codons, beginnend mit ATG oder GTG und am Ende mit TAA, TAG
oder TGA, und mit einer Codon Bias, wie für Proteincodierungsregionen
in einem Organismus erwartet, dessen DNA einen hohen Prozentanteil
Guanindin- und Cytosinreste
enthält
(Bibb et al., 1984). Siehe die untere rechte Seite von
2 für eine graphische
Darstellung der 16 ORFs in 9A6. Basierend auf dem Nachweis, der
nachfolgend hier diskutiert werden wird, sind 14 der ORFs bezeichnet
worden als Spinosyn-Biosynthesegene, nämlich: spnF, spnG, spnH, spnI,
spnJ, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR und spnS (sie sind markiert
als F bis S in
2). In der folgenden Tabelle
10 sind die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz für das entsprechende
Polypeptid für
jedes dieser Gene angegeben, als auch für zwei ORFs (ORFL15 und ORFL16),
die unmittelbar oberstromig von spnS gefunden werden. Ebenfalls
sind in Tabelle 10 die Nukleotidsequenzen für ORFR1 und ORFR2, unterstromig
der PKS-Gene (in Cosmid 2C10), und die ihnen entsprechenden Aminosäuresequnzen
angegeben. Tabelle 10
| GEN | BASEN
IN SEQUENZ ID NO: 1 | POLYPEPTID |
| spnF | 20168–20995 | SEQ
ID NO: 7 |
| spnG | 18541–19713 (C) | SEQ
ID NO: 8 |
| spnH | 17749–18501 (C) | SEQ
ID NO: 9 |
| spnI | 16556–17743 | SEQ
ID NO: 10 |
| spnJ | 14799–16418 (C) | SEQ
ID NO: 11 |
| spnK | 13592–14785 (C) | SEQ
ID NO: 12 |
| spnL | 12696–13547 (C) | SEQ
ID NO: 13 |
| spnM | 11530–12492 (C) | SEQ
ID NO: 14 |
| spnN | 10436–11434 | SEQ
ID NO: 15 |
| spnO | 8967–10427 | SEQ
ID NO: 16 |
| spnP | 7083–8450 | SEQ
ID NO: 17 |
| spnQ | 5363–6751 (C) | SEQ
ID NO: 18 |
| spnR | 4168–5325 (C) | SEQ
ID NO: 19 |
| spnS | 3416–4165 (C) | SEQ
ID NO: 20 |
| ORFL15 | 2024–2791 | SEQ
ID NO: 21 |
| ORFL16 | 1135–1971 (C) | SEQ
ID NO: 22 |
| ORFR1 | 76932–77528 | SEQ
ID NO: 23 |
| ORFR2 | 77729–79984 | SEQ
ID NO: 24 |
- (C) zeigt an, dass ein komplementärer Strang
in dem Sequenzprotokoll angegeben ist
-
Um
den Polypeptiden, die in Tabelle 10 angegeben sind, Funktionen zuzuweisen,
wurden drei Beweisführungen
verwendet: Ähnlichkeit
mit Sequenzen bekannter Funktionen, Ergebnisse von Targetgenzerstörungsversuchen
und Ergebnisse von Biokonversions- bzw. Bioumwandlungsversuchen.
-
Die
Aminosäuresequenzen
der vorhergesagten Polypeptide wurden verglichen mit Sequenzen,
die in den Datenbanken am National Center for Biotechnology Information
(NCBI, Washington, DC) hinterlegt sind, unter Verwendung des BLAST-Algorithmus
zum Bestimmen wie eng sie mit bekannten Proteinen in Beziehung stehen.
Die BLAST-Suchen der NCBI-Datenbanken
wurden ebenfalls periodisch wiederholt, um neue Erkenntnisse über zusätzliche
Homologien zu erhalten. Tabelle 11 gibt die besten Übereinstimmungen
aus einer Basis-BLAST-Suche vom 12. Januar 1998 an: Tabelle
11
- *
Größere Ähnlichkeit
ist assoziiert mit höheren
BLAST-Bewertungen (Altschul et al., 1990).
-
In
Targetgendisruptionen wurden interne Fragmente erzeugt durch PCR-Amplifikation der
Cosmid DNAs und kloniert in Plasmid pOJ260. Die resultierenden Plasmide
wurden dann konjugiert in S. spinosa (NRRL 18395) und Apramycin-resistente
Exkonjugate wurden isoliert und fermentiert. Wie früher angegeben, ist
die Basis der Disruptionsversuche, dass, wenn ein Plasmid, das ein
internes Genfragment trägt,
integriert wird, zwei unvollständige
Kopien des Biosynthesegens resultieren, wobei die enzymatische Funktion
eliminiert wird. Resultierende Fermentierungsprodukte wurden analysiert,
um zu bestimmen, welche Spinosyne akkumulierten. Die Ergebnisse
der Targetgendisruptionsversuche sind in Tabelle 12 zusammengefasst.
-
In
Biokonversionsstudien wurden Stämme,
in welchen Spinosynsynthese verändert
wurde, getestet auf ihre Fähigkeit
zum Überführen verfügbarer Spinosynzwischenprodukte
in andere Spinosyne. Die verwendeten Zwischenprodukte waren Spinosyn
A Aglykon (AGL), Spinosyn P (P), Spinosyn K (K) und Spinosyn A 9-Psa
(PSA). Die Ergebnisse der Biokonversionversuche sind ebenfalls in
Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12
| Zerstörtes Gen | internes Fragment in SEQ ID NO: 1 | Spinosyne akkumuliert | Biokonversionsprodukte |
| AGL→ | P→ | K→ | PSA→ |
| Keines | keines | A
+ D | | | | |
| spnF | 20325–20924 | keines | A | A | | A |
| spnG | 18818–19426 | keines | AGL | K | | A |
| spnG-H | 18511–19559 | P | | | K | A |
| spnI | 16699–17400 | keines | | J | A | A |
| spnJ | 14866–15470 | keines | A | | A | |
| spnK | 13785–14574 | keines | | | | |
| spnL | 12791–13428 | keines | A | A | | A |
| spnM | 11705–12371 | 3%
A | A | | | A |
| spnN | 10636–11369 | PSA | | | | |
| spnO | 9262–10226 | PSA | | | | |
| spnP | 7391–8159 | PSA | PSA | | | |
| ORFL15 | 2145–2719 | A
+ D | | | | |
| ORFL16 | 1226–1852 | A
+ D | | | | |
| ORFR2 | 79321–79855 | A
+ D | | | | |
-
Die
Schlüsse,
die aus BLAST-Versuchen gezogen werden, die Gendisruptionsversuche
und die Biokonversionsstudien werden nun detaillierter auf einer
Gen-für-Gen-Basis
diskutiert.
-
Die
11 Gene oberstromig der PKS erwiesen sich als involviert in der
Spinosynbiosynthese, da Stämme,
worin sie disruptiert waren, dabei versagten, die Hauptspinosyne
A und D zu akkumulieren (Tabelle 12). Die nächsten 2 oberstromigen Gene
(ORFL15, ORFL16) und das große
Gen unterstromig (ORFR2) der PKS tragen nicht zur Spinosynproduktion
bei, da Fermentation durch ihre Disruption nicht beeinträchtigt wurde
(Tabelle 12). Disruption des ORF unmittelbar unterstromig der PKS-Gene
(ORFR1) wurde nicht versucht, da er zu klein war, um ein internes
Fragment zu ergeben, das mit einer akzeptablen Häufigkeit rekombinieren würde. Disruptionen
der spnQ-, spnR- und spnS-Gene wurden nicht versucht, da frühe BLAST-Suchen zeigten, dass diese
Gene bemerkenswerte Ähnlichkeit
hatten mit Enzymen, von denen bekannt ist, dass sie an der Biosynthese
von ungewöhnlichen
Deoxyzuckern beteiligt sind. spnQ hatte 53% Identität zwischen
seinem Genprodukt und der CDP-4-keto-6-deoxy-D-glukose-3-dehydrase, die beteiligt
ist an der Synthese des Abequoserests des Salmonella enterica-Zelloberflächenliposaccharids
(Jiang et al., 1991); spnR hatte bis zu 40% Identität zwischen
seinem Produkt und einer Gruppe von Proteinen, von denen vorgeschlagen
wird, dass sie als Deoxyzuckertransaminasen arbeiten (Thorson et
al., 1993); und spnS hatte 42% Identität zwischen seinen Produkten
und dem SrmX-Produkt von Streptomyces ambofaciens, ein Organismus,
der das Forosamin-enthaltende Antibiotikum Spiramycin synthetisiert
(Geistlich et al., 1992). Noch stärkere Ähnlichkeiten ergaben sich aus
kürzlichen
BLAST-Suchen (Tabelle 11). Basierend auf diesen Ähnlichkeiten und der engen
Verbindung der Gene mit anderen Spinosynbiosynthesegenen kann geschlossen
werden, dass spnQ, spnR und spnS an der Produktion des Forosaminrestes
von Spinosynen beteiligt sind.
-
spnF, spnJ, spnL, spnM
-
Stämme, die
disrupiert sind in den Genen spnF, spnJ, spnL oder spnM akkumulierten
keine Spinosyne auf signifikante Gehalte (der niedere Gehalt von
Spinosyn A in dem spnM-Mutanten resultierte vermutlich auf etwas
Restaktivität
im Genprodukt, das an seinem Carboxyterminus deletiert ist). Jedoch
biokonvertierten sie exogen-zugeführtes Aglycon in Spinosyn A
und enthielten daher alle die Enzyme, die erforderlich sind für die späteren Schritte
in der Spinosynbiosynthese. Diese speziellen Gene müssen beteiligt
sein an der Erzeugung des Aglycons aus dem vermeintlichen monocyclischen
Lactonprodukt der PKS-Gene. Die Rollen für spnF und spnL bei der Bildung
von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Brücken
sind übereinstimmend
mit ihren Ähnlichkeiten
mit Enzymen, die Kohlenstoffatome methylieren (Tabelle 11). Das
Fehlen von teilweise modifizierten Zwischenprodukten in den blockierten
Mutanten kann aus der Instabilität
der Verbindungen oder aus reduzierter Biosynthese aufgrund des Fehlens
von glykosylierten Molekülen,
die als positive Regulatoren wirken, analog denjenigen des Tylosinweges,
resultieren (Fish & Cundliffe,
1997).
-
spnG, spnH, spnI, senK
-
Disruption
von spnG verhinderte auch Spinosynproduktion, jedoch der Mutantenstamm
konnte Aglycon nicht biokonvertieren, somit ist dieses Gen erforderlich
für einen
späteren
Schritt im Weg (Tabelle 12). Seine Sequenzähnlichkeit mit bekannten Glycosyltransferasegenen
(Tabelle 11) legt nahe, dass spnG für die Rhamnosyltransferase
codiert, die erforderlich ist für
die Addition des ersten Zuckers an das Aglycon. Dem Mutanten mit
einem disrupierten spnG fehlte auch eine funktionale 4'-O-Methyltransferase
(OMT), da er das 3',4'-Didesmethylspinosyn
(P) in das 4'-Desmethylspinosyn
(K) umwandelte, jedoch nicht in das vollständig methylierte Spinosyn A.
Die 4'-OMT-Aktivität wurde
vermutlich in dem Mutanten nicht exprimiert, da das codierende Gen
(spnH) unterstromig der Disruptionsintegration in dem gleichen Operon
liegt. Das Vorliegen dieses Operons wurde bestätigt durch Disruption von BamH1-Fragment
T, das die Verbindung zwischen spnG und spnH überspannt, jedoch nicht intern
ist in einem beliebigen offenen Leserahmen. Nichtsdestotrotz veränderte seine
Disruption die Spinosynsynthese sodass dieses Fragment intern eines
einzelnen Transkripts sein muss, das beide Gene umfasst. Zusätzlich zu
dem erwarteten Verlust von 4'-OMT-Aktivität, die durch
spnH codiert wird, bewirkte diese Disruption auch den unerwarteten
Verlust von 3'-OMT-Funktion, was zur
Akkumulation von Spinosyn P führte
(Tabelle 12). Die 3'-OMT-Aktivität scheint
codiert zu werden durch das konvergente unterstromige Gen spnI.
Dieses Gen hat am meisten Sequenzähnlichkeit mit dem ORF Y-Gen
von Streptomyces nogalator (Tabelle 11). Die Funktion des ORF-Y-Produkts
ist unbekannt, jedoch produziert der Organismus einen unüblichen
tetramethylierten Deoxyzucker (Nogalose) der ähnlich der trimethylierten
Rhamnose von Spinosyn A ist, wobwi somit vermutlich beide Gene an
der Zuckermethylierung beteiligt sind. Übereinstimmend mit dieser Hypothese
entwickelte Disruption von spnI einen Mutanten, der Spinosyn P nur
in das 3'-Desmethylspinosyn
(J) biokonvertierte, nicht in Spinosyn A (Tabelle 12). Die Disruption
verhinderte jegliche Spinosynakkumulierung in unsupplementierten
Fermentationen. senK weist eine Sequenz auf, die ähnlich spnI
und ORF Y ist und codiert vermutlich für die 2'-OMT. Seine Disruption verhinderte auch
Akkumulation von jeglichen Spinosynen in unsupplementierten Fermentationen
(Tabelle 12).
-
spnN, spnO, spnP
-
Disruption
der Gene spnN, spnO und spnP führte
zur Akkumulation des Pseudoaglycons (Tabelle 12). Diese Gene sind
daher beteiligt an der Biosynthese oder Addition des Forosaminzuckers.
Die Ähnlichkeit
von spnP mit Gylcosyltransferasen (Tabelle 11) zeigt, dass es für die Spinosynforosamyltransferase
codiert. Das hohe Ausmaß an Ähnlichkeit
zwischen spnO und einer 2,3-Dehydratase (Tabelle 11) zeigt, dass
es an dem 2'-Deoxygenierungsschritt
der Forosaminsynthese beteiligt ist.
-
Rhamnosegene
-
Die überlappenden
Inserts, die in Cosmiden 9A6, 3E11 und 2C10 kloniert sind, enthalten
keine Gene, die für
die vier Enzyme codieren, die erforderlich sind, um Rhamnose aus
Glucose zu produzieren (Liu & Thorson,
1994). Das erste Enzym ist eine Glucosethymidylattransferase (gtt)
oder ein äquivalentes
Enzym, das Glucose durch Addition eines Nukleotidyldiphosphats (NDP)
aktiviert. Das zweite ist eine Glucosedehydratase (gdh) zum Produzieren
von NDP-4-Keto-6-deoxyglucose,
ein Zwischenprodukt, das für
viele Deoxyzuckerbiosynthesewege üblich ist. Eine Epimerase (epi)
und eine Ketoreduktase (kre), spezifisch für Rhamnosesynthese, sind ebenfalls
erforderlich, um die NDP-4-Keto-6-deoxyglucose in NDP-L-Rhamnose überzuführen, den aktivierten
Zucker, der das Substrat der Glycosyltransferase ist, die Rhamnose
an das Aglycon addiert. Gene, die für diese Enzyme in S. spinosa
codieren, wurden kloniert aus einer separaten Bibliothek von 7–12 kb Sau3A
I-Teilfragmenten in dem λ-Vektor
ZAP ExpressTM (Stratagene, LaJolla, CA).
Radiomarkierte Sonden wurden hergestellt durch statistische Primerextension
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) von Fragmenten von Plasmid
pESC1, enthaltend die Saccharopolyspora erythraea gdh- (Linton et
al., 1995) und gtt-Gene. Plaquehybridisierungen zum Screenen der
Phage-Bibliothek wurden durchgeführt
mit einem stringenten Waschen von 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 1 h. Die
Plasmidteile (pDAB 1620 und pDAB1621) des Vektors, die Inserts enthalten,
wurden von zwei der drei Hybridisierungsphagen herausgeschnitten
und teilweise sequenziert unter Verwendung von Prism-Ready Sequencing
Kits (ABI) und multiplen Primern. Der sequenzierte Teil des Inserts
in pDAB1620 (SEQ ID NO: 25) umfasst einen ORF, der für ein 329-Aminosäurepolypeptid (SEQ
ID NO: 26) mit 82% Identität
zum gdh-Produkt
von S. erythraea codieren würde.
Benachbart zu diesem Gen ist ein ORF, der für ein 275-Aminosäurepolypeptid
(SEQ ID NO: 27) mit 72% Identität
mit S. erythraea kre-Genprodukt codiert. Der sequenzierte Teil des
Inserts in pDAB1621 (SEQ ID NO: 28) enthält einen ORF, der für ein 261-Aminosäurepolypeptid
(SEQ ID NO: 29) mit 83% Identität
mit dem S. erythraea gtt-Genprodukt codiert. Eine zweite Sonde für Rhamnosegene
wurde hergestellt durch PCR-Amplifikation von genomischer S. spinosa
DNA, unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotidprimern (SEQ
ID NO: 30 und SEQ ID NO: 31), basierend auf konservierten Aminosäureregionen
in bekannten epi-Proteinen (Jiang et al., 1991; Linton et al., 1995).
PCR-Reaktionen wurden in einem GeneAmp 9600 Thermocycler mit AmpliTaq-Polymerase
(Perkin-Elmer) unter Verwendung von 30 Zyklen von 30 sec bei 94°C, 30 sec
bei 60°C
und 45 sec bei 72°C
durchgeführt.
Die Sonde hybridisierte an einen Phagen in der 7–12 kb-Bibliothek; der Plasmidteil
des Vektors, der dieses Insert (pDAB1622) enthält, wurde herausgeschnitten
und teilweise sequenziert (SEQ ID NO: 32). Er enthält einen
ORF für
ein 202-Aminosäurepolypeptid
(SEQ ID NO: 33) mit 57% Homologie zum S. erythraea epi-Protein.
Die Gene wurden disruptiert durch Rekombination mit Plasmiden, enthaltend
interne Fragmente (Basen 382–941
in SEQ ID NO: 25, 1268–1867
in SEQ ID NO: 25, 447–994
in SEQ ID NO: 28 oder 346–739 in
SEQ ID NO: 32). Apramycinresistente Exkonjuganten wurden in allen
Fällen
erhalten, jedoch waren sie nur in der Lage auf osmotisch stabilisiertem
Medium, wie etwa CSM, supplementiert mit Sucrose bei 200 g/l, oder R6
(Matsushima et al., 1994) zu wachsen. Selbst unter diesen Bedingungen
wuchsen sie viel langsamer als das elterliche S. spinosa (NRRL 18395)
und waren morphologisch verschieden, mit hoch fragmentierten Myzellen.
Diese Ergebnisse könnten
zurückzuführen sein
auf das Vorliegen von Rhamnose in der Zellwand in S. spinosa und
eine Erfordernis, dass diese vier Gene für normale Zellwandsynthese
in diesem Organismus vorliegen. Mutanten, die in diesen Genen disruptiert
sind, wuchsen zu langsam, um unter Bedingungen, die für die Produktion
von Sinosynen bekannt sind, fermentiert zu werden. Jedoch zeigten
Southern Hybridisierungen von genomischer S. spinosa DNA mit der
S. erythraea gtt/gdh-Sonde (gewaschen in 2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 1 h) oder
mit der degenierten epi-Sonde (gewaschen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 1 h),
dass keine anderen Homologen dieser Gene in dem S. spinosa-Genom vorliegen.
Daher müssen
die vier klonierten S. spinosa-Gene die einzige Quelle von Rhamnose
für sowohl
Zellwandbildung als auch Spinosynbiosynthese sein.
-
Die
Nukleotidsequenz und entsprechende Aminosäuresequenz für jedes
dieser vier S. spinosa-Gene, die erforderlich sind, um Rhamnose
zu produzieren, sind in der folgenden Tabelle 13 angegeben: Tabelle 13
| Gen | DNA-Sequenz | Aminosäuresequenz |
| S.
spinosa gtt | SEQ
ID NO: 28; Basen 334–1119 | SEQ
ID NO: 29 |
| S.
spinosa gdh | SEQ
ID NO: 25, Basen 88–1077 | SEQ
ID NO: 26 |
| S.
spinosa epi | SEQ
ID NO: 32, Basen 226–834 | SEQ
ID NO: 33 |
| S.
spinosa kre | SEQ
ID NO: 25, Basen 1165–1992 | SEQ
ID NO: 27 |
-
So
können
23 Gene von S. spinosa Funktionen bei der Spinosynbiosynthese zugewiesen
werden: 5 PKS-Gene zum Produzieren eines makrocyclischen Lactons,
4 Gene zum Modifizieren dieses in Aglycon, 5 Gene zum Synthetisieren
und Addieren von Rhamnose, 3 Gene zum Methylieren der Rhamnose und
6 Gene zum Synthetisieren und Addieren von Forosamin. Der hypothetische
biosynthetische Weg ist in 1 zusammengefasst.
-
Anwendbarkeit
-
Es
gibt viele Anwendungen für
die klonierte Saccharopolyspora spinosa-DNA. Die klonierten Gene können verwendet
werden zum Verbessern von Ausbeuten von Spinosynen und zum Produzieren
neuer Spinosyne. Verbesserte Ausbeuten können erhalten werden durch
Integrieren in das Genom eines speziellen Stammes einer duplizierten
Kopie des Gens für
das Enzym, das Rate-limitierend in diesem Stamm ist. Im Extremfall,
worin der Biosyntheseweg blockiert ist in einem speziellen Mutantenstamm
aufgrund des Fehlens eines erforderlichen Enzyms, kann die Produktion
des gewünschten
Spinosyns wieder hergestellt werden durch Integrieren einer Kopie
des erforderlichen Gens. Ausbeuteverbesserungen, die erhalten werden
durch Integrieren von Kopien von Spinosyngenen sind hier nachfolgend
in den Beispielen 1–3
und 6 gezeigt.
-
Neue
Spinosyne können
produziert werden unter Verwendung von Fragmenten der klonierten
DNA, um Schritte in der Biosynthese von Spinosynen zu disruptieren.
Eine solche Disruption kann zu der Akkumulation von Vorläufern oder „Neben"-produkten (die natürlich prozessierten
Derivate von Vorläufern)
führen.
Die Fragmente, die geeignet sind zum Durchführen von Disruptionen sind
diejenigen, die intern in einem Gen sind, wobei Basen von sowohl
dem 5'- als auch
dem 3'-Ende des
Gens weggelassen werden. Homologe Rekombinationsereignisse unter
Verwendung solcher Fragmente führen
zu zwei Teilkopien des Gens: Einer, der die weggelassenen Basen
von dem 5'-Ende
fehlen und einer, der die weggelassenen Basen vom 3'-Ende fehlen. Die
Anzahl von weggelassenen Basen an jedem Ende des Fragments muss
groß genug
sein, sodass keine der Teilkopien des Gens Aktivität beibehält. Mindestens
50 Basen werden normalerweise von jedem Ende weggelassen und mehr
bevorzugt werden mindestens 100 Basen von jedem Ende weggelassen.
Die Länge des
Teilgenfragments sollte groß genug
sein, sodass die Rekombinationshäufigkeit
hoch genug ist für
einen praktischen Versuch. Geeignete Fragmente für Disruptionen sind mindestens
300 Basen lang und mehr bevorzugt mindestens etwa 600 Basen lang.
Modifizierte Spinosyne, die produziert werden durch Disrupieren von
Genen, können
Insektenbekämpfungsmittel
an sich sein, oder als Substrate für weitere chemische Modifikation
dienen, wobei neue semi-synthetische Spinosyne mit einzigartigen
Eigenschaften und Aktivitätsspektren
entwickelt werden. Beispiel 4 zeigt hier nachfolgend die Verwendung
der Disruption.
-
Neue
Spinosyne können
auch produziert werden durch Mutagenese der klonierten Gene und
Substitition der mutierten Gene für ihre unmutierten Gegenstücke in einem
Spinosyn-produzierenden Organismus. Mutagenese kann zum Beispiel
umfassen: 1) Deletion oder Inaktivierung einer KR-, DH- oder ER-Domäne, sodass
eine oder mehrere dieser Funktionen blockiert sind und der Stamm
ein Spinosyn produziert mit einem Lactonkern mit einer Doppelbindung,
einer Hydroxylgruppe oder einer Ketogruppe, die nicht in dem Kern
von Spinosyn A vorliegt (siehe Donadio et al., 1993); 2) Austausch
einer AT-Domäne,
sodass eine verschiedene Carbonsäure
eingebaut ist in den Lactonkern (siehe Ruan et al., 1997); 3) Addition
einer KR-, DH- oder ER-Domäne
an ein bestehendes PKS-Modul, sodass der Stamm ein Spinosyn produziert
mit einem Lactonkern mit einer gesättigten Bindung, Hydroxylgruppe
oder Doppelbindung, die in dem Kern von Spinosyn A nicht vorliegt; oder
4) Addition oder Subtraktion eines kompletten PKS-Moduls, sodass
der cyclische Lactonkern eine größere oder
kleinere Anzahl von Kohlenstoffatomen aufweist. Beispiel 5 zeigt
die Verwendung von Mutagenese zum Produzieren eines Spinosyns mit
modifizierter Funktionalität.
-
Die
DNA von der Spinosyngenclusterregion kann verwendet werden als eine
Hybridisierungssonde zum Identifizieren homologer Sequenzen. So
könnte
die hier klonierte DNA verwendet werden zum Lokalisieren zusätzlicher
Plasmide von den Saccharpolyspora spinosa-Genbibliotheken, die die
Region überlappen,
die hier beschrieben ist, jedoch auch frühere nicht klonierte DNA von
benachbarten Regionen in dem Genom von Saccharopolyspora spinosa
enthalten. Zusätzlich
kann DNA aus der Region, die hier kloniert wird, verwendet werden
zum Identifizieren nicht identischer jedoch ähnlicher Sequenzen in anderen
Organismen. Hybridisierungssonden sind normalerweise mindestens
etwa 20 Basen lang und sind so markiert, um einen Nachweis zu erlauben.
-
Die
modifizierten Stämme,
die durch die Erfindung bereitgestellt werden, können kultiviert werden, um Spinosyne
unter Verwendung herkömmlicher
Protokolle, wie etwa diejenigen, die in
U.S. Patent Nr. 5,362,634 offenbart
sind, bereitzustellen.
-
Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, sodass die Erfindung
vollständiger
verstanden wird. Sie sollten nicht als begrenzend für die Erfindung
ausgelegt werden.
-
Beispiel 1
-
Verbesserte Ausbeute von Spinosynen A
und D durch Transformation mit Cosmid 9A6
-
Vegetative
Kulturen von S. spinosa-Stamm NRRL 18538 wurden gezüchtet in
50 ml CSM-Medium (Tryptikase Soja Nährmedium 30 g/l, Hefeextrakt
3 g/l, Magnesiumsulfat 2 g/l, Glucose 5 g/l, Maltose 4 g/l) in 250
ml Erlenmeyer-Kolben,
geschüttelt
mit 300 UpM bei 30°C
für 48
h. Fermentationskulturen enthielten ein 1 ml – Inoculum dieser vegetativen
Kultur in 7 ml INF202, ein Markenmedium, das ähnlich demjenigen ist, das beschrieben
ist Strobel & Nakatsukasa
(1993). Die Kulturen wurden gezüchtet
in 30 ml Kunststoffflaschen, die angeordnet waren in 10 × 10 Modulen,
geschüttelt
bei 300 UpM, in einem Raum bei 30°C
für 3,
5 oder 7 Tage. Nährmedien
wurden extrahiert mit 4 Volumina Acetonitril, dann analysiert auf
Spinosyne A + D durch isokratische Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)
durch eine C-18-Reverse Phase-Säule
(Strobel und Nakatsukasa, 1993). Die Menge an Spinosynen wurde bestimmt
aus der Absorption bei 250 nm. Für
jeden Zeitpunkt wurden die Spinosyne A + D bestimmt aus 10 Fermentationsflaschen.
Zwei repräsentative
Beispiele aus jedem Satz von Replikaten wurden ebenfalls analysiert
durch ein leicht modifiziertes HPLC-System auf Pseudoaglycon (PSA), den
Spinosynvorläufer,
dem Forosamin fehlt. In diesem System ist die mobile Phase 35:35:30
Acetonitril/Methanol/0,5% (Gew./V) wässriges Ammoniumacetat (R.
Wijayaratne, unveröffentlicht).
-
Die
Kulturen enthalten nicht nur die Insekten-aktiven Spinosyne A und
D sondern auch Pseudoaglykon (Tabelle 14). Tabelle 14 Spinosynproduktion in Stamm NRRL 18538
| Zeit | A
+ D (μg/ml) | PSA
(μg/ml) |
| 3d | 101 ± 3 | 109 ± 11 |
| 5d | 269 ± 14 | 155 ± 26 |
| 7d | 334 ± 32 | 110 ± 53 |
-
Die
Werte sind Mittelwerte ±95%
Vertrauensbereiche.
-
Die
Akkumulation des Pseudoaglycons A, ein Forosamin-Defizienzvorläufer von
Spinosyn A, legt nahe, dass in diesen Stämmen, die unter diesen Bedingungen
gezüchtet
wurden, die Ausbeute der Spinosyne A + D begrenzt ist durch die
Zuführung
und/oder Zugabe von Forosamin.
-
Cosmid
9A6 wurde konjugiert von E. coli Stamm S17-1 (Simon et al., 1983)
in S. spinosa, Stamm NRRL 18538, unter Verwendung des Verfahrens
von Matsushima et al. (1994). Sechs unabhängige Isolate, transformiert
mit Cosmid 9A6, wurden nachfolgend gezüchtet und analysiert auf Spinosynfaktorproduktion
unter den Fermentationsbedingungen, die oben beschrieben sind. Die
mittlere Ausbeute an Spinosynen A + D aus diesen Stämmen war
höher als
aus ihrem Elternstamm, um 35 μg/ml
nach 3 Tagen Fermentation und um 37 μg/ml nach 5 Tagen. Die Menge
Pseudoaglycon in den transformierten Kulturen war geringer als in
dem Elternstamm während
der ganzen Fermentierung (Tabelle 15). Tabelle 15 Spinosynproduktion in Derivaten von NRRL
18538, transformiert mit Cosmid 9A6.
| Zeit | A
+ D (μg/ml) | PSA
(μg/ml) |
| 3d | 136 ± 4 | 31 ± 2 |
| 5d | 306 ± 5 | 7 ± 2 |
| 7d | 365 ± 7 | 7 ± 1 |
-
Die
Werte sind Mittelwerte ±95%
Vertrauensgrade.
-
Der
Stamm NRRL 18538 und 6 unabhängige
Isolate, transformiert mit Cosmid 9A6, wurden auf Spinosyngehalt
zu verschiedenen Zeiten während
der Fermentation analysiert. Für
jeden Stamm wurden die Spinosyne A + D aus 10 Fermentationsflaschen
bestimmt (Tabelle 16). Zwei Proben von jedem Satz von Replikaten
wurden ebenfalls auf den Pseudoaglykongehalt analysiert (Tabelle
17). Tabelle 16 Wirkung von Cosmid 9A6 auf Spinosyn A
+ D in NRRL 18538
| Zeit | –9A6 | +9A6 | Wirkung
von 9A6 |
| 3d | 101 ± 3 | 136 ± 4 | +35% |
| 5d | 269 ± 14 | 306 ± 5 | +14% |
| 7d | 334 ± 32 | 365 ± 7 | +9% |
| 9d | 414 ± 17 | 411 ± 8 | –1% |
-
Die
Werte sind Mittelwerte in μg/ml ±95% Vertrauensgrade Tabelle 17 Wirkung von Cosmid 9A6 auf Pseudoaglyconakkumulation
in NRRL 18538
| Zeit | –9A6 | +9A6 | Wirkung
von 9A6 |
| 3d | 109 ± 11 | 31 ± 2 | –72% |
| 5d | 155 ± 26 | 7 ± 2 | –95% |
| 7d | 110 ± 53 | 7 ± 1 | –94% |
| 9d | 119 ± 11 | 5 ± 1 | –96% |
-
Die
Werte sind Mittelwerte in μg/ml ±95% Vertrauensgrade
-
Es
ist daher gezeigt worden, dass Transformation mit Cosmid 9A6 die
Effizienz verbessert werden kann, mit welcher Vorläuferpseudoaglycon
in Spinosyne prozessiert wird. Bei NRRL 18538 waren die Ausbeuteverbesserungen
für Spinosyn
A + D 35% nach 3 Tagen Fermentation und 14% nach 5 Tagen (Tabelle
15). Der Rate-limitierende Prozess scheint die Zuführung und/oder
Adhäsion
von Forosamin zu sein, da Pseudoaglycon in dem Elternstamm mit etwa
120 μg/ml über die
gesamte Fermentation vorlag, jedoch war es in den Transkonjugaten
reduziert auf etwa 30 μg/ml
bei 3 Tagen und im Wesentlichen danach depletiert (Tabelle 15). Wenngleich
die Umwandlung nicht quantitativ war, sind die Daten übereinstimmend
mit einer verbesserten Effizienz beim Prozessieren von Pseudoaglycon
in Spinosyn A + D in Stämmen,
die transformiert sind mit Cosmid 9A6. Die Wirkung könnte das
Ergebnis eines Duplizierens eines Forosaminbiosynthesegens, eines
Forosaminyltransferasegens oder eine Kombination von Verbesserungen
sein. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen
den Spinosyn A + D-Ausbeuten von den NRRL 18358 Stämmen mit
oder ohne Cosmid 9A6 nach 7 oder 9 Tagen Fermentation. Pseudoaglycon
war weiterhin reduziert in den Transkonjugaten, jedoch kann es sein,
dass das Extraspinosyn A + D, das produziert wird durch seine Umwandlung,
nicht nachweisbar gewesen ist gegenüber dem höheren Hintergrund von Spinosynen,
die in dieser Stufe der Fermentation akkumuliert werden.
-
Beispiel 2
-
Korrektur von Methylierungsdefizienzen
in Stamm NRRL 18823 durch Cosmid 9A6
-
Wenngleich
Spinosynsynthese begrenzt ist durch Forosaminzuführung/Addition in Stamm NRRL 18358,
können
andere biosynthetische Funktionen begrenzend sein in anderen Stämmen. S.
Spinosa Stamm NRRL 18823 akkumuliert Spinosyn H (2'-Desmethylspinosyn
A; Kirst et al., 1992) eher als Spinosyn A. Spinosyn H ist kein
Zwischensprodukt in dem Spinosyn A-Biosyntheseweg, jedoch ein „Neben"-Produkt, das natürlich synthetisiert wird wenn
2'-O-Methylierung
nicht auftritt. Cosmid 9A6 wurde konjugiert von E. coli-Stamm S17-1
in Stamm NRRL 18823, unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens.
Zwei der resultierenden Exkonjugate produzierten bei Fermentation
vorherrschend Spinosyn A mit wenig Spinosyn H (Tabelle 18). Tabelle 18
| Stamm | H
(μg/ml) | A
+ D (μg/ml) |
| NRRL
18823 | 323 | 0 |
| NRRL
18823/9A6-2 | 36 | 551 |
| NRRL
18823/9A6-5 | 45 | 646 |
-
Dies
zeigt, dass Transformation mit Cosmid 9A6 in der Lage ist einen
zweiten Typ einer Begrenzung der Spinosynproduktion zu beseitigen – die Methylierungsdefizienz
in Stamm NRRL 18823.
-
Beispiel 3
-
Korrektur der 4'-O-Methylierungsdefizienz in Stamm NRRL
18743 durch Cosmid 9A6
-
S.
spinosa Stamm NRRL 18743 akkumuliert Spinosyn K (4'-Desmethyl-Spinosyn A), ein
Zwischenprodukt des Spinosyn A-Biosynthesewegs. Zwei der Exkonjugate
von Stamm NRRL 18743, enthaltend Cosmid 9A6, produzierten vorherrschend
Spinosyn A, mit wenig Spinosyn K, während der dritte kein nachweisbares Spinosyn
K produzierte (Tabelle 19). Tabelle 19
| Stamm | K
(μg/ml) | A
+ D (μg/ml) |
| NRRL
18743 | 488 | 0 |
| NRRL
18743/9A6-1 | 38 | 829 |
| NRRL
18743/9A6-2 | 22 | 725 |
| NRRL
18743/9A6-3 | 0 | 706 |
-
Dies
zeigt, dass Transformation mit Cosmid 9A6 in der Lage ist einen
dritten Typ einer Begrenzung der Spinosyn A-Produktion – die Methylierungsdefizienz
in Stamm NRRL 18743 – zu
beseitigen.
-
Beispiel 4
-
Akkumulation von Spinosynvorläufer, bewirkt
durch Disruption von spnP
-
Ein
internes Fragment von spnP (Basen 7391–8159) wurde amplifiziert in
einer Polymerasekettenreaktion, unter Verwendung von Primern, die
in SEQ ID NO: 34 und SEQ ID NO: 35 angegeben sind. AmpliTaq-Polymerase
(Perkin Elmer, Foster City, CA) wurde entsprechend den Anleitungen
des Herstellers in einer 100 μl-Reaktion
mit 20 pMol von jedem Primer und 1 μg 9A6 DNA verwendet. Das Gemisch
wurde 25 Zyklen von 60 sec bei 94°C,
60 sec bei 37°C
und 120 sec bei 72°C
unterzogen. Das Amplifikationsprodukt wurde kloniert als ein EcoR1-HindIII-Fragment
in den Plasmidvektor pOJ260 (Bierman et al., 1992), dann konjugiert
von E. coli S17-1 in S. spinosa NRRL 18538. Stabile Exkonjugate,
resultierend aus einem einzelnen homologen Rekombinationsereignis
zwischen den aus dem Plasmid hervorgegangenen und chromosomalen
Sequenzen enthalten eine Kopie der Vektor-DNA, die integriert ist
in das Chromosom zwischen zwei unvollständigen Kopien von spnP. Bei
Fermentation akkumulieren diese Exkonjugate die Forosamindefizientenvorläufer-Pseudoaglycone,
eher als die Endprodukte Spinosyne A und D (Tabelle 20). Tabelle 20
| Stamm | PSA
(μg/ml) | A
+ D (μg/ml) |
| NRRL
18538 | 79 | 284 |
| NRRL
18538/1614-2 | 416 | 22 |
| NRRL
18538/1615-1 | 372 | 21 |
| NRRL
18538/1615-2 | 543 | 21 |
| NRRL
18538/1615-5 | 476 | 19 |
| NRRL
18538/1615-6 | 504 | 18 |
-
Die
Pseudoaglycone sind Zwischenprodukte, die geeignet sind bei der
Herstellung bekannter Insektizide (internationale Anmeldung
WO 93/09126 ).
-
Beispiel 5
-
Akkumulation eines neuen Spinosyns, nachfolgend
auf Modifikation der PKS-Domäne ER2
-
Überlappende,
komplementäre
Oligonukleotide SEQ ID NO: 36 und SEQ ID NO: 37 wurden entwickelt,
um das Gen zu modifizieren, das für die Enoylreduktasefunktion
in Modul 2 von Spinosyn PKS codiert. Diese mutagenen Primer liefern
eine Substitution der Sequenz TCACC anstelle von GGTGG an den Basen 33563–33567 von
SEQ ID NO: 1, sodass die Sequenz für ein Serin-Prolin-Dipeptid
anstelle eines Glycin-Glycin-Dipeptids in dem mutmaßlichen
NAD(P)H-Bindungsmotiv codiert. Eine ähnliche Substitution wurde
erfolgreich angewendet zum Inaktivieren eines Erythromcyin ER ohne
Beeinträchtigung
irgendwelcher anderen PKS-Funktionen
(Donadio et al., 1993). Die Substitution führte simultan eine neue PinA1-Restriktionsstelle
ein und eliminierte eine SgrA1-Stelle, um den Nachweis der konstruierten
DNA in rekombinanten Organismen zu erleichtern.
-
Im
ersten Schritt der Mutagenese wurden zwei PCR-Amplifikationen durchgeführt, eine
unter Verwendung des mutagenen Primers SEQ ID NO: 36 und des flankierenden
Primiers SEQ ID NO: 38, die andere unter Verwendung des mutagenen
Primers SEQ ID NO: 37 und des flankierenden Primers SEQ ID NO: 39..
Im zweiten Schritt wurden die Produkte der ersten Reaktionen 100-fach
verdünnt,
gepoolt und amplifiziert mit nur den flankierenden Primern SEQ ID
NO: 38 und SEQ ID NO: 39. Im dritten Schritt wurden die Produkte
der zweiten PCR-Reaktion kloniert in das Plasmid pCRII, entsprechend
den Anleitungen des Herstellers (InVitrogen, San Diego, CA). Ein
Teil der mutierten ER2-Domäne
(überspannend
die Basen 33424–33626
in SEQ ID NO: 1) wurde herausgeschnitten als ein Van911-NheI-Fragment und
insertiert anstelle des Wildtyp-Van911-NheI-Fragments in ein 3,5
kb EcoR1-Fragment von Cosmid 3E11 (Basen 32162–35620 in SEQ ID NO: 1), kloniert
in dem Plasmid pBluescript SK-(Stratagene). Das mutierte EcoR1-Fragment
wurde dann transfiziert in das konjugative Plasmid pDAB1523 (5),
ein Derivat von pOJ260, enthaltend das rpsL-Gen von Streptomyces
roseosporus, das einen selektierbaren Phänotyp verleiht der gegenüber Streptomycin
empfindlich ist (Hosted & Baltz,
1997). Das resultierende Plasmid, das das mutierte EcoR1-Fragment
enthält,
wurde konjugiert von E. coli S17-1 (Simon et al., 1983) in SS15,
ein spontanes Streptomycin-resistentes Derivat von S. spinosa-Stamm
NRRL18538, unter Verwendung des Verfahrens von Matsushima et al.
(1994). (Spontane Streptomycinresistenzderivate von S. spinosa Stamm
NRRL18538 können
leicht durch den Fachmann in der Technik isoliert werden). Apramycin-resistente Exkonjugate
erwiesen sich so, dass sie sowohl Wildtyp- als auch mutierte Versionen
von der ER2-Domäne
enthalten, durch Southern Hybridisierung mit Digocygenin-markierten
Sonden (Boehringer Mannheim). Sie enthielten auch das S. roseosporus
rpsL-Gen und folglich, auf BHI-Agar (Difco, Detroit, MI), enthaltend
Streptomycin mit 150 mg/l, wuchsen sie schlecht und versagten dabei Luftmycel
zu produzieren. Spontane Revertanten auf Streptomycinresistenz wurde
ausgewählt
auf der Basis ihrer Fähigkeit
zum Wachsen und Produzieren von weißem, Luftmycel auf BHI-Agar, enthaltend
Streptomycin mit 150 mg/l. Southern Analyse zeigte, dass diese Stämme nicht
länger
das S. roseosporus rpsL-Gen noch irgendwelche anderen pDAB1523-Sequenzen
enthielten. Einige Stämme
hatten den gesamten Cluster von Spinosynbiosynthesegenen verloren,
einschließlich
der ER2-Domäne
als auch pDAB1523. Die anderen Stämme der pDAB1523-Sequenzen sind herausgeschnitten
worden entlang der Mutanten ER2-Domäne, wobei
die elterliche Genstruktur wieder gebildet wird. In einem dritten
Typ eines Streptomycin-resistenten Stamms ist das pDAB1523 herausgeschnitten
worden mit der Wildtyp ER2-Domäne,
wobei die mutierte Version an ihrer Stelle zurückbleibt. Beim Fermentieren
produzierte ein Stamm dieses dritten Typs einen neuen Metaboliten,
der separierbar ist von Spinosyn A durch Flüssigchromatographie auf einer
C18-Säule
(ODS-Aq, YMC, Wilmington, NC), unter Verwendung einer mobilen Phase
aus Acetonitril:Methanol:2% Ammoniumacetat (44:44:12). Das neue
Gebilde wurde analysiert durch Elektrosprühionisation und Tandemmassenspektroskopie
(Balcer et al., 1996), unter Verwendung eines Triple Quadropol-Massenspektrometers
(TSQ700, Finnigan MAT, San Jose, CA). Sie hatte die Eigenschaften,
die erwartet werden von dem C18:C19-Anhydrospinosyn A, mit einer Masse von
729,5 Dalton und produzierte das 142 Dalton-Forosaminfragment. Wir
schlossen, dass Modifikationen von DNA, die für PKS-Domänen codiert, zur Produktion
von neuen Fermentationsprodukten führt.
-
Beispiel 6
-
Verbesserte Ausbeute von Spinosyn A und
D durch Transformation von NRRL 18538 mit Rhamnosebiosynthesegenen
-
Fragmente,
enthaltend die Rhamnosebiosynthesegene, wurden unabhängig kloniert
in den Konjugationsvektor pOJ260 (Bierman et al., 1992). Die resultierenden
Plasmide sind in Tabelle 21 aufgeführt. Tabelle 21
| Plasmid | Gene |
| pDAB1632 | gtt |
| pDAB1634 | gdh
+ kre |
| pDAB1633 | epi |
-
Jedes
Plasmid wurde konjugiert von E. coli S17-1 (Simon et al., 1983)
in S. spinosa NRRL 18538 durch das Verfahren von Matsushima et al.
(1994). Apramycin-resistente Exkonjugate, die vermutlich ein Plasmid
enthalten, das integriert ist in das Chromosom durch homologe Rekombination,
wurden ausgewählt
und fermentiert (Tabelle 22). Tabelle 22 Spinosynproduktion in Derivaten von NRRL
15328, transformiert mit Rhamnosegenen
| Stamm | duplizierte
Gene | A
+ D (μg/ml) | |
| | | Experiment
1 | Experiment
2 |
| NRRL
18538 | keine | 344 ± 39 | 405 ± 25 |
| NRRL
18538/1632-1 | gtt | 410 ± 21 | 418 ± 38 |
| NRRL
18538/1634-1 | gdh
+ kre | 351 ± 27 | 360 ± 21 |
| NRRL
18538/1633-1 | epi | 318 ± 29 | 315 ± 18 |
-
Die
Werte sind Mittelwerte ±95%
Vertrauensgrenzen
-
In
den Derivaten von NRRL 15328, transformiert mit gtt oder epi, oder
der Kombination von gdh und kre, lag keine konsistente Erhöhung der
Ausbeute von Spinosynen vor.
-
Die
Fragmente, enthaltend die gtt und gdh + kre-Gene, wurden kombiniert
in einem Einzelplasmid. Zwei Plasmide, enthaltend die kombinierten
gtt-, gdh- und kre-Gene
(pDAB1654 und pDAB1655) wurden isoliert und konjugiert von E. coli
S17-1 (Simon et al., 1983) in S. spinosa NRRL 18538 durch das Verfahren
von Matsushima et al. (1994). Apramycin-resistente Exkonjugate wurden
ausgewählt
und fermentiert (Tabelle 23). Tabelle 23 Spinosynproduktion in Derivaten von NRRL
15328, transformiert mit Rhamnosegenen
| Stamm | duplizierte
Gene | A + D (μg/ml) |
| | | Experiment
1 | Experiment
2 |
| NRRL
18538 | keine | 109 ± 9 | 133 ± 36 |
| NRRL
18538/1654-2 | gtt,
gdh und kre | 323 ± 19 | 244 ± 34 |
| NRRL
18538/1654-5 | gtt,
gdh und kre | 571 ± 23 | 412 ± 61 |
| NRRL
18538/1654-6 | gtt,
gdh und kre | 577 ± 17 | 425 ± 51 |
| NRRL
18538/1654-11 | gtt,
gdh und kre | 587 ± 23 | 426 ± 55 |
| NRRL
18538/1655-1 | gtt,
gdh und kre | 501 ± 20 | 395 ± 59 |
| NRRL
18538/1655-3 | gtt,
gdh und kre | 537 ± 27 | 421 ± 63 |
| NRRL
18538/1655-5 | gtt,
gdh und kre | 529 ± 21 | 428 ± 47 |
| NRRL
18538/1655-12 | gtt,
gdh und kre | 526 ± 26 | 401 ± 60 |
-
Die
Werte sind Mittelwerte ±95%
Vertrauensgrenzen
-
In
Derivaten von NRRL 15328, transformiert mit den gt-t, gdh- und kre-Genen, wurden signifikante
Erhöhungen
von Spinosynausbeuten beobachtet. Dies resultiert möglicherweise
aus dem Beseitigen einer Rate-limitierenden
Versorgung von NDP-4-Keto-6-deoxyglucose durch simultane Erhöhung der
Mengen von sowohl gtt- als auch gdh-Genprodukten, die Enzyme, die
erforderlich sind für
seine Biosynthese (siehe 1). Eine
größere Versorgung
mit dem NDP-4-Keto-6-deoxyglucose-Zwischenprodukt würde zu einer
erhöhten Produktion
von sowohl Rhamnose als auch Forosamin führen, mit der Hypothese, dass
Deoxyzuckerversorgung begrenzend für Spinosynproduktion in NRRL
18538 ist, wobei viele Mutanten, blockiert in der Forosaminsynthese
oder Addition, PSA in sehr hohen Gehalten akkumulieren. Mehr von
diesem Zwischenprodukt kann hergestellt werden, da es nur einen
Deoxyzucker erfordert, verglichen mit den zwei erforderlichen für Spinosyne
A oder D.
-
Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf einen speziellen Vektor, der
Spinosyngene der Erfindung umfasst, begrenzt, sondern umfasst vielmehr
die Biosynthesegene in einem beliebigen Vektor, der verwendet wird,
um die Gene in eine rekombinante Wirtszelle einzuführen.
-
Zusätzlich,
aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, ist der Fachmann
in der Technik vertraut mit synthetischen Verfahren zum Herstellen
von DNA-Sequenzen, die für
die gleiche oder funktional die gleiche Aktivität codieren können, wie
diejenige der natürlichen
Gensequenz. Ebenso ist der Fachmann in der Technik vertraut mit
Techniken zum Modifizieren oder Mutieren der Genseqenz, um neue
Sequenzen herzustellen, die für
die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Polypeptidaktivität wie die
natürlichen
Sequenzen codieren. Folglich sind diese synthetischen Mutanten-
und modifizierten Formen der Gene und Expressionsprodukte dieser
Gene ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst.
-
Literaturstellen
-
- 1. Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E.
W. Myers und David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool.
J. Molec. Biol. 215: 403–10.
- 2. Aparicio, J. F., I. Molnar, T. Schwecke, A. Konig, S. F.
Haydrock, L. E. Khw, J. Staunton & J.
F. Leadlay (1996). „Organization
of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus:
analysis of the enzymatic domains in the modular poyketide synthase". Gene 169: 9–16.
- 3. Balcer, J. L., S. M. Brown & D. F. Berard (1996): "A rapid screening
technique for identification of Spinosad photolysis products using
ESI/MS/MS", Proc.
44th Conf. Amer. Soc. Mass Spec.
- 4. Baltz, R. H., M. A. McHenney, C. A. Cantwell, S. W. Queener & P. J. Solenberg
(1997). "Applications
of transposition mutagenesis in antibiotic producing streptomycetes," Ant. Van Leeuw.
71: 179–187.
- 5. Bibb, M. J., P. R. Findlay & M. W. Johnson (1984). "The relationship
between base composition and codon usage in bacterial genes and
its use for simple and reliable identification of protein-coding
sequences," Gene 30:
157–166.
- 6. Bierman, M., R. Logan, K. O'brien, E. T. Seno, R. N. Rao & B. E. Schoner
(1992). „Plasmid
cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia
coli to Streptomyces spp," Gene
116: 43–49.
- 7. Broughton, M. C., M. L. B. Huber, L. C. Creemer, H. A. Kirst & J. A. Turner
(1991). "Biosynthesis
of the macrolide insecticidal compound A83543 by Saccharopolyspora
spinosa," Ann. Mtg,
Amer. Soc. Micorbiol.
- 8. Burgett, S. G. & P.
R. J. Rosteck (1994), "Use
of dimethyl sulfoxide to improve fluorescent, Taq cycle sequencing.
In Automated DNA sequencing and analysis,". M. Adams, C. Fields & J. C. Venter,
eds. NY, Academic Press: pp. 211–215.
- 9. Dehoff, B. S., S. A. Kuhstoss, P. R. Rosteck & K. L. Sutton
(1997). "Polyketide
synthase genes." EPA 0791655 .
- 10. Don, R. H., P. T. Cox, B. J Wainwright, K. Baker & J. S. Mattick
(1991). "Touchdown' PCR to circumvent spurious
priming during gene amplification," Nucl. Acid Res. 19: 4008.
- 11. Donadio, S., J. B. McAlpine, P. S. Sheldon, M. Jackson & L. Katz (1993). "An erythromycin analog
produced by reprogramming of polyketide synthesis," Proc. Natn. Acad.
Sci. USA 90: 7119–7123.
- 12. Donadio, S. & L.
Katz (1992). "Organization
of the enzymatic domains in the multifunctional polyketide synthase
involved in erythromycin formation in Saccharopolyspora erythrae," Gene 111: 51–60.
- 13. Donadio, S., M. J. Staver, J. B. McAlpine, S. J. Swanson & L. Katz (1991). "Modular organization
of genes required for complex polyketide biosynthesis", Science 252: 675–679,
- 14. Fish, S. A. & E.
Cundliffe (1997). „Stimulation
of polyketide metabolism in Streptomyces fradiae by tylosin and
its glycosylated precursors," Microbiology
143: 3871–3876.
- 15. Geistlich, M., R. Losick, J. R. Tunrer & R. N. Rao (1992). „Characterization
of a novel regulatory gene governing the expression of a polyketide
synthase gene in Streptomyces ambofaciens," Mol Microcbiol. 6: 2019–2029.
- 16. Hosted, T. J. & R.
H. Baltz (/1997). "Use
of rpsL for diminance selection and gene replacement in Streptomyces
roseosporus", J.
Bacteriol. 179: 180–186.
- 17. Inouye, M., H. Suzuku, Y. Takada, N. Muto, S. Horinouchi & T. Beppu (1994). "A gene encoding mycinamicin
III O-methyltransferase
from Micromonospora griseorubida," Gene 141: 121–124.
- 18. Jiang, X. M., B. Neal, F. Santiago, S. J. Lee, L. K. Romana & P. R. Reeves
(1991). "Structure
and sequence of the rfb (O antigen) gene cluster of Salmonalle scrovar
typhimurium (strain LT2)," Mol.
Microbiol. 5: 695–713.
- 19. Kirst, H. A., K. H. Michel, J. S. Mynderse, E. H. Chio,
R. C. Yao, W. M. Nakatsukasa, L. D. Boeck, J. L. Occlowitz, J. W.
Paschal, J. B. Deeter & G.
D. Thompson (1992). "Discovery,
isolation and strcuture elucidation of a family of structurally
unique, fermentation-derived
tetracyclic macrolides. In Synthesis and Chemistry of Agrochemicals
III," D. R. Baker,
J. G. Fenyes & J.
J. Steffens, eds. Washington, DC, American Chemical Society: S.
214–225.
- 20. Linton, K. J., B. W. Jarvis & C. R. Hutchinson (1995). "Cloning the genes
encoding thymidine diphosphoglucose 4,6-dehydratase and thymidine
diphospho-4-keto-6-deoxyglucose 3,5-epimerase from the erythromycin-producing
Saccharopolyspora erythrae."
- 21. Liu, H. W. & J.
S. Thorson (1994). "Pathways
and mechanismus in the biogenesis of novel deoxysugars by bacteria," Ann Rev Microbiol
48: 223–256.
- 22. Matsushima, P., M. C. Broughton, J. R. Turner & R. H. Baltz (1994). "Conjugal transfer
of cosmid DNA from Escherichia coli to Saccharopolyspora spinosa:
effects of chromosomal insertion on macrolide A83543 production," Gene 146: 39–45.
- 23. Ruan, X. et al. (1997). "Acyltransferase
Domain Substitutions in Erythromcyin Polyketide Synthase Yield Novel
Erythromycin Derivatives," J.
Bacteriology 179, 6416.
- 24. Siggard-Andersen, M. 81993). "Conserved residues in condensing enzyme
domains of fatty acid synthases and related sequences," Protein Seq. Data
Anal. 5: 325–335.
- 25. Simon, R., U. Preifer & A.
Puhler (1983). „A
broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering:
transposon mutagenesis in Gram negative bacteria," Bio/Technology 1:
784–791.
- 26. Solenberg, P. J. & S.
G. Burgett (1989). "Method
for selection of transposable DNA and characterization of a new
insertion sequence, IS493, from Streptomyces lividans," J. Bacteriol. 171:
4807–4813.
- 27. Strobel, R. J. & W.
M. Nakatsukasa (1993). „Response
surface methods for optimizhing Saccharopolyspora spinosa, a novel
macrolide producer, J. Ind. Microbiol. 11: 121–127.
- 28. Thorson, J. S., S. F. Lo & H.
Liu (1993), "Biosynthesis
of 3,6-dideoxyhexoses:
new mechanistic reflections upon 2,6-dideoxy, 4,6-dideoxy, and amino
sugar construction," J.
Am. Chem. Soc. 115: 6993–6994.
- 29. Weber, J. M. & J.
B. McAlpine (1992). "Erythromycin
derivatives," U.S. Patent 5,141,926 .
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
