CZ200123A3 - Polyketidy, jejich příprava a materiály, které je obsahují - Google Patents
Polyketidy, jejich příprava a materiály, které je obsahují Download PDFInfo
- Publication number
- CZ200123A3 CZ200123A3 CZ200123A CZ200123A CZ200123A3 CZ 200123 A3 CZ200123 A3 CZ 200123A3 CZ 200123 A CZ200123 A CZ 200123A CZ 200123 A CZ200123 A CZ 200123A CZ 200123 A3 CZ200123 A3 CZ 200123A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plasmid
- nucleic acid
- plasmids
- polylinker
- encoding
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 title claims description 27
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 title description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 56
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 claims description 10
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 8
- 101001014220 Monascus pilosus Dehydrogenase mokE Proteins 0.000 claims description 7
- 101000573542 Penicillium citrinum Compactin nonaketide synthase, enoyl reductase component Proteins 0.000 claims description 7
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 102000052553 3-Hydroxyacyl CoA Dehydrogenase Human genes 0.000 claims 2
- 101001045218 Homo sapiens Peroxisomal multifunctional enzyme type 2 Proteins 0.000 claims 2
- 241000032841 Ellisella erythraea Species 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 380
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 77
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 77
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 51
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 48
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 46
- 239000000047 product Substances 0.000 description 42
- 241000187559 Saccharopolyspora erythraea Species 0.000 description 38
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 33
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 33
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 33
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 33
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 28
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 22
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 22
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 19
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 125000000422 delta-lactone group Chemical group 0.000 description 18
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 17
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 17
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 16
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 16
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 14
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 13
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 13
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 12
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 12
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 11
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 10
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 241000634742 Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338 Species 0.000 description 6
- 239000004182 Tylosin Substances 0.000 description 6
- 229930194936 Tylosin Natural products 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 6
- 229960004059 tylosin Drugs 0.000 description 6
- WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N tylosin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@H]1N(C)C)O)O[C@@H]1[C@@H](C)[C@H](O)CC(=O)O[C@@H]([C@H](/C=C(\C)/C=C/C(=O)[C@H](C)C[C@@H]1CC=O)CO[C@H]1[C@@H]([C@H](OC)[C@H](O)[C@@H](C)O1)OC)CC)[C@H]1C[C@@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)O1 WBPYTXDJUQJLPQ-VMXQISHHSA-N 0.000 description 6
- 235000019375 tylosin Nutrition 0.000 description 6
- OKDRUMBNXIYUEO-VHJVCUAWSA-N (2s,3s)-3-hydroxy-2-[(e)-prop-1-enyl]-2,3-dihydropyran-6-one Chemical compound C\C=C\[C@@H]1OC(=O)C=C[C@@H]1O OKDRUMBNXIYUEO-VHJVCUAWSA-N 0.000 description 5
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 5
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- RNNPPCJKHGXSBX-LXGUWJNJSA-N (2r,3r,4s,5r)-3,5-dihydroxy-2,4-dimethylheptanoic acid Chemical compound CC[C@@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)C(O)=O RNNPPCJKHGXSBX-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- HXTSAANQAHLDSZ-BDVNFPICSA-N (2r,3r,4s,5r)-3,5-dihydroxy-2,4-dimethylhexanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)C(O)=O HXTSAANQAHLDSZ-BDVNFPICSA-N 0.000 description 3
- UBWTVULSCRRTFA-RRKCRQDMSA-N (2r,4s,5r)-5-hydroxy-2,4-dimethylhexanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C(O)=O UBWTVULSCRRTFA-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229930189077 Rifamycin Natural products 0.000 description 3
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 3
- 229960003292 rifamycin Drugs 0.000 description 3
- HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N rifamycin SV Chemical compound OC1=C(C(O)=C2C)C3=C(O)C=C1NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@@H](OC)\C=C\O[C@@]1(C)OC2=C3C1=O HJYYPODYNSCCOU-ODRIEIDWSA-N 0.000 description 3
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- HMPIDGXCJUMOQK-UHFFFAOYSA-N CCCC(C)C(O)C(C)C(O)=O Chemical compound CCCC(C)C(O)C(C)C(O)=O HMPIDGXCJUMOQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 2
- ZVILOSWVRVWCKS-REJBHVJUSA-N O[C@@H]([C@@H](C(C(C(=O)O)C)=O)C)CC Chemical compound O[C@@H]([C@@H](C(C(C(=O)O)C)=O)C)CC ZVILOSWVRVWCKS-REJBHVJUSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 101150021072 rapC gene Proteins 0.000 description 2
- -1 rapamycin polyketide Chemical class 0.000 description 2
- ONDSBJMLAHVLMI-UHFFFAOYSA-N trimethylsilyldiazomethane Chemical compound C[Si](C)(C)[CH-][N+]#N ONDSBJMLAHVLMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCUQQFIESOSMIJ-XLPZGREQSA-N (2R,4S,5R)-5-hydroxy-2,4-dimethylheptanoic acid Chemical compound CC[C@@H](O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C(O)=O QCUQQFIESOSMIJ-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- HXTSAANQAHLDSZ-YTLHQDLWSA-N (2S,3S,4S,5R)-3,5-dihydroxy-2,4-dimethylhexanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)C(O)=O HXTSAANQAHLDSZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- HXTSAANQAHLDSZ-WNJXEPBRSA-N (2r,3s,4s,5r)-3,5-dihydroxy-2,4-dimethylhexanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(O)=O HXTSAANQAHLDSZ-WNJXEPBRSA-N 0.000 description 1
- UGGOGEYWDDANNV-NOWQFEBASA-N (4S,5R)-5-hydroxy-2,4-dimethyl-3-oxohexanoic acid Chemical compound O[C@@H]([C@@H](C(C(C(=O)O)C)=O)C)C UGGOGEYWDDANNV-NOWQFEBASA-N 0.000 description 1
- LKGJTWKCPAFFMT-CAHLUQPWSA-N (4s,5r)-5-hydroxy-2,4-dimethylhex-2-enoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C)C=C(C)C(O)=O LKGJTWKCPAFFMT-CAHLUQPWSA-N 0.000 description 1
- AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 22,23-dihydroavermectin B1a Natural products C1CC(C)C(C(C)CC)OC21OC(CC=C(C)C(OC1OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C1)C(C)C=CC=C1C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC1)O)CC4C2 AZSNMRSAGSSBNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- CWGATOJEFAKFBK-UHFFFAOYSA-N Ac-(E)-8-Tridecen-1-ol Natural products C1C(O)C(C)C(C(C)CC)OC11OC(CC=C(C)C(OC2OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C2)C(C)C=CC=C2C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(O)C3OC2)O)CC4C1 CWGATOJEFAKFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700037654 Acyl carrier protein (ACP) Proteins 0.000 description 1
- 102000048456 Acyl carrier protein (ACP) Human genes 0.000 description 1
- 241001468213 Amycolatopsis mediterranei Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187438 Streptomyces fradiae Species 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- ZPAKHHSWIYDSBJ-QDXJZMFISA-N avermectin b2 Chemical compound O1C(C)C(O)C(OC)CC1OC1C(OC)CC(O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)C(O)C4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)OC1C ZPAKHHSWIYDSBJ-QDXJZMFISA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 101150051821 era gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960002418 ivermectin Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 101150018420 kbp gene Proteins 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 101150077825 rapB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Vynález popisuje polyketidy, které je obsahují.
jejich přípravu a materiály,
Dosavadní stav techniky strukturálně různorodou třídu
Polyketidy tvoří velkou a přírodních produktů zahrnující mnoho sloučenin, které mají antibiotické nebo jiné farmakologické vlastnosti, jako tetracyklin, rapamycin, avermektin, FK506.
například erytromycin, polyéterové ionofory, a hojně produkovány bakteriemi rodu
Polyketidy jsou
Streptomyces a příbuznými aktinomycetami. Polyketidy jsou syntetizovány opakovanou postupnou kondenzací acylthioesterů analogickou biosyntéze mastných kyselin. Větší strukturální diverzita počáteční (obvykle) stupněm je jako řetězce různým přírodních polyketidů je dána tím, že jednotka nebo při dalším prodlužování použit acetát nebo propionát; a dále modifikací β-keto skupin po jednotlivých kondenzacích. Příklady těchto modifikací zahrnují redukci na β-hydroxyacylovou skupinu, skpinu,
V každém prodlužování na 2-enoylovou acylthioester. tohoto cyklu specifické stereochemické varianty.
redukci s následnou dehydratací a úplnou redukci na nasycený jednotlivém modifikačním kroku řetězce lze dále rozlišit
Biosyntéza polyketidů je zahájena skupinou vytvářejících základní řetězec molekuly polyketidů. této skupiny se označují jako polyketidsyntázy enzymů
Enzymy (PKS).
aktinomycetách byly popsány polyketidsyntáz. Polyketidy a způsoby podle dvě třídy vynálezu se
-2• ······ ·· • · · · · · ·· · ···· · · ······ · ··· · týkají převážně polyketidsyntáz I. třídy. Do této třídy polyketidsyntáz patří PKS pro makrolidy erytromycin, rapamycin a avermektin. Polyketidsyntázy I. třídy obsahují různou sadu enzymů neboli modul pro každý jednotlivý cyklus prodlužování řetězce polyketidu (viz Cortes, J. a další, Nátuře (1990) 348: strana 176 až 178; Donadio, S. a další, Science (1991) 252: strana 675 až 679; MacNeíl, D. J. a další, Gene (1991) 115: strana all9-125; Schwecke, T. a další, Proč.Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92: strana 7839 až 7843, a dále viz například obrázek 1 v tomto vynálezu, nebo obrázky 2a a 3 ve spise W098/01546). Naproti tomu polyketidsyntázy II. třídy jsou představovány syntézami aromatických sloučenin a mají jen jednu sadu enzymatických aktivit pro prodlužování řetězce polyketidu. Polyketidsyntázy II. třídy jsou opětovně používány v následujících cyklech biosyntézy polyketidu.
Úplný modul katalyzující úplnou redukci ň-ketoskupiny obsahuje doménu s ketoacyl-ACP syntázovou aktivitou (KS) ; acyl-přenášející doménu (ACP, acyl carrier protein); acyl-CoA::ACP acyltransferázu (AT); a ketoreduktázovou (KR) , dehydratázovou (DH) a enoylreduktázovou (ER) doménu pro dokončení modifikace β-keto skupiny. Vzhledem k tomu, že tyto domény vykazují enzymatickou aktivitu, mohou být také dále označovány jako enzymy, nicméně z tohoto označení nijak nevyplývá nic o jejich strukturální příbuznosti s dalšími PKS doménami. Podobně i sekvence nukleových kyselin kódující takové domény mohou být dále označovány jak geny, ač z tohoto označení nevyplývá nic o přítomnosti nebo o oddělení jednotlivých regulačních oblastí pro různé domény PKS.
Vynález popisuje způsoby přípravy polyketidu, využívající náhrady redukční smyčky (reductive loop, segment mezi koncem AT domény a začátkem ACP domény, obsahující buď KR nebo KR a DH nebo KR, DH a ER doménu) ve vybraném modulu
-3genového seskupeni (gene cluster) pro polyketidsyntázu I. třídy, ekvivalentním úsekem ze stejného nebo z jiného genového seskupení PKS, nebo mutovaným nebo syntetickým segmentem. Tímto způsobem vznikne nová hybridní polyketidsyntáza produkující polyketidy s různě redukovanými řetězci a/nebo stereochemickou konformací. Navíc lze výsledný polyketid na základě modifikace PKS predikovat.
Pro vyloučení jakýchkoli pochybností budiž řečeno, že termínem extenzní modul se dále rozumí soubor domén PKS I. třídy, z nichž každá má enzymatickou aktivitu, a které se účastní jednoho cyklu prodlužování řetězce polyketidu. Jmenovitě to znamená, že extenzní modul zahrnuje domény KS, AT a redukční smyčku (obsahující jednu nebo více z domén KR, DH a ER)a nakonec doménu ACP.
V neobvyklých případech může redukční smyčka obsahovat ještě další domény. Například u bakterií yersiniabakter, která má smíšenou polyketidsyntázu a polypeptidsyntázu, se vyskytuje ještě methyltransferázová doména.
Z literatury je známo, že po náhradě redukční smyčky modulu 2 v enzymu DEBS1TE za ekvivalentní úsek modulu 3 erytromycin polyketidsyntázy (PKS I. třídy) vzniká po expresi v buňkách S.coelicolor CH999 (Bedford, D. a další, Chemistry and Biology (1996) 3: strana 827 až 831) triketid ketolakton.
Podobným způsobem při náhradě redukční smyčky modulu 2 v enzymu DEBS1TE ekvivalentním úsekem modulu 5 erytromycin-polyketidsyntázy vznikal po expresi v buňkách S. coelicolor CH999 (McDaniel, R. a další, Chemistry and Biology (1997) 4: strana 667 až 674) triketid laktony s předpokládaným uspořádáním a stereochemickou konformací. Na druhé straně pokud byl stejný experiment proveden na redukční smyčce modulu 6 erytromycin-polyketidsyntázy, byly
izolovány pouze ketolaktony (McDaniel, R. a další, Chemistry and Biology (1997) 4: strana 667 až 674).
V dalším experimentu bylo prokázáno, že redukční smyčka modulu 2 v trojmodulovém systému obsahujícím zaváděcí (loading) doménu, první, druhý a třetí extenzní modul a TE doménu genu ery může být rovněž nahrazena ekvivalentním úsekem modulu 4 rapamycin-polyketidsyntázy obsahující domény KR a DH za vzniku tetraketidu s předpovídanou dvojnou vazbou při expresi v buňkách S. coelicolor CH999 (McDaniel, R. a další. J.Am. Chem. Soc. (1997) 119: strana 4309 až 4310). Ve stejném systému byla redukční smyčka modulu 2 nahrazena ekvivalentním úsekem modulu 1 rapamycin-polyketidsyntázy obsahujícím domény KR, DH a ER za vzniku tetraketidu s předpokládaným stupněm oxidace na uhlíku C-5 při expresi v buňkách S. coelicolor CH999 (Kao, C. M. a další. J.Am. Chem. Soc. (1997) 119: strana 11339 až 11340). Naproti tomu, při použití odpovídajícího segment modulu 4 genu pro erytromycin-polyketidsyntázu mohou být detekovány pouze polyketidy s dvojnou vazbou v odpovídající pozici a nikoli předpokládané polyketidy s úplně redukovaným řetezcem (Kao, C. M. a další. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: strana 11339 až 11340) .
Ve dvou podobných experimentech byla redukční smyčka modulu 2 v trojmodulovém systému nahrazena odpovídajícím segmentem modulu 2 rapamycin polyketidsyntázy, který obsahuje doménu KR a neaktivní DH doménu a dále KR doménou modulu 4 rap PKS (redukční smyčka rap modulu 4 obsahuje domény KR a DH). Z obou konstruktů vznikaly triketid-laktony s různou stereochemickou konformací na C-3 (Kao, C. M. a další. J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: strana 2478 až 2479).
Ve všech výše popsaných příkladech byla pro spojení fragmentů DNA použita stejná restrikčni místa- Pstl a Xbal, (pozice místa Pstl je identická s Pstl místem, které bylo • · použito v níže popsaném systému, a poloha místa Xbal odpovídá místu Bsu36l).
Byl navržen model struktury DEB syntázy, ve kterém redukční doména tvoří smyčka ležící mimo jádro tvořené doménami KS, AT a ACP (Staunton a další. Nátuře structural biology (1996) 3: strana 188 až 192). Navíc bylo dokázáno, že DEBS1 je hydrolyzován proteolytickými enzymy na specifických místech, které vyznačují hranice domén (Aparicio, J. F. a další. J. Biol. Chem. (1994) 269: strana 8524 až 8528). Tato proteolytická místa se nalézají hlavně v oblastech linkerů mezi doménami a proto se zdá vhodné spojovat jednotlivé fragmenty v těsné blízkosti těchto míst. Další příklady viz W098/01546.
V jednom ze svých provedeni vynález popisuje nukleovou kyselinu (zejména DNA) kódující alespoň část polyketidsyntázy (PKS) I. třídy, přičemž uvedená část obsahuje alespoň část extenzního modulu, a která obsahuje polylinker s mnohonásobným cílovým místem pro restrikční enzymy na místě jednoho nebo více genů kódujících enzymy asociované s redukční funkcí.
V dalším provedení vynález popisuje nukleovou kyselinu (zejména DNA) kódující alespoň část polyketidsyntázy I. třídy, přičemž uvedená část obsahuje alespoň část extenzního modulu, a která obsahuje polylinker s mnohonásobným cílovým místem pro restrikční enzymy, který spojuje nukleovou kyselinu kódující (alespoň část) AT domény s nukleovou kyselinou kódující (alespoň část) ACP domény.
Tyto nukleové kyseliny mohou obsahovat další nukleovou kyselinu, která kóduje jeden nebo více redukčních enzymů, vložených polylinkeru jak je to popsáno podrobněji níže. Taková inzerce je ve výhodném provedení vynálezu provedena po naštěpen! nukleové kyseliny s polylinkerem dvěma restrikčními enzymy. Pro lepší výběr inzerčních míst je • · · · výhodné, aby polylinker obsahoval alespoň tři restrikčni místa, výhodněji alespoň čtyři a ještě výhodněji alespoň šest nebo osm restrikčních míst.
Polylinker může být připraven vložením exogenní (obvykle syntetické) nukleové kyseliny do nukleové kyseliny kódující polyketidsyntázu I. třídy, nebo může být připraven pozměněním existující sekvence nukleové kyseliny kódující PKS I. třídy. Posledně jmenovaného způsobu vzniku restrikčních míst lze dosáhnout například cílenou mutagenezí sekvence nacházející se proti a/nebo po směru exprese genu (ve výhodném provedení vynálezu mutagenezí obou těchto sekvencí) kódujícího za normálních okolností redukční enzym, který je třeba vypustit. Ve výhodném provedení se mutagenizují sekvence kódující polypeptidové linkery mezi redukčním enzymem (enzymy) a sousedními doménami.
Polylinker výhodně obsahuje alespoň některé z následujících restrikčni míst: AvrlI, BglII; SnaBI; Pstl; Spěl; Nsil; Bsu361; Nhel; a Hpal. Výhodněji polylinker obsahuje alespoň čtyři z uvedených míst.
Ve výhodném provedení vynálezu alespoň některá z restrikčních míst obsažených v polylinkeru nejsou přítomna ve zbytku nukleové kyseliny, ve které se polylinker nachází. Výhodně alespoň některá z restrikčních míst obsažených v polylinkeru nejsou obvyklá nebo se vůbec nevyskytují v přirozených sekvencích nukleových kyselin, které kódují redukční enzymy dalších PKS (ve výhodném provedení vynálezu PKS I. třídy). Ve výhodném provedení se alespoň dvě z míst nevyskytují v alespoň polovině známých nukleotidových sekvencí kódujících redukční enzymy PKS, a výhodněji alespoň ve třech čtvrtinách těchto sekvencí. Protože geny PKS jsou obvykle bohaté na GC báze, jsou ve výhodném provedení vynálezu v polylinkeru restrikčni místa bohatá na AT báze.
• · · ·
Nukleové kyseliny podle vynálezu výhodně kóduji zaváděči modul a/nebo jeden nebo více extenznich modulů.
Podrobnosti týkající se variant zaváděcích modulů lze nalézt v naší současně podané mezinárodní patentové přihlášce, nazvané Polyketidy a jejich syntéza, podané dne 29. června 1999.
- Vynález dále popisuje nukleovou kyselinu obecně odpovídající výše popsané, které ale navíc obsahuje další, » do polylinkeru vloženou nukleovou kyselinu kódující jeden nebo více redukčních enzymů (například domény KR a/nebo DH a/nebo ER) . Vložená nukleová kyselina může kódovat jeden nebo více redukčních enzymů stejné polyketidsyntázy jako je ta, do níž byl vložen polylinker, pouze z jiného extenzního modulu. Popřípadě může být vložená nukleová kyselina exogenní, kódující jeden nebo více redukčních enzymů z jiné přirozené PKS nebo ze syntézy mastných kyselin, nebo může to být syntetická nebo mutantní forma přirozeně se vyskytující nukleové kyseliny, kódující jeden nebo více redukčních enzymů PKS nebo syntézy mastných kyselin. Ve výhodném provedení vynálezu vložená nukleová kyselina zakóduje jeden nebo více redukčních enzymů ze stejné nebo jiné polyketidsyntázy I. třídy nebo syntézy mastných kyselin, ale popřípadě může jít i o nukleovou kyselinu kódující jeden nebo více redukčních enzymů z polyketidsyntázy II. třídy nebo syntézy mastných kyselin.
Byly již sekvenováno mnoho genů kódujících polyketidsyntázy I. třídy a tyto sekvence jsou dostupné ve veřejných databázích sekvencí DNA a proteinů včetně databází Genbank, EMBL, a Swissprot. Například jsou dostupné, mimo jiné, sekvence polyketidsyntáz řídících syntézu erytromycinu (Cortes, J. a další, Nátuře (1990) 348: strana 176 až 178; přístupové číslo X62569, Donadio, S. a další, Science (1991) 252: strana 675 až 679; přístupové číslo M63677); rapamycinu
-8• ······ ·· • · · · · · • · · · · · · · · ······ · ··· · (Schwecke, T. a další, Proč.Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92: strana 7839 až 7843; přístupové číslo X86780); rifamycinu (August a další, (1998); přístupové číslo AF040570); a tylosinu (Eli Lily, přístupové číslo U78289). Obrázek 7 znázorňuje sekvenci nukleové kyseliny kódujících první dva moduly avermektin polyketidsyntázy z bakterií S. avermitilis; která může být použita jako alternativní zdroj pro inzerty použitých v některých provedeních vynálezu.
Odborníkům je zřejmé, že celková sekvenční podobnost nukleových kyselin kódujících srovnatelné domény nebo moduly různých polyketidsyntáz I. třídy je dostatečně vysoká, a organizace domén různých polyketidsyntáz I. třídy natolik konzistentní mezi různými mikroorganismy produkujícími polyketidy, že to syntézy hybridních přirozené modulární umožňuje obecnou polyketidů podle polyketidsyntázy použitelnost způsobů vynálezu pro všechny I. třídy nebo jejich deriváty.
Vynález dále popisuje vektory, jako například plazmidy nebo fágy (ve výhodném provedení vynálezu plazmidy), včetně nukleových kyselin definovaných ve výše popsaných provedeních a hostitelské buňky (zejména Streptomyces sp.) transfikované těmito nukleovými kyselinami nebo konstrukty.
V dalším provedení vynález popisuje polyketidsyntázy exprimovatelné výše popsanými hostitelskými buňkami. Tyto polyketidsyntázy mohou být popřípadě z hostitelských buněk izolovány běžnými způsoby, nicméně většinou je výhodné, není-li takováto izolace nutná.
V dalších provedeních vynález popisuje způsoby přípravy nových funkčních polyketidsyntáz a je kódujících nukleových kyselin prostřednictvím inzerce nukleové kyseliny kódující redukční enzymy do polylinkeru, jak již bylo popsáno výše. Vynález rovněž popisuje nové polyketidy produkované těmito polyketidsyntázami.
• · · ·
Vynález dále popisuje nové způsoby specifické nebo preferenční výroby určitých polyketidů, za použití materiálů a způsobů definovaných v předchozích provedeních vynálezu. Vynález například popisuje způsoby přípravy C22-C23 dihydroavermektinů, jako je ivermectin (viz Příklady 25 a 26) , přímou fermentací, a způsob přípravy B1 avermektinu v podstatně bez příměsi B2 avermektinu (viz Příklady 27 a 28).
V dalším provedení vynález popisuje nové polyketidy a nové stereoizomery polyketidů, jako jsou například speciální polyketidy vyrobené podle jednoho nebo více z popsaných příkladů.
Aby bylo možno zaměnit redukční smyčku v modulu 2 erytromycin-polyketidsyntázy v systému DEBS1TE (Cortés J. a další, Science (1995) 268: strana 1487 až 1489), byl místo redukční smyčky modulu 2 vložen polylinker (mnohonásobné klonovací místo (mcs)). Vznikl tak minimální modul obsahující domény KS, AT a ACP. Tento systém je stále ještě funkční a vzniká z něj ketolakton (viz příklady 2 a 4) . Mnohonásobné klonovací místo obsahuje unikátní cílová místa pro 9 restrikčních enzymů.
Tato nová restrikční místa jsou situována částečně v DNA kódující linker v blízkosti místa kde je polyketidsyntáza hydrolyzována proteolytickými enzymy (viz výše). Zatímco část restrikčních míst leží v DNA kódující oblasti s nízkou homologií, jiná jsou naopak situována v DNA kódující vysoce konzervované oblasti (viz obrázek 1). Vložení míst AvrlI, BglII, Bsu36l a Nhel nijak nemění aminokyselinovou sekvenci druhého modulu DEBS. V dalších pěti případech (SnaBI, Pstl, Spěl, Nsi, Hpal) je však aminokyselinová sekvence změněna (viz obrázek 2). Tyto změny nijak neovlivňují aktivitu proteinu (viz příklad 6).
Vzhledem k tom, že dvě z restrikčních míst pokrývají stejnou bázi, bylo rozhodnuto, že se zkonstruují dva
-10různé mnohonásobné klonovací místo • ·*···· ·· • · · · · ·· • · · ···· ·· ·♦···· · ··· · • · · · · · • · r v · · · ·· plazmidy obsahující (PJLK114 a pJLK117).
Oproti jedinému restrikčnímu místu na každé straně redukční smyčky nabízí použití mnohonásobného klonovacího místa následující výhody:
1) lze různých vyhnout
2) lze
Autoři vybrat vhodnou pozici pro spojení DNA fragmentů (20 kombinací) z různých redukčních smyček a tím se nepříznivým změnám v aminokyselinové sekvenci se vyhnout enzymům, které by štěpily uvnitř; a vytvářet různé kombinace vložením dalších fragmentů vynálezu učinili další překvapující objev, že lze různé výsledky při použití stejné nukleové kyseliny s polylinkerem a stejné nukleové kyseliny kódující jeden nebo více redukčních enzymů, pokud je nukleová jeden nebo více redukčních enzymů vložena polylinkeru. Například v příkladech 7 smyčka modulu 13 pro rapamycin vzniku polyketidů s extenzní modulu.
dobrým výtěžkem. Nicméně v redukční smyčka, respektive rap vložena do v podstatě a 8, restrikční místa v polylinkeru Nsil). Výsledkem bylo, že byl po podíl vedlejších produktů. Tyto ve kterých keto-skupiny nebo hydroxylové že pouhá změna místa použitého pro způsobila rozdíl mezi získáním a získáním nežádoucí směsi získat redukční modulu 2 řetězcem kyselina kódující do různých míst v je popsána vložena do pro ery za díky aktivitě druhého triketid-laktony
Příkladech 37 soubor domén, pozice byla použita jiná a Hpal místo BglII a fermentaci získán vedlejší byly na skupiny.
vložení stejné pouze (AvrlI byla úplně redukovaným
Požadované byly získány s byla stejná modulu 13 pro modulu 2 pro ery jako v Příkladech 7 použita významný zahrnovaly triketid-laktony,
C-3 buď produkty pozici
Z toho vyplývá, redukční smyčky požadovaného produktu požadovaného produktu s produkty neúplné redukce.
• •99
V příkladech 31 a 32 byly podobným způsobem použita místa Pstl a Bsu36l pro vložení redukční domény modulu 1 pro avermektin (plazmid pGMS2) namísto redukční smyčky modulu 2 pro ery. Vznikal sice očekávaný produkt, ale kromě toho ještě podstatné množství ketolaktonu. V příkladech 29 a 30, kdy byla použita místa BglII a Nhel (plazmid pJLK30), byl ketolakton stěží detekovatelný, ačkoli množství laktonu bylo v obou případech obdobné.
Zcela analogicky jako v Příkladech 29 a 30 byla v Příkladu 14 použita stejná restrikční místa BglII a Nhel pro náhradu redukční smyčky modulu 2 pro ery za redukční smyčku modulu 1 pro tylosin (plazmid pJLK35). Vznikaly přitom stejné požadované triketid-laktony jako v příkladech 30 a 32, ale s mnohem vyšším výtěžkem, ačkoli byly doprovázeny určitým množstvím ketolaktonu. Z toho vyplývá, že různé redukční smyčky mohou být výhodně vloženy do různých restrikčních míst.
V příkladech 33 a 34 byla použita restrikční místa BglII a Nhel pro vložení redukční domény modulu 2 pro avermektin (plazmid pJLK31) a očekávané produkty vznikaly jak hlavní. V experimentu popsaném v příkladech 35 a 36, kdy byla použita restrikční místa SnaBI a Bsu36l (plazmid pGMS4) byla získána jen stopová množství směsi triketid-laktonů.
Vynález popisuje možnost, že v případě, kdy nelze získat požadované a předpokládané produkty po vložení určité redukční smyčky do určité polyketidsyntázy, lze dosáhnout požadovaného výsledku jednoduchým použitím jiných restrikčních enzymů v polylinkeru. Z výše uvedených příkladů vyplývá, že takováto úprava může dramaticky ovlivnit výsledek a výtěžek syntézy polyketidu.
• ft ftftftft ··» » * < * · ·· • r · ♦ · · · 4 · ·β » ···· ft ♦ « <>«··>
• · · 9··«>
·*· · ·· ··· ·· ft··
-12Příklad 1: Konstrukce plazmidu pJLK114
Plazmid pJLK114 je založen na plazmidu pCJR24 a obsahuje gen pro polyketisyntázu se zaváděcím modulem ery, s prvním a druhým extenzním modulem polyketisyntázy ery a terminální thioesterázou ery s tím, že segment DNA mezi koncem acyltransferázy a začátkem domény ACP ve druhém rozšiřujícím modulu ery byl nahrazen syntetickým oligonukleotovým linkerem obsahujícím následující restrikční místa: AvrlI, BglII, SnaBI, Pstl, Spěl, Nsil, Bsu36I a Hpal. Ke zkonstruování finálního plazmidu bylo zapotřebí nejprve vytvořit několik intermediálních plazmidu, viz obrázek 3.
Konstrukce plazmidu pJLK02
Přibližně 1,47 kbp dlouhý fragment DNA genu eryAI z bakterie
S. erythraea byl amplifikován pomocí PCR s použitím syntetických oligonukleotidových primerů :
5’-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' a
5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3 ' .
Jako templát byl použit plazmid pNTEP2 (viz Oliynyk, M. a další, Chemistry a Bioloqy (1996) 3: strana 833 až 839;
W098/01546) . PCR produkt byl fosforylován T4 polynukleotid kinázou a poté byl ligován do Smál linearizovaného plazmidu pUC18, jehož konce byly defosforylovány alkalickou fosfatázou. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. Jednotlivé kolonie byly testovány na přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK02 byl identifikován na základě restrikční mapy a pomocí sekvenování DNA.
-13Konstrukce plazmidů pJLK03
Přibližně 1,12 kbp dlouhý fragment DNA gén eryAI z bakterie S. erythraea byla amplifikován pomocí PCR s použitím syntetických oligonukleotidových primerů :
5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3 ' a
5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3’
Jako templát byl použit plazmid pNTEPH. PCR produkt byl fosforylován T4 polynukleotid kinázou a poté byl ligován do Smál linearizovaného plazmidů pUC18, jehož konce byly defosforylovány alkalickou fosfatázou. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. Jednotlivé kolonie byly testovány na přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK02 byl identifikován na základě restrikčni mapy a pomocí sekvenování DNA.
Konstrukce plazmidů pJLK04
Plazmid pJLK02 byl naštěpen restrikčními enzymy Pstl a Hpal a 1,47 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidů pJLK03 naštěpeného rovněž enzymy Pstl a Hpal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK04 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidů pJLK05
Plazmid pJLKOl (PCT/GB97/01819) byl naštěpen restrikčními enzymy Pstl a AvrlI a 460 bp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidů pJLK04 naštěpeného rovněž enzymy Pstl a
-14AvrlI. Ligačni směs byla použita pro transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK05 byl identifikován restrikčním mapováním.
• ······ «· · • · · · ···· ·· ····· ·· · ······ · ··· · · • · · · · · · • · ····· ·· ···
Konstrukce plazmidů pJLK05
Plazmid pJLK05 byl naštěpen restrikčními enzymy Scal a Xbal a plazmid pNTEP2 byl naštěpen restrikčními enzymy Ndel a Scal. Vzniklé dva fragmenty byly ligací vloženy do plazmidů pCJR24 naštěpeného enzymy Ndel a Xbal. Ligačni směs byla použita pro transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK07 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidů pJLK114
Dva syntetické oligonukleotidy Plf a Plb (viz obrázek 4) byly resuspenovány každý zvlášť v TE pufru. 10μ1 alikvoty roztoků oligonukleotidů (0,5 nmol/μΐ) byly smíchány dohromady a zahřátý na 65 °C. Poté byly ponechány pomalu chladnout na pokojovou teplotu. Plazmid pJLK07 byl naštěpen restrikčními enzymy AvrlI a Hpal a poté ligací spojen s annealovaným oligonukleotidem. Ligačni směs byla použita pro transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK114 byl identifikován restrikčním mapováním.
• · · · • · • · · ·
-15• · · · ·· ··· ·· ···
Přiklad 2: Použiti plazmidu pJLK114 pro konstrukci rekombinantních bakterii . Saccharopolyspora erythraea JC2/PJLK114 a produkci derivátů TKL
Přibližně 5 pg plazmidu pJLK114 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterie S. erythraea kmene JC2 (kmen uložený po číslem NCIMB 40802, viz W098/01546). Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern-blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno že plazmid se integroval do genu TE.
Buňky JC2/PJLK114 byly vysety na agarové plotny se SM3 agarem (5,0 g glukózy, 50,0 g maltodextrinu MD30E, 25,0 g sójové mouky Arkasoy, 3,0 g řepné melasy, 0,25 g K2HPO4, 2,5 g CaC03, 22,0 g agaru, destilovaná voda do 1 litru pH=7,0) s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu a pěstovány dvanáct dnů při teplotě 30°C. 1 cm2 (500pl) plotny byl poté homogenizován a extrahován směsí 1,2 ml ethylacetátu a 20 pl kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odpařeno a odparek rozpuštěn v methanolu a analyzován GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány jako δ-lakton (4S, SR)-5-hydroxy-2,4 dimethyl-3-oxo-n-hexanové kyseliny a jako δ-lakton (4S, 5R)5-hydroxy-2,4-dimethyl-3-oxo-n-heptanové kyseliny.
• ······ · · · • ··· ···· ·· ····· · · · ······ · · · · · · • · · · · · · •·· · ·· · · · ·· ···
16Přiklad 3: Konstrukce plazmidu pJLK117
Plazmid pJLK117 je založen na plazmidu pCJR24 a obsahuje gen pro polyketidsyntázu obsahující zaváděcí modul ery, první a druhý extenzní modul polyketidsyntázy ery a terminační thioesterázu ery s tím, že segment DNA mezi koncem acyltransferázy a začátkem ACP domény druhého extenzního modulu ery byl nahrazen syntetickým oligonukleotidovým linkerem obsahujícím cílová místa následujících restrikčních enzymů: AvrlI, BglII, SnaBI, Pstl, Spěl, Nsil, Bsu36I a
Nhel. Tento plazmid byl zkonstruován přes několik intermediárních plazmidů následujícím způsobem (viz obrázek 3) .
Konstrukce plazmidu pJLK115
Plazmid pJLK114 byl naštěpen restrikčními enzymy Ndel a Xbal a přibližně 9,9 kbp dlouhý inzert bylo ligací vložen do plazmidu pUC18 naštěpeného rovněž enzymy Ndel a Xbal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK115 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pJLK116
Plazmid pJLK13 (PCT/GB97/01819) byl naštěpen restrikčními enzymy Bsu36l 10 a Xbal a 1,1 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK115 naštěpeného rovněž enzymy Bsu36I a Xbal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK116 byl identifikován restrikčním mapováním.
• · · · «
• · · • · • · · ·
-17•·· · ·· ··· ·· ···
Konstrukce plazmidů pJLK117
Plazmid pJLK116 byl naštěpen restrikčnimi enzymy Ndel a Xbal. 9,9 kbp dlouhý fragment byl ligačí vložen do plazmidů pCJR24 naštěpeného enzymy Ndel a Xbal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK117 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 4: Použití plazmidů pJLKll pro konstrukci rekombinantních bakterií Saccharopolyspora erythraea JC2/ pJLK117 a produkce TKL derivátů
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK117 bylo použito k transformaci protoplastů Saccharopolyspora erythraea a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/ pJLK117 byly vysety na agarové plotny SM3 s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu a pěstovány po dobu 12 dnů při 30°C. 1 cm2 (0,5ml) plotny byl homogenizován a extrahován směsí 1,2 ml ethyl acetátu a 20 μΐ kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován pomoci GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány jako δ-lakton (4S,5R)-5-hydroxy-2,4-dimetyl-3-oxo-n-hexanové kyseliny a jako δ-lakton (4S,5R)-5-hydroxy-2,4-dimetyl-3oxo-n-heptanové kyseliny
• · · ·
Příklad 5: Konstrukce plazmidu pJLK25
Plazmid pJLK25 je založen na plazmidu pJLK114, kromě toho, že DNA fragment, který kóduje redukční smyčku druhého modulu genu pro erythromycin PKS byl vložen do polylinkeru.
Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidu.
Konstrukce plazmidu pJLK118
Přibližně 1,4 kbp dlouhý DNA fragment genu eryAI S.erythrea, který kóduje redukční smyčku modulu 2, byl amplifikován metodou PCR, přičemž jako primery byly použity syntetické oligonukleotidy:
5'-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-3' a
5'-TAATGCATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-3' a jako templát byl použit plazmid pNTEP2. Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK118 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidů pJLK23
Plazmid pJLK118 byl štěpen pomocí restrikčních enzymů Spěl a Nsil a fragment o délce 1,4 kbp byl ligován s plazmidem pJLK115, který byl rovněž štěpen Spěl a Nsil. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK23 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidů pJLK25
Plazmid pJLK23 byl rozštěpen pomocí restrikčních enzymů Ndel a Xbal a fragment o velikosti přibližně 11,2 kbp byl ligován s plazmidem pCJR24, který byl rovněž štěpen Ndel a Xbal. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonii byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK25 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 6:Použití plazmidů pJLK25 pro konstrukci rekombinantních bakterií Saccharopolyspora erythraea JC2/pJLK25 a produkci triketidů
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK25 bylo použito k transformaci protoplastů Saccharopolyspora erythraea a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/ pJLK25 byly vysety na agarové plotny SM3 s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu a pěstovány po dobu 12 dnů při 30°C. 1 cm2 (0,5ml) plotny byl
homogenizován a extrahován směsi 1,2 ml ethyl acetátu a 20 μΐ kyseliny mravenči. Rozpouštědlo bylo slito a odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován pomocí GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty ' byly identifikovány (porovnáním s autentickým materiálem) jako δ-lakton (2R, 3S, 4S, 5R)-5,3-dihydroxy-2,4-dimetyl-n-hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 3S, 4S, 5R)-5-dihydroxy-2,4-dimetyl-nheptanové kyseliny.
Příklad 7: Konstrukce plazmidu pJLK120
Plazmid pJLK28 je založen na plazmidu pJLK117, s tím, že DNA fragment, který kóduje redukční smyčku modulu 13 rap PKS byl včleněn do polylinkeru.
Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidu. (Schéma 5)
Přibližně 3,2 kbp dlouhý DNA segment genu rapC buněk S.hyggroscopicus, který kóduje redukční smyčku modulu 13, byl amplifikován metodou PCR, přičemž jako primery byly použity syntetické oligonukleotidy:
z-TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-3' a
5'-TAATGCATCGACTCGTTGCGTGCCGCGGT-3'
-21a kosmid cos 31 (Schwecke,T. et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:7839-7843) jako templát. Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působeni alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK120 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidů pJLK28
Plazmid pJLK120 byl štěpen pomocí restrikčních enzymů BglII a Nsil a fragment o délce 3,2 kbp byl ligován s plazmidem pJLK115, který byl rovněž štěpen BglII a Nsil. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK28 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 8: Použití plazmidů pJLK28 pro konstrukci rekombinantních bakterií Saccharopolyspora erythraea JC2/pJLK28 a produkci triketidů.
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK28 bylo použito k transformaci protoplastů Saccharopolyspora erythraea JC2 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/ pJLK28 byly vysety na agarové plotny SM3 s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu a pěstovány po dobu 12 dnů při 30°C. 1 cm2 (0,5ml) plotny byl homogenizován a extrahován směsí 1,2 ml ethyl acetátu a • · • · · ·
-22•9 99 9 9 μΐ kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován pomocí GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány(porovnáním s autentickým materiálem) jako δ-lakton (2R, 4S, 5R) - 2,4-dimetyl-5-hydroxy-n-hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 4S, 5R)- 2,4-dimetyl-5hydroxy-n-heptanové kyseliny.
Příklad 9:Konstrukce plazmidů pJLK41
Plazmid pJLK41 je založen na plazmidů pJLK117, s tím, že DNA fragment, který kóduje redukční smyčku modulu 4 ery PKS byl včleněn do polylinkeru.
Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů. (Schéma 5)
Konstrukce plazmidů pJLK32,3
Přibližně 3,2 kbp dlouhý DNA segment genu eryAII z bakterií Saccharopolyspora erythraea , který kóduje redukční smyčku modulu 4, byl amplifikován metodou PCR, přičemž jako primery byly použity syntetické oligonukleotidy:
5'-ATAGATCTGCCTACGTACCCGTTCGAACACCAGCGCTTC-3' a
5'-ATCCTCAGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGCAGCTT -3 ' a kosmid cos4B (kosmid obsahující erythromycin PKS) jako templát. Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotidkinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působeni alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK120 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidu pJLK38
Plazmid pJLK32,3 byl štěpen pomocí restrikčních enzymů BglII a Bsu36l a fragment o délce 3,2 kbp byl ligován s plazmidem pJLK116, který byl rovněž štěpen BglII a Bsu36l. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK38 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pJLK41
Plazmid pJLK38 byl štěpen pomocí restrikčních enzymů Ndel a Xbal a fragment o přibližné délce 13 kbp byl ligován s plazmidem pCJR24, který byl rovněž štěpen Ndel a Xbal. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK41 byl identifikován restrikčním mapováním.
Přiklad 10: Použití plazmidu pJLK41 pro konstrukci rekombinantních bakterií . Saccharopolyspora erythraea JC2/pJLK41 a produkci triketidů
Přibližně 5 pg plazmidu pJLK41 bylo použito k transformaci protoplastů Saccharopolyspora erythraea JC2 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/ pJLK41 byly vysety na agarové plotny SM3 s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu a pěstovány po dobu 12 dnů při 30°C. 1 cm2 (0,5ml) plotny byl homogenizován a extrahován směsí 1,2 ml ethyl acetátu a 20 μΐ kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován pomocí GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány(porovnáním s autentickým materiálem) jako δ-lakton (2R, 4S, 5R) - 2,4-dimetyl-5-hydroxy-n-hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 4S, 5R)- 2,4-dimetyl-5hydroxy-n-heptanové kyseliny.
Příklad 11: Konstrukce plazmidu pJLK29
Plazmid pJLK29 je založen na plazmidu pJLK117, s tím, že DNA fragment, který kóduje redukční smyčku modulu 10 rap PKS byl včleněn do polylinkeru.
-25Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů. (Schéma 5)
Konstrukce plazmidů pJLK121,l
Přibližně 2,2 kbp dlouhý DNA segment genu rapB buněk S.hyggroscopicus, který kóduje redukční smyčku modulu 10, byl amplifikován metodou PCR, přičemž jako primery byly použity syntetické oligonukleotidy:
5'-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' a
5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3' a jako templát přibližně 7 kbp dlouhý fragment, který vznikl působením restrikčních enzymů Scal a Sphl na kosmid cos 26 (Schwecke,T. et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:7839-7843).
Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK121,l byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidů pJLK29
Plazmid pJLK121,l byl štěpen pomocí restrikčních enzymů BglII a Nhel a fragment o délce 2,2 kbp byl ligován s plazmidem pJLK117, který byl rovněž štěpen BglII a Nhel. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B a u jednotlivých
-26kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK29 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 12: Použití plazmidu pJLK29 pro konstrukci rekombinantních bakterií Saccharopolyspora erythraea JC2/pJLK29 a produkci triketidů.
Přibližně 5 pg plazmidu pJLK41 bylo použito k transformaci protoplastů Saccharopolyspora erythraea JC2 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/ pJLK41 byly použity k naočkování 30 ml media SM3 s obsahem 5 pg/ml thiostreptonu ve 250 ml kultivačních lahvích. Očkování bylo provedeno jediným vstřikem, aby bylo zabráněno shlukování buněk. Poté byly lahve třepány 300 rpm v 30 °C. Po osmi dnech byla suspenze zcentrifugována, pH supernatantu upraveno na pH=3 a třikrát provedena extrakce shodným objemem ethyl acetátu. Rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován metodou HPLC, elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií a po konverzi pomocí trimethylsilyl- diazomethanu na methyl ester rovněž metodou GC/MS. Hlavní produkty byly identifikovány(porovnáním s autentickým materiálem) jako (4S, 5R) - 5-hydroxy -2,4dimetyl-n-hex-2-enová kyselina a jako (4S, 5R) - 5-hydroxy 2,4-dimetylo-n-hept-2-enová kyselina.
OH
OH ·· ··« · • · ·· ·«
-27Příklad 13: Konstrukce plazmidu pJLK35
Plazmid pJLK35 je založen na plazmidu pJLK117, s tím, že DNA fragment, který kóduje reduktivní smyčku modulu 1 tylosin PKS, byl včleněn do polylinkeru. Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidu. (Schéma 5)
Konstrukce plazmidu pJLK33,l
Přibližně 1,6 kbp dlouhý DNA segment genu tylosin PKS buněk S.fradiae, který kóduje reduktivní smyčku modulu 1, byl amplifikován metodou PCR, přičemž jako primery byly použity syntetické oligonukleotidy:
5'-TAAGATCTCCCTACGTACCCCTTCAACCAC-3'
5'- GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-3'
Jako templát byl použit kosmid 6T (kosmid obsahující geny polyketidsyntázy produkující tylosin).
Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK33,l byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidu pJLK35
Plazmid pJLK33,l byl štěpen pomocí restrikčních enzymů BglII a Nhel a fragment o délce 1,6 kbp byl ligován s plazmidem pJLK117, který byl rovněž štěpen BglII a Nhel. Ligační směs ·· ····
-28byla použita k transformaci elektrokompetentnich buněk E.
coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK35 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 14: Použití plazmidů pJLK35 pro konstrukci rekombinantních bakterií Saccharopolyspora erythraea JC2/pJLK29 a produkci triketidů.
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK35 bylo použito k transformaci protoplastů Saccharopolyspora erythraea JC2 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/pJLK35 byly vysety na misku s SM3 agarem obsahujícím 50 pg/ml thiostreptonu a byly kultivovány po dobu dvanácti dnů při 30 °C. 1 cm2 (0,5 ml) misky byl homogenizován a extrahován směsí 1,2 ml ethylacetátu a 20 pl kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo bylo slito a odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován pomocí GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány (porovnáním s autentickým materiálem) jako dlakton (2R, 3R, 4S, 5R)- 5,3-dihydroxy -2,4-dimetyl-nhexanové kyseliny a jako d-lakton (2R, 3R, 4S, 5R) - 5,3dihydroxy -2,4-dimetyl-n-heptanové kyseliny.
O ‘'h.
‘0 • · · · • · ·
-29• · · · ··· ··· ·· • · · · ···· · · • ······ · ··« · • · · · · · · • fcfc · · ♦ · · · · >
Přiklad 15: Konstrukce plazmidu pRIF7
Plazmid pRIF7 je založen na plazmidu pJLK117, s tím, že DNA fragment, který kóduje reduktivní smyčku modulu 7 rifamycin PKS, byl včleněn do polylinkeru. Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidu. (Schéma 5)
Konstrukce plazmidu pUCRIF7
Přibližně 2,1 kbp dlouhý DNA segment genu rifamycin PKS buněk Amycolatopsis mediterranei, který kóduje reduktivní smyčku modulu 7, byl amplifikován metodou PCR, přičemž jako primery byly použity syntetické oligonukleotidy:
5'-CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-3'
5'-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT-3'
Jako templát kosmid 6 (kosmid začínající baží na pozici 35727 a pokračují až za pozici 76199, poloha je vztažena k sekvenci přístupového čísla AF040570).
Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pUCRIF7 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidu pRIF7
Plazmid pUCRIF7 byl štěpen pomocí restrikčních enzymů BglII a Nhel a fragment o délce 2,1 kbp byl ligován s plazmidem
-30pJLK117, který byl rovněž štěpen BglII a Nhel. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pRIF7 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 16: Použití plazmidů pRIF7 pro konstrukci rekombinantních bakterií S. erythraea JC2/pRIF7 a produkci triketidů.
Přibližně 5 pg plazmidů pRIF7 bylo použito k transformaci protoplastů S. erythraea JC2 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonii byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky JC2/pRIF7 byly vysety na misku s SM3 agarem obsahujícím 50 pg/ml thiostreptonu a byly kultivovány po dobu dvanácti dnů při 30 °C. 1 cm2 misky byl homogenizován a extrahován směsí 1,2 ml ethylacetátu a 20 pl kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo bylo slito a odstraněno odpařením, zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován pomocí GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány (porovnáním s autentickým materiálem) jako d-lakton (2S, 3S, 4S, 5R) - 5,3dihydroxy -2,4-dimetyl-n-hexanové kyseliny a jako d-lakton (2R, 3R, 4S, 5R)- 5,3-dihydroxy -2,4-dimetyl-n-heptanové kyseliny.
-31·· · · · · · · · ······ · ··· · • ····· ··
Příklad 17: Konstrukce plazmidu pJLK52
Plazmid pJLK52 je založen na plazmidu .pJLK35, s tím, že obsahuje gen PKS, který zahrnuje ery zaváděcí modul, dále první, druhý a třetí rozšiřovací modul genového seskupení ery a dále potom ery řetězec ukončující thioesterázu, přičemž segment DNA mezi koncem acyltransferázy a začátkem ACP druhého ery rozšiřovacího modulu byl nahrazen ekvivalentem segmentu modulu 1 tylosin PKS.
Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
Konstrukce plazmidu pJLK50
Přibližně 6,1 kbp dlouhý DNA segment genového seskupení erythromycin PKS buněk S. erythraea , který kódujeDNA fragment od začátku ACP modulu 2 po začátek ACP modulu 3, byl amplifikován metodou PCR za použití syntetických oligonukleotidů:
5'- TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' a
5'- ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3'
Jako templát byl použit plazmid pBAM25. Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK50 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
• · • · · ·
Konstrukce plazmidů pJLK52
Plazmid pJLK50 byl štěpen pomocí restrikčního enzymu Nhel a insert o délce 6,1 kbp byl ligován s plazmidem pJLK35, který byl rovněž štěpen Nhel. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK52 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 18: Použití plazmidů pJLK52 pro konstrukci rekombinantních
NRRL2338/pJLK52 makrolidů.
bakterií
S. erythraea a produkci tetraketidů a
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK52 bylo použito k transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE. Buňky S. erythraea NRRL2338/pJLK52 byly použity k naočkování media SM3 s obsahem 5 pg/ml thiostreptonu a kultivovány po dobu od 7 do 12 dní při 2830°C. Po uplynutí této doby byla suspenze zcentrifugována a pH supematantu upraveno na pH=9,5. Supernatant byl poté třikrát extrahován shodným objemem ethyl acetátu a rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován metodou GC/MS, HPLC/MS a MS-MS. Tetraketidy byly identifikovány pomocí metody GC/MS. Hlavní komponenty představovaly
Následující makrolid byl identifikován metodou HPLC/MS, MSMS a 1H-NMR (byl doprovázen produkty neúplného zpracování enzymy post-PKS).
Příklad 19: Konstrukce plazmidu pJLK53
Plazmid pJLK53 je založen na plazmidu pJLK28, s tím, že obsahuje gen PKS, který zahrnuje ery zaváděcí modul, dále první, druhý a třetí rozšiřovací modul genového seskupeni ery a dále potom ery řetězec ukončující thioesterázu,
-34přičemž segment DNA mezi koncem acyltransferázy a začátkem
ACP druhého ery rozšiřovacího modulu byl nahrazen ekvivalentem segmentu modulu 13 rapamycin PKS. Výsledný produkt byl připraven níže popsaným způsobem.
Plazmid pJLK50 byl štěpen pomocí restrikčního enzymu Nhel a insert o délce 6,1 kbp byl ligován s plazmidem pJLK28, který byl rovněž štěpen Nhel. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK53 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 20: Použití plazmidů pJLK53 pro konstrukci rekombinantních NRRL2338/pJLK53 makrolidů.
bakterií
S. erythraea a produkci tetraketidů a
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK53 bylo použito k transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE.
Buňky S. erythraea NRRL2338/pJLK53 byly použity k naočkování media SM3 s obsahem 5 pg/ml thiostreptonu a kultivovány po dobu od 7 do 10 dní při 28-30°C. Po uplynutí této doby byla suspenze zcentrifugována a pH supernatantu upraveno na pH=9,5. Supernatant byl poté třikrát extrahován shodným objemem ethyl acetátu a rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován metodou GC/MS, HPLC/MS a MS-MS. Tetraketidy byly identifikovány pomocí metody GC/MS. Hlavní komponentu představoval • · • · · P
Následujíci makrolid byl identifikován metodou HPLC/MS, MSMS a 1H-NMR (byl doprovázen produkty neúplného zpracování enzymy post-PKS)
Přiklad 21: Konstrukce plazmidů pJLK54
Plazmid pJLK54 je založen na plazmidů pJLK29, s tím, že obsahuje gen PKS, který zahrnuje ery zaváděcí modul, dále první, druhý a třetí rozšiřovací modul genového seskupení ery a dále potom ery řetězec ukončující thioesterázu, přičemž segment DNA mezi koncem acyltransferázy a začátkem ACP druhého ery rozšiřovacího modulu byl nahrazen ekvivalentem segmentu modulu 10 rapamycin PKS. Výsledný produkt byl připraven níže popsaným způsobem.
-36Plazmid pJLK50 byl štěpen pomocí restrikčního enzymu Nhel a insert o délce 6, 1 kbp byl ligov.án s plazmidem pJLK29, který byl rovněž štěpen Nhel. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK53 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 22: Použití plazmidu pJLK54 pro konstrukci rekombinantních bakterií
S.
erythraea
NRRL2338/pJLK54 a produkci derivátů tetraketidů a makrolidů.
Přibližně 5 pg plazmidu pJLK54 bylo použito k transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 a poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že plazmid se integroval do TE.
Buňky S. erythraea NRRL2338/pJLK54 byly použity k naočkování media SM3 s obsahem 5 pg/ml thiostreptonu a kultivovány po dobu od 7 do 10 dní při 28-30°C. Po uplynutí této doby byla suspenze zcentrifugována a pH supernatantu upraveno na pH=9,5. Supernatant byl poté třikrát extrahován shodným objemem ethyl acetátu a rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením. Zbytek byl rozpuštěn v methanolu a analyzován metodou GC/MS, HPLC/MS a MS-MS. Tetraketidy byly identifikovány pomocí metody GC/MS. Hlavní komponentu představoval
Následující makrolid byl identifikován metodou HPLC/MS, MSMS a 1H-NMR (byl doprovázen produkty neúplného zpracování enzymy post-PKS).
Avermektiny
Příklad 23: Konstrukce plazmidu pJLK136
Plazmid pJLK136 je založen na plazmidu pWHM3, s tím, že obsahuje hraniční oblasti po a proti směru exprese redukční smyčky druhého modulu genu pro avermektin polyketidsyntázu a do mnohonásobného klonovacícho místa oddělujícího tyto
-38oblasti má vložen gen pro rezistenci k erytromycinu. Plazmid pWHM3 byl popsán J. Varou a dalšími, J. Bacteriol. 1989,
171: strana 5872 až 5881. Výsledný plazmid pJLK136 byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
• · «····· ·· · ··· ··· · · · · • · · · ···· · · · ····»·· « ··· · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· · · · · ·
Konstrukce plazmidů pJLK130
Přibližně 2,4 kbp dlouhý fragment genu pro avermektin polyketidsyntázu z bakterie S. avermítilis kódující oblast proti směru transkripce genu pro redukční smyčku modulu 2, byl amplifikován metodou PCR za použití syntetických oligonukleotidů:
5'-GACGC CGAAT TCTTC GGCAT CAGCC CCCGC GAAG-3' a
5'-GAGCT AGCAG GTGGG GAGAT CTAGG TGGGT GTGGG TGTGG GGTTG
GTTGT GGTGG TGGGT GTA-3'
Jako templát byl použit plazmid pIG22 (viz Galloway, I. S. (1998) Dizertační práce, Univerzita Cambridge, UK) . Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK130 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidů pJLK131
Přibližně 2,0 kbp dlouhý fragment genu pro avermektin polyketidsyntázu z bakterie S. avermítilis kódující oblast
-39• · ······ ·· · •· · · · · ···· • · · · ···· · · · ·····«· · ··· · · • · ·· · · 9 · • · · · ·· «·· ·· ··· po směru transkripce genu pro redukční smyčku modulu 2, byl amplifikován metodou PCR za použití syntetických oligonukleotidů:
5'-GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-3' a
5'-GGGAATTCCTCGAGGATGACGTGGGCGTTGGTGC-3 '
Jako templát byl použit plazmid pIG25 (viz Galloway, I. S. (1998) Dizertační práce, Univerzita Cambridge, UK) . Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK131 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidu pJLK132
Plazmid pJLK130 byl naštěpen restrikčními enzymy Nhel a Xbal. Přibližně 2,4 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK131 naštěpeného rovněž enzymy Nhel a Xbal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK132 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pJLK133
Plazmid pJLK117 byl naštěpen restrikčními enzymy BglII a Nhel. Přibližně 0,1 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK132 naštěpeného rovněž enzymy BglII a Nhel.
• · · · • · • · · ·
-40Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK133 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pJLK134
Přibližně 1,9 kbp dlouhý fragment genu z erythromycinového genového shluku S.erythraea kódující gen pro rezistenci k erythromycinu byl amplifikován pomocí PCR za použití syntetických oligonukleotidů:
5'-TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-3' a
5'-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGTCCGCCG-3'
Jako templát byl použit plazmid pRH3 (Dhillon, N, a další, Molecular Microbiology (1989) 3: strana 1405 až 1414)). Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotid-kinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK134 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidu pJLK135
Plazmid pJLK134 byl naštěpen restrikčními enzymy BglII a Nhel. Přibližně 1,9 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK133 naštěpeného rovněž enzymy BglII a Nhel. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých • · · · • · · · · · · * · · ··· ««··· ·· · ······· · ♦ · ♦ · · • · ♦· · · · · ··· · ····· ·· ···
-41kolonii byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK135 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pJLK136
Plazmid pJLK135 byl naštepen restrikčním enzymem EcoRI. Přibližně 6,3 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pWHM3 naštěpeného rovněž enzymem EcoRI. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK136 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 24: Použití plazmidu pJLK136
Přibližně 10 pg plazmidu pJLK136 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. avermitilis (MacNeil, D.J. a Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2: strana 209 až 218). Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu erytromycinu. Byly vybrány jednotlivé kolonie, které byly čtyřikrát pasážovány v neselektivním kapalném médiu a poté z nich byly připraveny a regenerovány protoplasty (použitá média viz MacNeil T. a další J. Bacteriol. (1993) 175: strana 2552 až 2563). Tímto způsobem byly izolovány kolonie citlivé na thiostrepton a rezistentní k erytromycinu. Tyto kolonie byly dále charakterizovány pomocí Southern blotu. Jedna z těchto kolonií byla označena jako S. avermitilis/JLK1.
-42Přiklad 25: Konstrukce plazmidu pJLK137
Plazmid pJLK120 byl naštěpen restrikčními -enzymy BglII a Nsil. Přibližně 3,2 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK133 naštěpeného rovněž enzymy BglII a Nsil. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK137 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pJLK138
Plazmid pJLK137 byl naštěpen restrikčním enzymem EcoRI. Přibližně 7,6 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pWHM3 naštěpeného rovněž enzymem EcoRI. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK138 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 26: Použití plazmidu pJLK138
Přibližně 10 pg plazmidu pJLK138 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. avermitilis (MacNeil, D.J. a Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2: strana 209 až 218). Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu erytromycinu. Byly vybrány jednotlivé kolonie, které byly čtyřikrát pasážovány v neselektivním kapalném médiu a poté z nich byly připraveny a regenerovány protoplasty (použitá média viz MacNeil T. a další J. Bacteriol. (1993) 175: strana 2552 až 2563). Tímto způsobem byly izolovány kolonie citlivé na thiostrepton a
-43erytromycin. Tyto kolonie byly dále charakterizovány pomocí Southern blotu. Jedna z těchto kolonií byla označena jako S. avermitilis/pJLK138. Kolonií S. avermitilis/pJLK138 bylo naočkováno kapalné médium (Pang, C.H. a další J. of Antibiotics (1995) 48: strana 59 až 66)’. Z narostlých kultur byly izolovány produkty, které byly purifikovány podle literatury (Pang, C.H. a další J. of Antibiotics (1995) 48: strana 59 až 66). Produkty byly analyzovány pomocí HPLC/MS a 1H-NMR, přičemž byla identifikována následující sloučenina:
Příklad 27: Konstrukce plazmidu pJLK139
Plazmid pJLK121.1 byl naštěpen restrikčními enzymy BglII a Nhel. Přibližně 2,2 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK133 naštěpeného rovněž enzymy BglII a Nhel. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK139 byl identifikován restrikčním mapováním.
• · ·
-44• ·····« ·· • « · · · · • · · · ♦ · · · · ······ · ··· ·
Konstrukce plazmidů pJLK140
Plazmid pJLK139 byl naštěpen restrikčnim enzymem EcoRI. Přibližně 6, 6 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidů pWHM3 naštěpeného rovněž enzymem EcoRI. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentnich
| buněk E. coli DH10B. U jednotlivých | kolonií | byla prověřena | ||
| přítomnost | plazmidů. Požadovaný | plazmid | pJLK140 | byl |
| identifikován restrikčnim mapováním. | ||||
| Příklad 28: | Použití plazmidů pJLK140 | |||
| Přibližně | 10 μg plazmidů pJLK140 bylo | použito | pro |
transformaci protoplastů bakterií S. avermitilis (MacNeil, D.J. a Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2: strana 209 až 218). Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu erytromycinu. Byly vybrány jednctlivé kolonie, které byly čtyřikrát pasážovány v neselektivnim kapalném médiu a poté z nich byly připraveny a regenerovány protoplasty (použitá média viz MacNeil T. a další J. Bacteriol. (1993) 175: strana 2552 až 2563). Tímto způsobem byly izolovány kolonie citlivé na thiostrepton a erytromycin. Tyto kolonie byly dále charakterizovány pomocí Southern blotu. Jedna z těchto kolonií byla označena jako S. avermitilis/pJLK140. Kolonií S. avermitilis/pJLK140 bylo naočkováno kapalné médium (Pang, C.H. a další J. of Antibiotics (1995) 48: strana 59 až 66) . Z narostlých kultur byly izolovány produkty, které byly purifikovány podle literatury (Pang, C.H. a další J. of Antibiotics (1995) 48: strana 59 až 66) . Produkty byly analyzovány pomocí HPLC/MS a 1H-NMR, přičemž byla identifikována následující sloučenina:
-45• · ♦«♦·♦» ·· ··· * · f ·· • · · * · ·«« » « * ······ · ··· « • · · · · · · ««·
Přiklad 29: Konstrukce plazmidu pJLK30
Plazmid pJLK30 je založen na plazmidu pJLK117, s tím, že do polylinkeru byla za použití restrikčních míst BglII a Nhel vložena DNA kódující redukční smyčku modulu 1 avermektin polyketidsyntázy. Výsledný plazmid pJLK30 byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
Konstrukce plazmidu pIG67
Přibližně 1,7 kbp dlouhý fragment genu pro avermektin polyketidsyntázu z bakterie S. avermitilis kódující redukční smyčku modulu 1, byl amplifikován metodou PCR za použití syntetických oligonukleotidů:
5'-CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-3' a
5'-TGGGCTAGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGTG-3' «· «·*· ··· · * « · · ·« • * · ·*··· «· « ··«·«· · · ··· · · • « ·« ·»·· ··· * ·« ·* · 9 9 r * ·
-46Jako templát byl použit buď plazmid pIG155 obsahující první dva moduly avermektin polyketidsyntázy .nakloňované v plazmidů pT7-7, nebo chromosomální DNA bakterie S. avermitilis. Na produkt PCR bylo působeno T4 polynukleotidkinázou a poté byl ligován s plazmidem pUC18, který byl linearizován enzymem Smál a poté vystaven působení alkalické fosfatázy. Ligační směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B a u jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pIG67 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenací DNA.
Konstrukce plazmidů pJLK30
Plazmid pIG67 byl naštěpen restrikčními enzymy BglII a Nhel. Přibližně 1,7 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidů pJKL117 naštěpeného rovněž enzymy BglII a Nhel.. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK30 byl identifikován restrikčním mapováním.
| Příklad 30: | Použití plazmidů pJLK30 pro konstrukci rekombinantních bakterií S.erythraea JC2/PJLK30 a produkce triketidů |
Přibližně 5 pg plazmidů pJLK30 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. erythraea kmene JC2. Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern-blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že se plazmid integroval do TE. Bakterie S. erythraea kmene JC2/PJLK30 byly vysety na SM3 agar s obsahem 50 pg/ml • · · • · ·· 9«·· »* ·· * · · *· • · · · ···· ·« • »··· · · · · · ·» • · · · · ♦·
Λ·9 9 ·· 4··Μ
-47thiostreptonu. Buňky byly pěstovány dvanáct dnů při teplotě 30°C. 1 cm2 plotny byl poté homogenizován a extrahován směsí
1,2 ml ethylacetátu a 20 μΐ kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odpařeno a odparek rozpuštěn v methanolu a analyzován GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány jako δ-lakton (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-dihydroxy-2,4-dimethyl-n- hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 3R, 4S, SR)-5,3dihydroxy-2,4dimethyl-n-heptanové kyseliny (celkem 25 mg/1). Nebyl detekován téměř žádný odpovídající 3-ketolakton.
Příklad 31: Konstrukce plazmidů pGMS2
Plazmid pGMS2 je založen na plazmidů pJLK117 s tím, že do polylinkeru byla za použití restrikčních míst Pstl a Bsu36l vložena DNA kódující redukční smyčku modulu 1 avermektinpolyketidsyntázy. Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
Konstrukce plazmidů pIG68
Přibližně 1.7 kbp dlouhý fragment DNA z genu pro avermektin polyketidsyntázu S. avermitilis kódující redukční smyčku modulu 1 byl amplifikován pomocí PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů:
5'-TGGCTGCAGAGCTCACAGCCGGGTGCCGGATCCGGTT-3' a
5'-TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-3'
Jako templát byl použit buď plazmid pIG155, který obsahuje první dva moduly avermektin-polyketidsyntázy nakloňované do plazmidů pT7-7, nebo chromozomální DNA Streptomyces avermitilis. Na PCR produkt bylo působeno T4 polynukleotid
-48kinázou a poté byl vložen ligací do plazmidu pUC18 linearizovaného restrikčním enzymem Smál a poté defosforylovaného alkalickou fosfatázou. Ligačni směsí byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pIG68 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenováním.
Konstrukce plazmidu pGMSl
Plazmid pIG68 byl naštěpen restrikčními enzymy Pstl a Bsu36I. 1,7 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK116 naštěpeného enzymy Pstl a Bsu36I. Ligačni směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pGMSl byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidu pGMS2
Plazmid pGMSl byl naštěpen restrikčními enzymy Ndel a Xbal a přibližně 11,5 kbp dlouhý fragment DNA byl vložen ligací do plazmidu pCJR24 naštěpeného enzymy Ndel a Xbal. Ligačni směs byla použita k transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pGMS2 byl identifikován restrikčním mapováním.
-49• · ······ · · · • · 4 · · ····· ··· · 4 4 4 4 · ·« ······· « ··· » ·
444 4 44 444 44444
Příklad 32: Použiti plazmidu pGMS2 pro vytvoření rekombinantních bakterií S. erythraea JC2/pGMS2 a produkce triketidů
Přibližně 5 pg plazmidu pGMS2 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. erythraea kmene JC2. Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern-blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že se plazmid integroval do TE. Bakterie S. erythraea kmene JC2/pGMS2 byly vysety na SM3 agar s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu. Buňky byly pěstovány dvanáct dnů při teplotě 30°C. 1 cm2 plotny byl poté homogenizován a extrahován směsí
1,2 ml ethylacetátu a 20 pl kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odpařeno a odparek rozpuštěn v methanolu a analyzován GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány jako δ-lakton (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-dihydroxy-2,4-dimethyl-n- hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 3R, 4S,SR)-5,3dihydroxy-2,4-dimethyl-n-heptanové kyseliny (celkem 17 mg/1) . Ve vzorku bylo přítomno rovněž významné množství odpovídajícího 3-ketolaktonu (5.5 mg/1).
Ό
OH
Ό
-50• · · w • · • · · · • ·
Přiklad 33: Konstrukce plazmidů pJLK31
Plazmid pJLK31 je založen na plazmidů pJLKll’7 s tím, že do polylinkeru byla za použití restrikčních míst BglII a Nhel vložena DNA kódující redukční smyčku modulu 2 avermektinpolyketidsyntázy. Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
Konstrukce plazmidů pIG69
Přibližně 2,4 kbp dlouhý fragment DNA z genu pro avermektin polyketidsyntázu z bakterií S. avermitilis kódující redukční smyčku modulu 2 byl amplifikován pomocí PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů:
5'-CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCACTACTG-3' a
5'-CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-3'
Jako templát byl použit buď plazmid pIG155, který obsahuje první dva moduly avermektin-polyketidsyntázy nakloňované do plazmidů pT7-7, nebo chromozomální DNA Streptomyces avermitilis. Na PCR produkt bylo působeno T4 polynukleotid kinázou a poté byl vložen ligací do plazmidů pUC18 linearizovaného restrikčním enzymem Smál a poté defosforylovaného alkalickou fosfatázou. Ligačni směsí byla použita pro transformaci elektrokompetentnich buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pIG68 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenováním.
Plazmid pIG69 byl naštěpen restrikčními enzymy BglII, Nhel a Dral. 1,7 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK117 naštěpeného enzymy BglII a Nhel . Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pJLK31 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 34: Použití plazmidu pJLK31 pro konstrukci rekombinantních bakterií S.erythraea JC2/PJLK31 a produkce triketidů
Přibližně 5 pg plazmidu pJLK31 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. erythraea kmene JC2. Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern-blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že se plazmid integroval do TE. Bakterie S. erythraea kmene JC2/PJLK31 byly vysety na SM3 agar s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu. Buňky byly pěstovány dvanáct dnů při teplotě 30°C. 1 cm2 plotny byl poté homogenizován a extrahován směsí
1,2 ml ethylacetátu a 20 pl kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odpařeno a odparek rozpuštěn v methanolu a analyzován GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány jako δ-lakton (2R, 25 3R, 4Ξ, 5R) -5,3-dihydroxy-2,4-dimethyl-n- hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3dihydroxy-2,4dimethyl-n-heptanové kyseliny (celkem 30 mg/1) .
• ······φ· • · · · · ·· • · · ♦ · · · ·· ······ · ··· ·
ΟΗ
Přiklad 35: Konstrukce plazmidů pGMS4
Plazmid pGMS4 je založen na plazmidů pJLK117 s tím, že do polylinkeru byla za použití restrikčních míst SnaBI a Bsu36I vložena DNA kódující redukční smyčku modulu 2 avermektinpolyketidsyntázy. Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
Konstrukce plazmidů pIG70
Přibližně 2,4 kbp dlouhý fragment DNA z genu pro avermektin polyketidsyntázu z bakterií S. avermitilis kódující redukční smyčku modulu 2 byl amplifikován pomocí PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů:
5'-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-3' a
5'-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-3'
Jako templát byl použit buď plazmid pIG155, který obsahuje první dva moduly avermektin-polyketidsyntázy nakloňované do plazmidů pT7-7, nebo chromozomální DNA Streptomyces avermitilis. Na PCR produkt bylo působeno T4 polynukleotid kinázou a poté byl vložen ligací do plazmidů pUC18 linearizovaného restrikčním enzymem Smál a poté • · • · · · ··· · · · ···· ··· · ···· · · · ······· · ··· · · • · ·· ···· ··· · ·· ··· · · ···
-53defosforylovaného alkalickou fosfatázou. Ligační směsí byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli
DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pIG68 byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenováním.
Konstrukce plazmidů pGMS3
Plazmid pIG70 byl naštěpen restrikčními enzymy SnaBI, Bsu36l a Dral. 2,4 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidů pJLK116 naštěpeného enzymy SnaBI a Bsu36l . Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pGMS3 byl identifikován restrikčním mapováním.
Konstrukce plazmidů pGMS4
Plazmid pGMS2 byl naštěpen restrikčními enzymy Ndel a Xbal. Přibližně 12,4 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidů pJLK116 naštěpeného enzymy Ndel a Xbal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidů. Požadovaný plazmid pGMS4 byl identifikován restrikčním mapováním.
Příklad 36: Použití plazmidů pGMS4 pro konstrukci rekombinantních bakterií S.erythraea JC2/pGMS4 a produkce triketidů
Přibližně 5 pg plazmidů pGMS4 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. erythraea kmene JC2. Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z
-54• · ······ · · • · · ··· ·· ··· · ···· · · ······· · · · · · několika kolonii byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern-blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že se plazmid integroval do TE. Bakterie S. erythraea kmene JC2/pGMS4 byly vysety na SM3 agar s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu. Buňky byly pěstovány dvanáct dnů při teplotě 30°C. 1 cm2 plotny byl poté homogenizován a extrahován směsí
1,2 ml ethylacetátu a 20 μΐ kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odpařeno a odparek rozpuštěn v methanolu a analyzován GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Byla identifikována pouze stopová množství požadovaných triketidů.
Příklad 37: Konstrukce plazmidu pJLK27
Plazmid pJLK27 je založen na plazmidu pJLK114 s tím, že do polylinkeru byla vložena DNA kódující redukční smyčku modulu 13 rap-polyketidsyntázy. Výsledný konstrukt byl připraven klonováním přes několik níže uvedených intermediárních plazmidů.
Konstrukce plazmidu pJLK120a
Přibližně 3,2 kbp dlouhý fragment DNA z genu pro rapC polyketidsyntázu z bakterií S. hygroscopicus kódující redukční smyčku modulu 13 byl amplifikován pomocí PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů:
5'-TACCTAGGCACCACCACAACCCGGGTA-3' a
5'-TACAATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-31
Jako templát byl použit kosmid cos 31 (Schwecke, T. a další (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: strana 7839 až 7843). Na PCR produkt bylo působeno T4 polynukleotid kinázou a poté byl vložen ligací do plazmidu pUC18 linearizovaného • · • ·
restrikčním enzymem Smál a poté defosforylovaného alkalickou fosfatázou. Ligační směsí byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E, coli DH10B. U jednotlivých kolonií byla prověřena přítomnost plazmidu. Požadovaný plazmid pJLK120a byl identifikován restrikčním mapováním a sekvenováním.
Konstrukce plazmidu pJLK27
Plazmid pJLK120a byl naštěpen restrikčními enzymy AvrlI a Hpal. 3,2 kbp dlouhý fragment byl ligací vložen do plazmidu pJLK114 naštěpeného enzymy AvrlI a Hpal. Ligační směs byla použita pro transformaci elektrokompetentních buněk E. coli
DH10B. U jednotlivých kolonií plazmidu. Požadovaný plazmid restrikčním mapováním.
byla prověřena přítomnost pJLK27 byl identifikován
| Příklad 38: | Použití plazmidu pJLK27 pro konstrukci rekombinantních bakterií S.erythraea JC2/pJLK27 a produkce triketidů |
Přibližně 5 pg plazmidu pJLK27 bylo použito pro transformaci protoplastů bakterií S. erythraea kmene JC2. Poté byly izolovány kolonie stabilně rezistentní k thiostreptonu. Z několika kolonií byla získána celková DNA a analyzována metodou Southern-blot hybridizace, čímž bylo potvrzeno, že se plazmid integroval do TE. Bakterie S. erythraea kmene JC2/pJLK27 byly vysety na SM3 agar s obsahem 50 pg/ml thiostreptonu. Buňky byly pěstovány dvanáct dnů při teplotě 30°C. 1 cm2 plotny byl poté homogenizován a extrahován směsí
1,2 ml ethylacetátu a 20 pl kyseliny mravenčí. Rozpouštědlo bylo slito a odpařeno a odparek rozpuštěn v methanolu a analyzován GC/MS a elektrosprayovou hmotnostní spektroskopií. Hlavní produkty byly identifikovány (a porovnány se standardy) jako δ-lakton (2R, 4S, 5R)-2,4dimethyl-5-hydroxy-n-hexanové kyseliny a jako δ-lakton (2R, 4S, 5R)-2,4-dimethyl-5-hydroxy-n-heptanové kyseliny (celkem 41 mg/1). Dále bylo identifikováno určité množství odpovídajících 3-ketolaktonů (celkem 12 mg/1) a
3-hydroxylaktonů (celkem 2,8 mg).
• · · ·
Claims (20)
1. Nukleová kyselina kódující alespoň část polyketidsyntázy I. třídy, přičemž uvedená část obsahuje alespoň část extenzního modulu, a ve které je jeden nebo více genů kódujících enzymy asociované s redukční funkcí nahrazen polylinkerem s mnohonásobným cílovým místem pro restrikční enzymy.
2. Nukleová kyselina podle nároku 1, ve které je v uvedeném extenzním modulu polylinker nahrazující všechny geny kódující enzymy asociované s redukční funkcí.
3. Nukleová kyselina kódující alespoň část polyketidsyntázy I. třídy, přičemž uvedená část obsahuje alespoň část extenzního modulu, a která obsahuje polylinker s mnohonásobným cílovým místem pro restrikční enzymy spojující nukleovou kyselinu kódující alespoň část AT domény s nukleovou kyselinou kódující alespoň část ACP domény.
4. Nukleová kyselina podle libovolného z předchozích nároků, ve které' část kódující polyketidsyntázu I. třídy neobsahuje alespoň některá z cílových míst pro restrikční enzymy, která se vyskytují na polylinkeru.
5. Nukleová kyselina podle libovolného z předchozích nároků, přičemž alespoň některá z cílových míst pro restrikční enzymy v polylinkeru jsou neobvyklá nebo se nevyskytují v dalších přirozených nukleových ·♦ · · • · kyselinách kódujících redukční domény polyketidsyntáz I. třídy.
6. Nukleová kyselina podle libovolného z předchozích nároků, přičemž polylinker obsahuje alespoň některé z následujících restrikční míst: AvrlI, BglII; SnaBI; Pstl; Spěl; Nsil; Bsu361; Nhel; a Hpal.
7. Nukleová kyselina podle libovolného z předchozích nároků, která navíc kóduje zaváděcí (loading) modul.
8. Nukleová kyselina podle libovolného z předchozích nároků, která navíc kóduje jeden nebo více dalších extenzních modulů.
9. Nukleová kyselina podle libovolného z předchozích
β-ketoreduktáza, dehydratáza a/nebo enoylreduktáza.
11. Nukleová kyselina podle nároku 10, přičemž uvedená redukční doména (domény) obsahuje (obsahují) alespoň β-ketoreduktázu.
12. Nukleová kyselina podle nároků 10 nebo 11, přičemž je alespoň jedna z uvedených redukčních domén z jiného extenzního modulu stejné polyketidsyntázy alespoň části polyketid syntézy I. třídy.
13. Nukleová kyselina podle libovolného z nároků 10 až 12, přičemž je alespoň jedna z uvedených redukčních domén z jiné polyketidsyntázy.
14. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle libovolného z předchozích nároků.
15. Hostitelská buňka transfikovaná, konjugovaná nebo transformovaná nukleovou kyselinou nebo vektorem podle libovolného z předchozích nároků.
16. Hostitelská buňka podle nároku 15, přičemž jde o buňku bakterií rodu Streptomyces.
17. Hostitelská buňka podle nároku 16, přičemž jde o buňku bakterií druhu S. erythraea nebo S.avermitilis.
18. Způsob přípravy nukleové kyseliny kódující novou polyketidsyntázu vyznačující se tím, že se:
i) použije nukleová kyselina podle libovolného z nároků 1 až 8 ii) do této kyseliny vloží nukleová kyselina kódující alespoň jednu redukční doménu.
19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedená nukleová kyselina kódující alespoň • · ····«· ·« « • · · ♦·· · · 4 « • · · · · e · · · · · ······· · ··· * * • · ·· ···· ··· · ·· ··· ·· ···
-60- 6'/ jednu redukční doménu odpovídá libovolnému z nároků 9 až 13.
20. Způsob výroby produktu fermentace obsahující polyketidy vyznačující se tím, že se kultivují buňky podle nároku 15.
21. Produkt fermentace, který obsahuje C22-C23 dihydroavermektin v podstatě prostý dalších makrolidů.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9814622.8A GB9814622D0 (en) | 1998-07-06 | 1998-07-06 | Polyketides,their preparation,and materials for use therein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ200123A3 true CZ200123A3 (cs) | 2001-12-12 |
Family
ID=10835024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ200123A CZ200123A3 (cs) | 1998-07-06 | 1999-07-06 | Polyketidy, jejich příprava a materiály, které je obsahují |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7001747B1 (cs) |
| EP (1) | EP1095147B1 (cs) |
| JP (1) | JP2002519066A (cs) |
| KR (1) | KR20010074652A (cs) |
| CN (1) | CN1316002A (cs) |
| AT (1) | ATE321138T1 (cs) |
| AU (1) | AU762185B2 (cs) |
| BR (1) | BR9911898B1 (cs) |
| CA (1) | CA2332491A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ200123A3 (cs) |
| DE (1) | DE69930515T2 (cs) |
| GB (1) | GB9814622D0 (cs) |
| HU (1) | HUP0105464A2 (cs) |
| ID (1) | ID27760A (cs) |
| IL (1) | IL140439A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA00012894A (cs) |
| NZ (1) | NZ509602A (cs) |
| PL (1) | PL345851A1 (cs) |
| TR (1) | TR200100027T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000001827A2 (cs) |
| YU (1) | YU1001A (cs) |
| ZA (1) | ZA200100775B (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ304422B6 (cs) * | 2001-03-29 | 2014-04-30 | Plansee Tizit Aktiengesellschaft | Způsob výroby žáruvzdorné formulace na bázi tvrdého kovu |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000245457A (ja) * | 1999-02-24 | 2000-09-12 | Kitasato Inst:The | エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子 |
| WO2001062939A1 (fr) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de production d'un derive d'avermectine |
| KR20020012395A (ko) * | 2000-08-07 | 2002-02-16 | 김종하 | 사이버 카드 매매제어방법 |
| AU2003217591B2 (en) * | 2002-02-19 | 2009-02-26 | Corteva Agriscience Llc | Novel spinosyn-producing polyketide synthases |
| DE60315723T2 (de) | 2002-07-16 | 2008-06-19 | Biotica Technology Ltd. | Herstellung von Polyketiden und anderen natürlichen Produkten |
| US7407941B2 (en) * | 2003-08-26 | 2008-08-05 | Pfizer, Inc. | N-desmethyl-N-substituted-11-deoxyerythromycin compounds |
| GB0327720D0 (en) | 2003-11-28 | 2003-12-31 | Biotica Tech Ltd | Erythromycins and process for their preparation |
| GB0417852D0 (en) | 2004-08-11 | 2004-09-15 | Biotica Tech Ltd | Production of polyketides and other natural products |
| WO2010034243A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Shanghai Institute Of Organic Chemistry, Chinese Academy Of Sciences | Novel gene cluster |
| GB0904540D0 (en) | 2009-03-17 | 2009-04-29 | Biotica Tech Ltd | Novel compounds and methods for their production |
| GB0914589D0 (en) | 2009-08-20 | 2009-09-30 | Biotica Tech Ltd | Novel compounds and methods for their production |
| US9119853B2 (en) | 2010-02-09 | 2015-09-01 | Neurovive Pharmaceutical Ab | Sanglifehrin based compounds |
| WO2011098808A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Biotica Technology Limited | Sanglifehrin based compounds |
| WO2011098805A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Biotica Technology Limited | Sanglifehrin based compounds |
| CN106916836B (zh) * | 2015-12-24 | 2022-08-12 | 武汉合生科技有限公司 | 化合物的生物合成基因簇及其应用 |
| CN106619540A (zh) * | 2016-10-10 | 2017-05-10 | 东莞市麦亘生物科技有限公司 | 一种抗肝癌纳米核酸类冻干粉及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4199569A (en) * | 1977-10-03 | 1980-04-22 | Merck & Co., Inc. | Selective hydrogenation products of C-076 compounds and derivatives thereof |
| ES2079436T3 (es) * | 1989-03-31 | 1996-01-16 | Merck & Co Inc | Clonacion de genes de streptomyces avermitilis para biosintesis de avermectinas y procedimientos para su uso. |
| NZ240150A (en) * | 1990-10-15 | 1993-07-27 | Merck & Co Inc | Fermentation medium and its use in the production of ivermectin derivatives |
| EP2182067A3 (en) * | 1996-07-05 | 2010-07-14 | Biotica Technology Limited | Hybrid polyketide synthases |
| GB9814006D0 (en) * | 1998-06-29 | 1998-08-26 | Biotica Tech Ltd | Polyketides and their synthesis |
-
1998
- 1998-07-06 GB GBGB9814622.8A patent/GB9814622D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-07-06 CZ CZ200123A patent/CZ200123A3/cs unknown
- 1999-07-06 TR TR2001/00027T patent/TR200100027T2/xx unknown
- 1999-07-06 IL IL14043999A patent/IL140439A0/xx unknown
- 1999-07-06 MX MXPA00012894A patent/MXPA00012894A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-07-06 US US09/743,162 patent/US7001747B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-06 JP JP2000558217A patent/JP2002519066A/ja active Pending
- 1999-07-06 ID IDW20010275A patent/ID27760A/id unknown
- 1999-07-06 CN CN99810270A patent/CN1316002A/zh active Pending
- 1999-07-06 BR BRPI9911898-0A patent/BR9911898B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-07-06 WO PCT/GB1999/002158 patent/WO2000001827A2/en active IP Right Grant
- 1999-07-06 KR KR1020017000136A patent/KR20010074652A/ko not_active Withdrawn
- 1999-07-06 EP EP99929580A patent/EP1095147B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-06 AU AU46365/99A patent/AU762185B2/en not_active Ceased
- 1999-07-06 NZ NZ509602A patent/NZ509602A/en unknown
- 1999-07-06 PL PL99345851A patent/PL345851A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-07-06 CA CA002332491A patent/CA2332491A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-06 AT AT99929580T patent/ATE321138T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-06 DE DE69930515T patent/DE69930515T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-06 HU HU0105464A patent/HUP0105464A2/hu unknown
- 1999-07-06 YU YU1001A patent/YU1001A/sh unknown
-
2001
- 2001-01-26 ZA ZA200100775A patent/ZA200100775B/en unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ304422B6 (cs) * | 2001-03-29 | 2014-04-30 | Plansee Tizit Aktiengesellschaft | Způsob výroby žáruvzdorné formulace na bázi tvrdého kovu |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4636599A (en) | 2000-01-24 |
| JP2002519066A (ja) | 2002-07-02 |
| TR200100027T2 (tr) | 2001-07-23 |
| IL140439A0 (en) | 2002-02-10 |
| CA2332491A1 (en) | 2000-01-13 |
| ZA200100775B (en) | 2001-11-05 |
| NZ509602A (en) | 2003-12-19 |
| MXPA00012894A (es) | 2002-07-02 |
| CN1316002A (zh) | 2001-10-03 |
| HUP0105464A2 (hu) | 2002-04-29 |
| HK1034535A1 (en) | 2001-10-26 |
| DE69930515D1 (de) | 2006-05-11 |
| YU1001A (sh) | 2003-04-30 |
| KR20010074652A (ko) | 2001-08-04 |
| BR9911898B1 (pt) | 2010-11-30 |
| ATE321138T1 (de) | 2006-04-15 |
| WO2000001827A2 (en) | 2000-01-13 |
| WO2000001827A3 (en) | 2000-04-27 |
| BR9911898A (pt) | 2001-03-27 |
| AU762185B2 (en) | 2003-06-19 |
| ID27760A (id) | 2001-04-26 |
| DE69930515T2 (de) | 2006-12-14 |
| PL345851A1 (en) | 2002-01-14 |
| EP1095147B1 (en) | 2006-03-22 |
| EP1095147A2 (en) | 2001-05-02 |
| US7001747B1 (en) | 2006-02-21 |
| GB9814622D0 (en) | 1998-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0910633B1 (en) | Hybrid polyketide synthase I gene | |
| US6251636B1 (en) | Recombinant oleandolide polyketide synthase | |
| CZ200123A3 (cs) | Polyketidy, jejich příprava a materiály, které je obsahují | |
| CZ20004912A3 (cs) | Polyketidy a jejich syntéza | |
| CA2405958C (en) | Hybrid glycosylated products and their production and use | |
| JP2008278895A (ja) | ブテニル−スピノシン殺虫剤生産のための生合成遺伝子 | |
| US6838265B2 (en) | Overproduction hosts for biosynthesis of polyketides | |
| CA2463167A1 (en) | Production, detection and use of transformant cells | |
| US7807418B2 (en) | Method for producing hybrid polyketide synthases | |
| US20010034046A1 (en) | Production of 8,8a-dihydroxy-6-deoxyerythronolide B | |
| WO2003106638A2 (en) | Methods and cells for improved production of polyketides | |
| HK1034535B (en) | Polyketides, their preparation, and materials for use therein | |
| JP2009219493A (ja) | ポリケチド類及びそれらの合成 |