DE69930515T2 - Polyketide, ihre herstellung, und darin benutzte materialien - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polyketide, ihre Herstellung und Materialien zur Verwendung bei der Herstellung.
  • Polyketide sind eine große und strukturell sehr unterschiedliche Klasse natürlicher Produkte, die jegliche Verbindungen umfasst, die antibiotische oder andere pharmakologische Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise Erythromycin, Tetracycline, Rapamycin, Avermectin, Polyetherionophore und FK506.
  • Polyketide werden insbesondere durch Streptomyces und verwandte Aktinomyzet-Bakterien reichlich produziert. Sie werden durch die wiederholte schrittweise Kondensation von Acylthioestern auf eine analoge Weise synthetisiert, wie dies bei der Fettsäurebiosynthese geschieht. Die größere strukturelle Vielfalt, die unter natürlichen Polyketiden zu finden ist, entsteht durch die Auswahl von (üblicherweise) Acetat oder Propionat als "Ausgangs"- oder "Verlängerungs"-Einheiten; und aus dem unterschiedlichen Verarbeitungsgrad der β-Keto-Gruppe, der nach jeder Kondensation beobachtet wird. Beispiele für Verarbeitungsschritte umfassen Reduktion zu β-Hydroxyacyl-, Reduktion gefolgt von Dehydratisierung zu 2-Enoyl- und vollständige Reduktion zum gesättigten Acylthioester. Das stereochemische Ergebnis dieser Verarbeitungsschritte wird ebenfalls für jeden Zyklus der Kettenverlängerung spezifiziert.
  • Die Biosynthese von Polyketiden wird durch eine Gruppe von kettenbildenden Enzymen, die als Polyketidsynthasen (PKSs) bekannt sind, initiiert. Zwei Klassen von Polyketidsynthase wurden bereits in Aktinomyzeten beschrieben. Die neuen Polyketide und Verfahren, die Inhalt der vorliegenden Erfindung sind, gehören jedoch hauptsächlich zu den PKSs vom Typ I, für die die PKSs für die Makroliden Erythromycin, Rapamycin und Avermectin als Beispiele stehen. Typ-I-PKSs enthalten für jeden Zyklus der Polyketidkettenverlängerung eine andere Reihe oder ein anderes "Modul" von Enzymen (J. Cortes et al., Nature 348, 176-178 (1990); S. Donadio et al., Science 252, 675-679 (1991); D. J. MacNeil et al., Gene 115, 119-125 (1991); T. Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995), und siehe z.B. 1 hierin oder die 2a und 3 aus der WO 98/01546); Typ-II-PKSs andererseits sind die Synthasen für aromatische Verbindungen und enthalten nur eine einzelne Reihe von enzymatischen Aktivitäten für Kettenverlängerung. Diese werden je nach Bedarf in nachfolgenden Zyklen neuerlich verwendet.
  • Ein vollständiges Modul, das vollständige Reduktion fordert, enthält eine Ketoacyl-ACP-Synthase- (KS-) Domäne; eine Acylträgerproteindomäne (ACP); eine Acyl-CoA:ACP-Acyltransferase (AT) zum Laden der Verlängerungseinheit; und eine Ketoreductase (KR), eine Dehydratase (DH) und eine Enoylreductase- (ER-) Domäne für den Abschluss der Verarbeitung der β-Keto-Gruppe. Da diese Domänen enzymatische Aktivität aufweisen, können sie hierin auch als "Enzyme" bezeichnet werden, wobei hier nicht beabsichtigt wird, irgendetwas über ihre strukturelle Beziehung zu anderen PKS-Domänen auszusagen. In ähnlicher Weise können die Nucleinsäuresequenzen, die für solche Domänen kodieren, auch als "Gene" bezeichnet werden, wobei hier nicht beabsichtigt wird, irgendetwas über die Gegenwart oder sonstiges von separaten Regulationsregionen für die verschiedenen Domänen einer PKS auszusagen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Polyketiden durch Ersetzen der reduktiven Schleife (des Segments vom Ende der AT bis zum Anfang der ACP, umfassend entweder eine KR oder eine KR und eine DH oder eine KR, eine DH und eine ER) in einem ausgewählten Modul von einem Typ-I-Polyketidsynthase-Gencluster durch das entsprechende Segment aus demselben oder aus einem anderen PKS-Gencluster, oder durch ein mutiertes oder synthetisches Segment, wodurch neue Hybridpolyketidsynthasen gebildet werden, die Polyketide mit verschiedenem Reduktionsausmaß und/oder unterschiedlicher Stereochemie auf eine vorhersehbare Weise produzieren.
  • Zum eindeutigen Verständnis bezieht sich die Bezeichnung "Erweiterungsmodul" bzw. "Verlängerungsmodul", wie hierin nachstehend verwendet, auf eine Reihe von Domänen einer Typ-I-PKS, wobei jede enzymatische Aktivität aufweist und die an einem Zyklus von Polyketidkettenverlängerung beteiligt ist. Insbesondere umfasst ein Erweiterungsmodul KS, AT, eine reduktive Schleife (die eine oder mehrere von KR, DH und ER umfasst) und ACP.
  • Selten kann die reduktive Schleife andere Domänen umfassen. Yersiniabacter beispielsweise, das eine gemischte PKS und Polypeptidsynthase umfasst, weist eine Methyltransferasedomäne auf.
  • Es wurde berichtet, dass Ersetzung der reduktiven Schleife von Modul 2 in DEBS1TE durch das äquivalente Segment aus Modul 3 des Erythromycin-PKS-Gens (Typ I) ein Triketidketolacton ergibt, wenn es in S. coelicolor CH999 exprimiert wird (D. Bedford et al., Chemistry and Biology 3, 827-831 (1996)).
  • In ähnlicher Weise ergibt eine Ersetzung der reduktiven Schleife aus Modul 2 in DEBS1TE durch das äquivalente Segment aus Modul 5 der Erythromycin-PKS ein Triketidlacton mit der vorhergesagten Struktur und Stereochemie, wenn es in S. coelicolor CH999 exprimiert wird (R. McDaniel et al., Chemistry and Biology 4, 667-674 (1997)). Dahingegen konnte, wenn derselbe Versuch unter Verwendung der reduktiven Schleife aus Modul 6 der Erythromycin-PKS durchgeführt wurde, nur ein Ketolacton isoliert werden (R. McDaniel et al., Chemistry and Biology 4, 667-674 (1997)).
  • In einem weiteren Versuch wurde gezeigt, dass die reduktive Schleife von Modul 2 in einem trimodularen System, das die Ladungsdomäne, das erste, zweite und dritte Erweiterungsmodul und die TE des ery-Gens enthält, auch durch das äquivalente Segment aus Modul 4 der Rapamycin-PKS ersetzt werden kann, das eine KR- und DH-Domäne umfasst, woraus ein Tetraketid mit der vorhergesagten Doppelbindung entsteht, wenn es in S. coelicolor CH999 exprimiert wird (R. McDaniel et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 4309-4310 (1997)). Im selben System wurde die reduktive Schleife aus Modul 2 durch das äquivalente Segment von Modul 1 der Rapamycin-PKS ersetzt, das eine KR-, eine DH- und eine ER-Domäne enthält, woraus ein Tetraketid mit dem vorhergesagten Oxidationsgrad bei C-5 entsteht, wenn es in S. coelicolor CH999 exprimiert wird (C. M. Kao et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 11339-11340 (1997)). Dahingegen konnte unter Verwendung des entsprechenden Segments aus Modul 4 des Erythromycin-PKS-Gens nur ein Polyketid mit einer Doppelbindung an der relevanten Position beobachtet werden und nicht, wie vorhergesagt worden wäre, vollständige Reduktion (C. M. Kao et al., J. Am. Chem. Soc. 119, 11339-11340 (1997)).
  • In zwei ähnlichen Versuchen wurde die reduktive Schleife aus Modul 2 im trimodularen System durch das entsprechende Segment aus Modul 2 der Rapamycin-PKS, das eine KR- und eine inaktive DH-Domäne enthielt, und durch die KR-Domäne aus Modul 4 der rap-PKS (die reduktive Schleife von rap-Modul 4 enthält eine KR- und eine DH-Domäne) substituiert. Von beiden Konstrukten wird berichtet, dass sie ein Triketidlacton mit einer unterschiedlichen Stereochemie an C-3 ergeben (C. M. Kao et al., J. Am. Chem. Soc. 120, 2478-2479 (1998)).
  • In allen zuvor beschriebenen Beispielen wurden dieselben Restriktionsstellen, PstI und XbaI, verwendet, um die DNA-Fragmente zu verbinden (die Position der PstI-Stelle ist dieselbe wie der PstI-Stelle, die im nachstehend beschriebenen System verwendet wurde, und die XbaI-Stelle liegt an derselben Position wie die Bsu36I-Stelle).
  • Für die Struktur der DEB-Synthase wurde ein Modell vorgeschlagen, in dem die reduktiven Domänen eine Schleife bilden, die außerhalb des durch die KS-, AT- und die ACP-Domänen gebildeten Kerns liegt (Staunton et al., Nature structural biology 3, 188-192 (1996)). Darüber hinaus wurde erkannt, dass DEBS1 durch proteolytische Enzyme an spezifischen Positionen, die die Grenzen der Domänen anzeigen, hydrolysiert wird (J. F. Aparicio et al., J. Biol. Chem. 269, 8524-8528 (1994)). Diese proteolytischen Stellen werden hauptsächlich in Linkerregionen gefunden, und es scheint daher ideal, die Fragmente in der nahen Umgebung dieser Stellen zu binden. Beispiele hierfür sind in der WO 98/01546 festgehalten.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäure (insbesondere DNA) bereit, die für zumindest einen Teil einer Polyketidsynthase (PKS) vom Typ I kodiert, worin dieser Teil zumindest einen Teil eines Erweiterungsmoduls umfasst, worin die Nucleinsäure einen Polylinker mit mehrfachen Restriktionsenzym-Schnittstellen anstelle eines oder mehrerer Gene dieser PKS, die für mit Reduktion assoziierte Enzyme kodieren, aufweist.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäure (insbesondere DNA) bereit, die für zumindest einen Teil einer Polyketidsynthase (PKS) vom Typ I kodiert, worin dieser Teil zumindest einen Teil eines Erweiterungsmoduls umfasst, worin die Nucleinsäure einen Polylinker mit mehrfachen Restriktionsenzym-Schnittstellen aufweist, der Nucleinsäure, die für (zumindest einen Teil von) AT dieser PKS kodiert, mit Nucleinsäure, die für (zumindest einen Teil von) ACP dieser PKS kodiert, verbindet.
  • Solche Nucleinsäuren können eine zusätzliche Nucleinsäure aufweisen, die für ein oder mehrere reduktive Enzyme kodiert und in den Polylinker, wie nachstehend noch näher beschrieben wird, insertiert wird. Solch eine Insertion erfolgt vorzugsweise nach Verdau der Polylinker-hältigen Nucleinsäuren durch zwei Restriktionsenzyme. Um eine Auswahl an Insertionsstellen bereitzustellen, umfasst der Polylinker vorzugsweise zumindest drei Restriktionsstellen, noch bevorzugter zumindest vier, und noch bevorzugter zumindest sechs oder acht Restriktionsstellen.
  • Der Polylinker kann durch Einführen exogener (üblicherweise synthetischer) Nucleinsäure in die für Typ-I-PKS kodierende Nucleinsäure bereitgestellt werden oder kann durch gentechnische Veränderung der bestehenden Sequenz der für Typ-I-PKS kodierenden Nucleinsäure bereitgestellt werden. Um Letzteres zu erreichen, können beispielsweise Restriktionsstellen (z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese) gentechnisch zu Sequenzen stromauf und/oder -ab (vorzugsweise beides) von der Stelle, an der die nicht vorhandene, reduktive, Enzym-kodierende Sequenz normalerweise liegen würde, insbesondere zu Sequenzen, die für Polypeptidlinker zwischen dem/den reduktiven Enzymen) und benachbarten Domänen kodieren, verändert werden.
  • Der Polylinker umfasst wünschenswerterweise zumindest einige der folgenden Restriktionsstellen: AvrII; BgIII; SnaBI; PstI; SpeI; NsiI; Bsu361; NheI; und HpaI. Noch wünschenswerter umfasst der Polylinker zumindest vier dieser Stellen.
  • Vorzugsweise sind zumindest einige der Restriktionsstellen, die in den Polylinker eingebunden sind, im Rest der Nucleinsäure, in die er inkorporiert wird, nicht vorhanden. Wünschenswerterweise sind zumindest manche der Stellen, die in den Polylinker eingebunden sind, für natürlich vorkommende Nucleinsäuresequenzen, die für reduktive Enzyme oder andere (vorzugsweise Typ-I-) PKSs kodieren, unüblich oder in diesen nicht vorhanden. Es ist wünschenswert, dass zumindest zwei der Stellen in zumindest etwa der Hälfte, noch wünschenswerter zumindest etwa drei Vierteln, bekannter Nucleinsäuresequenzen, die für reduktive Enzyme von PKSs kodieren, nicht vorhanden sind. Vorzugsweise sind die Restriktionsstellen reich an A- und T-Resten, da PKS-Gene dazu neigen, reich an G- und C-Resten zu sein.
  • Wünschenswerterweise kodieren die Nucleinsäuren der Erfindung für ein Ladungsmodul und/oder ein oder mehrere Erweiterungsmodule. Weitere Details bezüglich Varianten von Ladungsmodulen können in der gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung mit dem Titel "Polyketides and their synthesis" (Polyketide und ihre Synthese), eingereicht am 29. Juni 1999, gefunden werden.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Nucleinsäure im Allgemeinen wie oben angegeben bereit, die jedoch weitere Nucleinsäure aufweist, die für ein oder mehrere reduktive Enzyme (z.B. KR und/oder DH und/oder ER), die in den Polylinker insertiert sind, kodiert. Die insertierte Nucleinsäure kann für ein oder mehrere reduktive Enzyme derselben Polyketidsynthase wie jene der Nucleinsäure, in die der Polylinker insertiert wird, jedoch aus einem anderen Erweiterungsmodul, kodieren. Alternativ dazu kann die insertierte Nucleinsäure exogen sein und für ein oder mehrere reduktive Enzyme aus einer anderen natürlichen PKS oder Fettsäuresynthase kodieren, oder sie kann synthetisch sein oder kann aus einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure mutiert sein, die für ein oder mehrere reduktive Enzyme einer PKS oder Fettsäuresynthase kodiert. Vorzugsweise kodiert die insertierte Nucleinsäure für ein oder mehrere reduktive Enzyme aus derselben oder einer anderen Typ-I-PKS oder -Fettsäuresynthase, alternativ dazu kann sie jedoch für ein oder mehrere reduktive Enzyme aus einer Typ-II-PKS oder -Fettsäuresynthase kodieren.
  • Die für zahlreiche Beispiele von Typ-I-PKSs kodierenden Gene wurden sequenziert, und diese Sequenzen wurden in öffentlich zugänglichen DNA- und Protein-Sequenz-Datenbanken, einschließlich GenBank, EMBL und SwissProt, offenbart. Die Sequenzen sind beispielsweise für die PKSs erhältlich, die die Synthese von unter anderem Erythromycin (J. Cortes et al., Nature 348, 176-178 (1990), Zugriffsnummer X62569; S. Donadio et al., Science 252, 675-679 (1991), Zugriffsnummer M63677); Rapamycin (T. Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995), Zugriffsnummer X86780); Rifamycin (August et al. (1998), Zugriffsnummer AF040570); bzw. Tylosin (Eli Lily, Zugriffsnummer U78289) steuern. Weiters zeigt 7 hierin die für die ersten zwei Module der Avermectin-PKS aus S. avermitilis kodierenden Nucleinsäuresequenz; diese kann als eine alternative Quelle für die in gewissen Beispielen eingesetzten Inserts verwendet werden.
  • Fachleuten wird es ersichtlich sein, dass die gesamte Sequenzähnlichkeit zwischen den für vergleichbare Domänen oder Module verschiedener Typ-I-PKSs kodierenden Nucleinsäuren ausreichend hoch und die Domänenorganisation verschiedener Typ-I-PKSs somit unter verschiedenen Polyketid-produzierenden Mikroorganismen konsistent ist, dass die Verfahren zur Gewinnung neuer Hybridpolyketide, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, im Allgemeinen auf alle natürlichen modularen Typ-I-PKSs oder ihre Derivate anwendbar sind.
  • In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Vektoren wie Plasmide oder Phagen (vorzugsweise Plasmide), einschließlich Nucleinsäuren, wie in den obigen Aspekten definiert, und Wirtszellen (insbesondere von Streptomyces-Spezies), die mit solchen Nucleinsäuren oder Konstrukten transfiziert sind, bereit.
  • In wiederum einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Polyketidsynthasen bereit, die durch Wirtszellen wie oben definiert exprimierbar sind. Solche Polyketidsynthasen können, sofern erwünscht, aus den Wirtszellen mittels Routineverfahren isoliert werden, wobei jedoch üblicherweise bevorzugt wird, dass dies nicht geschieht.
  • In weiteren Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zur Schaffung neuer funktioneller PKSs und Nucleinsäuren, die dafür kodieren, mittels Insertion von Nucleinsäure, die für reduktive Enzyme kodiert, in Polylinker wie oben angegeben; sowie neue Polyketide, die von solchen PKSs produziert werden, bereit.
  • In wiederum einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Verfahren für die spezifische oder präferenzielle Produktion bestimmter Polyketide unter Verwendung der wie in den obigen Aspekten definierten Materialien und Verfahren bereit. Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise Herstellungsverfahren durch direkte Fermentation von C22-C33-Dihydroavermectinen, wie beispielsweise Ivermectin (siehe z.B. die Beispiele 25 und 26), und von B1-Avermectinen, die im Wesentlichen frei von B2-Avermectinen sind (siehe z.B. die Beispiele 27 und 28), bereit.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung neue Polyketide und neue Stereoisomere von Polyketiden, wie beispielsweise bestimmte Polyketide, die gemäß einem oder mehreren der Beispiele hergestellt werden, bereit.
  • Um den Austausch der reduktiven Schleife in Modul 2 des Erythromycin-PKS-Gens im DEBS1TE-System (J. Cortes et al., 268, 1487-1489 (1995)) zu ermöglichen, wurde ein Polylinker (Mehrfachklonierstelle (mcs)) anstelle der reduktiven Schleife von Modul 2 insertiert, wodurch ein minimales Modul gebildet wurde, das eine KS, eine AT und eine ACP enthielt. (Dieses System ist stets funktionell und produziert ein Ketolacton (siehe Beispiele 2 und 4).) Die mcs enthält einmalige Erkennungsstellen für 9 Restriktionsenzyme.
  • Diese neuen Restriktionsstellen sind teilweise in der DNA, die für eine Linkerregion kodiert, in der Nähe von Positionen, an denen die Polyketidsynthase durch proteolytische Enzyme hydrolysiert wird (s.o.), angeordnet. Während manche der Restriktionsstellen in DNA angeordnet sind, die für Regionen mit geringer Homologie kodiert, liegen andere in DNA, die für hochkonservierte Regionen kodiert (1). Das Einführen der Erkennungsstellen für die Enzyme AvrII, BgIII, Bsu36I und NheI verändert die Aminosäuresequenz im DEBS-Modul 2 nicht. In den fünf anderen Fällen (SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, HpaI) wird die Aminosäuresequenz verändert (2). Diese Veränderungen beeinflussen die Aktivität des Proteins nicht (siehe Beispiel 6).
  • Da zwei der Restriktionsstellen dieselben Basen abdecken, wurde beschlossen, zwei Plasmide zu konstruieren, die verschiedene mcs aufweisen (pJLK114 und pJLK117).
  • Die Verwendung einer mcs bietet die folgenden Vorteile gegenüber einer einzelnen Restriktionsstelle an jeder Seite der reduktiven Schleife:
    • 1) geeignete Positionen, um die DNA-Fragmente zu verbinden (20 verschiedene Kombinationen), können für jede unterschiedliche reduktive Schleife ausgewählt werden, wodurch ungünstige Veränderungen in der Aminosäuresequenz vermieden werden
    • 2) Enzyme, die innerhalb der Schleife schneiden, können vermieden werden; und
    • 3) Schleifeninsertion kann auf kombinatorische Weise erfolgen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Beschreibung machten weiters die überraschende Entdeckung, dass verschiedene Resultate unter Verwendung derselben Polylinkerhältigen Nucleinsäure und derselben Nucleinsäure, die für ein oder mehrere reduktive Enzyme kodiert, erzielt werden können, wenn die für ein oder mehrere reduktive Enzyme kodierende Nucleinsäure an verschiedenen Stellen im Polylinker insertiert wird.
  • In den Beispielen 7 und 8 beispielsweise wurde die reduktive Schleife des Rapamycin-Moduls 13 in ery-Modul 2 insertiert, um vollständige Reduktion der Polyketidkette als Resultat des zweiten Erweiterungsmoduls zu erlangen. Die erwünschten Triketidlactonprodukte wurden mit guter Ausbeute erhalten. In den Beispielen 37 und 38 jedoch wurde dieselbe reduktive Schleife, oder Reihe von Domänen, aus rap-Modul 13 in im Wesentlichen dieselbe Position in ery-Modul 2 wie in den Beispielen 7 und 8 insertiert, abgesehen davon, dass andere Restriktionsstellen des Polylinkers verwen det (AvrII und HpaI anstelle von BgIII und NsiI) und signifikante Mengen an Nebenprodukten erhalten wurden. Solche Nebenprodukte umfassten Triketidlactone, in denen C-3 entweder Keto oder Hydroxy waren, was zeigt, dass ein einfaches Ändern der Stellen, verwendet zum Austausch der reduktiven Schleife, den Unterschied zwischen der Gewinnung des erwünschten Produkts und der Gewinnung eines nicht wünschenswerten Gemisches aus dem erwünschten Produkt und den Produkten unvollständiger Reduktion ausmacht.
  • In ähnlicher Weise wurde in den Beispielen 31 und 32, wenn die Stellen PstI und Bsu36I verwendet wurden, um die reduktiven Domänen von Avermectin-Modul 1 (Plasmid pGMS2) anstelle der reduktiven Schleife von ery-Modul 2 zu insertieren, das erwartete Produkt gebildet, aber auch eine wesentliche Menge an Ketolacton. Im Versuch der Beispiele 29 und 30 wurde, wenn die Stellen BgIII und NheI verwendet wurden (Plasmid pJLK30), kaum ein Ketolacton-Nebenprodukt gebildet, auch wenn die Mengen an Lacton in jedem Fall in einem ähnlichen Bereich lagen.
  • Wurden, exakt analog zu den Beispielen 29 und 30, in Beispiel 14 dieselben Stellen BgIII und NheI verwendet, um die reduktive Schleife von ery-Modul 2 durch die reduktive Schleife von Tylosin-Modul 1 (Plasmid pJLK35) zu ersetzen, so wurden dieselben Target-Triketidlactone wie in den Beispielen 30 und 32 gebildet, dies aber bei einer viel höheren Ausbeute, auch wenn eine gewisse Menge an Ketolacton vorhanden war, was zeigt, dass verschiedene reduktive Schleifen auf äußerst günstige Weise in verschiedene Restriktionsstellen insertiert werden können.
  • In den Beispielen 33 und 34, in denen die Stellen BgIII und NheI verwendet wurden, um die reduktiven Domänen von Avermectin-Modul 2 (Plasmid pJLK31) zu insertieren, wurden die erwarteten Produkte als die Hauptprodukte produziert. Im Versuch der Beispiele 35 und 36, als die Stellen SnaBI und Bsu36I verwendet wurden (Plasmid pGMS4), konnten nur Spurenmengen eines Triketidlactongemisches gewonnen werden.
  • Somit bietet die vorliegende Erfindung, sollten die erwünschten und vorhergesagten Produkte nicht erhalten werden, wenn eine bestimmte reduktive Schleife in eine bestimmte PKS insertiert wird, die Gelegenheit zu einer einfachen Anpassung der Insertionsstelle durch die Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme, die Stellen im Polylinker aufweisen. Wie in den obigen Vergleichsbeispielen gezeigt, kann solch eine neuerliche Anpassung das Ergebnis und die Ausbeute von Polyketidsynthese drastisch beeinflussen.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion von Plasmid pJLK114
  • Plasmid pJLK114 ist ein pCJR24-basiertes Plasmid, das ein PKS-Gen enthält, das das ery-Ladungsmodul, das erste und zweite Erweiterungsmodul der ery-PKS und die ery-Kette-abschließende Thioesterase umfasst, außer dass das DNA-Segment zwischen dem Ende der Acyltransferase und dem Anfang der ACP des zweiten ery-Erweiterungsmoduls durch einen synthetischen Oligonucleotidlinker substituiert wurde, der die Erkennungsstellen der folgenden Restriktionsenzyme enthält: AvrII, BgIII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I und HpaI. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (3).
  • Konstruktion von Plasmid pJLK02
  • Das etwa 1,47 kbp umfassende DNA-Fragment des eryAI-Gens von S. erythraea wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' und
    5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3' und Plasmid pNTEP2
    (M. Oliynyk et al., Chemistry and Biology 3, 833-839 (1996); WO 98/01546) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligations gemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK02 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK03
  • Das etwa 1,12 kbp umfassende DNA-Fragment des eryAI-Gens von S. erythraea wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3' und
    5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3' und Plasmid pNTEPH
    als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK03 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK04
  • Plasmid pJLK02 wurde mit PstI und HpaI verdaut, und das 1,47 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK03 ligiert, das mit PstI und HpaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK04 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK05
  • Plasmid pJLK01 (PCT/GB97/01819) wurde mit PstI und AvrII verdaut, und das 460 bp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK04 ligiert, das mit PstI und AvrII verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK05 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK07
  • Plasmid pJLK05 wurde mit ScaI und XbaI verdaut, und Plasmid pNTEP2 wurde mit NdeI und ScaI verdaut, und diese zwei Fragmente wurden mit Plasmid pCJR24 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK07 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK114
  • Die zwei synthetischen Oligonucleotide Plf und Plb (4) wurden in TE-Puffer aufgelöst. 10 μl von jeder Lösung (0,5 nmol/μl) wurden vermischt und 2 min lang auf 65 °C erhitzt und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Plasmid pJLK07 wurde mit AvrII und HpaI verdaut und mit den anellierten Oligonucleotiden ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK114 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 2
  • Verwendung von Plasmid pJLK114 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK114 und die Herstellung von TKL-Derivaten.
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK114 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 (Stamm hinterlegt unter der Nr. NCIMB 40802. WO 98/01546) zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE-Gen integriert hatte. JC2/pJLK114 wurde auf SM3-Agar ausplattiert (5,0 g Glucose, 50,0 g MD30E Maltodextrin, 25,0 g Arkasoy-Sojamehl, 3,0 g Melasse (Bete), 0,25 g K2HPO4, 2,5 g CaCO3, 22,0 g Agar, destilliertes Wasser auf 1 Liter, pH 7,0), der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (500 μl) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden als (4S,5R)-5-Hydroxy-2,4-dimethyl-3-oxo-n-hexylsäure-δ-lacton und als (4S,5R)-5-Hydroxy-2,4-dimethyl-3-oxo-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00140001
  • Beispiel 3
  • Konstruktion von Plasmid pJLK117
  • Plasmid pJLK117 ist ein pCJR24-basiertes Plasmid, das ein PKS-Gen enthält, das das ery-Ladungsmodul, das erste und zweite Erweiterungsmodul der ery-PKS und die ery-Ketten-abschließende Thioesterase umfasst, außer dass das DNA-Segment zwischen dem Ende der Acyltransferase und dem Anfang der ACP des zweiten ery-Erweiterungsmoduls durch einen synthetischen Oligonucleotidlinker substituiert wur de, der die Erkennungsstellen der folgenden Restriktionsenzyme enthält: AvrII, BgIII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I und NheI.
  • Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (3).
  • Konstruktion von Plasmid pJLK115
  • Plasmid pJLK114 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das etwa 9,9 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pUC18 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK115 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK116
  • Plasmid pJLK13 (PCT/GB97/01819) wurde mit Bsu36I und XbaI verdaut, und das 1,1 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK115 ligiert, das mit Bsu36I und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK116 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK117
  • Plasmid pJLK116 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das 9,9 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pCJR24 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK117 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 4
  • Die Verwendung von Plasmid pJLK117 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK117 und die Herstellung von TKL-Derivaten
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK117 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK117 wurde auf SM3-Agar, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, ausplattiert und zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (0,5 ml) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden als (4S,5R)-5-Hydroxy-2,4-dimethyl-3-oxo-n-hexylsäure-δ-lacton und als (4S,5R)-5-Hydroxy-2,4-dimethyl-3-oxo-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00160001
  • Beispiel 5
  • Konstruktion von Plasmid pJLK25
  • Plasmid pJLK25 ist ein pJLK114-basiertes Plasmid, außer dass das DNA-Fragment, das für die reduktive Schleife des zweiten Moduls des Erythromycin-PKS-Gens kodiert, in die mcs insertiert wurde.
  • Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK118
  • Das etwa 1,4 kbp umfassende DNA-Fragment des eryAI-Gens von S. erythraea, das für die reduktive Schleife aus Modul 2 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-3' und
    5'-TAATGCATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-3' und pNTEP2 als
    Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK118 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK23
  • Plasmid pJLK118 wurde mit SpeI und NsiI verdaut, und das 1,4 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK115 ligiert, das mit SpeI und NsiI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK23 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK25
  • Plasmid pJLK23 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das etwa 11,2 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pCJR24 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK25 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 6
  • Verwendung von Plasmid pJLK25 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK25 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK25 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK25 wurde auf SM3-Agar, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, ausplattiert und zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (0,5 ml) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden (mittels Vergleich mit authentischem Material) als (2R,3S,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,3S,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00180001
  • Beispiel 7
  • Konstruktion von Plasmid pJLK28
  • Plasmid pJLK28 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass das DNA-Fragment, das für die reduktive Schleife von Modul 13 der rap-PKS kodiert, in die mcs insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (5).
  • Konstruktion von Plasmid pJLK120
  • Das etwa 3,2 kbp umfassende DNA-Segment des rapC-Gens von S. hygroscopicus, das für die reduktive Schleife von Modul 13 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-3' und
    5'-TAATGCATCGACCTCGTTGCGTGCCGCGGT-3' und Cosmid cos 31
    (T. Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995)) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK120 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK28
  • Plasmid pJLK120 wurde mit BgIII und NsiI verdaut, und das 3,2 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK117 ligiert, das mit BgIII und NsiI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK28 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 8
  • Verwendung von Plasmid pJLK28 zur Konstruktion von JC2/pJLK28 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK28 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert.
  • Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK28 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (0,5 ml) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden (mittels Vergleich mit authentischem Material) als (2R,4S,5R)-2,4-Dimethyl-5-hydroxy-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,4S,5R)-2,4-dimethyl-5-hydroxy-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00200001
  • Beispiel 9
  • Konstruktion von Plasmid pJLK41
  • Plasmid pJLK41 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass das DNA-Fragment, das für die reduktive Schleife von Modul 4 der ery-PKS kodiert, in die mcs insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (5).
  • Konstruktion von Plasmid pJLK32.3
  • Das etwa 3,2 kbp umfassende DNA-Segment des eryAII-Gens von S. erythraea, das für die reduktive Schleife von Modul 4 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-ATAGATCTGCCTACGTACCCGTTCGAACACCAGCGCTTC-3' und
    5'-ATCCTCAGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGCAGCTT-3'
    und Cosmid cos4B (Cosmid, das die Erythromycin-PKS enthielt) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK32.3 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK38
  • Plasmid pJLK32.3 wurde mit BgIII und Bsu36I verdaut, und das 3,2 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK116 ligiert, das mit BgIII und Bsu36I verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK38 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK41
  • Plasmid pJLK38 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das etwa 13 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pCJR24 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK41 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 10
  • Verwendung von Plasmid pJLK41 zur Konstruktion von JC2/pJLK41 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK41 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK41 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (0,5 ml) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden (mittels Vergleich mit authentischem Material) als (2S,4S,5R)-2,4-Dimethyl-5-hydroxy-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2S,4S,5R)-2,4-Dimethyl-5-hydroxy-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00220001
  • Beispiel 11
  • Konstruktion von Plasmid pJLK29
  • Plasmid pJLK29 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass das DNA-Fragment, das für die reduktive Schleife von Modul 10 der rap-PKS kodiert, in die mcs insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (5).
  • Konstruktion von Plasmid pJLK121.1
  • Das etwa 2,2 kbp umfassende DNA-Segment des rapB-Gens von S. hygroscopicus, das für die reduktive Schleife von Modul 10 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' und
    5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3' und eines etwa 7 kbp umfassenden Fragments, das durch Verdau von Cosmid cos 26 (T. Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995)) mit ScaI und SphI gewonnen wurde, als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK121.1 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK29
  • Plasmid pJLK121.1 wurde mit BgIII und NheI verdaut, und das 2,2 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK117 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK29 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 12
  • Verwendung von Plasmid pJLK29 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK29 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK29 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK29 wurde verwendet, um 30 ml SM3-Medium, das 5 mg/ml Thiostrepton enthielt, in einem 250-ml-Kolben mit einer einzelnen Feder, um Klumpung gering zu halten, geschüttelt bei 300 U/min und bei 30 °C, zu inokulieren. Nach 8 Tagen wurde das Nährmedium zentrifugiert, der Überstand wurde auf pH 3 eingestellt und dreimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen entfernt und der Rückstand in Methanol aufgelöst und mittels HPLC und Elektrospray-Massenspektroskopie und, nach Umsetzung zu Methylester mit Trimethylsilyldiazomethan, durch GC/MS analysiert. Die Hauptprodukte wurden (mittels Vergleich mit authentischem Material) als (4S,5R)-5-Hydroxy-2,4-dimethyl-n-hex-2-ensäure und als (4S,5R)-S-Hydroxy-2,4-dimethyl-n-hept-2-ensäure identifiziert.
  • Figure 00240001
  • Beispiel 13
  • Konstruktion von Plasmid pJLK35
  • Plasmid pJLK35 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass das DNA-Fragment, das für die reduktive Schleife von Modul 1 der Tylosin-PKS kodiert, in die mcs insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (5).
  • Konstruktion von Plasmid pJLK33.1
  • Das etwa 1,6 kbp umfassende DNA-Segment des Tylosin-PKS-Gens von S. fradiae, das für die reduktive Schleife von Modul 1 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TAAGATCTCCCTACGTACCCCTTCAACCAC-3' und
    5'-GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-3' und Cosmid 6T (Cosmid, das die Tylosin-produzierenden PKS-Gene enthält) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK33.1 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK35
  • Plasmid pJLK33.1 wurde mit BgIII und NheI verdaut, und das 1,6 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK117 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK35 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 14
  • Verwendung von Plasmid pJLK35 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK35 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK35 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot- Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK35 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (0,5 ml) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden (mittels Vergleich mit authentischem Material) als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00260001
  • Beispiel 15
  • Konstruktion von Plasmid pRIF7
  • Plasmid pRIF7 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass das DNA-Fragment, das für die reduktive Schleife von Modul 7 der Rifamycin-PKS kodiert, in die mcs insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (5).
  • Konstruktion von Plasmid pUCRIF7
  • Das etwa 2,1 kbp umfassende DNA-Segment des Rifamycin-PKS-Gens von Amycolatopsis mediterranei, das für die reduktive Schleife von Modul 7 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-3' und
    5'-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT und Cosmid 6 (Cosmid, das bei 35727 beginnt und bis über 76199 hinaus reicht, Nummern gemäß Zugriffsnummer AF040570) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pUCRIF7 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pRIF7
  • Plasmid pUCRIF7 wurde mit SnaBI und NheI verdaut, und das 2,1 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK117, das mit SnaBI und NheI verdaut worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurde auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das gewünschte Plasmid pRIF7 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 16
  • Verwendung von Plasmid pRIF7 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pRIF7 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 μg Plasmid pRIF7 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pRIF7 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Amei sensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden (mittels Vergleich mit authentischem Material) als (2S,3S,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert.
  • Figure 00280001
  • Beispiel 17
  • Konstruktion von Plasmid pJLK52
  • Plasmid pJLK52 ist ein pJLK35-basiertes Plasmid, das ein PKS-Gen enthält, das das ery-Ladungsmodul, das erste, das zweite und das dritte Erweiterungsmodul des ery-Clusters und die ery-Ketten-abschließende Thioesterase umfasst, außer dass das DNA-Segment zwischen dem Ende der Acyltransferase und dem Anfang der ACP des zweiten ery-Erweiterungsmoduls durch das äquivalente Segment aus Modul 1 der Tylosin-PKS substituiert wurde.
  • Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK50
  • Das etwa 6,1 kbp umfassende DNA-Segment des Erythromycin-PKS-Genclusters von S. erythraea, das für das DNA-Fragment kodiert, das vom Anfang der ACP aus Modul 2 bis zum Anfang der ACP aus Modul 3 reicht, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' und
    5'-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3' und Plasmid pBAM25
    als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK50 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK52
  • Plasmid pJLK50 wurde mit NheI verdaut, und das 6,1 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK35 ligiert, das mit NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK52 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 18
  • Verwendung von Plasmid pJLK52 zur Konstruktion von S. erythraea NRRL2338/pJLK52 und die Herstellung von Tetraketiden und Makroliden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK52 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea NRRL2338 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte.
  • S. erythraea NRRL2338/pJLK52 wurde verwendet, um SM3-Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, zu inokulieren, und wurde sieben bis zwölf Tage lang bei 28- 30 °C wachsen gelassen. Nach diesem Zeitraum wurde das Nährmedium zentrifugiert, und der pH der Überstandes wurde auf pH 9,5 eingestellt. Der Überstand wurde dann dreimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS, HPLC/MS und MS-MS analysiert. Tetraketide wurden mittels GC/MS identifiziert. Die Hauptkomponenten waren
    Figure 00300001
  • Das folgende Makrolid wurde mittels HPLC/MS, MS-MS und 1H-NMR identifiziert (es wurde zusammen mit Produkten unvollständiger Verarbeitung durch Post-PKS-Enzyme gefunden).
  • Figure 00300002
  • Beispiel 19
  • Konstruktion von Plasmid pJLK53
  • Plasmid pJLK53 ist ein pJLK28-basiertes Plasmid, das ein PKS-Gen enthält, das das ery-Ladungsmodul, das erste, das zweite und das dritte Erweiterungsmodul des ery-Clusters und die ery-Ketten-abschließende Thioesterase umfasst, außer dass das DNA-Segment zwischen dem Ende der Acyltransferase und dem Anfang der ACP des zweiten ery-Erweiterungsmoduls durch das äquivalente Segment aus Modul 13 der Rapamycin-PKS substituiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert.
  • Plasmid pJLK50 wurde mit NheI verdaut, und das 6,1 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK28 ligiert, das mit NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK53 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 20
  • Verwendung von Plasmid pJLK53 zur Konstruktion von S. erythraea NRRL2338/pJLK53 und die Herstellung von TKL-Derivaten
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK53 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea NRRL2338 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte.
  • S. erythraea NRRL2338/pJLK53 wurde verwendet, um SM3-Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, zu inokulieren, und wurde sieben bis zehn Tage lang bei 28-30 °C wachsen gelassen. Nach diesem Zeitraum wurde das Nährmedium zentrifugiert, und der pH der Überstandes wurde auf pH 9,5 eingestellt. Der Überstand wurde dann dreimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS, HPLC/MS und MS-MS analysiert. Tetraketide wurden mittels GC/MS identifiziert. Die Hauptkomponente war
    Figure 00320001
  • Das folgende Makrolid wurde mittels HPLC/MS, MS-MS und 1H-NMR identifiziert (es wurde zusammen mit Produkten unvollständiger Verarbeitung durch Post-PKS-Enzyme gefunden).
  • Figure 00320002
  • Beispiel 21
  • Konstruktion von Plasmid pJLK54
  • Plasmid pJLK54 ist ein pJLK29-basiertes Plasmid, das ein PKS-Gen enthält, das das ery-Ladungsmodul, das erste, das zweite und das dritte Erweiterungsmodul des ery-Clusters und die ery-Ketten-abschließende Thioesterase umfasst, außer dass das DNA-Segment zwischen dem Ende der Acyltransferase und dem Anfang der ACP des zweiten ery-Erweiterungsmoduls durch das äquivalente Segment aus Modul 10 der Rapamycin-PKS substituiert wurde. Es wurde wie folgt konstruiert.
  • Plasmid pJLK50 wurde mit NheI verdaut, und das 6,1 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK29 ligiert, das mit NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK54 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 22
  • Verwendung von Plasmid pJLK54 zur Konstruktion von S. erythraea NRRL2338/pJLK54 und die Herstellung von Tetraketid-Derivaten und Makroliden
  • Etwa 5 μg Plasmid pJLK54 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea NRRL2338 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte.
  • S. erythraea NRRL2338/pJLK54 wurde verwendet, um SM3-Medium, das 5 μg/ml Thiostrepton enthielt, zu inokulieren, und wurde sieben bis zwölf Tage lang bei 28-30 °C wachsen gelassen. Nach diesem Zeitraum wurde das Nährmedium zentrifugiert, und der pH der Überstandes wurde auf pH 9,5 eingestellt. Der Überstand wurde dann dreimal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel durch Abdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS, HPLC/MS und MS-MS analysiert. Tetraketide wurden mittels GC/MS identifiziert. Die Hauptkomponente war
    Figure 00330001
  • Das folgende Makrolid wurde durch HPLC/MS, MS-MS und 1H-NMR identifiziert (es wurde zusammen mit Produkten unvollständiger Verarbeitung durch Post-PKS-Enzyme gefunden).
  • Avermectine
    Figure 00340001
  • Beispiel 23
  • Konstruktion von pJLK136
  • Plasmid pJLK136 ist ein pWHM3-basiertes Plasmid, das die flankierende Stromauf- und Stromab-Region der reduktiven Schleife aus Modul 2 des Avermectin-PKS-Gens und des Erythromycin-Resistenzgens in die mcs insertiert aufweist, die diese zwei Fragmente miteinander verbindet. Plasmid pWHM3 wird von J. Vara et al. in: J. Bacteriol. 171, 5872-5881 (1989), beschrieben. Plasmid pJLK136 wurde über mehrere Zwischenplasmide wie folgt konstruiert (6).
  • Konstruktion von pJLK130
  • Das etwa 2,4 kbp umfassende DNA-Segment des Avermectin-PKS-Gens von S. avermitilis, das für die Region stromauf der reduktiven Schleife aus Modul 2 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-GACGCCGAATTCTTCGGCATCAGCCCCCGCGAAG-3' und
    5'-GAGCTAGCAGGTGGGGAGATCTAGGTGGGTGTGGGTGTGGGGTTGGTTGTG GTGGTG-3' und Plasmid pIG22 (I. S. Galloway, Dissertation, University of Cambridge, GB (1998)) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ih ren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK130 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von pJLK131
  • Das etwa 2,0 kbp umfassende DNA-Segment des Avermectin-PKS-Gens von S. avermitilis, das für die Region stromab der reduktiven Schleife aus Modul 2 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-3' und
    5'-GGGAATTCCTCGAGGATGACGTGGGCGTTGGTGC-3' und Plasmid pIG25 (I. S. Galloway, Dissertation, University of Cambridge, GB (1998)) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK131 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK132
  • Plasmid pJLK130 wurde mit NheI und XbaI verdaut, und das etwa 2,4 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK131 ligiert, das mit NheI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK132 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK133
  • Plasmid pJLK117 wurde mit BgIII und NheI verdaut, und das etwa 0,1 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK132 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK133 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von pJLK134
  • Das etwa 1,9 kbp umfassende DNA-Segment des Erythromycin-Genclusters von S. erythraea, das für die Erythromycinresistenz kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-3' und
    5'-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGTCCGCCG-3' und Plasmid pRH3 (N. Dhillon et al., Molecular Microbiology 3, 1405-1414 (1989)) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK134 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK135
  • Plasmid pJLK134 wurde mit BgIII und NheI verdaut, und das etwa 1,9 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK133 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK135 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK136
  • Plasmid pJLK135 wurde mit EcoRI verdaut, und das etwa 6,3 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pWHM3 ligiert, das mit EcoRI verdaut worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK136 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 24
  • Verwendung von Plasmid pJLK136
  • Etwa 10 μg Plasmid pJLK136 wurden verwendet, um Protoplasten von S. avermitilis (D.J. MacNeil & C.M. Klapko, Journal of Industrial Microbiology 2, 209-218 (1987)) zu transformieren, und stabile, Thiostrepton- und Erythromycin-resistente Kolonien wurden isoliert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und viermal in nichtselektivem flüssigem Medium subkultiviert, woraufhin die Herstellung und Regeneration von Protoplasten folgte (Medium gemäß T. MacNeil et al., J. Bacteriol. 175, 2552-2563 (1993)). Thiostrepton-empfindliche und Erythromycin-resistente Kolonien wurden isoliert und mittels Southern-Blot-Hybridisierung charakterisiert. Eine solche Kolonie wurde als S. avermitilis/JLK1 bezeichnet.
  • Beispiel 25
  • Konstruktion von Plasmid pJLK137
  • Plasmid pJLK120 wurde mit BgIII und NsiI verdaut, und das etwa 3,2 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pJLK133 ligiert, das mit BgIII und NsiI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt ü berprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK137 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK138
  • Plasmid pJLK137 wurde mit EcoRI verdaut, und das etwa 7,6 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pWHM3 ligiert, das mit EcoRI verdaut worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK138 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 26
  • Verwendung von Plasmid pJLK138
  • Etwa 10 μg Plasmid pJLK138 wurden verwendet, um Protoplasten von S. avermitilis (D.J. MacNeil & C.M. Klapko, Journal of Industrial Microbiology 2, 209-218 (1987)) zu transformieren, und stabile, Thiostrepton- und Erythromycin-resistente Kolonien wurden isoliert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und viermal in nichtselektivem flüssigem Medium subkultiviert, woraufhin die Herstellung und Regeneration von Protoplasten folgte (Medium gemäß T. MacNeil et al., J. Bacteriol. 175, 2552-2563 (1993)). Thiostrepton- und Erythromycin-empfindliche Kolonien wurden isoliert und mittels Southern-Blot-Hybridisierung charakterisiert. Eine Kolonie von S. avermitilis/pJLK138 wurde verwendet, um flüssiges Medium zu inokulieren (Fermentation gemäß C-H. Pang et al., J. of Antibiotics 48, 59-66 (1995)). Die Kulturen wurden geerntet, und die Produkte wurden wie in der Literatur beschrieben isoliert und gereinigt (C-H. Pang et al., J. of Antibiotics 48, 59-66 (1995)). Die Produkte wurden durch HPLC/MS und 1H-NMR analysiert, und die folgende Verbindung konnte identifiziert werden:
    Figure 00390001
  • Beispiel 27
  • Konstruktion von Plasmid pJLK139
  • Plasmid pJLK121.1 wurde mit BgIII und NheI verdaut, und das 2,2 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK133 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK139 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK140
  • Plasmid pJLK139 wurde mit EcoRI verdaut, und das etwa 6,6 kbp umfassende Insert wurde mit Plasmid pWHM3 ligiert, das mit EcoRI verdaut worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK140 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 28
  • Verwendung von Plasmid pJLK140
  • Etwa 10 μg Plasmid pJLK140 wurden verwendet, um Protoplasten von S. avermitilis (D.J. MacNeil & C.M. Klapko, Journal of Industrial Microbiology 2, 209-218 (1987)) zu transformieren, und stabile, Thiostrepton- und Erythromycin-resistente Kolonien wurden isoliert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und viermal in nichtselektivem flüssigem Medium subkultiviert, woraufhin die Herstellung und Regeneration von Protoplasten folgte (Medium gemäß T. MacNeil et al., J. Bacteriol. 175, 2552-2563 (1993)). Thiostrepton- und Erythromycin-empfindliche Kolonien wurden isoliert und mittels Southern-Blot-Hybridisierung charakterisiert. Eine Kolonie von S. avermitilis/pJLK140 wurde verwendet, um flüssiges Medium zu inokulieren (Fermentation gemäß C-H. Pang et al., J. of Antibiotics 48, 59-66 (1995)). Die Kulturen wurden geerntet, und die Produkte wurden wie in der Literatur beschrieben isoliert und gereinigt (C-H. Pang et al., J. of Antibiotics 48, 59-66 (1995)). Die Produkte wurden durch HPLC/MS und 1H-NMR analysiert, und die folgende Verbindung konnte identifiziert werden:
    Figure 00400001
  • Beispiel 29
  • Konstruktion von Plasmid pJLK30
  • pJLK30 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass die für die reduktive Schleife aus Modul 1 der Avermectin-PKS kodierende DNA in den Polylinker unter Verwendung der Restriktionsstellen BgIII und NheI insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pIG67
  • Das etwa 1,7 kbp umfassende DNA-Segment des Gens der Avermectin-PKS aus S. avermitilis, das für die reduktive Schleife aus Modul 1 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-3' und
    5'-TGGGCTAGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGTG-3' und entweder Plasmid pIG155, das die ersten zwei Module der Avermectin-PKS, kloniert in Plasmid pT7-7, enthält, oder chromosomaler DNA aus Streptomyces avermitilis als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pIG67 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK30
  • Plasmid pIG67 wurde mit BgIII und NheI verdaut, und das 1,7 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK117 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK30 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 30
  • Verwendung von Plasmid pJLK30 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK30 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 mg Plasmid pJLK30 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. S. erythraea JC2/pJLK30 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 mg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und abgedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert (insgesamt 25 mg/l). Beinahe nichts vom entsprechenden 3-Ketolacton konnte nachgewiesen werden.
  • Beispiel 31
  • Konstruktion von Plasmid pGMS2
  • pGMS2 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass die für die reduktive Schleife aus Modul 1 der Avermectin-PKS kodierende DNA in den Polylinker unter Verwendung der Restriktionsstellen PstI und Bsu36I insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pIG68
  • Das etwa 1,7 kbp umfassende DNA-Segment des Gens der Avermectin-PKS aus S. avermitilis, das für die reduktive Schleife aus Modul 1 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TGGCTGCAGAGCTCACAGCCGGGTGCCGGATCCGGTT-3' und
    5'-TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-3' und entweder Plasmid pIG155, das die ersten zwei Module der Avermectin-PKS, kloniert in Plasmid pT7-7, enthält, oder chromosomaler DNA aus Streptomyces avermitilis als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünsch te Plasmid pIG68 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pGMS1
  • Plasmid pIG68 wurde mit PstI und Bsu36I verdaut, und das 1,7 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK116 ligiert, das mit PstI und Bsu36I verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pGMS1 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pGMS2
  • Plasmid pGMS1 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das 11,5 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pCJR24 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pGMS2 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 32
  • Verwendung von Plasmid pGMS2 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pGMS2 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 mg von Plasmid pGMS2 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. S. erythraea JC2/pGMS2 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 μg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelas sen. 1 cm2 der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und abgedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Produkte wurden als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert (insgesamt 17 mg/l), und auch eine wesentliche Menge des entsprechenden 3-Ketolactons konnte nachgewiesen werden (5,5 mg/l).
  • Figure 00440001
  • Beispiel 33
  • Konstruktion von Plasmid pJLK31
  • pJLK31 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass die für die reduktive Schleife aus Modul 2 der Avermectin-PKS kodierende DNA in den Polylinker unter Verwendung der Restriktionsstellen BgIII und NheI insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pIG69
  • Das etwa 2,4 kbp umfassende DNA-Segment des Gens der Avermectin-PKS aus S. avermitilis, das für die reduktive Schleife aus Modul 2 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCACTACTG-3' und
    5'-CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-3' und entweder Plasmid pIG155, das die ersten zwei Module der Avermectin-PKS, kloniert in Plasmid pT7-7, enthält, oder chromosomaler DNA aus Streptomyces avermitilis als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pIG69 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK31
  • Plasmid pIG69 wurde mit BgIII, NheI und DraI verdaut, und das 2,4 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK117 ligiert, das mit BgIII und NheI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK31 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 34
  • Verwendung von Plasmid pJLK31 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pJLK31 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 mg von Plasmid pJLK31 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. S. erythraea JC2/pJLK31 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 mg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethyl acetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und abgedampft. Der Rest wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Produkte wurden als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,3R,4S,5R)-5,3-Dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert (insgesamt 30 mg/l).
  • Figure 00460001
  • Beispiel 35
  • Konstruktion von Plasmid pGMS4
  • pGMS4 ist ein pJLK117-basiertes Plasmid, außer dass die für die reduktive Schleife aus Modul 2 der Avermectin-PKS kodierende DNA in den Polylinker unter Verwendung der Restriktionsstellen SnaBI und Bsu36I insertiert wurde. Es wurde über mehrere Zwischenplasmide konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pIG70
  • Das etwa 2,4 kbp umfassende DNA-Segment des Gens der Avermectin-PKS aus S. avermitilis, das für die reduktive Schleife aus Modul 2 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-3' und
    5'-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-3' und entweder Plasmid pIG155, das die ersten zwei Module der Avermectin-PKS, kloniert in Plasmid pT7-7, enthält, oder chromosomaler DNA aus Streptomyces avermitilis als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und an schließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pIG70 wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pGMS3
  • Plasmid pIG70 wurde mit SnaBI, Bsu36I und DraI verdaut, und das 2,4 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK116 ligiert, das mit SnaBI und Bsu36I verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pGMS3 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pGMS4
  • Plasmid pGMS2 wurde mit NdeI und XbaI verdaut, und das etwa 12,4 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pCJR24 ligiert, das mit NdeI und XbaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pGMS4 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 36
  • Verwendung von Plasmid pGMS4 zur Konstruktion von S. erythraea JC2/pGMS4 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 mg von Plasmid pGMS4 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. S. erythraea JC2/pGMS4 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 mg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und abgedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Nur Spuren von mutmaßlichen Triketidprodukten wurden nachgewiesen.
  • Beispiel 37
  • Konstruktion von Plasmid pJLK27
  • Plasmid pJLK27 ist ein pJLK114-basiertes Plasmid, außer dass das für die reduktive Schleife aus Modul 13 der rap-PKS kodierende DNA-Fragment in die mcs insertiert wurde. Es wurde wie folgt über mehrere Zwischenplasmide konstruiert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK120a
  • Das etwa 3,2 kbp umfassende DNA-Segment des rapC-Gens aus S. hygroscopius, das für die reduktive Schleife aus Modul 13 kodiert, wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide als Primer:
    5'-TACCTAGGCACCACCACAACCCGGGTA-3' und
    5'-TACAATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-3' und Cosmid cos 31 (T. Schwecke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843 (1995)) als Matrix amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polynucleotidkinase behandelt und anschließend mit Plasmid pUC18 ligiert, das durch Verdau mit SmaI linearisiert worden war, und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK120a wurde durch sein Restriktionsmuster und mittels DNA-Sequenzierung identifiziert.
  • Konstruktion von Plasmid pJLK27
  • Plasmid pJLK120a wurde mit AvrII und HpaI verdaut, und das 3,2 kbp umfassende Fragment wurde mit Plasmid pJLK114 ligiert, das mit AvrII und HpaI verdaut worden war. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um elektrokompetente E.-coli-DH10B-Zellen zu transformieren, und einzelne Kolonien wurden auf ihren Plasmidgehalt überprüft. Das erwünschte Plasmid pJLK27 wurde durch sein Restriktionsmuster identifiziert.
  • Beispiel 38
  • Verwendung von Plasmid pJLK27 zur Konstruktion von JC2/pJLK27 und die Herstellung von Triketiden
  • Etwa 5 mg von Plasmid pJLK27 wurden verwendet, um Protoplasten von S. erythraea JC2 zu transformieren, und stabile, Thiostrepton-resistente Kolonien wurden isoliert. Aus mehreren Kolonien wurde Gesamt-DNA gewonnen und mittels Southern-Blot-Hybridisierung analysiert, um zu bestätigen, dass sich das Plasmid in das TE integriert hatte. JC2/pJLK27 wurde auf SM3-Agar ausplattiert, der 50 mg/ml Thiostrepton enthielt, und wurde zwölf Tage lang bei 30 °C wachsen gelassen. 1 cm2 (0,5 ml) der Platte wurde homogenisiert und mit einem Gemisch aus 1,2 ml Ethylacetat und 20 μl Ameisensäure extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und durch Abdampfen entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und mittels GC/MS und Elektrospray-Massenspektroskopie analysiert. Die Hauptprodukte wurden (durch Vergleich mit authentischem Material) als (2R,4S,5R)-2,4-Dimethyl-5-hydroxy-n-hexylsäure-δ-lacton und als (2R,4S,5R)-2,4-Dimethyl-5-hydroxy-n-heptylsäure-δ-lacton identifiziert (insgesamt 41 mg/l), worunter sich einige der ent sprechenden 3-Ketolactone (insgesamt 12 mg/l) und 3-Hydroxylactone (insgesamt 2,8 mg) befanden.
  • Figure 00500001

Claims (22)

  1. Nucleinsäuremolekül, das für zumindest einen Teil einer Polyketidsynthase (PKS) vom Typ I kodiert, wobei dieser Teil zumindest einen Teil eines Erweiterungsmoduls umfasst, worin die Nucleinsäure anstelle von einem oder mehreren Genen dieser PKS, die für mit Reduktion assoziierten Enzyme kodieren, einen Polylinker mit mehreren Restriktionsenzymschnittstellen aufweist.
  2. Nucleinsäure, die für zumindest einen Teil einer Polyketidsynthase (PKS) vom Typ I kodiert, wobei dieser Teil zumindest einen Teil eines Erweiterungsmoduls umfasst, worin die Nucleinsäure einen Polylinker mit mehreren Restriktionsenzymschnittstellen aufweist, wobei der Polylinker Nucleinsäure, die für zumindest einen Teil eines Acyltransferase-Enzyms der PKS kodiert, mit Nucleinsäure verbindet, die für zumindest einen Teil eines Acylträgerproteins der PKS kodiert.
  3. Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der Polylinker zumindest manche der folgenden Restriktionsschnittstellen umfasst: AvrII; BgIII; SnaBI; PstI; SpeI; NsiI; Bsu361; NheI; und HpaI.
  4. Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, die weiters für ein Lademodul kodiert.
  5. Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, die darüber hinaus für ein oder mehrere weitere Erweiterungsmodule kodiert.
  6. Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche, weiters umfassend eine in den Polylinker eingebaute Nucleinsäuresequenz, worin die eingebaute Nucleinsäure für ein oder mehrere reduzierende Enzyme kodiert.
  7. Nucleinsäure nach Anspruch 6, worin das/die reduzierende(n) Enzym(e) eine β-Ketoreductase, eine Dehydratase und/oder eine Enoylreductase ist/sind.
  8. Nucleinsäure nach Anspruch 7, worin das/die reduzierende(n) Enzym(e) zumindest eine β-Ketoreductase umfasst/umfassen.
  9. Nucleinsäure nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin zumindest ein reduzierendes Enzym von einem anderen Erweiterungsmodul derselben Polyketidsynthase herrührt als der zumindest eine Teil einer Polyketidsynthase vom Typ I.
  10. Vektor, umfassend Nucleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche.
  11. Wirtszelle, die mit Nucleinsäure oder einem Vektor nach einem der vorangehenden Ansprüche transfiziert, transformiert oder konjugiert ist.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 11, die eine Zelle einer Streptomyces-Spezies ist.
  13. Wirtszelle nach Anspruch 12, die eine Zelle von S. erythraea oder S. avermitilis ist.
  14. Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure, die für eine neue Polyketidsynthase kodiert, folgende Schritte umfassend: i. Bereitstellen von Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5; und ii. Einbau einer Nucleinsäuresequenz, die für zumindest ein reduzierendes Enzym kodiert, in die Nucleinsäure.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Nucleinsäuresequenz, die für zumindest ein reduzierendes Enzym kodiert, wie in einem der Ansprüche 6 bis 9 definiert ist.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts, das ein Polyketid enthält, umfassend den Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle nach Anspruch 11.
  17. Fermentationskultur, die ein C22-C23-Dihydroavermectin im Wesentlichen frei von anderen Makroliden und eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, die selbiges direkt produziert, enthält.
  18. Fermentationskultur nach Anspruch 17, worin das Dihydroavermectin Ivermectin ist.
  19. Fermentationskultur, die ein B1-Avermectin im Wesentlichen frei von B2-Avermectinenund eine Wirtszelle nach Anspruch 11 bis 13, die selbiges direkt produziert, enthält.
  20. Verfahren zur Herstellung eines Polyketids, folgende Schritte umfassend: i. Bereitstellen eines aus einem Verfahren nach Anspruch 16 resultierenden Fermentationsprodukts oder einer Fermentationskultur nach einem der Ansprüche 17 bis 19; und ii. zumindest teilweises Reinigen eines Polyketids aus diesem Fermentationsprodukt oder dieser Fermentationskultur; worin das Polyketid ein Avermectin ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Avermectin ein C22-C23-Dihydroavermectin ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Avermectin ein B1-Avermectin ist.
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