CZ20004912A3 - Polyketidy a jejich syntéza - Google Patents

Description

Oblast techniky <r , Předkládaný vynález se týká způsobů a materiálů (včetně enzymových systémů, nukleových kyselin, vektorů a kultur) pro přípravu nových polyketidů, zejména makrolidů s 12-, 14- a 16členným kruhem, rekombinantní syntézou a takto připravených nových polyketidů. Geny pro biosyntézu polyketidů nebo jejich • v z části, které mohou být odvozeny z různých genových seskupení pro biosyntézu polyketidů, jsou upraveny tak, aby umožnily produkci specifických nových polyketidů, jako jsou 12-, 14- a 16-členné makrolidy předem definované struktury. Předkládaný vynález je zejména zaměřen na nahrazení genetického materiálu kódujícího přirozenou počáteční jednotku jinými geny pro přípravu makrolidů obsahujících přednostně acetatovou počáteční jednotku; nebo přednostně propionatovou jednotku; nebo přednostně neobvyklou počáteční jednotku; za minimalizace tvorby vedlejších produktů obsahujících jinou počáteční jednotku.

' Dosavadní stav techniky

Polyketidy jsou rozsáhlou a strukturálně diversifikovanou třídou přirozených sloučenin, do které patří mnoho sloučenin majících antibiotické nebo jiné farmakologické vlastnosti, jako je erythromycin, tetracykliny, rapamycin, avermectin, monensin, epothilony a FK506. Přesněji, polyketidy jsou hojně produkovány bakteriemi Streptomyces a jinými aktinomycetami. Jsou syntetizovány opakovanou postupnou kondenzací acylthioesterů způsobem podobným syntéze mastných kyselin. Větší strukturální diverzita existující mezi přirozenými polyketidy vzniká v důsledku výběru (obvykle) acetatu nebo propionatu jako počátečních nebo prodlužovacích jednotek; a

«· ··· · · ··· z různého stupně zpracováni β-skupiny probíhajícího po každé kondenzaci. Příklady stupňů zpracování zahrnují redukci na βhydroxyacyl-, redukci následovanou dehydratací na 2-enoyl-, a úplnou redukci na nasycený acylthioester. Stereochemický důsledek těchto stupňů zpracování je také specifický pro každý cyklus prodloužení řetězce.

Biosyntéza polyketidů je zahájena skupinou enzymů vytvářejících řetězec známých jako polyketid-synthasy. U aktinomycet byly popsány dvě třídy polyketid-synthas (PKS). Jedna třída, označovaná jako PKS typu I, představovaná PKS pro makrolidy erythromycin, oleandomycin, avermectin a rapamycin, se skládá z různé sady nebo modulu enzymů pro každý cyklus prodloužení řetězce polyketidů. Pro příklad viz obr. 1 (Cortés, J. et al., Nátuře (1990) 348: 176-178; Donadio, S. et al., Science (1991) 2523: 675-679; Swan, D.G. et al., Mol. Gen. Genet. (1994 242: 358-362; MacNeil, D.J. et al., Gene (1992) 115: 119-125; Schwecke, T. et al·., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843).

Termín prodlužovací modul, jak je zde použit, označuje sadu sousedících domén, od domény β-ketoacyl-ACP synthasy (AKS) do další proteinové domény acylového nosiče (ACP) domény, která provádí jeden cyklus prodloužení polyketidového řetězce. Termín zaváděcí modul označuje jakoukoliv skupinu sousedících domén, která provádí zavedení počáteční jednotky na PKS a tak způsobuje její dostupnost pro KS doménu prvního prodlužovacího modulu. Délka tvořeného polyketidů byla pozměněna, v případě biosyntézy erythromycinu, specifickým přesunem enzymové domény PKS produkující erythromycin, která obsahuje řetězec mající thioesterasovou/cyklasovou aktivitu, pomocí technik genového inženýrství (Cortés et al. Science •« · · * • · · · · *

(1995) 268:1487-1489; Kao, C.M. et al. J. /km. Chem. Soc.

(1995) 117:9105-9106).

Bylo popsáno, že delece DNA kódující část ketoreduktasové domény v modulu 5 PKS produkující erythromycin (též známé jako

6-deoxyerythronolid B synthasa, DEBS) provedená ve čtecím rámci vede ke tvorbě erythromycinových analogů 5,6-dideoxy-3-a-mycarosyl-5-oxoerythronolidu, 5,6-dideoxy-5-oxoerythronolidu B a 5,6-dideoxy,60-epoxy-5-oxoerythronolidu B (Donadio, S. et al. Science (1991: 252:675-679). Podobně, alterace aktivních zbytků v enoylreductasové doméně modulu 4 v DEBS, pomocí genetického upravení příslušné DNA kódující PKS a jejího vložení do Saccharopolyspora erythraea, vede k produkci 6,7-anhydroerythromycinu C (Donadio, S. et al. Proč Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90:7119-7123) .

Mezinárodní patentová přihláška č. WO 93/13663 popisuje další typy genetických úprav DEBS genů, které vedou k produkci pozměněných polyketidů. Nicméně, mnoho z těchto pokusů se ukázalo jako neproduktivní (Hutchinson, C. R. and Fujii, I., Annu. Rev. Microbiol. (1995), 49: 201-238, na str. 231). Byla popsána kompletní DNA sekvence genů ze Streptomyces hygroscopicus kódující modulární typ I PKS řídící syntézu makrocyklického imunosupresivního polyketidů rapamycinu (Schwecke, T. et al.,(1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:7839-7843). DNA sekvence je uložena v EMBL/Genbank Database pod přírůstkovým číslem X86780.

Druhá třída PKS, označovaná jako PKS typu II, je představována synthasami pro aromatické sloučeniny. PKS typu II obsahují pouze jednu sadu enzymatických aktivit pro prodloužení řetězce a tyto jsou znovu využívány podle potřeby v opakovaných cyklech (Bibb, M. J. et al. EMBO J. (1989) • · ·· · ··· * · ··*♦···· ··*«· ·«· ····· · · · · ·· • · · · · ·· ··· ·· ·· ♦·· ·« ···

8:2727-2736; Sherman, D. H. et al. EMBO J. (1989) 8:27172725; Fernandez-Moreno, M.A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278-19290). Prodlužovací jednotky pro PKS typu II jsou obvykle acetatové jednotky a přítomnost specifických cyklas určuje přednostní dráhu pro cyklizaci dokončeného řetězce na aromatickou sloučeninu (Hutchinson, C. R. and Fujii, I. Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49:201-238). Hybridní polyketidy byly získány vložením klonů DNA obsahujících gen pro PKS II. typu do jiného kmene obsahujícího jiné genové seskupení PKS typu II, například vložením DNA odvozené od genového seskupení pro actinorhodin, modře pigmentovaný polyketid ze Streptomyces coelicolor, do anthrachinonový polyketid-produkujícího kmene Streptomyces galileus (Bartel, P. L. et al. J. Bacteriol. (1990) , 172: 4816-4826) .

Minimální počet domén nutných pro prodloužení řetězce na PKS II. typu, při její expresi v Streptomyces coelicolor hostitelské buňce (minimální PKS) byl definován například v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 95/08548, která popisuje, že tato PKS musí obsahovat následující tři polypeptidy, které jsou produkty act I genů: nejprve KS; potom polypeptid označený CLF s celkovou podobností aminokyselinové sekvence s KS, ale ve kterém je aktivní zbytek KS, konkrétně cysteinový zbytek, substituován buď glutaminovým zbytkem, nebo v případě PKS pro pigment spor, jako je produkt whiE genu (Cháter, K.F. and Davis, N.K., Mol. Microbiol. (1990) 4: 16791691), zbytkem kyseliny glutamové (obr. 2); a nakonec ACP. CLF byla uvedena například v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 95/08548 jako faktor, který určuje délku polyketidového řetězce produkovaného minimální PKS. Nicméně, bylo zjištěno (Shen B. et al., J. AM. Chem. Soc. (1995) 117: 6811-6821), že když je CLF pro oktaketid actinorhodin použita místo CLF pro dekaketid tetracenomycin v hostitelské buňce Streptomyces • · • · · · · ··· · · · · ······ ··* c · ···»·· ♦··♦ · « ···· ··· • ·* · · * · ··· · · ··· glaucescens, není polyketidový produkt alterován z dekaketidu na oktaketid, takže přesná úloha CLF zůstává nejasná. Byla navrženo alternativní názvosloví, ve kterém je KS označován jako KSa a CLF je označován jako ΚΞβ, aby byly brány v úvahu tyto znalosti (Meurer, G. et al., Chemistry and Biology (1997), 4: 433-443). Mechanismus, kterým jsou acetatové počáteční jednotky a acetatové prodlužovací jednotky dodávány na PKS typu II není znám, ale předpokládá se, že malonylCoA:ACP acyltransferasa synthasy mastných kyselin hostitelské buňky může splňovat některé funkce pro PKS typu II (Revill, W. P. et al., J. Bacteriol. (1995) 177: 3946-3952).

Mezinárodní patentová přihláška č. WO 95/08548 popisuje nahrazení PKS genů pro actinorhodin heterologní DNA z jiného seskupení PKS genů pro získání hybridních polyketidů. Stejná Mezinárodní patentová přihláška WO 95/08548 popisuje přípravu kmene Streptomyces coelicolor, který v podstatě neobsahuje přirozené genové seskupení pro actinorhodin, ve kterém je použit plasmidový vektor pRM5 odvozený od vektoru SCP2* s nízkým počtem kopií izolovaného od Streptomyces coelicolor (Bibb, M.J. and Hopwood, D.A., J. Gen. Microbiol. (1981) 126: 427), ve kterém může být DNA kódující heterologní PKS exprimována pod kontrolou divergentního actl/actlll promotorového regionu genového seskupení pro actinorhodin (Fernandez-Moreno, Μ.Ά. et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278-19290). Plasmid pRM5 také obsahuje DNA z genového seskupení pro biosyntézu actinorhodinu kódující gen pro specifický aktivátorový protein, ActII-orf4. ActII-orf4 protein je nutný pro transkripci genů umístěných pod kontrolu actl/actll dvousměrného promotoru a aktivuje expresi genu během přechodu z růstu do stacionární fáze ve vegetativním myceliu (Hallam, S.E. et al., Gene (1988) 74: 305-320).

• · · · · · · ·· ·«·· ··· ··«·· · # ·· · · • ♦ · · · · • · · ·· · · ··· ·· ··♦

Je dobře známo, že seskupeni typu II v Streptomyces jsou aktivována aktivátorovými geny specifickými pro určitou metabolickou dráhu (Narva, Κ. E. and Feitelson, J. S. J. Bacteriol. (1990) 172:326-333; Stutzman-Engwall, K. J. et al.

J. Bacteriol. (1992) 174:144-154; Fernandez-Moreno, M.A. et al. Cell (1991) 66:769-780; Takano, E. et al. Mol. Microbiol. (1992) 6:2797-2804; Takano, E. et al. Mol Microbiol. (1992) 7:837-845). Produkt Dnrl genu doplňuje mutaci v actll-orf4 genu of S. coelicolor, což naznačuje, že Dnrl a ActII-orf4 proteiny působí na podobné cíle. Byl popsán gen (srmR) (EP 0 524 832 A2), který je umístěn poblíž genového seskupení pro PKS II. typu pro makrolidový polyketid spiramycin. Tento gen specificky aktivuje produkci makrolidového antibiotika spiramycinu, ale nebyly objeveny žádné další příklady takového genu. Také nebyly popsány žádné homology ActlI-orf4/DnrI/RedD rodiny aktivátorů, které by působily na geny pro PKS II. typu.

Ačkoliv bylo identifikováno velké množství terapeuticky významných polyketidů, přetrvává potřeba pro získáni nových polyketidů, které mají lepší vlastnosti nebo které mají zcela novou biologickou aktivitu. Komplex polyketidů produkovaný PKS I.typu je zejména významný v tom, že zahrnuje sloučeniny se známou použitelností jako antihelmintika, insekticidy, imunosupresiva, antimykotika nebo antibiotika. Vzhledem ke komplexnosti jejich struktury nemohou být takové nové polyketidy snadno získány chemickou syntézou ani chemickou modifikací známých polyketidů.

Existuje také potřeba vývoje spolehlivých a specifických způsobů pro použití jednotlivých modulů v praxi tak, aby všechny, nebo značná část, hybridních PKS genů, které jsou připraveny, byly funkční a produkovaly požadované polyketidové produkty.

··· ·· · ·· · ·«· · · ··· · ·♦· ······ ··· • ····« · · ·· · · • «·«· ··· • · · ·· · · ··♦ · ♦ »··

Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/GB97/01819 popisuje, že PKS genový soubor (konkrétně typu I) kóduje zaváděcí modul, po kterém následuje alespoň jeden prodlužovací modul. Obr. 1 ukazuje organizaci DEBS genů. První otevřený čtecí rámec kóduje první multi-enzym nebo kazetu (DEBS 1), která se skládá ze tří modulů: zaváděcího modulu (ery-zaváděcí modul) a dvou prodlužovacích modulů (modul 1 a modul 2). Zaváděcí modul obsahuje acyltransferasu a proteinový nosič pro acyl. Toto může být srovnáno s obr. 1 WO 93/13663 (viz výše). Tento obr. ukazuje ORF1, který se skládá z pouze dvou modulů, z nichž první je jak zaváděcí modul, tak první prodlužovací modul.

PCT/GB97/01819 popisuje obecně produkci hybridního PKS genového souboru obsahujícího zaváděcí modul a alespoň jeden prodlužovací modul. PCT/GB97/01819 také popisuje (viz též Marsden, A.F.A. et al., Science (1998), 279: 199-202) konstrukci hybridního PKS genového souboru pomocí přenosu zaváděcího modulu se širší specificitou pro polyketid synthasu produkující avermectin do první multienzyraové složky (DEBS 1) pro erythromycinovou PKS místo normálního zaváděcího modulu. Některé nové polyketidy mohou být připraveny za použití hybridního PKS genového souboru, jak je popsáno například v projednávané Mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB97/01810. Mezinárodní patentová přihláška č. PCT/GB97/01819 dále popisuje přípravu hybridního PKS genového souboru pomocí přenosu zaváděcího modulu pro polyketid synthasu produkující rapamycin do první multienzymové složky (DEBS 1) pro erythromycinovou PKS místo normálního zaváděcího modulu. Zaváděcí modul rapamycinové PKS se liší od zaváděcích modulů DEBS a avermektinové PKS v tom, že obsahuje doménu CoA ligasy, enoylreduktasovou (ER) doménu a ACP, takže vhodné organické kyseliny včetně přirozené počáteční jednotky ····· · · · · kyseliny 3,4-dihydrocyklohexankarboxylové mohou být aktivovány in šitu na zaváděči doméně PKS, a s nebo bez redukce ER doménou přenesenou na ACP pro intramolekulové zavedeni KS prodlužovaciho modulu 1 (Schwecke, T. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1995), 92: 7839-7843).

Byly popsány DNA sekvence pro několik seskupeni PKS genů typu I, které řidi produkci 16-členných makrolidových polyketidů, včetně tylosinové PKS ze Streptomyces fradiase (EP 0 791 655 A2), niddamycinové PKS ze Streptomyces caelestis (Kavakas, S.J. et al., J. Bacteriol. (1998), 179: 7515-7522) a spiramycinové PKS ze Streptomyces ambofacicens (EP 0791 655 A2). Všechny tyto genové sekvence máji společné to, že obsahuji zaváděcí modul PKS odlišný od zaváděcího modulu DEBS a avermektinové PKS v tom, že se skládá z domény napodobující KS domény prodlužovacích modulů, AT domény a ACP (obr. 3). Další N-koncová doména podobná KS byla označena KSq, protože se liší od prodlužovacích KS specifickým nahrazením aktivních cysteinových zbytků nutných pro aktivitu β-ketoacyl-ACP synthasy glutaminem (Q je v jednopísmeném kódu aminokyselin) . Funkce KSq domény je neznámá (Kavakas, S.J. et al., J. Bacteriol. (1998), 179: 7515-7522), ale její přítomnost v těchto PKS pro 16-členné makrolidy je překvapivá, protože počátečními jednotkami tylosinu, niddamycinu a spiramycinu se zdají být propionat, acetat a acetat, v příslušném pořadí, to znamená, že se jedná o stejný typ počátečních jednotek jako v DEBS. AT sousedící s KSq doménou zde označována jako ATq doména.

Když byl celý zaváděcí modul tylosinové PKS použit pro nahrazení analogického zaváděcího modulu ve spiramycinové PKS

S. ambofaciens (Kuhstoss et al., Gene (1996), 183: 231-236), změnil se charakter počáteční jednotky z acetatu na propionat.

• 9 9 · · · ·· «··· · · · · · 9 · • ····· · * ♦ · · · • ···· · · · • ·· «9 9* 99« ♦ · ···

Protože úloha KSq domény není známá, nebyl proveden žádný objev odhalující význam KSq domény ani možné použiti těchto zaváděcích modulů obsahujících KSq v určení počátečních jednotek polyketidových produktů, ani při produkci makrolidů ve velkém rozsahu. Interpretace tohoto výsledku byla: Proto předpokládáme, že zde uvedené pokusy silně podporují hypotézu, že AT domény v PKS systémech typu I vybírají vhodný substrát v každém stupni syntézy (Kuhstoss et al., Gene (1996), 183: 231-236, na str. 235). Tito autoři popisuji analogii s CLF proteinem v systémech PKS typu II a uvádějí, že poslední uvedený protein se účastní určování délky řetězce. Uvádějí: KSq může mít podobnou funkci, ačkoliv není jasné, jak by taková funkce mohla být nezbytná pro syntézu těchto 16členných polyketidů, když není nutná pro syntézu jiných komplexních polyketidů, jako je 6-DEB nebo rapamycin. V každém případě je nepravděpodobné, že by se KSq účastnila výběru substrátu v každém stupni syntézy. (Kuhstoss et al., Gene (1996), 183: 231-236).

Bylo prokázáno, že když je genetické inženýrství použito pro odstranění zaváděcího modulu DEBS, tak vzniklý zkrácený DEBS v Sacch. erythraea stále produkuje nízké hladiny erythromycínů obsahujících propionatovou počáteční jednotku (Pereda, A. et al., Microbiology (1995) 144: 543-553). Stejná práce uvádí, že když je v tomto zkráceném DEBS AT specifická pro methylmalonyl-CoA prodlužovacího modulu 1 nahrazena ATspecifickou pro malonyl CoA z prodlužovacího modulu rapamycinové PKS, tak jsou výsledným produktem také erythromyciny v nízké koncentraci, které obsahují propionatové počáteční jednotky, což ukazuje, že počáteční jednotky nevznikají dekarboxylací (methyl)malonylových skupin zavedených na enzym AT modulu 1, ale přímou acylací KS prodlužovacího modulu 1 propionyl-CoA. Toto je v protikladu k předchozím pracím, využívajícím částečně přečištěný

DEBS1+TE, zkrácenou biomodulární PKS odvozenou od DEBS (Kao,

C.M. et al., J. Am. Chem. Soc. (1995) 117: 9105-9106) a funkčního ekvivalentu k DEBS1+TE (Brown, M.J.B. et al., J.

Soc. Chem. Commun. (1995), 1517-1518; Cortés, J. et al., Science (1991), 2523: 675-679), které uvádějí, že mezi zdroje počátečních jednotek pro DEBS patří methylmalonatové jednotky, které jsou zavedeny na modul 1 a které jsou dekarboxylovány KS modulu 1 (Přeper, R. et al., Biochemistry (1997), 36: 18461851). Nyní bylo zjištěno, že když je DEBS1-TE protein plně přečištěn z extraktu rekombinantní Sacch. erythraea, nemá žádnou takovou specifickou dekarboxylasovou aktivitu (Weissmann, K. et al., (1998), Biochemistry 37: 11012-11017), což dále potvrzuje to, že počáteční jednotky ve skutečnosti nevznikají dekarboxylací prodlužovacích jednotek provedenou KS prodlužovacího modulu 1.

Nyní je známo, že DEBS zaváděcí modul má o něco větší specificitu než propionat samotný, a že acetatové počáteční jednotky jsou použity jak in vitro, tak in vivo, když je PKS obsahující tento zaváděcí modul částí PKS, která je exprimována buď v Sacch. erythraea přirozeném hostiteli pro produkci erythromycinu (viz například Cortés, J. et al., Science (1995), 268: 1487-1489), nebo v heterologním hostiteli, jako je S. coelicolor (Kao, C.M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994), 116: 11612-11613; Brown, M.J.B. et al., J. Soc. Chem. Commun. (1995), 1517-1519). Pokusy in vitro využívající přečištěný DEBS1-TE prokázaly, že propionyl-CoA a acetyl-CoA jsou alternativními substráty, které účinně nahrazují propionatové a acetatové jednotky, v příslušném pořadí, v zaváděcím modulu (Wiessmann, K.E.H. et al., Chemistry and Biology (1995) 2: 583-589; Pieper, R. et al., J. Am. Chem. Soc. (1995), 117: 11373-11374). Výsledek soutěže

mezi acetatovými a propionatovými počátečními jednotkami je ovlivněn příslušnými intracelulárními koncentracemi propionylCoA a acetyl-CoA převládajícími v použité hostitelské buňce (viz například Kao, C.M. et al., Science (1994), 265: 509-512; Pereda, A. et al., Microbiology (1995), 144: 543-553). Toto je také potvrzeno úrovní exprese PKS hostitele, jak je popsána v projednávané Mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB97/01819, která uvádí, že když je rekombinantní DEBS nebo jiná hybridní PKS obsahující DEBS zaváděcí modul nadměrně exprimována v Sacch. erythraea, tak jsou produkty obvykle směsi, jejichž složky se liší pouze přítomností acetatových nebo propionatových počátečních jednotek.

Existuje potřeba vývoje spolehlivých způsobů pro vyloučení tvorby směsí polyketidů obsahujících jak acetatové, tak propionatové počáteční jednotky, a pro umožnění specifických inkorporací neobvyklých počátečních jednotek. Nyní bylo překvapivě zjištěno, že úloha zaváděcích domén v PKS pro 16členné makrolidy tylosin, niddamycin a spiramycin je odlišná od úlohy zaváděcích domén v avermektinové PKS a DEBS. Bylo zjištěno, že KSq doména tylosinové PKS a asociovaná AT doména, která je zde označována jako ATq, jsou společně odpovědné za vysoce specifickou produkci propionatových počátečních jednotek, protože ATq je specifická pro zavedení methylmalonyl-CoA a ne propionyl-CoA, jak se předpokládalo dříve; a KSq je odpovědná za vysoce specifickou dekarboxylaci methylmalonatové jednotky navázané na enzym za vzniku propionatové jednotky navázané na ACP doménu zaváděcího modulu a vhodně umístěnou tak, aby mohla být přenesena do KS prodlužovacího modulu 1 pro iniciaci prodlužování řetězce. Podobně jsou ATq spiramycinové a nidamycinové PKS a sousední KSq odpovědné za specifické zavedení malonatových jednotek místo acetatových jednotek, jak se předpokládalo dříve, a za • ·· ·♦ 4 ·*· •· · · · ·*· « ·· jejich specifickou dekarboxylaci vedoucí ke vzniku acetatových počátečních jednotek pro prodlužování polyketidového řetězce.

Nyní bylo také zjištěno, že nejen PKS pro výše uvedené 16členrjé makrolidy, ale také PKS pro některé 14-členné makrolidy, konkrétně oleandomycinová PKS od Streptomyces antibioticus (obr. 4), a také PKS pro některé polyetherové ionoforové polyketidy, konkrétně domnělá monensinová PKS ze Streptomyces cinnamonensis (obr. 4), obsahují zaváděči doménu obsahující KSq doménu, ATq doménu a ACP. Na obr. 4 je uvedeno uspořádání sekvence KSq domén a sousedních ATq domén, které byly identifikovány, a jsou uvedeny konzervované glutaminové (Q) zbytky aktivního místa v KSq doménách a argininový zbytek, který je konzervovaný ve všech prodlužovacích AT doménách a také zcela konzervovaný v ATq doménách. Tento zbytek je charakteristicky jiný než arginin v AT doménách zaváděcích modulů DEBS nebo avermektinové PKS, kde je substrátem pro AT nekarboxylovaný ester acyl-CoA (Haydock, S.F. et al., FEBS Letters, (1995), 374: 246-248). Zkratka ATq je zde použita pouze pro odlišení AT domén přítomných bezprostředně na Ckonci KSq od prodlužovacích AT a nemá žádný jiný význam.

Podstata vynálezu

V jednom aspektu vynález poskytuje PKS multienzym nebo jeho část, nebo nukleovou kyselinu (obvykle DNA) kódující tento multienzym, kde uvedený multienzym nebo jeho část obsahuje zaváděcí modul a více prodlužovacích modulů, kde:

(a) zaváděcí modul je upraven tak, aby zaváděl malonylový zbytek nebo substituovaný malonylový zbytek a potom prováděl dekarboxylaci zavedeného zbytku za vzniku acetylového zbytku ··· · · ··» · ··* • · · · * · · · · • ····· · · · v · · • ···· ··· • · · ·· · · · » · · 9 « · · nebo substituovaného acetylového zbytku (kde tento termín zahrnuje propionyl) pro přenos na prodlužovaci modul; a (b) prodlužovaci moduly, nebo alespoň jeden z nich (výhodně alespoň modul sousedící se zaváděcím modulem) se v přirozeném stavu nevyskytují ve spojení se zaváděcím modulem, který provádí dekarboxylaci volitelně substituovaného malonylového zbytku.

Obvykle obsahuje zaváděcí modul také ACP (proteinový nosič pro acyl) doménu.

Výhodně je dekarboxylační funkce zaváděcího modulu dodána doménou KS (ketosynthasového) - typu. Výhodně se odlišuje od KS běžného prodlužovacího modulu tím, že obsahuje glutaminový zbytek místo zásadního cysteinového zbytku v aktivním místě. Tato doména je označena KSq. Může být přirozená nebo geneticky upravená, například vzniklá místně cílenou mutagenesí nukleové kyseliny kódující jinou KS, jako je KS prodlužovacího modulu.

Alternativně může být dekarboxylační funkce dodána doménou CLF typu, která se obvykle vyskytuje v PKS systémech II. typu.

Výhodně je zaváděcí funkce dodána doménou AT (acyltransferasového) typu, která napodobuje AT doménu běžného prodlužovacího modulu v tom, že obsahuje argininový zbytek v aktivním místě, který není přítomen v AT doménách zaváděcích modulů, které zavádějí acetat nebo propionat, například v DEBS nebo avermektinových PKS systémech. Tato doména může být označena ATq. Opět může být přirozená nebo geneticky upravená, například mutagenesí AT prodlužovacího modulu.

Obvykle je zaváděcí modul ve formě:

KSq-ATq-ACP kde ACP je proteinový nosič pro acyl.

V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro syntézu polyketidů obsahujících v podstatě výlučně požadovanou počáteční jednotku, který využívá PKS multienzym obsahující zaváděcí modul, jak byl definován výše, který specificky dodává požadovanou počáteční jednotku. Tento způsob může obsahovat poskytnutí nukleové kyseliny kódující multienzym a její vložení do organismu, ve kterém může být exprimována.

V dalším aspektu vynález poskytuje vektory a transformované organismy a kultury obsahující nukleové kyseliny kódující multienzym. Výhodným provedením je kultura, která produkuje polyketid mající požadovanou počáteční jednotku, který v podstatě neobsahuje polyketid s jinou počáteční jednotkou. Například, erythromycin může být produkován v podstatě bez produkce analogů vznikajících v důsledku inkorporace acetatových počátečních jednotek místo propionatu.

Výhodně kóduje hybridní PKS zaváděcí modul a 2 až 7 prodlužovacích modulů a enzym ukončující řetězec (obvykle thioesterasu).

Zejména výhodné je použití zaváděcího modulu typu KSq-ATqACP v souboru PKS genu produkujícího 12-, 14- nebo 16-členný makrolid, aby bylo možno získat 12, 14- nebo 16-členný makrolid, který obsahuje výlučně nebo téměř výlučně acetatové počáteční jednotky, i když je taková sestava PKS genu ··«·· 4 · · 4 · · • · · · · · · • · ·· «·· · 4 4 4 4 exprimována ve vysokých úrovních v aktinomycetové hostitelské buňce. Zejména vhodné PKS pro tento účel jsou složky PKS pro biosyntézu erythromycinu, oleandomycinu, tylosinu, spiramycinu, midecamycinu a niddamycinu, kde pro všechny tyto sloučeniny je alespoň částečně znám gen a organizace modulů. Zejména vhodnými zdroji genů kódujících zaváděcí modul typu KSq-ATq-ACP jsou zaváděcí moduly oleandomycinu, spiramycinu, niddamycinu, methymycinu a monensinu, které jsou specifické pro zavedení malonatových jednotek, které jsou potom dekarboxylovány na acetatové počáteční jednotky.

Podobně je zejména výhodné použití zaváděcího modulu typu

KSq-ATq-ACP v souboru PKS genu produkujícího makrolidy rifamycin, avermectin, rapamycin, immunomycin a FK506, jejichž zaváděcí moduly mají neobvyklou specificitu (a kde pro každý z nich je alespoň částečně znám gen a organizace modulů) pro přípravu takových makrolidů, které obsahují výlučně nebo téměř výlučně acetatové počáteční jednotky, i když je taková sestava PKS genu exprimována ve vysokých úrovních v aktinomycetové hostitelské buňce. Zejména vhodnými zdroji genů kódujících zaváděcí modul typu KSq-ATq-ACP jsou zaváděcí moduly oleandomycinu, spiramycinu, niddamycinu, methymycinu a monensinu, které jsou specifické pro zavedení malonatových jednotek, které jsou potom dekarboxylovány na acetatové počáteční jednotky.

Podobně je zejména výhodné použití zaváděcího modulu typu KSq-ATq-ACP v souboru PKS genu produkujícího 12-, 14- nebo 16členný makrolid, aby bylo možno získat 12, 14- nebo 16-členný makrolid, který obsahuje výlučně nebo téměř výlučně propionatové počáteční jednotky, i když je taková sestava PKS genu exprimována ve vysokých úrovních v aktinomycetové hostitelské buňce. Zejména vhodné PKS pro tento účel jsou ····· · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ··· ·· ··· složky PKS pro biosyntézu erythromycinu, methymycinu, oleandomycinu, tylosinu, spiramycinu, midecamycinu a niddamycinu, kde pro všechny tyto sloučeniny je alespoň částečně znám gen a organizace modulů. Zejména vhodným zdrojem genu kódujícího zaváděči modul typu KSq-ATq-ACP je zaváděcí modul tylosinu, který je specifické pro zavedení methylmalonatových jednotek, které jsou potom dekarboxylovány na propionatové počáteční jednotky.

Podobně je zejména výhodné použití zaváděcího modulu typu KSq-ATq-ACP v souboru PKS genu produkujícího makrolidy rifamycin, avermectin, rapamyc.in, immunomycin a FK506, jejichž zaváděcí moduly mají neobvyklou specificitu (a kde pro každý z nich je alespoň částečně znám gen a organizace modulů) pro přípravu takových makrolidů, které obsahují výlučně nebo téměř výlučně propionatové počáteční jednotky, i když je taková sestava PKS genu exprimována ve vysokých úrovních v aktinomycetové hostitelské buňce. Zejména vhodným zdrojem genu kódujícího zaváděcí modul typu KSq-ATq-ACP je zaváděcí modul tylosinu, který jr specifický pro zavedení methylmalonatových jednotek, které jsou potom dekarboxylovány na propionatové počáteční jednotky.

V zaváděcím modulu typu KSq-ATq-ACP mohou být domény nebo jejich části odvozeny ze stejných nebo z různých zdrojů a patři mezi ně přirozené nebo geneticky upravené domény. Například může být ATq doména nahrazena AT doménou z nějakého prodlužovacího modulu PKS typu I, který je specifický pro zavedení buď malonatových jednotek, nebo methylmalonatových jednotek, v příslušném pořadí, pokud je KSq doména vybrána tak, aby měla odpovídající specificitu k methylmalonatovým nebo malonatovým jednotkám, v příslušném pořadí.

♦ · · ·· · · · · ··· · ♦ ··· · ··· • · · · « * · · · · · • · · · · ♦ · ··· ·· ···

Alternativně může být KSq doména v zaváděcím modulu dodaná KSq-ATq-ACP substituovaná CLF polypeptidem PKS typu II. Nyní je známo, že oproti předchozím předpokladům, že jde o faktor určující délku řetězce, může mít CLF kromě jiných aktivit aktivitu analogickou aktivitě KSq domény a může účinkovat jako dekarboxylasa navázaných malonatových jednotek.

Zjištění, že CLF doména PKS typu II má dekarboxylační aktivitu vedlo k provedený zásahů do systémů typu II, například pro zvýšení výtěžku některých fermentací. Mnoho vysoce výtěžných průmyslových fermentací má tendenci ke vzniku směsí, ve kterých jsou přítomny složky inkorporující nežádoucí počáteční jednotky. Tak je tomu zejména v případě systémů, které obsahují pomocné geny pro přípravu neobvyklých počátečních jednotek. CLF geny mohou způsobovat produkci nežádoucích acylových typů, což vede ke vzniku materiálů obsahujících nežádoucí acylové jednotky.

Například produkce oxytetracyklinu vyžaduje neobvyklou malonamidovou počáteční jednotku. Nicméně, nežádoucí aktivita CLF domény způsobuje určitou dekarboxylaci, která vede k inkorporaci acetylu. Podobně syntéza daunomycinu vyžaduje neobvyklou počáteční jednotku, která podléhá parazitické aktivitě CLF domény.

Aktivní místo (pro dekarboxylaci) CLF domény obvykle obsahuje glutaminový zbytek. Zjistili jsme, že dekarboxylační aktivita domény může být odstraněna mutací, ve které je Gin zbytek přeměněn na (například) Ala.

V dalším aspektu tedy vynález poskytuje systém a způsob pro syntézu polyketidů typu II (aromatického), ve kterém je Gin • · * · · · · • · · · ♦ ··· zbytek CLF domény PKS typu II mutován pro potlačení dekarboxylační aktivity. Techniky místně cílené mutagenese, pomocí kterých může být toto provedeno, jsou dobře známé odborníkům v oboru.

Zaváděcí modul typu KSq-ATq-ACP může být navázán na hybridní PKS připravenou například podle PCT/GB97/01819 a PCT/GB97/01810. Je zejména výhodné navázat takový zaváděcí modul na genovou sestavu, která kóduje hybridní PKS, který produkuje nové deriváty 14-členných makrolidů, jak je popsáno například v PCT/GB97/01819 a PCT/GB97/01810.

Vynález dále poskytuje takové sestavy PKS vybavené zaváděcím modulem typu KSq-ATq-ACP, vektory obsahující takové sestavy a transformované organismy exprimující takové vektory. Transformované organismy mohou obsahovat rekombinantní plasmidy nebo mohou být takové plasmidy integrovány. Plasmid s int sekvencí se bude integrovat do specifického vazebného místa (att) chromosomu hostitele. Transformované organismy mohou modifikovat počáteční produkty, například provedením všech nebo některých biosyntetických modifikací běžných při produkci erythromycinů (jak je uvedena na obr. 5) a jiných polyketidů. Mohou být použity mutantní organismy, ve kterých jsou některé normální dráhy mutované, například pro produkci produktů s jednou nebo více přirozenými hydroxylovými skupinami nebo sacharidovými skupinami. Vynález dále poskytuje nové polyketidy produkovatelné, přímo nebo nepřímo, transformovanými organismy. Sem patří polyketidy, které byly zpracovány enzymovou modifikací.

V dalším aspektu vynález poskytuje jak známé polyketidy, tak nové polyketidy v čistší formě vzhledem k charakteru

počáteční jednotky, než bylo dosud možné získat. Sem patří makrolidy tvořené 12-, 14- a 16-členným kruhem, které jsou buď přirozené, nebo které se liší od příslušných přirozených sloučenin:

(a) v oxidačním stavu jedné nebo více ketidových jednotek (tj. výběru alternativ ze skupiny: -C0-, -CH(OH)-, alken, -CH- a -CH2-), kde stereochemické uspořádání -CH(OH)- je také vybráno nezávisle;

(b) v nepřítomnosti přirozeného methylového vedlejšího řetězce; nebo (c) ve stereochemickém uspořádání přirozeného methylu; a/nebo substituentů kruhu jiných než je methyl.

Je také možné připravit deriváty makrolidů tvořených 12-, 14-, nebo 16-členným kruhem odlišné od přirozených sloučenin ve dvou nebo více bodech (a) až (c) uvedených výše.

Mohou být také připraveny deriváty jakýchkoliv výše uvedených polyketidů, které byly dále zpracovány enzymy jinými než PKS, například jednou nebo více hydroxylacemi, epoxidacemi, glykosylacemi a methylacemi.

Předkládaný vynález poskytuje nový způsob pro získání jak známých, tak nových komplexních polyketidů bez tvorby směsí produktů lišící se pouze v tom, že obsahují buď propionatové, nebo acetatové počáteční jednotky. Dále předkládaný vynález poskytuje způsob pro přípravu nových polyketidů, ve kterých je počáteční jednotkou neobvyklá počáteční jednotka, která vzniká * · ♦ · · · · • · · · « · • · · · · ···♦· · · β · v důsledku působeni Ksq domény na sloučeninu vázanou na enzym, která je produktem AT s neobvyklou specificitou odvozené od modulu přirozeného PKS typu I. Konkrétně AT prodlužovaciho modulu 4 FK506 PKS genového seskupení přednostně využívá allylový vedlejší řetězec; AT prodlužovaciho modulu 6 niddamycinového PKS genového seskupení přednostně využívá vedlejší řetězec vzorce HOCH2-; a AT spiramycinového prodlužovaciho modulu 5 a monensinového prodlužovaciho modulu 5 přednostně využívá ethylový vedlejší řetězec.V každém případě je Ksq doména přednostně taková, která je v přirozeném stavu specifická pro propionat. Alternativně, jakákoliv KS z prodlužovaciho modulu PKS typu I může být přeměněna na Ksq doménu dekarboxylovat navázaný karboxylovaný acylový thioester, pomocí místně cílené mutagenese cysteinového zbytku aktivního místa pro jeho nahrazení jiným zbytkem, výhodně glutaminem. Nyní je známo, že synthasa živočišných mastných kyselin, která má mnoho společných rysů s PKS typu I, má za nepřítomnosti acetyl-CoA prokazatelnou dekarboxylasovou aktivitu pro malonyl-CoA (Kresze, G.B. et al., Eur. J.

Biochem. (1977) 79: 191-199). Po reakci s alkylačním činidlem, jako je jodacetamid, je synthasa mastných kyselin inaktivována specifickou modifikací cysteinu aktivního zbytku KS, a vzniklý protein má zesílenou dekarboxylasovou aktivitu pro malonylCoA. Přeměna KS domény pro mastnou kyselinu na dekarboxylasu odráží geneticky určenou změnu mezi KS doménami a Ksq doménou v PKS typu I. Kromě toho, velikost a polarita glutaminového vedlejšího řetězce se velmi podobá velikosti a polaritě karboxamido-cysteinu. Ksq použitá pro dekarboxylaci neobvyklé alkylmalonatové jednotky je výhodně vybrána ze stejného prodlužovaciho modulu stejného PKS typu I, který dodává neobvyklou AT, aby byla optimalizována dekarboxylace neobvyklého alkylmalonatu, a použitá ACP je také výhodně ACP stejného prodlužovaciho modulu.

Vhodné plasmidové vektory a geneticky upravené buňky vhodné pro expresi PKS genů obsahujících pozměněný zaváděcí modul jsou ty, které jsou popsány v PCT/GB97/O1819 jako vhodné pro expresi hybridních PKS genů typu I. Příklady použitelných hostitelů jsou Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces hygroscopicus, Micromonospora griseorubida, Streptomyces lasaliensis, Streptomyces venezuelae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces lividans, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Amycolatopsis mediterranei, a Streptomyces tsukubaensis. Mezi tyto organismy patří hostitelé, o kterých je známo, že se v nich plasmidy odvozené od SCP2* replikují autonomně, jako je například S. coelicolor, S. avermitilis a S. griseofuscus; a jiní hostitelé jako je Saccharopolyspora erythraea, ve kterých se plasmidy odvozené od SCP* integrují do chromosomu homologní rekombinací mezi sekvencí plasmidového insertu a chromosomu; a všechny takové vektory, které jsou integrativně transformovány integrovatelnými plasmidovými vektory.

Nikterá provedení vynálezu jsou ilustrována na následujících výkresech.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je diagram ukazující funkci 6-deoxyerythronolid B synthasy (DEBS), modulární PKS produkující 6-deoxyerytholidon B (6-DEB), prekursor erythromycinu A.

Obr. 2 ukazuje srovnání aminokyselinové sekvence KS domén a CLF domén representativních genových seskupení PKS typu II.

Cystein (C) aktivního místa KS domén je označen šipkou a odpovídá glutaminu (Q) nebo kyselině glutamové (E) CLF domén. Použité zkratky a příslušná Genbank/EMBL přírůsková čísla jsou: GRA, granaticin ze Streptomyces violaceoruber (X63449); HIR, neznámý polyketid ze Saccharopolyspora hirsuta (M98258); ACT, actinorhodin ze Streptomyces coelicolor (X63449); CIN, neznámý polyketid ze Streptomyces cinnamonensis (Z11511); VNZ, jadomycin ze Streptomyces venezuelae (L33245); NOG, anthracykliny ze Streptomyces nogalater (Z48262); TCM, tetracenomycin ze S. glaucescens (M80674); DAU, daunomycin ze Streptomyces sp. C5 (L34880); PEU, doxorubicin ze Streptomyces peucetius (L35560); WHI, WhiE pigment spor ze Streptomyces coelicolor (X55942).

Obr. 3 ukazuje organizaci genu PKS pro tři 16-členné makrolidy, tylosin, spiramycin a niddamycin.

Obr. 4 ukazuje uspořádáni aminokyselinové sekvence KSq-ATq zaváděcích didomén PKS pro niddamycin, platenolid (spiramycin), monensin, oleandomycin a tylosin. Sekvence zaváděcích domén pro monensin a oleandomycin nebyly dříve známé.

Obr. 5 ukazuje enzymatické stupně, které přeměňuji 6deoxyerythronolid B na erythromycin A v Saccharopolyspora erythrae.

Obr. 6 je diagram ukazující přípravu plasmidu pJLK117.

Obr. 7 ukazuje strukturu dvou oligonukleotidů.

• ·

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález bude nyní dokreslen v následujících příkladech, které nijak neomezuji rozsah vynálezu. Všechna NMR spektra byla měřena v CDC13r za použití Bruker 500 mHz DMX spektrometru, pokud není uvedeno jinak, a pozice píků jsou vyjádřeny jako díly na milion (ppm) od tetramethylsilanu. Atomové číslo uvedené v NMR vzorci nepředstavuje standardní hodnotu, ale odpovídá NMR datům pro jednotlivé příklady.

HPLC

Způsob A:

Kolona	Waters Symmetry 5 C18 2,1 mm x 150 mm
Průtok	0,29 ml/min
Mobilní fáze	Gradient: A:B (22:78) až A:B (38:62) během 12 minut, potom A:B (80:20) do minuty 15. Udržování po dobu 1 minuty. Opětovné uvedení do rovnováhy před dalším vzorkem. A = acetonitril a B = 0,01 M octan amonný v 10% acetonitrilu a 0,02% TFA

Způsob B:

Kolona	Waters Symmetry 5 C18 2,1 mm x 150 mm
Průtok	0,29 ml/min
Mobilní fáze	Gradient: 28:72 acetonitril:10 mM NH4OAC až 50:50 během 18 minut. 50:50 do 25 minut. Zpět na 28:72, opět uvedení do rovnováhy během 7 minut.
Přístroj	Hewlet-Packard 1100 LC/MS s APCI zdrojem

Vodné medium

Glukosa	5 g/1
Trypton	5 g/1

Kvasinkový extrakt 2,5 g/1

EDTA 36 mg/1

Vodovodní voda do 1 1 celkového objemu

ERY-P medium

Dextrosa 50 g/1

Nutrisoy^(tm) moučka 30g/1 (NH₄)₂SO₄ 3g/1

NaCI 5g/1

CaCO3 6g/1

Vodovodní voda do 1 1 celkového objemu pH upraveno na 7,0

Příklad 1: Příprava rekombinantního vektoru pPFL43

Plasmid pCJR24 se připraví způsobem popsaným v PCT/GB97/01819. pPFL43 je plasmid na bázi pCJR24 obsahující gen kódující hybridní polyketid-synthasu, která obsahuje zaváděcí modul monensinové PKS (izolovaný ze S.

cinnamonensis) , prodlužovací moduly 1 a 2 DEBS a thioesterasu ukončující řetězec. Plasmid pPFL43 se připraví následujícím způsobem:

Následující syntetické oligonukleotidy:

5'-CCATATGGCCGCATCCGCGTCAGCGT-3', a

5'-GGCTAGCGGGTCCTCGTCCGTGCCGAGGTCA~3', se použijí pro amplifikaci DNA kódující zaváděcí modul pro monensin za použití kosmidu, který obsahuje 5'-konec domnělých genů produkujících monensin ze S. cinnamonensin nebo chromosomální DNA od S. cinnamonensis jako templátu. PCR produkt velikosti 3,3 kb se přečistí gelovou elektroforesou,

zpracuje se T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL40. Plasmid pPFL40 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a podle analýzy sekvence.

Plasmid pHD30His je derivátem pNEWAVETE (PCT(GB97/01810), který obsahuje avermektinový zaváděcí modul, erythromycinové prodlužovací moduly 1 a 2 a ery thioesterasovou doménu. Plasmid pNEWAVETE se tráví EcoRI a HindlII a vloží se do něj syntetický spojovací oligonukleotid, který kóduje adici Ckoncové polyhistidinové sekvence k polypeptidu. Následující oligonukleotidy: 5'-AATTCACATCACCATCACCATCACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3', a 5'-AGCTTCTAGATGGCCAGACCTCCTACTAGTGATGGTGATGGTGATGTG-3' se tepelně zpracují a duplex se liguje do pNEWAVETE tráveného EcoRI a HindlII. Vzniklý plasmid se štěpí Ndel a Xbal a liguje se do plasmidu pCJR24, který se předem štěpí stejnými dvěma enzymy, za zisku plasmidu pND30His.

Plasmid pPFL40 se tráví Ndel a Nhel a 3,3 kb fragment se přečistí gelovou elektroforesou a liguje se do plasmidu pND30His, který se předem tráví Ndel a Nhel a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL43. Plasmid pPFL43 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příklad 2: Příprava S. erythraea JC2/pPFL43

Plasmid pPFL43 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2. Příprava kmene JC2, ze kterého jsou prakticky odstraněny vlastní geny pro DEBS, je popsána v projednávané patentové přihlášce PCT/GB97/01819. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 pg/ml thiostreptonu. Několik kolonií se testuje na přítomnost pPFL43 integrovaného do chromosomu Southernovým přenosem jejich genomové DNA s DIG-značenou DNA obsahující mon PKS fragment kódující zaváděcí modul.

Příklad 3: Produkce polyketidů za použití S. erythraea JC2/pPFL43

Zmrazená suspenze S. erythraea JC2/pPFL43 se naočkuje do eryP media obsahujícího 5 pg/ml thiostreptonu. Naočkovaná kultura se nechá růst po dobu 7 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium přefiltruje pro odstranění mycelií a pH se upraví na pH = 3,0. Medium se extrahuje dvakrát dvěma objemy ethylacetátu a kombinované extrakty se promyjí stejným objemem nasyceného roztoku chloridu sodného, suší se přes bezvodý síran sodný a ethylacetát se odstraní za redukovaného tlaku, za zisku surového materiálu Získaný materiál má vzorec uvedený dále a podle MS, GC-MS a ^XH-NMR je identický a autentickým vzorkem.

Příklad 4: Příprava S. erythraea NRRL2338/pPFL43 ··· ·· · A A» ··· « * ··< A A A A ♦······ A « • A·· A A « * A A AA • ΑΑΑ» A · A ··· ·· ·· · A · A C. A A A

Plasmid pPFL43 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338. Kolonie resistentni na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 pg/ml thiostreptonu. Několik kolonií se testuje na přítomnost pPFL43 integrovaného do chromosomu Southernovým přenosem jejich genomové DNA s DIGznačenou DNA obsahující mon PKS fragment kódující zaváděcí modul. Tímto způsobem se selektuje klon s integrovanou kopií pPFL43.

Příklad 5a: Produkce 13-methyl-erythromycinu A a B za použití Sacch. erythraea NRRL2338/pPFL43

Kultura Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 (pPFL43), připravená s insertem monensinové zaváděcí DUT DNA místo přirozené zaváděcí domény, jak bylo popsáno v příkladu 2, se naočkuje do 30 ml vodného media s 50 μg/ml thiostreptonu v 300 ml Erlenmeyerově baňce. Po třech dnech inkubace při 29 °C se tato baňka použije pro inokulaci 300 ml ERY-P media v 300 ml baňce. Medium se inkubuje při 29 °C a 200 rpm po dobu 6 dnů. V tuto dobu se pH media upraví pomocí NaOH na 8,5 a medium se extrahuje stejným objemem ethylacetátu. Ethylacetatový extrakt se odpaří do sucha při 45 °C za použití proudu dusíku v Zymark TurboVap LV odpařovacím přístroji a potom se rekonstituuje v 0,0625 objemech methanolu pro 16-násobné zahuštění extraktu. Struktura produktů se potvrdí LC/MS, způsobem A. Jako hlavní složka se pozoruje pík při retenčním čase 4,0 minuty, s m/z hodnotou 720 (M+H)⁺, odpovídající 13-methyl-erythromycinu A. Druhý pík má retenční čas 6,4 minuty a m/s hodnotu 704 (M+H)⁺, což odpovídá 13-methyl-erythromycinu B.

Příklad 5b: Produkce a získání 13-methyl-erythromycinu A a B za použití Sacch. erythraea NRRL2338/pPFL43 v objemu 8 1

Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 (pPFL43) se naočkuje do 1000 ml vodného media s 50 pg/ml thiostreptonu v 2,8 1 Fernbachově baňce. Po třech dnech inkubace při 29 °C se tato kultura použije pro inokulaci 8 1 ERY-P media ve 14 1 Microferm fermentačnim tanku (New Brunswick Scientifics Co., Inc., Edison, NJ). Medium se inkubuje při 28 °C při provzdušňování 8 1/min, miseni při 800 rpm a za udržováni pH mezi 6,9 a 7,3 pomoci NaOH nebo H2SO4 (15%). Po 24 hodinách se přidává voda pro udržováni objemu. Fermentace probíhá po dobu 167 hodin. Po této době se přítomnost 13-methyl-erythromycinu A a B potvrdí upravením vzorku z fermentačního tanku na pH 8,5 pomocí NaOH a potom extrakcí stejným objemem ethylacetátu. Ethylacetatový extrakt se odpaří do sucha při 45 °C za použití proudu dusíku v Zymark TurboVap LV odpařovacím přístroji a potom se rekonstituuje v 0,25 objemech methanolu pro 4-násobné zahuštění extraktu. Struktura produktů se potvrdí LC/MS, způsobem A. Jako hlavní složka se pozoruje pík při retenčním čase 4,1 minuty, s m/z hodnotou 720 (M+H)⁺, odpovídající 13methyl-erythromycinu A. Druhý pík má retenční čas 6,6 minuty a m/s hodnotu 704 (M+H)⁺, což odpovídá 13-methyl-erythromycinu B.

Přibližně 35 1 media obsahujícího přibližně 2,8 g 13methyl-erythromycinu A se zpracuje pro získání produktu. Medium se přefiltruje přes vyzkoušenou Ceraflo keramickou jednotku a vnese se do 500 ml kolony naplněné XAD-16 pryskyřicí. Produkt se eluuje za použití 100% methanolu. 175 ml CG-161 adsorpční kolona se připraví a uvede do rovnováhy 20% methanolem/vodou. Když se část roztoku obsahujícího produkt se upraví tak, aby obsahoval 20% methanol a vnese se do kolony, není pozorován žádný degradačni produkt. Promývání kolony až 40% methanolem/vodou selhává v odstranění jakýchkoliv významných množství nečistot. Eluce 50% methanolem/vodou vede k chromatografické separaci produktu od ··· ·· ·· ··· ·· · dvou hlavních nečistot, 13-methyl-erythromycinu B a degradačního produktu, 13-methyl-dehydroerythromycinu A. Nejčistší frakce se kombinují a zahustí se na přibližně 75% pomocí odpaření za dosažení koncentrace methanolu <10%. Pro zvýšení extrakce 13-methyl-erythromycinu A se přidává pevný hydrogenuhličitan sodný do celkové koncentrace 250 mM. Vodná vrstva obsahující produkt se extrahuje 2x methylenchloridem, pokaždé za použití jedné poloviny celkového objemu. Objem se sníží odpařením za zisku světle žlutého pevného materiálu. 13methyl-erythromycin A se přečistí rozpuštěním surových krystalů v methylenchloridu při teplotě okolí a ředěním na 15% methylenchlorid hexanem. Kalný roztok se umístí na 30 minut do teploty -10 °C a potom se kapalina dekantuje do druhé zkumavky a nečistoty zůstanou v první zkumavce ve formě oleje. Zkumavka se ponechá přes noc při -10 °C a následující den se odfiltrují špinavě bílé krystaly 13-methyl-erythromycinu A. Přibližně 300 mg 13-methyl-erythromycinu A se izoluje z částečného zpracování 35 1 media.

Přibližně 100 g materiálu odpařeného z původní kapaliny se dále použije pro izolaci 13-methyl-erythromycinu B. Zbytkový 13-methyl-erythromycin A se odstraní opakovanou extrakcí původního vzorku vodnou kyselinou octovou (pH 5). Získaná methylenchloridová vrstva se zpracuje chromatografií na 700 g silikagelu za použití 20% methanolu v methylenchloridu. Frakce bohatá na 13-methyl-erythromycin B, jak se určí LC/MS, se kombinují a odpaří se za zisku přibližně 11,0 g tmavého oleje. Olej se rozpustí v minimálním množství methanolu a vnese se do 500 ml kolony obsahující Amberchrom CG-161 pryskyřici. 13methyl-erythromycin B se eluuje při 2 objemech lože za hodinu pomocí 40% methanolu v deionizované vodě. Frakce velikosti jednoho objemu lože se odeberou a analyzují se LC/MS. frakce 42-62 se kombinují, ředí se na 20% roztok methanolu ··· ·· · ·· · •♦ · · · ··· · ··· ··· ··· ··· • ····· · · · · · · • · · · · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ··· deionizovanou vodou a neutralizující se na pH 7,5 pomocí hydrogenuhličitanu sodného. Vzniklý roztok se extrahuje jednou 4 1 methylenchloridu, zahustí se na 500 ml a suší se přes bezvodý síran hořečnatý. Po odstranění MgSCU filtrací se filtrát odpaří za zisku 110 mg světle hnědého pevného materiálu. 110 mg surového 13-methyl-erythromycinu B se rozpustí v přibližně 3,0 ml acetonitrilu HPLC čistoty a vnese se na silikagelovou destičku pro preparativní chromatografii na tenké vrstvě (PTLC) velikosti 20 cm x 20 cm, tloušťky 2 m. Destička se vyvíjí v methanolu:acetonitrilu (60:40). Požadovaná část silikagelu z PTLC plotny (vizualizovaná jodem) se odstraní a extrahuje se acetonem HPLC čistoty. Acetonový extrakt se odpaří za zisku 12,1 mg čirého pevného materiálu.

Identifikace vzorků 13-methyl-erythromycinu A a 13-methylerythromycinu B se potvrdí hmotností spektrometrií (LS/MS způsob B) a NMR spektrometrií. Pík vzorku 13-methylerythromycinu A má retenční čas 4,7 minuty, s m/z hodnotou 720 (M+H)⁺, což odpovídá 13-methyl-erythromycinu A. Pík vzorku 13-methyl-erythromycinu B má retenční čas 7,6 minuty, s m/z hodnotou 704 (M+H)⁺, což odpovídá 13-methyl-erythromycinu B.

• ·

#	13C - ppm	#H	1H - ppm
1	221.91	0
2	175.99	0
3	103.63	1	4.45
4	96.81	1	4.88
5	83.76	1	3.60
6	79.86	1	4.10
7	78.36	1	3.05
8	75.50	0
9	74.87	0
10	73.07	0
11	72.25	1	5.19
12	71.25	1	3.26
13	69.53	1	3.53
14	69.24	1	3.97
15	66.16	1	4.06
16	65.96	1	2.48
17	49.96	3	3.36
18	45.36	1	2.79
19	45.07	1	2.81
20	40.73	3	2.32
21	39.00	1	3.15
22	35.30	2	2.42/1.61
24	27.20	3	1.50
25	21.92	3	1.28
26	21.82	3	1.27
27	18.99	3	1.32
28	18.60	3	1.22
29	16.07	3	1.19
30	15.08	3	1.19
31	14.23	3	1.26
32	12.12	3	1.19
33	9.60	3	1.15
34	39.00	2	1.98/1.75
35	28.90	2	1.72/1.27
36	40.94	1	2.05

NMR, 13-methyl-erythromycin B:

#	13C - PPM	#H navázáno	1H-PPM
1	80.50	1	4.15
2	40.62	1	2.15
4	45.17	1	2.84
5	84.08	1	3.62
6	9.86	3	1.18
7	97.26	1	4.88
8	176.48	0
9	1525	3	1.22
11	75.98	0
12	35.43	2	2.42/1.61
16	103.75	1	4.46
17	38.77	'2	2.09/1.72
18	27.67	3	1.51
20	73.09	0
21	66.20	1	4.06
22	7027	1	5.58
23	7124	1	3.28
25	45.49	1	2.81
26	78.29	1	3.06
28	21.91	3	128
29	19.03	3	1.33
30	41.61	l	í 1-65
31	18.73	3	129
32	65.94	1	2.53
34	69.52	1	3.55
35	219.92	0
36	19.03	3	1.21
38	49.97	3	3.36
39	70.17	1	3.88
40	9.27	3	0.95
41	29.12	2	1.73/1.28
43	21.80	3	127
44	39.87	1	3.07
47	40.74	3	2.35
48	40.74	3	235
49	9.62	3	1.04

Příklad 6: Příprava rekombinantního vektoru pPFL42 pPFL42 je plasmid na bázi pCJR24 obsahující gen kódující hybridní polyketid-synthasu, která obsahuje zaváděcí modul tylosinové PKS, erythromycinové prodlužovací moduly 1 a 2 a thioesterasu ukončující řetězec. Plasmid pPFL42 se připraví následujícím způsobem:

Následující syntetické oligonukleotidy:

'-CCATATGACCTCGAACACCGCTGCACAGAA-3', a

5'-GGCTAGCGGCTCCTGGGCTTCGAAGCTCTTCT-3' se použijí pro amplifikaci DNA kódující zaváděcí modul pro tylosin za použití buď cps6T (kosmidu, který obsahuje geny pro PKS produkující tylosin ze S. fradiae), nebo chromosomální DNA od S. fradiae jako templátu. PCR produkt velikosti 3,3 kb se

přečisti gelovou elektroforesou, zpracuje se T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL39. Plasmid pPFL39 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a podle analýzy sekvence.

Plasmid pPFL39 se tráví Ndel a Nhel a 3,3 kb fragment se přečistí gelovou elektroforesou a liguje se do plasmidu pND30His, který se předem tráví Ndel a Nhel a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL42. Plasmid pPFL43 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příklad 7: Příprava S. erythraea JC2/pPFL42

Plasmid pPFL42 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 gg/ml thiostreptonu. Několik kolonií se testuje na přítomnost pPFL42 integrovaného do chromosomu Southernovým přenosem jejich genomové DNA s DIGznačenou DNA obsahující tyl PKS fragment kódující zaváděcí modul. Tímto způsobem se identifikuje klon s integrovanou kopií pPFL42.

Příklad 8: Produkce polyketidů za použití S. erythraea

JC2/pPFL42

Zmrazená suspenze S. erythraea JC2/pPFL42 se naočkuje do eryP media obsahujícího 5 pg/ml thiostreptonu. Naočkovaná kultura se nechá růst po dobu 7 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium přefiltruje pro odstraněni mycelií a pH se upraví na pH = 3,0. Medium se extrahuje dvakrát dvěma objemy ethylacetátu a kombinované extrakty se promyjí stejným objemem nasyceného roztoku chloridu sodného, suší se přes bezvodý síran sodný a ethylacetat se odstraní za redukovaného tlaku, za zisku surového materiálu. Získaný materiál má vzorec uvedený dále a podle MS, GC-MS a ¹H-NMR je identický a autentickým vzorkem.

Příklad 9: Příprava S. erythraea NRRL2338/pPFL42

Plasmid pPFL42 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 μg/ml thiostreptonu. Několik kolonií se testuje na přítomnost pPFL42 integrovaného do chromosomu Southernovým přenosem jejich genomové DNA s DIGznačenou DNA obsahující tyl PKS fragment kódující zaváděcí modul. Tímto způsobem se selektuje klon s integrovanou kopií pPFL42.

Příklad 10: Produkce polyketidů za použití S. erythraea

NRRL2338/pPFL42 • ·· ·· · ·· ··· · · · · · · · ·

Zmrazená suspenze S. erythraea NRRL2338/pPFL42 se naočkuje do eryP media obsahujícího 5 gg/ml thiostreptonu a nechá se růst po dobu 7 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium přefiltruje pro odstranění mycelií a pH se upraví na pH - 9,0. Supernatant se potom extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetatu a rozpouštědlo se odstraní odpařením. Získaný materiál se analyzuje HPLC/MS a identifikuje se makrolid, který má strukturu identickou s autentickým erythromycinem A (spolu s jinými produkty, které odpovídají erythromycinům B a D, které vznikají v důsledku neúplného post-PKS zpracování).

Příklad 11: Příprava plasmidu pPFL35

Plasmid pPFL35 je plasmid na bázi pCJR24 obsahující PKS gen obsahující zaváděči modul, první a druhý prodlužovací modul DEBS a thioesterasu ukončující řetězec. Zaváděcí modul obsahuje DNA KSq domény ze zaváděcího modulu oleandomycinové PKS fúzovaný na AT specifickou pro malonyl CoA modulu 2 rapamycinové PKS, nakonec navázanou na DEBS zaváděcí doménu ACP. Plasmid pPFL35 se připraví přes několik přípravných plasmidů následujícím způsobem:

411 bp segment DNA eryAI genu od S. erythraea v rozsahu od nukleotidu 1279 do nukleotidu 1690 (Donadio, S. et al., Science (1991) 2523: 675-679) se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů: 5'-TGGACCGCCGCCAATTGCCTAGGCGGGCCGAACCCGGCT-3', a 5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCC-3'.

DNA z plasmidu označeného pKSW, odvozeného od pT7-7 a DEBS1-TE, do které byla vložena nová Pstl a HindlII místa tak, aby obklopovala KS1 prvního prodlužovacího modulu, se použije jako templát. 441 bp produkt PCR se zpracuje se T4

polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL26. Nová Mfel/AvrlI místa ohraničující insert sousedí s EcoRI místem v polylinkeru pUC18. Plasmid pPFL26 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a podle analýzy sekvence.

Mfel restrikční místo je umístěno 112 bp od 5' konce DNA kódující propionyl-CoA:ACP transferasu zaváděcího modulu DEBS. Plasmid pKSW se tráví Mfel a Pstl a liguje se s 411 insertem získaným trávením plasmidu pPFL26 Mfel a Pstl. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL27. Plasmid pPFL27 obsahuje PKS gen obsahující DEBS zaváděcí modul, první a druhý prodlužovací modul DEBS a DEBS thioesterasu ukončující řetězec. Plasmid pPFL27 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Plasmid pPFL27 se tráví Ndel a AvrlI a liguje se na 4,6 kb insert odvozený z trávení plasmidu pMO6 (PCT/GB97/01819) Ndel a AvrlI. Plasmid pM06 obsahuje PKS gen obsahující DEBS zaváděcí modul, první a druhý prodlužovací modul DEBS a DEBS thioesterasu ukončující řetězec, s tou výjimkou, že DNA segment kódující AT specifickou pro methylmalonat v prvním prodlužovacím modulu byla specificky nahrazena DNA kódující AT specifickou pro malonat modulu 2 rap PKS. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL28. Plasmid pPFL28 obsahuje hybridní PKS gen obsahující DEBS zaváděcí modul, AT specifickou pro malonat • ·· ·· · ·· • · · · · ··· · ·· modulu 2 rap PKS, ACP zaváděcího modulu DEBS a potom první a druhý prodlužovací modul DEBS a DEBS thioesterasu ukončující řetězec. Plasmid pPFL28 se identifikuje restrikční analýzou.

DNA segment kódující KSq doménu z oleAI genu S. antibioticus od nukleotidu 1671 do nukleotidu 3385 se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidových primerů:

5’-CCACATATGCATGTCCCCGGCGAGGAA-3', a

5'-CCCTGTCCGGAGAAGAGGAAGGCGAGGCCG-3' a chromosomální DNA ze Streptomyces antibioticus jako templátu. PCR produkt se zpracuje T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL31. Nové Ndel místo ohraničující insert sousedí s EcoRI místem pUC18 polylinkeru, a nové BspEI místo sousedí s HindHI místem spojovacího regionu. Plasmid pPFL31 se identifikuje restrikční analýzou a analýzou sekvence.

Plasmid pPFL31 se tráví Ndel a AvrlI a insert se liguje s plasmidem pPFL28, který se předem tráví Ndel a AvrlI. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL32. Plasmid pPFL32 se identifikuje restrikční analýzou.

Plasmid pPFL32 se tráví Ndel a Xbal a insert se liguje s plasmidem pCRJ24, který se předem tráví Ndel a Xbal a přečistí se gelovou elektroforesou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL35. Plasmid pPFL35 se identifikuje restrikční analýzou.

Příklad 12: Příprava S. erythraea JC2/pPFL35

Plasmid pPFL35 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 pg/ml thiostreptonu. Několik kolonii se testuje na přítomnost pPFL35 integrovaného do chromosomu Southernovým přenosem jejich genomové DNA s DIGznačenou DNA obsahující rap PKS fragment kódující acyltransferasu modulu 2. Tímto způsobem se identifikuje klon s integrovanou kopií pPFL35.

Příklad 13: Produkce polyketidů za použití S. erythraea JC2/pPFL35

Zmrazená suspenze S. erythraea JC2/pPFL35 se naočkuje do eryP media obsahujícího 5 pg/ml thiostreptonu a nechá se růst po dobu 7 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium přefiltruje pro odstranění mycelií a pH se upraví na pH = 3,0. Medium se extrahuje dvakrát dvěma objemy ethylacetátu a kombinované extrakty se promyji stejným objemem nasyceného roztoku chloridu sodného, suší se přes bezvodý síran sodný a ethylacetát se odstraní za redukovaného tlaku, za zisku surového materiálu. Získaný materiál má vzorec uvedený dále a podle MS, GC-MS a ¹H-NMR je identický a autentickým materiálem.

• 9 ϊ

Příklad 14: Příprava S. erythraea NRRL2338/pPFL35

Plasmid pPFL35 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu (Yamamoto et al.) obsahujícím 10 μς/ιηΐ thiostreptonu. Několik klonů se testuje na přítomnost pPFL35 integrovaného do chromosomu Southernovou hybridizací jejich genomové DNA s DIG-značenou DNA obsahující rap PKS fragment kódující AT modulu 2. Tímto způsobem se selektuje klon s integrovanou kopií pPFL35.

Příklad 15: Produkce 13-methyl-erythromycinu A a B za použití

Sacch. erythraea NRRL2338/pPFL35

Kultura Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 (pPFL35), připravená s insertem oleandomycinové KSQ-rapamycinové AT2D1TE DNA místo přirozené zaváděcí domény, jak bylo popsáno v příkladu 14, se naočkuje do 30 ml vodného media s 50 μg/ml· thiostreptonu v 300 ml Erlenmeyerově baňce. Po třech dnech inkubace při 29 °C se tato baňka použije pro inokulaci 300 ml ERY-P media v 300 ml baňce. Medium se inkubuje při 29 °C a 200 rpm po dobu 6 dnů. V tuto dobu se pH media upraví pomocí NaOH na 8,5 a medium se extrahuje stejným objemem ethylacetátu. Ethylacetatový extrakt se odpaří do sucha při 45 °C za použití proudu dusíku v Zymark TurboVap LV odpařovacím přístroji a potom se rekonstituuje v 0,25 objemech methanolu pro 4-násobné zahuštění extraktu. Struktura produktů se potvrdí LC/MS, způsobem A. Jako hlavní složka se pozoruje pík při retenčním čase 4,0 minuty, s m/z hodnotou 720 (M+H)⁺, odpovídající 13methyl-erythromycinu A (C36H65NO13) . Druhý pík má retenční čas 6,4 minuty a m/z hodnotu 704 (M+H)⁺, což odpovídá 13-methylerythromycinu B (C36H65NO12) .

·· ·· ··· · • · ········ • · ······ ····· · · · · · · • · · ·· · · ··· ·· ·· ··· ·· ···

Příklad 16: Příprava rekombinantního vektoru pPFL44 pPFL44 je plasmid na bázi pCJR24 obsahující gen kódující hybridní polyketid-synthasu, která obsahuje zaváděcí modul spiramycinové PKS, erythromycinové prodlužovací moduly 1 a 2 a thioesterasu ukončující řetězec. Plasmid pPFL44 se připraví následujícím způsobem:

Následující syntetické oligonukleotidy:

5'-CCATATGTCTGGAGAACTCGCGATTTCCCGCAGT-3', a 5'-GGCTAGCGGGTCGTCGTCGTCCCGGCTG-3', se použijí pro amplifikaci DNA kódující zaváděcí modul pro spiramycin za použití chromosomální DNA ze S. ambofaciens produkující spiramycin připravené způsobem popsaným v Hopwood et al., (1985). PCR produkt velikosti 3,3 kb se přečistí gelovou elektroforesou, zpracuje se T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních

E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu pPFL41. Plasmid pPFL41 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a podle analýzy sekvence.

Plasmid pPFL41 se tráví Ndel a Nhel a 3,3 kb fragment se přečistí gelovou elektroforesou a liguje se do plasmidu pND30 (plasmid odvozený od pND30 obsahující jako insert ave PKS zaváděcí modul a prodlužovací moduly 1 a 2 nebo DEBS a DEBS thioesterasu) (PCT/GB97/01810), který se předem tráví Ndel a Nhel a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného • · · ·· · · · · · ·· ··· plasmidu pPFL44. Plasmid pPFL44 se identifikuje podle charakteru restrikčního tráveni.

Příklad 17: Příprava S. erythraea JC2/pPFL44

Plasmid pPFL44 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea JC2. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 μg/ml thiostreptonu. Několik kolonií se testuje na přítomnost pPFL44 integrovaného do chromosomu Southernovým přenosem jejich genomové DNA s DIGznačenou DNA obsahující srm PKS fragment kódující zaváděcí modul. Tímto způsobem se identifikuje klon s integrovanou kopií pPFL44.

Příklad 18: Produkce polyketidů za použití S. erythraea

JC2/pPFL44

Zmrazená suspenze S. erythraea JC2/pPFL44 se naočkuje do eryP media obsahujícího 5 μρ/ιηΐ thiostreptonu a nechá se růst po dobu 7 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium přefiltruje pro odstranění mycelií a pH se upraví na pH = 3,0. Medium se extrahuje dvakrát dvěma objemy ethylacetátu a kombinované extrakty se promyji stejným objemem nasyceného roztoku chloridu sodného, suší se přes bezvodý síran sodný a ethylacetat se odstraní za redukovaného tlaku, za zisku surového materiálu. Získaný materiál má vzorec uvedený dále a podle MS, GC-MS a ¹H-NMR je identický a autentickým materiálem:

····· « · · · * · • · · · · · · ··· ·· ·· · ·· ·· ···

Přiklad 19: Příprava S. erythraea NRRL2338/pPFL44

Plasmid pPFL44 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338. Kolonie resistentní na thiostrepton se selektují v R2T20 mediu obsahujícím 10 gg/ml thiostreptonu. Několik kolonií se testuje na přítomnost pPFL44 integrovaného do chromosomu Southernovou hybridizací jejich genomové DNA s DIG-značenou DNA obsahující fragment spiramycinové PKS kódující zaváděcí modul. Tímto způsobem se selektuje klon s integrovanou kopií pPFL44.

Příklad 20: Produkce 13-methyl-erythromycinu A a B za použití Sacch. erythraea NRRL2338/pPFL44

Kultura Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 (pPFL44), připravená s insertem DNA spiramycinového zaváděcího modulu DITĚ místo přirozené zaváděcí domény, se naočkuje do 30 ml vodného media s 50 /g/ml thiostreptonu v 300 ml Erlenmeyerově baňce. Po třech dnech inkubace při 29 °C se tato kultura použije pro inokulaci 300 ml ERY-P media v 300 ml baňce. Medium se inkubuje při 29 °C a 200 rpm po dobu 6 dnů. V tuto dobu se pH media upraví pomocí NaOH na 8,5 a medium se extrahuje stejným objemem ethylacetátu. Ethylacetatový extrakt se odpaří do sucha při 45 °C za použití proudu dusíku v Zymark TurboVap LV odpařovacím přístroji a potom se rekonstituuje v 0,0625 objemech methanolu pro 16-násobné zahuštění extraktu. Struktura produktů se potvrdí LC/MS, způsobem A. Jako hlavní složka se pozoruje pík při retenčním čase 4,0 minuty, s m/z hodnotou 720 (M+H)⁺, odpovídající 13-methyl-erythromycinu A (C36H65NO13) . Druhý pík má retenční čas 6,4 minuty a m/z hodnotu 704 (M+H)⁺, což odpovídá 13-methyl-erythromycinu B (C36H65NO12) .

Příklad 21: Příprava plasmidu pJLK114 ♦ e ·« · «·· • · · ···· ··· • · ·····« ····· · · · · « * • · · ·· · · ··· ·· ·· ··· ·· «·« pJLK114 je plasmid na bázi pCJR24 obsahující PKS gen obsahující ery zaváděcí modul, první a druhý prodlužovací modul ery PKS a ery thioesterasu ukončující řetězec s tou výjimkou, že segment DNA mezi koncem acyltransferasy a začátkem ACP druhého ery prodlužovacího modulu je substituován syntetickým spojovacím oligonukleotidem obsahujícím rozpoznávací místa pro následující restrikční enzymy: AvrlI, BglII, SnaBI, Pstl, Spěl, Nsil, Bsu36I a Hpal. Připraví se následujícím způsobem přes postupné plasmidy (obr. 6).

Příprava plasmidu pJLK02

Přibližně 1,47 kb DNA fragment eryAI genu S. erythraea se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů jako primerů: 5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3', a 5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3', a plasmidu pNTEP2 (Oliynyk, M. et al., Chemistry and Biology (1996) 3: 833-839; WO98/01546) jako templátu. PCR produkt se zpracuje T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK02 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a sekvenováním DNA.

Příprava plasmidu pJLK03

Přibližně 1,12 kb DNA fragment eryAI genu S. erythraea se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů jako primerů:

• · · · · ·· ·

5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3', a 5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3', a plasmidu pNTEPH jako templátu. PCR produkt se zpracuje T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testuji na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK03 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a sekvenováním DNA.

Příprava plasmidu pJLK04

Plasmid pJLK02 se tráví Pstl a Hpal a 1,47 kb insert se liguje s plasmidem pJLK03, který se předem tráví Pstl a Hpal. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK04 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pJLK05

Plasmid pJLKOl (PCT/GB97/01819) se tráví Pstl a AvrlI a 460 b insert se liguje s plasmidem pJLK04, který se předem tráví Pstl a AvrlI. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK05 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pJLK07

Plasmid pJLK05 se tráví Scal a Xbal a plasmid pNTEPH se tráví Ndel a Scal a tyto dva fragmenty se ligují s plasmidem

pCJR24, který se předem tráví Ndel a Xbal. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK07 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pJLK114

Dva syntetické oligonukleotidy Plf a Plb (obr. 7) se každý rozpustí v TE-pufru. 10 μg každého roztoku (0,5 nmol/μΐ) se smísí a směs se zahřívá po dobu 2 minut při 65 °C a potom se pomalu ochladí na teplotu okolí. Plasmid pJLK07 se tráví AvrlI a Hpal a liguje se s tepelně zpracovanými oligonukleotidy. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK114 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

pJLK117 je plasmid na bázi pCJR24 obsahující PKS gen obsahující ery zaváděcí modul, první a druhý prodlužovací modul ery PKS a ery thioesterasu ukončující řetězec s tou výjimkou, že segment DNA mezi koncem acyltransferasy a začátkem ACP druhého ery prodlužovacího modulu je substituován syntetickým spojovacím oligonukleotidem obsahujícím rozpoznávací místa pro následující restrikčni enzymy: AvrlI, BglII, SnaBI, Pstl, Spěl, Nsil, Bsu36I a Nhel.

Připraví se následujícím způsobem přes postupné plasmidy (obr. 6).

Příprava plasmidu pJLK115

4Ί

Plasmid pJLK114 se tráví Ndel a Xbal a přibližně 9,9 kb insert se liguje s plasmidem pUC18, který se předem tráví Ndel a Xbal. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK115 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pJLK116

Plasmid pJLK13 (PCT/GB97/01819) se tráví Bsu36I a Xbal a

1,1 kb fragment se liguje s plasmidem pJLK115, který se předem tráví Bsu36l a Xbal. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK116 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pJLK117

Plasmid pJLK116 se tráví Ndel a Xbal a 9,9 kb fragment se liguje s plasmidem pCJR24, který se předem tráví Ndel a Xbal. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK117 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příklad 22: Příprava plasmidu pJLK29 pJLK29 je plasmid na bázi pJLK117 s tou výjimkou, že DNA fragment kódující redukční smyčku modulu 10 rap PKS se insertuje do mcs. Připraví se následujícím způsobem přes postupné plasmidy (obr. 5).

Příprava plasmidu pJLK121.1

Přibližně 2,2 kb DNA fragment rapB genu S. hygroscopicus kódující redukční smyčku modulu 10 se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů jako primerů:

5'-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3', a 5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3', a přibližně 7 kb fragmentu získaného trávením kosmidu cos 26 (Schwecke, T. et al., (1995), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:

7839-7843) Scal a Sphl jako templátu. PCR produkt se zpracuje T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK121.1 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a sekvenováním DNA.

Příprava plasmidu pJLK29

Plasmid pJLK121.1 se tráví BglII a Nhel a 2,2 kb fragment se liguje s plasmidem pJLK117, který se předem tráví BglII a Nhel. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK29 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příklad 24: Příprava plasmidu pJLK50

Přibližně 6,1 kb DNA fragment genového seskupení erythromycinové PKS S. erythraea v rozsahu od začátku ACP modulu 2 do začátku ACP modulu 3 se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů jako primerů: 5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3', a

5'-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3' a plasmidu pBAM25 (publikovaný pBK25, Best, D.J. et al., Eur. J. Biochem. (1992) 204: 39-49) jako templátu. PCR produkt se zpracuje T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK50 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a sekvenováním DNA.

Příklad 25: Příprava kmene JLK10 S. erythraea

Kmen JLK10 je variantou kmene NRRL2338, ve kterém je redukční smyčka ery modulu 2 (tj. KR doména) nahrazena redukční smyčkou rapamycinového modulu 10. Připraví se za použití plasmidu pJLK54, který se připraví následujícím způsobem.

Příprava plasmidu pJLK54 pJLK54 je plasmid na bázi pJLK29 obsahující PKS gen obsahující ery zaváděcí modul, první, druhý a třetí prodlužovací modul ery genového seskupení a ery thioesterasu ukončující řetězec s tou výjimkou, že segment DNA mezi koncem acyltransferasy a začátkem ACP druhého ery prodlužovacího modulu je substituován ekvivalentním segmentem modulu 10 rapamycinové PKS. Připraví se následujícím způsobem:

Plasmid pJLK50 se tráví Nhel a přibližně 6,1 kb insert se liguje s plasmidem pJLK29, který se předem tráví Nhel. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli

DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost • » · · ♦ • · * · · · · požadovaného plasmidu. Plasmid pJLK54 se identifikuje podle charakteru restrikčniho tráveni.

Použití plasmidu pJLK54 pro přípravu S. erythraea NRRL2338/pJLK54 a produkci TKL derivátů

Přibližně 5 μς plasmidu pJLK54 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 a izolují se stabilní kolonie resistentní na thiostrepton. Z několika kolonií se získá celková DNA a analyzuje se Southernovou hybridizací pro potvrzení toho, že plasmid byl integrován do TE.

Příprava kmene JLK10 S. erythraea a jeho použití pro produkci 13-methyl-10,11-dehydro-erythromycinu A

Kmen JLK10 S. erythraea je mutant S. erythraea NRRL2338, ve kterém je redukční smyčka ery modulu 2, tj. ketoreduktasová doména, substituována redukční smyčkou rapamycinového modulu

10. Připraví se ze S. erythraea kmene NRRL2338, do kterého se integruje plasmid pJLK54. S. erythraea NRRL2338 se podrobí několika kolům neselektivní kultivace, která vede ke druhému křížení současně se ztrátou integrovaného plasmidu. Klony, ve kterých dojde k nahrazení erythromycinového genu kódujícího DEBS1 mutantní verzí se identifikují Southernovou hybridizací. Jeden z těchto klonů se označí jako kmen JLK10 S. erythraea a použije se k naočkování SM3 media (eryP medium dává stejné výsledky) a nechá se růst po dobu 7 až 10 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium odstředí a pH supernatantu se upraví na pH

9. Supernatant se potom extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu a rozpouštědlo se odstraní odpařením. Získaný materiál se analyzuje HPLC/MS, MS/MS a 1H-NMR. Identifikuje se následující makrolid, C-13 methyl-erythromycin A (spolu s produkty neúplného zpracování post-PKS enzymy).

Příklad 26: Příprava plasmidu pPFL50

Plasmid pPFL50 je plasmid na bázi pPFL43, ze kterého se odstraní DNA fragment kódující KR1 (částečně), ACP1 a modul 2 erythromycinové PKS a erythromycinová TE. Připraví se následujícím způsobem. Plasmid pPFL43 se tráví Sful a Xbal pro odstranění 6,5 kb fragmentu. 5' přesahující konec se doplní Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I a plasmid se recirkularizuje. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pPFL50 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava S. erythraea JLK10/pPFL50

Přibližně 5 μς plasmidu pPFL50 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea kmene JLK10 a izolují se stabilní kolonie resistentní na thiostrepton. Z několika kolonií se získá celková DNA a analyzuje se Southernovou hybridizací pro potvrzení toho, že plasmid byl integrován do homologního regionu chromosomální DNA. Kmen JLK10/pPFL50 S. erythraea se použije k naočkování SM3 media obsahujícího 5 gg/ml • *« · ··4 • · · · · ··· «··· ••·· · « ·»·« • ··»»· · « « « • · · · · ·· · ··· ·· · *> ··· ·· ··· thiostreptonu (eryP medium obsahující 5 μ9/πι1 thiostreptonu dává stejné výsledky) a nechá se růst po dobu 7 až 10 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium odstředí a pH supematantu se upraví na pH 9. Supernatant se potom extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetatu a rozpouštědlo se odstraní odpařením. Získaný materiál se analyzuje HPLC/MS, MS/MS a 1H-NMR. Identifikuje se následující makrolid, C-13 methyl-10,11dehydro-erythromycin A (spolu s produkty neúplného zpracování post-PKS enzymy).

Příprava S. erythraea NRRL2338/pPFL50

Přibližně 5 μς plasmidu pPFL50 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 a izolují se stabilní kolonie resistentní na thiostrepton. Z několika kolonií se získá celková DNA a analyzuje se Southernovou hybridizací pro potvrzení toho, že plasmid byl integrován do homologního regionu chromosomální DNA. Kmen NRRL2338/pPFL50 S. erythraea se použije k naočkování SM3 media obsahujícího 5 μ9/ιη1 thiostreptonu (eryP medium obsahující 5 μ9/ιη1 thiostreptonu dává podobné výsledky) a nechá se růst po dobu 7 až 10 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium odstředí a pH supematantu se upraví na pH 9,5. Supernatant se potom extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetatu a rozpouštědlo se odstraní odpařením. Získaný materiál se analyzuje HPLC/MS, MS/MS a 1HNMR. Identifikuje se následující makrolid, C-13 methylerythromycin A (spolu s produkty neúplného zpracování post-PKS enzymy).

Příprava plasmidu pCB121 pCB121 je plasmid obsahující monensinový zaváděcí modul a

KS monensinového modulu 1, po kterém následuje AT

9 • 4 erythromycinového modulu 1 a část KR erythromycinového modulu

1. Připraví se následujícím způsobem přes postupné plasmidy.

Příprava plasmidu pPFL45

Přibližně 1,8 kb DNA segment genového seskupení monensinové PKS Streptomyces cinnamonensis kódující část ACP zaváděcího modulu a KS modulu 1 se amplifikuje PCR za použití následujících syntetických oligonukleotidů jako primerů: 5'-CGTTCCTGAGGTCGCTGGCCCAGGCGTA-3', a 5'-CGAAGCTTGACACCGCGGCGCGGCGCGG-3', a kosmidu obsahujícího 5' konec genů monensinové PKS ze S. cinnamonensis nebo alternativně chromosomální DNA S. cinnamonensis jako templátu. PCR produkt se zpracuje T4 polynukleotidkinasou a liguje se do plasmidu pUC18, který se předem linearizuje trávením Smál a potom se zpracuje alkalickou fosfatasou. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé klony se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pPFL45 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pPFL47

Plasmid pPFL45 se tráví Ndel a Bsu36I a přibližně 2,6 kb fragment se liguje do plasmidu pPFL43, který se předem tráví Ndel a Bsu36l. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pPFL47 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pCB135 • · · · · ·· ··· ·· · · ·

Plasmid pCJR24 se tráví HindlII, 5' přesahující část se doplní Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I a religuje se. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pCB135 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení, při kterém chybí rozpoznávací místo pro HindlII.

Příprava plasmidu pKSWl

Plasmid pKSlW je vektor odvozený od pNTEP2 (GB97/01810) obsahující triketid synthasu odvozenou od DEBS1TE s jedinečnými restrikčními místy vloženými do okrajů KS1. Plasmid pKSlW se připraví přes následující postupné plasmidy.

Příprava plasmidu pMOO9, pMOlO a pM013

Pro PCR amplifikaci pro plasmid pM009 se následující syntetické oligonukleotidy použijí jako mutagenní primery, kde jeden z těchto oligonukleotidů obsahuje MunI místo a druhý obsahuje Pstl místo.

5'-GCGCGCCAATTGCGTGCACATCTCGAT-3', a 5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3'.

Pro PCR amplifikaci pro plasmid pMOlO se následující syntetické oligonukleotidy použijí jako mutagenní primery, kde jeden z těchto oligonukleotidů obsahuje HindlII místo a druhý obsahuje EcoRV místo.

5'-GTCTCAAGCTTCGGCATCAGCGGCACCAA-3', a

5'-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3'.

Pro PCR amplifikaci pro plasmid pM013 se následující syntetické oligonukleotidy použijí jako mutagenní primery, kde jeden z těchto oligonukleotidů obsahuje Pstl místo a druhý obsahuje HindlII místo. 5'-GATGGCCTGCAGGCTGCCCGGCGGTGTGAGCA-3', a 5'-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3'

PCR se provede za použití pNTEP2 (GB97/01810) jako templátu za použití Pwo DNA polymerasy a jednoho cyklu: 96 °C, 1 minuta; tepelné zpracování při 50 °C, 3 minuty; a prodloužení při 72 °C, 1 minuta; a 25 cyklů: 96 °C, 1 minuta; tepelné zpracování při 50 °C, 3 minuty; a prodloužení při 72 °C, 1 minuta, za přítomnosti 10% (obj./obj.) dimethylsulfoxidu. U získaného materiálu se opraví konce a materiál se klonuje do pUC18 tráveného Smál a ligační směs se transformuje do E. coli DH10B. Z jednotlivých kolonií se připraví plasmidová DNA. Požadované plasmidy pro pM009 (3,8 kb), pMOlO (3,9 kb) a pM013 (4,3 kb) se identifikují podle charakteru restrikčního trávení a sekvenováním DNA.

Příprava plasmidu pMOll

Plasmid pM013 se tráví HindlII a 1,2 kb insert se klonuje do pMOlO, který se předem tráví HindlII. Ligační směs se transformuje do E. coli DH 10B. Požadovaný plasmid (5,0 kb) se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a označí se pMOll.

Příprava plasmidu pM012 ··· · · · · · · · *· ··· «·· ··· • ····· · · ·· · · • ···· · » · • · · ·· · · ··· · · ···

Plasmid pM009 se tráví Pstl a 1,6 kb insert se klonuje do pMOll, který se předem tráví Pstl. Ligační směs se transformuje do E. coli DH 10B. Požadovaný plasmid (6,6 kb) se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a označí se pM012.

Příprava plasmidu pKSlW

Plasmid pM012 se tráví MunI a EcoRV a 3,9 kb fragment se klonuje do pNTEPH (viz dále) , který se předem tráví MunI a EcoRV. Ligační směs se transformuje do E. coli DH 10B. Požadovaný plasmid (13, kb) se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení a označí se pKSlW.

Příprava pNTEPH

Plasmid pNTEPH se získá z pNTEP2 odstraněním HindlII místa. pNTEP2 se tráví HindlII, 5' přesah se doplní Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I a religuje se. Požadovaný plasmid (13,6 kb) se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pCB136

Plasmid pKSWl se tráví Ndel a Xbal a přibližně 11,2 kb fragment se liguje s plasmidem pCB135, který se předem tráví Ndel a Xbal. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentních E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pCB136 se identifikuje podle charakteru restrikčního trávení.

Příprava plasmidu pCB137 ····· · * · · · · • · · · · · * ··· ·· ·· · · · ·· ···

Plasmid pCB136 se tráví Sful a Xbal pro odstranění 6,5 kb fragmentu. 5' přesah se doplní Klenowovým fragmentem DNA polymerasy I a religuje se. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pCB137 se identifikuje podle charakteru restrikčniho trávení.

Příprava plasmidu pCB121

Plasmid pPFL47 se tráví Ndel a HindlII a přibližně 4,4 kb fragment se liguje s plasmidem pCB137, který se předem tráví Ndel a HindlII. Ligační směs se použije pro transformaci elektrokompetentnich E. coli DH10B buněk a jednotlivé kolonie se testují na přítomnost požadovaného plasmidu. Plasmid pCB121 se identifikuje podle charakteru restrikčniho trávení.

Příklad: Příprava S. erythraea JLK10/pPFL50

Přibližně 5 μς plasmidu pCB121 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea JLK10 a izolují se stabilní kolonie resistentní na thiostrepton. Z několika kolonií se získá celková DNA a analyzuje se Southernovou hybridizací pro potvrzení toho, že plasmid byl integrován do homologniho regionu chromosomální DNA. Kmen JLK10/pCB121 S. erythraea se použije k naočkování SM3 media obsahujícího 5 μg/ml· thiostreptonu (eryP medium obsahující 5 pg/ml thiostreptonu dává podobné výsledky) a nechá se růst po dobu 7 až 10 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium odstředí a pH supernatantu se upraví na pH 9. Supernatant se potom extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu a rozpouštědlo se odstraní odpařením. Získaný materiál se analyzuje HPLC/MS, MS/MS a 1H-NMR. Identifikuje se makrolid C-13 methyl-10,11-dehydro58 ·· ·· · · ♦· • · · · · · ·· · • · · · · ·· *···· · · ·· · · • · · · · ·· ·· ·· · · · · · ···

-erythromycin A (spolu s produkty neúplného zpracováni postPKS enzymy).

Příklad: Příprava S. erythraea NRRL2338/pCB121

Přibližně 5 μ9 plasmidu pCB121 se použije pro transformaci protoplastů S. erythraea NRRL2338 a izolují se stabilní kolonie resistentní na thiostrepton. Z několika kolonií se získá celková DNA a analyzuje se Southernovou hybridizací pro potvrzení toho, že plasmid byl integrován do homologního regionu chromosomální DNA. Kmen NRRL2338/pCB121 S. erythraea se použije k naočkování SM3 media obsahujícího 5 μg/ml thiostreptonu (eryP medium obsahující 5 μg/ml thiostreptonu dává podobné výsledky) a nechá se růst po dobu 7 až 10 dnů při 28-30 °C. Po této době se medium odstředí a pH supernatantu se upraví na pH 9. Supernatant se potom extrahuje třikrát stejným objemem ethylacetátu a rozpouštědlo se odstraní odpařením. Získaný materiál se analyzuje HPLC/MS, MS/MS a 1H-NMR. Identifikuje se makrolid C-13 methyl-erythromycin A (spolu s produkty neúplného zpracování post-PKS enzymy).

Ačkoliv je předkládaný vynález dokreslen příklady uvedenými výše, není jimi nijak omezen. Popis uvedený výše poprvé popisuje přípravu genového uskupení PKS typu I obsahující zcela nebo částečně heterologní zaváděcí modul obsahující KSq a jeho použití pro získání polyketidových produktů, které jsou použitelné jako meziprodukty nebo jako biologicky aktivní materiály, jako jsou antibiotika. Odborníkům v oboru bude jasné, že zcela nebo částečně heterologní zaváděcí modul obsahující KSq z jiné genové sestavy PKS může být použit pro nahrazení zaváděcího modulu DEBS, nebo může být vložen do jiné sestavy PKS genů. Odborníkům v oboru bude také jasné, že specificita způsobená účinnějším rozlišením mezi • · • ·

methylmalonyl-CoA a malonyl CoA na ATq, následovaná specifickou dekarboxylací prostřednictvím KSq, je výhodnější než nedokonalé rozlišeni mezi propionyl-CoA a acetyl-CoA, které je vlastni zaváděcímu modulu DEBS a mnoha jiným zaváděcím modulům PKS v tom, že maximalizuje produkci jednoho produktu vzhledem ke směsi lišící se v charakteru počáteční jednotky. Eliminace takových směsí zvyšuje výtěžek a eliminuje potřebu pracných a obtížných separačních postupů.

Claims (15)

1. Systém pro výrobu polyketidů obsahujících v podstatě * výlučně požadovanou počáteční jednotku vyznačuj ící se t i m, že obsahuje PKS multienzym, který obsahuje zaváděcí modul a více prodlužovacích modulů; kde uvedený zaváděcí modul je upraven tak, aby zaváděl volitelně substituovaný malonylový zbytek a potom prováděl dekarboxylaci zavedeného zbytku pro dodání volitelně substituovaného • acetylového zbytku, který je potom přenesen do blízkosti jednoho z uvedených prodlužovacích modulů; a kde uvedené prodlužovací moduly, nebo alespoň jeden z nich, nejsou přirozeně spojeny se zaváděcím modulem, který způsobuje dekarboxylaci, s podmínkou, že cílovým polyketidem není 14členný makrolid obsahující 13-methylovou skupinu v důsledku inkorporace (nesubstituované) acetatové počáteční jednotky.

2. Systém podle nároku Ivyznačující se tím, že uvedený sousední prodlužovací modul, na který je acetatová počáteční jednotka přenesena, není za přirozeného stavu spojen se zaváděcím modulem, který provádí dekarboxylaci.

3. Systém podle nároku 1 nebo 2vyznačující se tím, že dekarboxylační funkce zaváděcího modulu je zprostředkována doménou ketosynthasového typu obsahující v aktivním místě glutaminový zbytek nebo jiný zbytek jiný než cystein.

4. Systém podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že dekarboxylační funkce zaváděcího modulu je zprostředkována doménou CLF-typu.

5. Systém podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že zaváděcí funkce zaváděcího modulu je zprostředkována doménou acyltransferasového typu obsahující v aktivním místě argininový zbytek.

6. Systém podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že zaváděcí modul obsahuje proteinový nosič pro acyl.

7. Systém podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3, 5 nebo 6 vyznačující se tím, že alespoň KSq doména uvedeného zaváděcího modulu odpovídá zaváděcímu modulu PKS multienzymu pro oleandomycin, spiramycin, niddamycin, methymycin nebo monensin.

8. PKS multienzym exprimovatelný z DNA systému podle jakéhokoliv z nároků 1-7 nebo jeho varianta mající schopnost syntetizovat polyketidovou sloučeninu.

9. Nukleová kyselina kódující PKS multienzym podle nároku 8.

10. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 9.

11. Transformovaný organismus obsahující systém podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7.

12. Způsob pro přípravu polyketidu vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci organismu podle nároku 11 a získání polyketidu.

13. Systém, multienzym, nukleová kyselina, organismus nebo způsob podle jakéhokoliv z předešlých nároků vyznačující se tím, že uvedený polyketid je vybrán z:

(a) 12- a 16-členných makrolidů s acetatovými počátečními j ednotkami;

(b) 12-, 14- a 16-členných makrolidů s propionatovými počátečními jednotkami;

(c) variant rifamycinu, avermectinu, rapamycinu, immunomycinu a FK506 s acetatovými počátečními jednotkami nebo propionatovými počátečními jednotkami;

(d) polyketidů, ve kterém počáteční jednotka vytváří vedlejší řetězec vybraný z allylu a hydroxymethylu.

14. Varianta původního polyketidů, která se liší od původního polyketidů ve vedlejším řetězci tvořeném počáteční jednotkou.

15. Způsob přípravy polyketidů II. typu vyznačuj ící se t i m, že obsahuje kultivaci organismu obsahujícího polyketid-synthasu II. typu (PKS), kde přirozená synthasa obsahuje CLF doménu, která způsobuje dekarboxylaci vedoucí k tvorbě nežádoucích počátečních jednotek; kde uvedený organismus obsahuje PKS, která byla geneticky upravena tak, aby měla potlačenou dekarboxylaČní aktivitu uvedené CLF domény.