CN1315956A - 聚酮化合物及其合成 - Google Patents

聚酮化合物及其合成 Download PDF

Info

Publication number
CN1315956A
CN1315956A CN99810052A CN99810052A CN1315956A CN 1315956 A CN1315956 A CN 1315956A CN 99810052 A CN99810052 A CN 99810052A CN 99810052 A CN99810052 A CN 99810052A CN 1315956 A CN1315956 A CN 1315956A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
pks
assembly
loading assembly
structural domain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN99810052A
Other languages
English (en)
Inventor
P·F·利德莱
J·斯汤顿
J·库尔特斯
H·A·I·麦阿瑟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotica Technology Ltd
Pfizer Inc
Original Assignee
Biotica Technology Ltd
Pfizer Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotica Technology Ltd, Pfizer Inc filed Critical Biotica Technology Ltd
Publication of CN1315956A publication Critical patent/CN1315956A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D313/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than six members having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Polyoxymethylene Polymers And Polymers With Carbon-To-Carbon Bonds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Abstract

Ⅰ型聚酮化合物合酶(“PKS”)是一种复杂的多酶,包括连接于多个延伸组件的一个装载组件。所述第一延伸组件从所述装载组件接受一个酰基起子单位,每个延伸组件加入一个另外的可能经过加工(例如还原)的ketide单位。我们已经发现,某些PKS具有的Ksq结构域具有脱羧活性,例如由(取代的)丙二酰产生(取代的)酰基。Ⅱ型PKS的CLF结构域具有相似的活性。通过将包含这样的结构域的装载组件插入通常不具有这种装载组件的PKS中,可能控制所用的起子单位。

Description

聚酮化合物及其合成
本发明涉及通过重组合成制备14元大环内酯的方法和材料(包括酶系统、核酸、载体和培养物)，还涉及如此产生的新的聚酮化合物(polyketide)。可以操作聚酮化合物生物合成基因或其部分，使得可以生产具有预测结构的特定的新聚酮化合物，诸如12元、14元和16元大环内酯，其中所述聚酮化合物生物合成基因或其部分可以衍生自不同的生物合成基因簇。本发明具体涉及用其它基因取代编码天然起子(starter)单位的遗传材料，以便制备优选具有乙酸(acetate)起子单位的14元大环内酯，而同时使含不同起子单位的副产物形成减至最少。
聚酮化合物是一大类结构多样的天然产物，包括具有抗生特性或其它药理学特性的许多化合物，诸如红霉素、四环素、雷帕霉素、除虫菌素、莫能菌素、epothilones和FK506。特别是，链霉菌属(Streptomyces)细菌和相关的放线菌大量产生聚酮化合物。通过以类似于脂肪酸生物合成的方式重复分步缩合酰基硫酯，合成聚酮化合物。由于选择(通常的)乙酸或丙酸(propiotate)作为起子单位或“延伸”单位，以及在每次缩合后观察到的β-酮基的不同加工程度，因而导致了在天然聚酮化合物发现的更大的结构多样性。加工步骤的实例包括还原为β-羟酰基-、还原后脱水为2-烯酰-、以及完全还原为饱和酰基硫酯。这些加工步骤的立体化学结果对于每个链延伸循环也是特化的。
聚酮化合物的生物合成由一组称为聚酮化合物合酶的链形成酶引发。在放线菌中已经描述了两类聚酮化合物合酶(PKS)。一类称为Ⅰ型PKS，其代表为大环内酯红霉素、夹竹桃霉素、除虫菌素和雷帕霉素的PKS，由一组聚酮化合物链延伸的每个循环不同的酶或酶“组件(module)”组成。一个实例参见图1(Cortés,J．等Nature(1990)348:176-178；Donadio,S．等Science(1991)2523:675-679；Swan,D.G.等Mol.Gen.Genet.(1994)242:358-362；MacNeil,D.J.等Gene(1992)115:119-125；Schwecke,T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7839-7843)。
本文所用的术语“延伸组件”是指完成一个聚酮化合物链延伸循环的一组连续的结构域，从β-酮脂酰(ketoacyl)-ACP合酶(“AKS”)结构域至下一个酰基载体蛋白(“ACP”)结构域。术语“装载组件”用来指完成将起子单位装载至所述PKS并因此使其可被第一个延伸组件的KS结构域利用的任一组连续的结构域。在红霉素生物合成的情况下，通过对红霉素生产PKS的含有链释放硫酯酶/环化酶活性的酶结构域采用基因工程进行特定的再定位，已经改变了所形成的聚酮化合物的长度(Cortés等Science(1995)268:1487-1489；Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:9105-9106)。
已经表明，符合读框地缺失编码红霉素生产PKS组件5(也称为6-脱氧红霉内酯B合酶，DEBS)的部分酮还原酶结构域的DNA，导致形成红霉素类似物5,6-二脱氧-3-α-碳霉糖基(mycarosyl)-5-氧代红霉内酯B、5,6-二脱氧-5-氧代红霉内酯B和5,6-二脱氧，6β-环氧-5-氧代红霉内酯B(Donadio,S.等Science(1991)252:675-679)。同样，通过对相应的PKS编码DNA进行遗传工程，改变DEBS组件4的烯酰还原酶结构域中的活性位点残基，并将其引入红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)中，导致产生6,7-脱水红霉素C(Donadio,S.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7119-7123)。
国际专利申请WO 93/13553描述了对DEBS基因进行的能够产生改变的聚酮化合物的其它类型的遗传操作。然而，据报道许多这样的努力没有结果(Hutchinson,CR．和Fujii,I.Annu.Rev.Microbiol.(1995)49:201-238，第231页)。已经公开了得自吸水链霉菌(Sreptomyceshygroscopicus)的编码模块(modular)Ⅰ型PKS的基因的完整DNA序列，所述PKS支配大环免疫抑制性聚酮化合物雷帕霉素的生物合成(Schwecke,T.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)。所述DNA序列存贮于EMBL/Genbank数据库中，登录号为X86780。
第二类PKS称为Ⅱ型PKS，以芳族化合物的合酶为代表。Ⅱ型PKS仅含有单组链延伸的酶活性，它们在连续的循环中被适当地再使用(Bibb,M.J.等EMBO J.(1989)8:2727-2736；Sherman,D.H等EMBO J.(1989)8:2717-2725；Femandez-Moreno,MA．等J.Biol.Chem.(1992)267:19278-19290)。Ⅱ型PKS的“延伸”单位通常是乙酸单位，特异性环化酶的存在指出将所完成的链环化为芳族产物的优选途径(Hutchinson,C.R.和Fujii,I.Anan.Rev.Microbiol.(1995)49:201-238)。通过将含Ⅱ型PKS基因的DNA克隆引入到含有不同类型Ⅱ型PKS基因簇的另一菌株中，例如通过将得自放线菌紫素(得自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的一种蓝色色素的聚酮化合物)基因簇的DNA引入到加利利链霉菌(Streptomyces galileus)的蒽醌聚酮化合物生产菌株中，已经获得了杂合聚酮化合物(Bartel,P.L.等J.Bacteriol.(1990)172:4816-4826)。
当在天蓝色链霉菌宿主细胞中表达时，Ⅱ型PKS上的聚酮化合物链延伸所需的最少数目的结构域(“最小PKS”)已经在例如国际专利申请WO 95/08548中确定为含有作为actⅠ基因产物的以下三种多肽：首先是KS；第二是称为CLF的多肽，其首尾氨基酸序列与所述KS具有相似性，但其中所述KS的必需活性位点(即半胱氨酸残基)或者被谷氨酰胺残基取代，或者在孢子色素(诸如whiE基因产物)的PKS的情况下(Chater,K.F.和Davis,N.K.Mol.Microbiol.(1990)4:1679-1691)被谷氨酸残基取代(图2)；最后是ACP。例如在国际专利申请WO 95/08548中，所述CLF已经被叙述为决定最小PKS产生的聚酮化合物链长度的因子。然而，已经发现(Shen,B.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:6811-6821)，当在淡青链霉菌(Streptomyces glaucescens)宿主细胞中用辛酮化合物(octaketide)放线菌紫素的CLF取代癸酮化合物(decaketide)丁省霉素时，发现聚酮化合物产物没有由癸酮化合物改变为辛酮化合物，因此所述CLF的真正作用仍不清楚。已经提出了一种替代的命名法，其中将KS命名为KSα，而将CLF命名为KSβ，反映出对其缺乏了解(Meurer,G.等Chemistry and Biology(1997)4:433-443)。尚不了解将乙酸起子单位和乙酸延伸单位装载到Ⅱ型PKS的机制，但推测宿主细胞的脂肪酸合酶的丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶可以完成Ⅱ型PKS的相同功能(Revill,W.P.等J.Bacteriol.(1995)177:3946-3952)。
国际专利申请WO 95/08548描述了用来自其它Ⅱ型PKS基因簇的异源DNA取代放线菌紫素的PKS基因，以获得杂合聚酮化合物。同一国际专利申请WO 95/08548描述了本质上缺乏放线菌紫素天然基因簇的天蓝色链霉菌的一个菌株的构建，也描述了在该菌株中应用衍生自低拷贝载体SCP2*(分离自天蓝色链霉菌(Bibb,M.J.和Hopwood,D.A.J.Gen.Microbiol.(1981)126:427))的质粒载体pRM5，并且其中异源PKS编码DNA可以在放线菌紫素基因簇的背驰(divergent)actⅠ/actⅢ启动子区控制之下表达(Femandez-Moreno,M.A.等J.Biol.Chem.(1992)267:19278-19290)。质粒pRM5也含有得自放线菌紫素生物合成基因簇的编码特异性激活蛋白ActⅡ-orf4的基因的DNA。ActⅡ-orf4蛋白是置于actⅠ/actⅡ双向启动子控制之下的基因转录所需的，并且在营养菌丝体从生长转变为稳定期期间激活基因表达(Hallam,S.E.等Gene(1988)74:305-320)。
已知链霉菌属中的Ⅱ型基因簇通过途径特异性激活蛋白的基因激活(Narva,K.E.和Feitelson,J.S.J.Bacteriol.(1990)172:326-333；Stutzman-Engwall,K.J.等J.Bacteriol.(1992)174:144-154；Femandez-Moreno,MA.等Cell(1991)66:769-780；Takano,E.等Mol.Microbiol.(1992)6:2797-2804；Takano,E．等Mol.Microbiol.(1992)7:837-845)。DnrⅠ基因产物互补天蓝色链霉菌的actⅡ-orf4基因中的一个突变，暗示DnrⅠ和ActⅡ-orf4蛋白作用于相似的靶。已经描述了一个基因(srmR)(EP 0 524 832 A2)，该基因位于大环内酯聚酮化合物螺旋霉素的Ⅰ型PKS基因簇附近。该基因特异性地激活大环内酯抗生素螺旋霉素的产生，但尚未发现这样一种基因的其它实例。此外，尚未描述过ActⅡ-orf4/DnrⅠ/RedD激活蛋白家族的同系物作用于Ⅰ型PKS基因。
尽管已经鉴定出大量的治疗上重要的聚酮化合物，但仍需要获得特性增强的或具有全新生物活性的新的聚酮化合物。由Ⅰ型PKS产生的复杂的聚酮化合物特别有价值，因为它们包括已知可用作驱蠕虫药、杀虫剂、免疫抑制剂、抗真菌剂或抗细菌剂的化合物。因为它们结构上的复杂性，这类新的聚酮化合物不容易通过全化学合成获得，或不容易通过已知的聚酮化合物的化学改性而获得。
也需要开发可靠并且特异性的方法，以在实践中配置单个组件，使得构建的所有或大部分杂种PKS基因是有活力的，并且产生所需的聚酮化合物产物。
待审的国际专利申请PCT/GB97/01819公开了一种PKS基因组合(gene assembly)(特别是Ⅰ型)编码一个装载组件(module)、然后编码至少一个延伸组件。因此，图1显示DEBS基因的组构。第一个可读框编码第一种多酶或盒(DEBS1)，它由三个组件组成：装载组件(ery-装载)和两个延伸组件(组件1和组件2)。装载组件包括一个酰基转移酶和一个酰基载体蛋白。可以将其与WO 93/13663(上文提及的)的图1相对比。这显示ORF1仅由两个组件组成，其中第一个组件实际上同时为装载组件和第一延伸组件。
PCT/GB97/01819概括地描述了包含一个装载组件和至少一个延伸组件的一个杂种PKS基因组合的产生。PCT/GB97/01819也描述了(也参见Marsden,A.F.A.等Science(1998)279:199-202)通过将生产除虫菌素的聚酮化合物合酶的特异性广的装载组件，移植到红霉素PKS的第一多酶组分(DEBS1)上，以取代正常的装载组件，来构建一种杂种PKS基因组合。采用杂种PKS基因组合，可以制备某些新的聚酮化合物，如待审的国际专利申请(PCT/GB97/01810)所述。国际专利申请PCT/GB97/01819还描述了，通过将生产雷帕霉素的聚酮化合物合酶的装载组件移植到红霉素PKS的第一多酶组分(DEBS1)上，以取代正常的装载组件，来构建一种杂种PKS基因组合。雷帕霉素PKS的装载组件与DEBS和除虫菌素PKS的装载组件的不同之处在于：它包含一个CoA连接酶结构域、一个烯酰还原酶(“ER”)结构域和一个ACP，使得包括天然起子单位3,4-二羟基环己烷羧酸在内的合适的有机酸可以在PKS装载结构域上原位活化，同时由ER结构域还原或不还原，然后转移至ACP，以进行延伸组件1的KS的分子内装载(Schwecke,T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7839-7843)。
已经公开了几种支配16元大环内酯聚酮化合物生产的Ⅰ型PKS基因簇的DNA序列，所述聚酮化合物包括得自弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的泰乐霉素PKS(EP 0 791 655 A2)、得自天青链霉菌(Streptomyces caelestis)的尼达霉素PKS(Kavakas,S.J.等J.Bacteriol.(1998)179:7515-7522)和得自产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)的螺旋霉素PKS(EP 0791 655 A2)。所有这些基因序列的共同之处是，它们显示出其PKS的装载组件不同于DEBS和除虫菌素PKS的装载组件，因为它们由一个类似延伸组件KS结构域的结构域、一个AT结构域和一个ACP组成(图3)。所述额外的N末端KS样结构域已经命名为KSq，因为每种情况下它与延伸KS的不同之处在于β-酮脂酰-ACP合酶活性必需的活性位点半胱氨酸残基被谷氨酰胺(以单字母表示时为Q)残基取代。KSq结构域的功能尚不清楚(Kavakas,S.J.等J.Bacteriol.(1998)179:7515-7522)，但其在这些16元大环内酯PKS中存在使人感到意外，因为泰乐霉素、尼达霉素和螺旋霉素的起子单位看来分别是丙酸、乙酸和乙酸，亦即与DEBS中的起子单位类型相同。与KSq结构域相邻的AT在此命名为ATq结构域。
当用泰乐霉素PKS的完整装载组件取代产二素链霉菌中螺旋霉素的类似装载组件(Kuhstoss等Gene(1996)183:231-236)时，显示出起子单位的本质由乙酸转变为丙酸。由于尚不了解KSq结构域的作用，因此没有具体的公开内容或者揭示KSq结构域的重要性，或者揭示这些含KSq装载组件甚至在大环内酯高生产水平下，在确保所述聚酮化合物产物在起子单位方面的纯度的可能用途。对这些结果的解释叙述为：“因此，我们相信，本文描述的实验为下述假说提供了强有力的实验支持：Ⅰ型PKS系统中的AT结构域选择合成中每一步骤的合适底物”(Kuhstoss等Gene(1996)183:231-236，第235页)。这些作者注意到与Ⅱ型PKS系统中CLF蛋白的类似性，并且所述CLF蛋白被认为参与决定链长度。他们叙述到：“KSq可能起相似作用，尽管不清楚为什么这样一种功能在这些16元聚酮化合物合成中是必需的，而其它复杂的聚酮化合物诸如6-DEB或雷帕霉素的合成不需要这样一种功能。在任何情况下，KSq都不可能参与每一个合成步骤的底物选择。”(Kuhstoss等Gene(1996)183:231-236)。
已经表明，当采用遗传工程来去除DEBS的装载组件时，红色糖多孢菌中所得的截短的DEBS继续产生低水平的含丙酸起子单位的红霉素(Pereda,A.等Microbiology(1995)144:543-553)。同一出版物表明，当在这种截短的DEBS中，延伸组件1的甲基丙二酰-CoA特异性AT被得自雷帕霉素PKS延伸组件的丙二酰-CoA特异性AT取代，产物也是低水平含丙酸起子单位的红霉素，证明起子单位的来源不是由组件1的AT将装载到该酶上的(甲基)丙二酰基脱羧的结果，而是丙酰-CoA对延伸组件1的KS直接酰化的结果。这与先前的报道形成对比，先前的报道采用部分纯化的DEBS1+TE，这是一种得自DEBS的截短的双组件PKS(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:9105-9106)，并且在功能上等同于DEBS1-TE(Brown,M.J.B.等J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1995)1517-1518；Cortés,J.等Science(1991)2523:675-679)，所述先前的报道表明：DEBS的起子单位的来源可以包括甲基丙二酸(methylmalonate)单位，它被装载到组件1上，并由组件1的KS脱羧(Pieper,R等Biochemistry(1997)36:1846-1851)。现在已经发现，当将DEBS1-TE蛋白从重组红色糖多孢菌中完全纯化时，它不含这样的特异性脱羧酶活性(Weissmann,K.等(1998)Biochemistry,37,11012-11017)，这进一步证实起子单位事实上的确不是通过延伸组件1的KS介导的延伸单位的脱羧而产生的。
已知DEBS装载组件的特异性仅比丙酸略广，特别是当含这种装载组件的PKS是或者在红霉素生产的天然宿主红色糖多孢菌中表达的PKS(参见例如Cortés,J.等Science(1995)268:1487-1489)的一部分，或者是在诸如天蓝色链霉菌的异源宿主中表达的PKS(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1994)116:11612-11613；Brown,M.J.B.等J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1995)1517-1519)的一部分时，在体外和体内均使用乙酸起子单位。在采用纯化的DEBS1-TE的体外实验中，已经证明，丙酰-CoA和乙酰-CoA是分别有效供应给装载组件丙酸或乙酸单位的替代底物(Wiessman,K.E.H．等Chemistry and Biology(1995)2:583-589；Pieper,R等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:11373-11374)。乙酸和丙酸之间竞争的结果受所用宿主细胞中占优势的丙酰-CoA和乙酰-CoA的相应细胞内浓度影响(参见例如Kao,C.M.等Science(1994)265:509-512；Pereda,A.等Microbiology(1995)144:543-553)。它也由宿主PKS表达的水平决定，使得如例如在待审的国际专利申请PCT/GB97/01819中公开的，当重组DEBS或另一种含DEBS装载组件的杂种PKS在红色糖多孢菌中过量表达时，产物通常为混合物，其组分之间的不同之处仅在于不是存在乙酸起子单位就是存在丙酸起子单位。
需要开发可靠的方法，来避免形成既具有乙酸起子单位也具有丙酸起子单位的聚酮化合物的混合物，并且使得可以特异性地掺入不常见的起子单位。现在已经意外地发现，16元大环内酯泰乐霉素、尼达霉素和螺旋霉素的PKS中的装载结构域，其作用不同于除虫菌素PKS和DEBS的装载结构域的作用。已经认识到，泰乐霉素PKS的KSq结构域和相关的AT结构域(在此命名为ATq)一起负责高度特异性地产生乙酸起子单位，因为所述ATq特异性地装载甲基丙二酰-CoA，而不是先前认为的特异性地装载丙酰-CoA；所述KSq负责将所述酶结合的甲基丙二酸单位特异性脱羧，形成连接至装载组件的ACP结构域的丙酸单位，并且将其适当地放置，以转移至延伸组件1的KS，以引发链延伸。螺旋霉素和尼达霉素PKS的ATq和相邻的KSq以类似的方式负责特异性地装载丙二酸酯单位，而不是如先前认为的装载乙酸单位，并且将其随后特异性脱羧，提供乙酸起子单位以进行聚酮化合物链延伸。
在这一点上，现在也发现，不仅上述16元大环内酯的PKS，而且某些14元大环内酯、特别是得自抗生链霉菌(Streptomycesantibioticus)的夹竹桃霉素PKS(图4)以及某些聚醚实电解质聚酮化合物、特别是得自肉桂地链霉菌(Streotomyces cinnamonensis)的推定的莫能菌素(图4)，均具有一个装载结构域，该结构域包括一个KSq结构域、一个ATq结构域和一个ACP。在图4中显示了已经鉴定的所述KSq结构域和相邻连接的ATq结构域的序列对比，显示出所述KSq结构域中保守的活性位点谷氨酰胺(Q)残基和一个在所有延伸AT结构域中保守且也在ATq结构域中完全保守的精氨酸残基。在或者DEBS或者除虫菌素PKS装载组件的AT结构域中，所述AT的底物是非羧化酰基-CoA酯，该残基在特性上不是精氨酸(Haydock,S.F．等FEBSLetters(1995)374:246-248)。缩写ATq在此用来简单地将发现紧接KSqC末端的AT结构域与延伸AT区别开来，该标记没有其它意义。
一方面，本发明提供PKS多酶或其部分，或编码它的核酸(一般为DNA)，所述多酶或部分包含一个装载组件和多个延伸组件，以产生新的14元大环内酯，其中
(a)所述装载组件被改变为装载丙二酰残基，然后实现所装载残基的脱羧，提供乙酰残基以转移至延伸组件；和
(b)所述延伸组件或至少一个延伸组件(最好至少邻接所述装载组件的那个延伸组件)与实现任选取代的丙二酰残基脱羧的装载组件不是天然连接的。
一般而言，所述装载组件也包括一个ACP(酰基载体蛋白)结构域。
最好是，所述装载组件的脱羧功能性由KS(酮合酶(ketosynthase))型结构域提供。合适的是，这与常规延伸组件的KS的不同之处在于在活性位点中拥有一个谷氨酰胺残基，而不是必需的半胱氨酸残基。它称为Ksq。它可以是“天然的”或遗传工程改造的，例如通过定点诱变编码不同KS(诸如延伸组件的KS)的核酸而产生的基因工程改造。
或者，所述脱羧功能性可以由Ⅱ型PKS系统中存在的一般类型的CLF型结构域提供。
最好是，所述装载功能性由类似常规延伸组件的AT结构域的AT(酰基转移酶)型结构域提供，常规延伸组件的AT结构域在活性位点具有一个精氨酸残基，而装载乙酸或丙酸的装载组件的AT结构域的情况不是这样，例如在DEBS或除虫菌素PKS系统中。它可以称为Atq。再一次，它可以是“天然的”或例如通过对延伸组件的AT诱变而遗传工程改造的。
所述装载组件通常为以下形式：
             Ksq-ATq-ACP其中ACP为酰基载体蛋白。
另一方面，本发明提供一种方法，通过提供一种加入上文定义的特异性提供所需乙酸起子单位的装载组件的PKS多酶，来合成新的基本上仅有所需乙酸起子单位的14元聚酮化合物。这可以包括提供编码所述多酶的核酸，并将其引入可以将其表达的生物体中。
再一方面，本发明提供含有编码所述多酶的载体和转化生物体和培养物。一个优选实施方案是一种培养物，所述培养物产生一种特征为基本上不存在具有不同起子单位的、具有所需乙酸起子单位的14元聚酮化合物。因此，例如可以产生这样的C13-甲基红霉素：所述C13-甲基红霉素基本上不含因为掺入丙酸起子单位而产生的天然类似物。
为制备仅含有或几乎仅含有乙酸起子单位的14元大环内酯，给产生14元大环内酯的PKS基因组合提供KSq-ATq-ACP型装载组件特别有用，甚至当这样的PKS基因组合在放线菌宿主细胞中以高水平表达时也是如此。用于此目的的特别合适的PKS是用于生物合成以下大环内酯的PKS的组分：红霉素、酒霉素、夹竹桃霉素、泰乐霉素、螺旋霉素、麦迪霉素和尼达霉素，所有这些PKS的基因和组件组构至少部分是已知的。特别合适的编码KSq-ATq-ACP型装载组件的基因来源是夹竹桃霉素、螺旋霉素、尼达霉素、酒霉素和莫能霉素的装载组件，它们特异性地装载丙二酸酯单位，然后将其脱羧为乙酸起子单位。
在KSq-ATq-ACP型的装载组件中，它们的结构域或部分可以衍生自相同或不同的来源，包括或者天然结构域或者工程改造的结构域。例如，ATq结构域可以被衍生自Ⅰ型PKS、特异性地装载丙二酸酯单位的任何延伸组件的AT结构域取代，只要选择所述KSq结构域对丙二酸酯单位具有匹配特异性即可。
或者，在所提供的Ksq-ATq-ACP型装载组件中的KSq结构域可以被Ⅱ型PKS的CLF多肽取代。先前鉴定所述CLF为唯一决定链长度的因子，现在看来显然相反，所述CFL除了它可能具有的任何其它活性外，还是所述KSq结构域的类似物，并且对于结合的丙二酸酯单位可以用作脱羧酶。
对于Ⅱ型PKS的CLF结构域具有脱羧活性的这种了解，已经使得我们设计在Ⅱ型系统中有用的干预，例如以提高在某些发酵中可获得的产量。许多高产工业发酵由于掺入不想要的起子，往往得到混合物。在具有产生不常见起子的辅助基因的系统中，情况尤为如此。CLF基因可以用来产生不想要的酰基种类，产生掺入不想要的酰基单位的产物。
例如，土霉素的生产涉及一种不常见的丙二酰氨基起子。然而，CLF结构域的不想要的活性引起某些脱羧反应，而导致掺入乙酰基。道诺霉素合成同样涉及一种不常见的起子，所述起子具有CLF结构域的所述“寄生”活性的倾向。
CLF结构域的活性位点(对于脱羧)一般包括一个谷氨酰胺残基。我们发现，通过突变，将所述Gln残基转化为(例如)Ala，可以除去所述结构域的脱羧活性。
因此，另一方面，本发明提供用于合成Ⅱ型(芳族)聚酮化合物的系统和方法，其中Ⅱ型PKS的CLF结构域的gln残基突变，以抑制脱羧活性。用于完成这一点的定点诱变的技术是本领域技术人员众所周知的。
可以将Ksq-ATq-ACP型装载组件连接至例如在PCT/GB97/01819和PCT/GB97/01810中产生的杂种PKS。将这样一种装载组件连接至编码杂种PKS的基因组合上特别有用，所述杂种PKS例如如PCT/GB97/01819和PCT/GB97/01810中所述产生新的14元大环内酯衍生物。
本发明还提供装配有Ksq-ATq-ACP型装载组件的这种PKS组合、含有这种组合的载体以及可以表达所述组合的转化生物体。转化生物体可以带有(harbour)重组质粒，或所述质粒可以整合。具有int序列的质粒将整合到宿主染色体的特定附着位点(att)中。转化生物体可能能够修饰初始产物，例如进行红霉素(如图5所示)和其它聚酮化合物的产生中正常的所有或某些生物合成修饰。可以使用突变生物体，使得阻断某些正常途径，例如以产生没有一个或多个“天然”羟基或糖基的产物。本发明还提供可由转化生物体直接或间接产生的新的聚酮化合物。这包括经过酶修饰的聚酮化合物。
在又一方面，本发明以在乙酸起子单位的特性方面比迄今可能获得的更纯形式提供先前获得的14元环大环内酯和新的14元环大环内酯。这些包括或者为“天然的”或者在以下方面可能不同于相应的“天然”化合物的14元环大环内酯：
a)在一个或多个所述酮(ketide)单位的氧化态方面(即从以下选择可替代物：-CO-、-CH(OH)-、烯烃-CH-和-CH2-)，其中任何-CH(OH)-的立体化学也是独立可选择的；
b)在缺乏一个“天然”甲基侧链方面；或
c)在“天然”甲基的立体化学方面；和/或非甲基的环取代基方面。
制备与在以上a)-c)中的两条或两条以上鉴定的不同于所述天然产物的14元环大环内酯的衍生物也是可能的。
也可以制备已经由非PKS酶经过进一步加工的任何上述的聚酮化合物，所述加工例如为一次或多次的羟基化、环氧化、糖基化和甲基化。
本发明提供一种新的方法，以获得具有乙酸起子单位的已知的和新的复杂14元大环内酯，所述14元大环内酯大致不含仅在丙酸起子单位方面不同的产物。
适用于表达加入了改变的装载组件的PKS基因的质粒载体和基因工程细胞，是那些描述于PCT/GB97/01819的适用于表达Ⅰ型杂种PKS基因的载体和细胞。有效宿主的实例是红色糖多孢菌、天蓝色链霉菌、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、灰褐链霉菌(Streptomycesgriseofuscus)、肉桂地链霉菌、弗氏链霉菌、长孢黄色链霉菌(Streptomyces longisporoflavus)、吸水链霉菌、灰略红小单胞菌(Micromonospora griseorubida)、拉沙里链霉菌(Streptomyceslasaliensis)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、抗生链霉菌、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsts mediterranei)和Streptomyces tsukubaensis。这些包括已知SCP2*-衍生的质粒在其中自主复制的宿主，诸如天蓝色链霉菌、除虫链霉菌和灰褐链霉菌；以及其它宿主，诸如其中SCP2*-衍生的质粒通过所述质粒插入片段上的序列和染色体上的序列的同源重组整合到染色体中的红色糖多孢菌；和用自杀质粒载体转化整合转化的所有这样的载体。
尽管先前已经报道了某些13-甲基红霉素(也称为15-去甲红霉素)(Kibwage等，J.Antibiotics,40,1-6,1987；Weber和McAlpine，美国专利5,141,926)，但这些已经限制于15-去甲红霉素C和6-脱氧-15-去甲红霉素B和D。此外，不仅发现为极少组分的这些15-去甲红霉素与高水平的“天然”红霉素(13-甲基红霉素)一起共同表达，而且先前从未分离出最想要的和有生物活性的“天然”红霉素(红霉素A和B)的13-甲基对应物(15-去甲红霉素A和B)。“天然”红霉素的化学改性已经证明对于增强所述“天然”分子的生物效力是一种极其有效的手段。因此，能够想象，新红霉素的化学改性将相似地产生具有想要的增强的生物效力的化合物。PCT/GB97/01819概括地描述了通过重组DNA技术生产新的聚酮化合物，以及应用这些技术产生新的红霉素，其中具有的起子单位不同于“天然”红霉素特征性的丙酸起子单位的许多红霉素描述于待审的国际专利申请PCT/GB97/01810中，这些新红霉素的某些化学改性也描述于共同待审的国际专利申请PCR/IB98/02100和PCT/IB98/02099中。然而显然，以良好表达水平并在基本上没有新的或天然的具有不同起子单位的红霉素的情况下产生新红霉素的能力，对于便利完成对这类新红霉素的各式各样化学改性的能力而言是必不可少的。以良好表达水平并在基本上没有具有不同起子单位的聚酮化合物的情况下产生聚酮化合物的能力的增强，已经描述于该申请中，它们是家族成员，我们现在描述以良好表达水平并在基本上没有具有不同起子单位的红霉素的情况下产生13-甲基红霉素的能力。应用该技术，已经使得可以制备大量的13-甲基红霉素，这使得我们可以第一次进行各式各样的化学改性，这在先前仅可能由“天然”红霉素开始。
现在参考附图提供本发明的某些实施方案，在附图中：
图1为一图表，显示6-脱氧红霉内酯B合酶(DEBS)的作用方式(functioning),DEBS为生产红霉素A前体6-脱氧红霉内酯B(6-DEB)的组件(modular)PKS。
图2给出了所述KS结构域和代表性Ⅱ型PKS基因簇的CLF结构域的氨基酸序列比较。KS结构域中的活性位点半胱氨酸(C)在图中用箭头指示，与所述CLF结构域的谷氨酰胺(Q)或谷氨酸(E)相对(align)。所用的缩写和相关的Genbank/EMBL登录号为：GRA：得自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的榴菌素(X63449)；HIR：得自披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)的未知聚酮化合物(M98258)；ACT：得自天蓝色链霉菌的放线菌紫素(X63449)；CIN：得自肉桂地链霉菌的未知聚酮化合物(Z11511)；VNZ：得自委内瑞拉链霉菌的jadomycin(L33245)；NOG：得自黑胡桃链霉菌(Streptomyces nogalater)的anthacyclines(Z48262)；TCM：得自淡青链霉菌的丁省霉素(M80674)；DAU：得自种名待定的链霉菌C5(Streptomyces sp.C5)的道诺霉素(L34880)；PEU：得自波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)的阿霉素(L35560)；WHI：得自天蓝色链霉菌的WhiE孢子色素(X55942)。
图3显示泰乐霉素、螺旋霉素和尼达霉素三种16元环大环内酯的PKS的基因组构。
图4显示尼达霉素、platenolide(螺旋霉素)、莫能霉素、夹竹桃霉素和泰乐霉素的PKS的KSq-ATq装载二结构域的氨基酸序列对比。莫能霉素和夹竹桃霉素装载二结构域的序列先前没有公开。
图5在红色糖多孢菌中将6-脱氧红霉内酯B转化为红霉素A的酶促步骤。
图6为显示质粒pJLK117构建的图。
图7显示两种寡核苷酸的结构。
现在描述本发明，但本发明将不受某些实施例的限制。
所有NMR谱均在CDCl3中测量，除非另有说明，都采用Bruker500MHz DMX波谱仪，峰的位置以四甲基硅烷为标准，以每百万的份数(ppm)的低磁场场位移表示。NMR结构中显示的原子数不代表标准命名法，但使NMR数据与该特定实施例相关。HPLC法方法A
    色谱柱    Waters Symmetry 5_C18 2.1mm×150mm
    流速      0.29ml/min
    流动相    梯度：A∶B(22∶78)至A∶B(38∶62)，时间12
              分钟；然后第15分钟至A∶B(80∶20)。保持
              1分钟。在下一个样品之前再平衡。其中：
              A=乙腈，B=0.01M乙酸铵在10％乙腈和
              0.02％TFA中的溶液
    仪器      用连接至配有APCI源的VG平台Ⅱ质谱仪
              的Hewlett-Packard 1050液相层析获得方法B
    色谱柱    Waters Symmetry 5_C18 2.1mm×150mm
    流速      0.29ml/min
    流动相    梯度：28∶72乙腈：10mM NH4OAc至50∶50,
              18分钟；50∶50直至第25分钟。回到28∶72,
              再平衡7分钟。
    仪器      用配有APCI源的Hewlett-Packard 1050液相
              层析获得自来水培养基
    葡萄糖               5g/升
    胰蛋白胨             5g/升
    酵母提取物           2.5g/升
    EDTA                 36mg/升
    自来水  至1L总体积ERY-P培养基
    葡萄糖               50g/升
    NutrisoyTM粉        30g/升
    (NH4)2SO4        3g/升
    NaCl                 5g/升
    CaCO3               6g/升
    自来水  至1L总体积
    将pH调至7.0实施例1重组载体pPFL43的构建
如PCT/GB97/01819中所述制备质粒pCJR24。pPFL43是一种基于pCJR24的质粒，含有编码杂种聚酮化合物合酶的基因，所述基因含有推定的莫能霉素PKS装载组件(分离自肉桂地链霉菌)、DEBS延伸组件1和2以及链终止硫酯酶。如下构建质粒pPFL43：
使用以下合成的寡核苷酸5’-CCATATGGCCGCATCCGCGTCAGCGT-3’和5’-GGCTAGCGGGTCCTCGTCCGTGCCGAGGTCA-3’，用含有得自肉桂地链霉菌的推定的莫能霉素生产PKS基因的5’端的粘粒，或肉桂地链霉菌的染色体DNA用作为模板，扩增编码推定的莫能霉素生产装载组件。3.3kbp的PCR产物经凝胶电泳纯化，用T4多核苷酸激酶处理，并连接至已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL40。通过限制图谱和序列分析鉴定质粒pPFL40。
质粒pHD30His是一种pNEWAVETE的衍生物(PCT/GB97/018100)，它含有除虫菌素装载组件、红霉素延伸组件1和2以及ery硫酯酶结构域。质粒pNEWAVETE用EcoRⅠ和HindⅢ切割，插入合成寡核苷酸接头，所述合成寡核苷酸接头编码将C末端多组氨酸尾加至所述多肽。将以下寡核苷酸一起退火：5’-AATTCACATCACCATCACCATCACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3’和5’-AGCTTCTAGATGGCCAGACCTCCTACTAGTGATGGTGATGGTGATGTG-3’，将该双链体连接至EcoRⅠ和HindⅢ切割的pNEWAVETE。所产生的质粒用NdeⅠ和XbaⅠ切割，并连接到预先已经用同样两种酶切割的质粒pCJR24中，产生质粒pND30His。
质粒pPFL40用NdeⅠ和NheⅠ消化，3.3kbp片段经凝胶电泳纯化，连接至预先用NdeⅠ和NheⅠ消化并用碱性磷酸酶处理的pND30-His。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL43。通过限制酶切分析鉴定质粒pPFL43。实施例2红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL43的构建
用质粒pPFL43转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体。在含有10μg/ml硫链丝菌肽的R2T20培养基中选择硫链丝菌肽抗性菌落。通过将基因组DNA与DIG标记的含编码所述装载组件的mon PKS片段的DNA进行DNA印迹杂交，测试几个克隆内整合到染色体中的pPFL43的存在。以该方式选择出一个具有pPFL43整合拷贝的克隆。实施例3用红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL43生产13-甲基-红霉素A和B
红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)如实施例2所述，通过用莫能霉素装载件(loader)-D1TE DNA插入片段取代野生型装载结构域而构建，将红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)培养物接种到300ml三角锥瓶中含有50μg/ml硫链丝菌肽的30ml自来水培养基中。于29℃培养3天后，用该烧瓶培养物接种300ml烧瓶中的300ml ERY-P培养基中。该肉汤以200rpm于29℃培养6天。此后，用NaOH将整个肉汤调至pH8.5，然后用等体积的乙酸乙酯萃取。用Zymark TurboVap LV蒸发器，将乙酸乙酯萃取物于45℃氮气流下蒸发至干，然后在0.0625体积的甲醇中重建，以将萃取物浓缩16倍。通过LC/MS、方法A证实产物的结构。观察到作为主要组分的4.0min保留时间峰，m/z值为720(M+H)+，符合13-甲基-红霉素A的要求。观察到保留时间为6.4min的第二个峰，m/z值为704(M+H)+，符合13-甲基-红霉素B的要求。实施例4用红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)以8L规模生产和回收13-甲基-红霉素A和B
将红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)接种到2.81费氏烧瓶中含有50μg/ml硫链丝菌肽的1000ml自来水培养基中。于29℃培养3天后，用该烧瓶培养物接种141 Microferm发酵罐(New Brunswick ScientificCo.,Inc.,Edison,NJ)中的81 ERY-P培养基中。该肉汤于28℃下培养，通气率为8l/min，以800rpm搅拌，用NaOH或硫酸(15％)将pH保持在6.9-7.3。加入水，以24小时体积水平保持体积。继续发酵167小时。此后用NaOH将从发酵罐取出肉汤样品调至pH8.5，然后用等体积的乙酸乙酯萃取，证实13-甲基-红霉素A和B的存在。用ZymarkTurboVap LV蒸发器，将乙酸乙酯萃取物于45℃氮气流下蒸发至干，然后在0.25体积的甲醇中重建，以将萃取物浓缩4倍。通过LC/MS、方法A证实产物的结构。观察到作为主要组分的4.1min保留时间的峰，m/z值为720(M+H)+，符合13-甲基-红霉素A的要求。观察到保留时间为6.6min的第二个峰，m/z值为704(M+H)+，符合13-甲基-红霉素B的要求。
加工含有约2.8克13-甲基-红霉素A的约35升肉汤以回收产物。将肉汤通过中间试验规模的Ceraflo陶瓷装置过滤，并上样至500mlXAD-16树脂柱上。用100％甲醇稀释产物。制备175ml CG-161吸附柱，并用20％甲醇/水平衡。将所述产物溶液的一部分调至20％甲醇溶液，上样至该柱上，没有观察到产物穿透。用直至40％甲醇/水洗涤该柱也不能去除任何显著水平的杂质。用50％甲醇/水洗脱，达到所述产物与两种主要杂质的层析分离，所述主要杂质为13-甲基-红霉素B和一种降解产物13-甲基-脱氢红霉素A。合并最纯的流分，采用蒸发将体积减少约75％，达到＜10％甲醇浓度。为了增强13-甲基-红霉素A的提取，加入固体碳酸氢钠直至获得250mM的总浓度。用二氯甲烷2次萃取水性产物层，每次用总体积的一半。通过蒸发将体积减小，得到浅黄色固体。通过将粗制晶体于室温下溶于二氯甲烷中，然后用己烷稀释至15％二氯甲烷，纯化13-甲基-红霉素A。将浑浊的溶液置于-10℃下约30分钟，此时将液体倾至第二个烧瓶中，留下作为油状物的大多数杂质。将烧瓶于-10℃静置过夜，然后在第二天过滤出灰白色的13-甲基-红霉素A晶体。通过351肉汤体积的部分处理，分离出约300毫克的13-甲基-红霉素A。
用100克蒸发的母液进一步分离13-甲基-红霉素B。通过用乙酸水溶液(pH 5)重复萃取原始样品，除去残留的13-甲基-红霉素A。随后的二氯甲烷层在700g硅胶上层析分离，用20％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱。将经LC/MS测定的13-甲基-红霉素B富集部分合并并蒸发，产生约11.0克深色油状物。将该油状物溶于最小量的甲醇中，并上样至500ml Amberchrom CG-161树脂上。用40％甲醇的去离子水溶液，以2倍床体积/小时洗脱出13-甲基-红霉素B。收集一倍床体积的部分，并经LC/MS分析。合并部分42-62，用去离子水稀释至约20％甲醇，用碳酸氢钠中和至pH 7.5。所产生的溶液用41二氯甲烷萃取1次，将其浓缩至约500ml并经无水硫酸镁干燥。通过过滤除去硫酸镁后，将滤液蒸发，得到约110mg浅褐色固体。将110mg粗制13-甲基-红霉素B溶于约3.0毫升HPLC级乙腈中，并上样至20cm×20cm、2mm厚的硅胶制备型薄层层析(PTLC)板上。该板用60∶40甲醇∶乙腈展层。取出得自PTLC板的所需硅胶部分(碘目测法)，用HPLC级丙酮萃取。将丙酮萃取液蒸发，得到12.1mg透明固体。
通过质谱(LC/MS方法B)和NMR光谱学，证实13-甲基-红霉素A和13-甲基-红霉素B的鉴定。13-甲基-红霉素A样品峰的保留时间为4.7min,m/z值为720(M+H)+，符合13-甲基-红霉素A的要求。13-甲基-红霉素B样品峰的保留时间为7.6min,m/z值为704(M+H)+，符合13-甲基红霉素B的要求。NMR,13-甲基-红霉素A：
          #    13C-ppm     #H      1H-ppm
          1    221.91      0
          2    175.99      0
          3    103.63      1       4.45
          4    96.81       1       4.88
          5    83.76       1       3.60
          6    79.86       1       4.10
          7    78.36       1       3.05
          8    75.50       0
          9    74.87       0
          10   73.07       0
          11   72.25       1       5.19
          12   71.25       1       3.26
          13   69.53       1       3.53
          14   69.24       1       3.97
          15   66.16       1       4.06
          16   65.96       1       2.48
          17   49.96       3       3.36
          18   45.36       1       2.79
          19   45.07       1       2.81
          20   40.73       3       2.32
          21   39.00       1       3.15
          22   35.30       2     2.42/1.61
          24   27.20       3       1.50
          25   21.92       3       1.28
          26   21.82       3       1.27
          27   18.99       3       1.32
          28   18.60       3       1.22
          29   16.07       3       1.19
          30   15.08       3       1.19
          31   14.23       3       1.26
          32   12.12       3       1.19
          33   9.60        3       1.15
          34   39.00       2     1.98/1.75
          35   28.90       2     1.72/1.27
          36   40.94       1       2.05NMR,13-甲基-红霉素B：
    #    13C-PPM  连接的#H    1H-PPM
    1     80.50     1     4.15
    2     40.62     1     2.15
    4     45.17     1     2.84
    5     84.08     1     3.62
    6     9.86     3     1.18
    7     97.26     1     4.88
    8     176.48     0
    9     15.25     3     1.22
    11     75.98     0
    12     35.43     2   2.42/1.61
    16     103.75     1     4.46
    17     38.77     2   2.09/1.72
    18     27.67     3     1.51
    20     73.09     0
    21     66.20     1     4.06
    22     70.27     1     5.58
    23     71.24     1     3.28
    25     45.49     1     2.81
    26     78.29     1     3.06
    28     21.91     3     1.28
    29     19.03     3     1.33
    30     41.61     1     1.65
    31     18.73     3     1.29
    32     65.94     1     2.53
    34     69.52     1     3.55
    35     219.92     0
    36     19.03     3     1.21
    38     49.97     3     3.36
    39     70.17     1     3.88
    40     9.27     3     0.95
    41     29.12     2   1.73/1.28
    43     21.80     3     1.27
    44     39.87     1     3.07
    47     40.74     3     2.35
    48     40.74     3     2.35
    49     9.62     3     1.04
实施例5质粒pPFL35的构建
质粒pPFL35是一种基于pCJR24的质粒，含有一个包含一个装载组件、DEBS的第一和第二延伸组件和链终止硫酯酶的PKS基因。所述装载组件包含与雷帕霉素PKS组件2的丙二酰-CoA特异性AT融合、得自夹竹桃霉素PKS装载组件的KSq结构域DNA，该KSq结构域DNA再连接至DEBS装载组件ACP。如下通过几个中间质粒构建质粒pPFL35：
使用以下合成的寡核苷酸引物：5’-TGGACCGCCGCCAATTGCCTAGGCGGGCCGAACCCGGCT-3’和5’-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCC-3’，通过PCR从红色糖多孢菌中扩增从核苷酸1279延伸至核苷酸1690的411bp DNA区段(Donadio,S.等，Science(1991)2523:675-679)。
名为pKSW的质粒衍生自pT7-7和DEBS1-TE，其中已经将新的PstⅠ和HindⅢ位点引入所述第一延伸组件的KS1的侧翼，用质粒pKSW的DNA作为模板。用T4多核苷酸激酶处理所述441bp PCR产物，将其与已经通过用SmaⅠ消化而线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL26。位于所述插入片段边界的新的MfeⅠ/AvrⅡ位点与pUC18中多接头中的Eco RⅠ位点相邻。通过限制图谱和序列分析鉴定质粒pPFL26。
一个MfeⅠ限制位点位于距编码DEBS装载组件的丙酰-CoA:ACP转移酶的DNA5’端112bp。质粒pKSW用MfeⅠ和PstⅠ消化，并与通过用MfeⅠ和PstⅠ消化质粒pPFL26获得的411bp插入片段连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL27。质粒pPFL27含有一个PKS基因，所述PKS基因包含DEBS装载组件、DEBS的第一和第二延伸组件以及DEBS链终止硫酯酶。根据其限制图谱鉴定质粒pPFL27。
质粒pPFL27用NdeⅠ和AvrⅡ消化，并连接至通过用NdeⅠ和AvrⅡ消化质粒pMO6(PCT/GB97/01819)得到的4.6kbp插入片段。质粒pMO6含有一个PKS基因，该PKS基因包含DEBS装载组件、DEBS的第一和第二延伸组件以及DEBS链终止硫酯酶，只是所述第一延伸组件内的编码甲基丙二酸特异性AT的DNA区段已经具体被rapPKS的组件2的丙二酸特异性AT取代。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL28。质粒pPFL28含有一个杂种PKS基因，所述杂种PKS基因包含DEBS装载组件、rapPKS的组件2的丙二酸特异性AT、DEBS装载组件的ACP，然后是DEBS的第一和第二延伸组件以及DEBS链终止硫酯酶。根据限制图谱鉴定质粒pPFL28。
使用以下合成的寡核苷酸引物：5’-CCACATATGCATGTCCCCGGCGAGGAA-3’和5’-CCCTGTCCGGAGAAGAGGAAGGCGAGGCCG-3’，采用抗生链霉菌的染色体DNA作为模板，通过PCR从抗生链霉菌的oleAⅠ基因中扩增从核苷酸1671延伸至核苷酸3385的编码KSq结构域的一个DNA区段。用T4多核苷酸激酶处理所述PCR产物，将其与已经通过用SmaⅠ消化而线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL31。位于所述插入片段边界的新的NdeⅠ位点与pUC18多接头中的EcoRⅠ位点相邻，而新的BspEⅠ位点位于所述接头区的HindⅢ位点边界处。
质粒pPFL31用NdeⅠ和AvrⅡ消化，将所述插入片段与已经用NdeⅠ和AvrⅡ消化的质粒pPFL28连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL32。根据限制图谱鉴定质粒pPFL32。
质粒pPFL32用NdeⅠ和XbaⅠ消化，将所述插入片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接，并经凝胶电泳纯化。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL35。根据限制图谱鉴定质粒pPFL35。实施例6红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL35的构建
用质粒pPFL35转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体。在含有10μg/ml硫链丝菌肽的R2T20培养基(Yamanoto等)中选择硫链丝菌肽抗性菌落。通过将基因组DNA与DIG标记的含编码装载组件2AT的rapPKS片段的DNA进行DNA印迹杂交，测试几个克隆内整合到染色体中的pPFL35的存在。以该方式选择出一个具有pPFL35整合拷贝的克隆。实施例7用红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL35)生产13-甲基-红霉素A和B
红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL35)按照实施例6中所述，通过用夹竹桃霉素KSQ-雷帕霉素AT2-D1TE DNA插入片段取代野生型装载结构域而构建，将红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL35)培养物接种到300ml三角锥瓶中含有50μtg/ml硫链丝菌肽的30ml自来水培养基中。于29℃培养2天后，用该烧瓶培养物接种300ml烧瓶中的300mlERY-P培养基中。该肉汤以200rpm于29℃培养6天。此后，用NaOH将整个肉汤调至pH8.5，然后用等体积的乙酸乙酯萃取。用ZymarkTurboVap LV蒸发器，将乙酸乙酯萃取物于45℃氮气流下蒸发至干，然后在0.25体积的甲醇中重建，以将萃取物浓缩4倍。通过LC/MS、方法A证实产物的结构。观察到一个保留时间为4.0min、m/z值为720(M+H)+的峰，符合13-甲基-红霉素A(C36H65NO13)的要求。观察到保留时间为6.4min、m/z值为704(M+H)+的第二个峰，符合13-甲基-红霉素B(C36H65NO12)的要求。实施例8重组载体pPFL44的构建
pPFL44是一种基于pCJR24的质粒，含有编码杂种聚酮化合物合酶的基因，所述基因含有螺旋霉素PKS装载组件、红霉素延伸组件1和2以及链终止硫酯酶。如下构建质粒pPFL44：
按照Hopwood等所述的方法(1985)，使用以下合成的寡核苷酸5’-CCATATGTCTGGAGAACTCGCGATTTCCCGCAGT-3’和5’-GGCTAGCGGGTCGTCGTCGTCCCGGCTG-3’，用得自螺旋霉素生产者产二素链霉菌的染色体DNA，扩增编码螺旋霉素生产装载组件的DNA。3.3kbp的PCR产物经凝胶电泳纯化，用T4多核苷酸激酶处理，并连接至已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL41。通过限制图谱和序列分析鉴定质粒pPFL41。
质粒pPFL41用NdeⅠ和NheⅠ消化，3.3kbp片段经凝胶电泳纯化，连接至预先用NdeⅠ和NheⅠ消化并用碱性磷酸酶处理的pND30(一种衍生自质粒pCJR24的质粒，具有作为插入片段的ave PKS装载组件和DEBS的延伸组件1和2以及DEBS硫酯酶)(PCT/GB97/01810)。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个克隆的所需质粒pPFL44。通过限制酶切分析鉴定质粒pPFL44。实施例9红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL44的构建
用质粒pPFL44转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体。在含有10μg/ml硫链丝菌肽的R2T20培养基中选择硫链丝菌肽抗性菌落。通过将基因组DNA与DIG标记的含编码装载组件的螺旋霉素PKS片段的DNA进行DNA印迹杂交，测试几个克隆整合到染色体中的pPFL44的存在。以该方式选择出一个具有pPFL44整合拷贝的克隆。实施例10用红色糖多孢菌NRRL-2338(pPFL44)生产13-甲基-红霉素A和B
红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL44)通过用螺旋霉素装载件-D1TEDNA插入片段取代野生型装载结构域而构建，将红色糖多孢菌NRRL2338(pPFL44)培养物接种到300ml三角锥瓶中含有50μg/ml硫链丝菌肽的30ml自来水培养基中。于29℃培养3天后，用该烧瓶培养物接种300ml烧瓶中的300ml ERY-P培养基中。该肉汤以200rpm于29℃培养6天。此后，用NaOH将整个肉汤调至pH8.5，然后用等体积的乙酸乙酯萃取。用Zymark TurboVap LV蒸发器，将乙酸乙酯萃取物于45℃氮气流下蒸发至干，然后在0.0625体积的甲醇中重建，以将萃取物浓缩16倍。通过LC/MS、方法A证实产物的结构。观察到一个保留时间为4.0min、m/z值为720(M+H)+的峰，符合13-甲基-红霉素A(C36H65NO13)的要求。观察到保留时间为6.4min、m/z值为704(M+H)+的第二个峰，符合13-甲基-红霉素B(C36H65NO12)的要求。实施例21质粒pJLK114的构建
pPFL114是一种基于pCJR24的质粒，含有一个PKS基因，所述基因含有ery装载组件、ery PKS的第一和第二延伸组件以及ery链终止硫酯酶，只是酰基转移酶的末端和所述第二ery延伸组件的ACP开始处之间的DNA区段，已经被含有以下限制酶识别位点的合成寡核苷酸接头取代：AvrⅡ、BglⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu36Ⅰ和HpaⅠ。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图6)。质粒pJLK02的构建
使用以下合成的寡核苷酸：5’-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3’和5’-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3’，使用质粒pNTEP2(Oliynyk，M.等，Chemistry and Biology(1996)3:833-839；WO 98/01546)作为模板，通过PCR扩增编码红色糖多孢菌eryAⅠ基因的约1.47kbp DNA片段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理，然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK02。质粒pJLK03的构建
使用以下合成的寡核苷酸：5’-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3’和5’-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC’，使用质粒pNTEPH作为模板，通过PCR扩增编码红色糖多孢菌eryAⅠ基因的约1.12kbpDNA片段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理，然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK03。质粒pJLK04的构建
用PstⅠ和HpaⅠ消化质粒pJLK02，将1.47kbp插入片段与已经用PstⅠ和HpaⅠ消化的质粒pJLK03连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK04。质粒pJLK05的构建
用PstⅠ和AvrⅡ消化质粒pJLK01(PCT/GB97/01819)，将460bp插入片段与已经用PstⅠ和AvrⅡ消化的质粒pJLK04连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK05。质粒pJLK07的构建
用ScaⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK05，用NdeⅠ和ScaⅠ消化质粒pNTEPH，将这两个片段与与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK07。质粒pJLK114的构建
将两种合成的寡核苷酸Plf和Plb(图7)分别溶于TE缓冲液中。将每种溶液(0.5nmol/μl)各10μl混合并加热2分钟至65C，然后缓慢冷却至室温。质粒JLK07用AvrⅡ和HpaⅠ消化，与所述退火的寡核苷酸连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK114。
pJLK117是一种基于pCJR24的质粒，含有一个PKS基因，所述基因含有ery装载组件、ery PKS的第一和第二延伸组件以及ery链终止硫酯酶，只是酰基转移酶的末端和所述第二ery延伸组件的ACP开始处之间的DNA区段，已经被含有以下限制酶识别位点的合成寡核苷酸接头取代：AvrⅡ、BglⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu36Ⅰ和NdeⅠ。
如下通过几种中间质粒构建该质粒(图6)。质粒pJLK115的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK114，将约9.9kbp插入片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK115。质粒pJLK116的构建
用Bsu36Ⅰ和XbaⅠ消化质粒pJLK13(PCT/GB97/01819)，将1.1kbp片段与已经用Bsu36Ⅰ和XbaⅠ消化的质粒pJLK115连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK116。质粒pJLK117的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK116，将9.9kbp片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK117。实施例11质粒pJTK29的构建
pJLK29是一种基于pJLK117的质粒，只是编码rap PKS组件10的还原型回折(loop)的DNA片段已经插入mcs中。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图5)。质粒pJLK121.1的构建
使用以下合成的寡核苷酸：5’-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3’和5’-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3’，使用通过用ScaⅠ和SphⅠ消化粘粒cos 26(Schwecke,T.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)获得的约7kbp片段作为模板，通过PCR扩增吸水链霉菌rapB基因编码组件10的还原性回折的约2.2kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理，然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK121.1。质粒pJLK29的构建
用BglⅡ和NdeⅠ消化质粒pJLK121.1，将2.2kbp片段与已经用BglⅡ和NdeⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK29。实施例24质粒pJLK50的构建
使用以下合成的寡核苷酸：5’-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3’和5’-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3’，使用质粒pBAM25(由Best,D.J等公开的pBK25,Eur J Biochem(1992)204:39-49)作为模板，通过PCR扩增红色糖多孢菌红霉素PKS基因簇编码组件2的ACP开始处至组件3的ACP开始之处之间的约6.1kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理，然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序鉴定所需质粒pJLK50。实施例25红色糖多孢菌菌株JLK10的构建
菌株JLK10是菌株NRRL2338的一种变异体，其中ery组件2的还原性回折(即KR结构域)被雷帕霉素组件10的还原性回折取代。用如下构建的质粒pJLK54构建该菌株。质粒pJLK54的构建
pJLK54是一种基于pCJR29的质粒，含有一个PKS基因，所述基因含有ery装载组件、ery基因簇的第一、第二和第三延伸组件以及ery链终止硫酯酶，只是酰基转移酶的末端和所述第二ery延伸组件的ACP开始处之间的DNA区段，已经被雷帕霉素PKS组件10的等同区段取代。
如下构建该质粒。
用NheⅠ消化质粒pJLK50，将6.1kbp插入片段与已经用NheⅠ消化的质粒pJLK29连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK54。应用质粒pJLK54构建红色糖多孢菌NRRL2338/pJLK54和生产TKL衍生物
用约5μg质粒pJLK54转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体，并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA，并经DNA印迹杂交分析，以证实该质粒已经整合入所述TE。红色糖多孢苜菌株JLK10的构建和用该菌株生产13-甲基-10,11-脱氢-红霉素A
红色糖多孢菌菌株JLK10是红色糖多孢菌NRRL2338的一种突变体，其中ery组件2的“还原性回折”(即酮还原酶结构域)被雷帕霉素组件10的“还原性回折”取代。由已经插入质粒pJLK54的红色糖多孢菌NRRL2338开始，构建所述菌株。使红色糖多孢菌NRRL2338/pJLK54经过几轮非选择性生长，导致第二次交换，同时失去所述整合的质粒。通过DNA印迹杂交，鉴定其中已经发生用突变形式的DEBS1取代红霉素基因的克隆。其中一个克隆命名为红色糖多孢菌菌株JLK10，用其接种SM3培养基(eryP培养基给出相似的结果)，让其于28-30℃生长7-10天。此后，将肉汤离心，将上清液的pH调至pH9。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，并通过蒸发除去溶剂。产物经HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鉴定出以下大环内酯C13甲基红霉素A(伴有由后-PKS酶不完全加工的产物)。
Figure A9981005200381
实施例26质粒pPFL50的构建
质粒pPFL50是一种基于pPFL43的质粒，已经从pPFL43中除去了编码红霉素PKS的KS1(部分)、ACP1和组件2以及红霉素TE的DNA片段。该质粒如下构建。用SfuⅠ和XbaⅠ消化质粒pPFL43，以除去6.5kbp片段。用克列诺片段DNA聚合酶Ⅰ填平5’突出端，将该质粒再环化。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pPFL50。红色糖多孢菌JLK10/pPFL50的构建
用约5μg质粒pPFL50转化红色糖多孢菌菌株JLK10的原生质体，并分离出稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA，并经DNA印迹杂交分析，以证实该质粒已经整合入同源染色体DNA区。用红色糖多孢菌菌株JLK10/pPFL50接种含有5μg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基(含有5μg/ml硫链丝菌肽的eryP培养基给出相似的结果)，让其于28-30℃生长7-10天。此后，将肉汤离心，将上清液的pH调至pH9。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，并通过蒸发除去溶剂。产物经HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鉴定出大环内酯C13甲基10,11-脱氢-红霉素A(伴有由后-PKS酶不完全加工的产物)。红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL50的构建
用约5μg质粒pPFL50转化红色糖多孢菌NRRL338的原生质体，并分离出稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA，并经DNA印迹杂交分析，以证实该质粒已经整合入染色体DNA的同源区。用红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL50接种含有5μg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基(含有5μg/ml硫链丝菌肽的eryP培养基给出相似的结果)，让其于28-30℃生长7-10天。此后，将肉汤离心，将上清液的pH调至pH9.5。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，并通过蒸发除去溶剂。产物经HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鉴定出大环内酯C13甲基红霉素A(伴有由后-PKS酶不完全加工的产物)。质粒pCB121的构建
质粒pCB121是一种含有莫能霉素装载组件和莫能霉素组件1的KS、后接红霉素组件1AT和红霉素组件1KR的部分的质粒。通过几种中间质粒如下制备该质粒。质粒pPFL45的构建
使用以下合成的寡核苷酸：5’-CGTTCCTGAGGTCGCTGGCCCAGGCGTA-3’和5’-CGAAGCTTGACACCGCGGCGCGGCGCGG-3’，使用含有得自肉桂地链霉菌的莫能霉素PKS基因5’端的粘粒作为模板，或者采用肉桂地链霉菌的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增肉桂地链霉菌莫能霉素PKS基因簇编码装载组件的ACP一部分和组件1的KS的约1.8kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理，然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pPFL45。质粒pPFL47的构建
用NdeⅠ和Bsu36Ⅰ消化质粒pPFL45，将约2.6kbp片段连接到已经用NdeⅠ和Bsu36Ⅰ消化的质粒pPFL43中。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pPFL47。质粒pCB135的构建
用HindⅢ消化质粒pCJR24，用克列诺片段DNA聚合酶Ⅰ填平5’突出端并再连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱、根据缺乏HindⅢ识别位点鉴定所需质粒pCB135。质粒pKSW1的构建
质粒pKS1W是一种衍生自pNTEP2(GB97/01810)的载体，含有DEBS1TE衍生的三酮化合物(triketide)合酶以及在KS1的边界引入的独特的限制位点。通过几种中间质粒如下获得pKS1W。质粒pMO09、pMO10和pMO13的构建
为了经PCR扩增质粒pMO09，使用以下合成的寡核苷酸作为诱变引物，一种引物含有一个MunⅠ位点，另一种引物含有一个PstⅠ位点：5’-GCGCGCCAATTGCGTGCACATCTCGAT-3’和5’-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3’。
为了经PCR扩增质粒pMO10，使用以下合成的寡核苷酸作为诱变引物，一种引物含有一个HindⅢ位点，另一种引物含有一个EcoRⅤ位点：5’-GTCTCAAGCTTCGGCATCAGCGGCACCAA-3’和5’-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3’。
为了经PCR扩增质粒pMO13，使用以下合成的寡核苷酸作为诱变引物，一种引物含有一个PstⅠ位点，另一种引物含有一个HindⅢ位点：5’-GATGGCCTGCAGGCTGCCCGGCGGTGTGAGCA-3’和5’-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3’。
以pNTEP2(GB97/01810)作为模板，使用Pwo DNA聚合酶进行PCR，进行一个循环为：96℃(1分钟)；于50℃退火(3分钟)；和于72℃延伸(1分钟)，然后在存在10％(体积/体积)二甲基亚砜的情况下再进行25个循环：96℃(1分钟)；于50℃退火(1分钟)和于72℃延伸(1分钟)。将产物进行末端修补，克隆到用SmaⅠ消化的pUC18中，将连接混合物转化到大肠杆菌DH 10B中。从各个菌落制备质粒DNA。通过限制图谱和DNA测序鉴定所需质粒pMO09(3.8kbp)、pMO10(3.9kbp)和pMO13(4.3kbp)。质粒pMO11的构建
用HindⅢ消化质粒pMO13，将1.2kbp插入片段克隆到已经用HindⅢ消化的质粒pMO10中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH10B中。通过限制图谱鉴定所需质粒(5.0kbp)并命名为pMO11。质粒pMO12的构建
用PstⅠ消化质粒pMO09，将1.6kbp插入片段克隆到已经用PstⅠ消化的质粒pMO11中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH 10B中。通过限制图谱鉴定所需质粒(6.6kbp)并命名为pMO12。质粒pKS1W的构建
用MunⅠ和EcoRV消化质粒pMO12，将3.9kbp片段克隆到已经用MunⅠ和EcoRⅤ消化的质粒pNTEPH(参见下文)中。将连接混合物转化到大肠杆菌DH 10B中。通过限制图谱鉴定所需质粒(13.kbp)并命名为pKS1W。质粒pNTEPH的构建
通过除去HindⅢ位点，由pNTEP2获得质粒pNTEPH。用HindⅢ消化质粒pNTEP2，用克列诺片段DNA聚合酶Ⅰ填平5’突出端并再连接。通过限制图谱鉴定所需质粒(13.6kbp)。质粒pCB136的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pKSW1，将约11.2kbp片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCB135连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pCB136。质粒pCB137的构建
用SfuⅠ和XbaⅠ消化质粒pCB136，以除去6.5kb片段。用克列诺片段DNA聚合酶Ⅰ填平5’突出端并再连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pCB137。质粒pCB121的构建
用NdeⅠ和HindⅢ消化质粒pPFL47，将约4.4 kbp片段与已经用NdeⅠ和HindⅢ消化的质粒pCB137连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞，检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pCB121。实施例红色糖多孢菌JLK10/pCB121的构建
用约5μg质粒pCB121转化红色糖多孢菌JLK10的原生质体，并分离出稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA，并经DNA印迹杂交分析，以证实该质粒已经整合入同源染色体DNA区。用红色糖多孢菌菌株JLK10/pCB121接种含有5μg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基(含有5μg/ml硫链丝菌肽的eryP培养基给出相似的结果)，让其于28-30℃生长7-10天。此后，将肉汤离心，将上清液的pH调至pH9。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，并通过蒸发除去溶剂。产物经HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鉴定出大环内酯C13甲基-10,11-脱氢-红霉素A(伴有由后-PKS酶不完全加工的产物)。实施例红色糖多孢菌NRRL2338/pCB121的构建
用约5μg质粒pCB121转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体，并分离出稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA，并经DNA印迹杂交分析，以证实该质粒已经整合入同源染色体DNA区。用红色糖多孢菌NRRL2338/pPFL50接种含有5μg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基(含有5μg/ml硫链丝菌肽的ertP培养基给出相似的结果)，让其于28-30℃生长7-10天。此后，将肉汤离心，将上清液的pH调至pH=9。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，并通过蒸发除去溶剂。产物经HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鉴定出大环内酯C13甲基红霉素A(伴有由后-PKS酶不完全加工的产物)。
尽管通过以上所列的实施例说明本发明，但它们不应该被认为限制本发明的范围。以上描述首次描绘了Ⅰ型PKS基因组合的构建，所述基因组合包含含全部或部分异源KSq的装载组件，也首次描绘了用其获得可用作合成中间体或作为生物活性材料诸如抗生素的聚酮化合物产物。本领域技术人员容易想到，得自其它PKS基因系(gene set)的含全部或部分异源KSq的装载组件能够用来取代DEBS的装载组件，或引入到(indeed into)一种相当不同的PKS基因组合中。本领域技术人员也容易联想到：通过由一种ATq更有效地鉴别甲基丙二酰-CoA和丙二酰-CoA、然后由一种KSq特异性地脱羧所提供的额外的特异性，比丙酰-CoA和乙酰-CoA之间的鉴别不完善更为可取，而后者为DEBS装载组件和许多其它PKS装载组件的特征；因为这可使单一产物的产量最大，而不是生产在起子单位的性质上不同的混合物。避免样的混合物提高了产量，并且避免需要冗长困难的分离步骤。

Claims (25)

1．14元大环内酯，其加入了一种乙酸起子单位，使得它具有13-甲基取代基，前提是它不是去甲红霉素(norerythromycin)C、6-脱氧-15-去甲红霉素B或6-脱氧-15-去甲红霉素D。
2．15-去甲红霉素A。
3．15-去甲红霉素B。
4．式1化合物：或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H或OH；R2-R4各自独立地为H、CH3或CH2CH3；R5为H或OH；而R6为H、CH3或CH2CH3；R7为H或德糖胺；R8为H、CH3或CH2CH3；R9为OH、碳霉糖(mycarose)(R12为H)或克拉定糖(R12为CH3),R10为H；或R9=R10=O；而R11为H、CH3或CH2CH3，前提是当R2-R4为CH3,R6为CH3,R8为CH3，且R11为CH3时，则R1和R5不是H，且R12不是H；或此外当R2-R4为CH3,R6为CH3,R8为CH3，且R11为CH3时，则R1和R5不是OH，且R12不是H。
5．按照权利要求4的化合物，其中R1为OH；R2-R4为CH3；R5为OH；R6为CH3,R7为德糖胺；R8为CH3；R9为克拉定糖(R12为CH3)；而R11为CH3。
6．按照权利要求4的化合物，其中R1为H；R2-R4为CH3；R5为OH；R6为CH3,R7为德糖胺；R8为CH3；R9为克拉定糖(R12为CH3)；而R11为CH3。
7．制备式1化合物的方法：
Figure A9981005200031
其中：R1为H或OH；R2-R4各自独立地为H、CH3或CH2CH3；R5为H或OH；而R6为H、CH3或CH2CH3；R7为H或德糖胺；R8为H、CH3或CH2CH3；R9为OH、碳霉糖(R12为H)或克拉定糖(R12为CH3)，R10为H；或R9=R10=O；而R11为H、CH3或CH2CH3
8．如权利要求7中提出的制备式1化合物的方法，其中R1为OH；R2-R4为CH3；R5为OH；R6为CH3,R7为德糖胺；R8为CH3；R9为克拉定糖(R12为CH3)；而R11为CH3
9．如权利要求7中提出的制备式1化合物的方法，其中R1为H；R2-R4为CH3；R5为OH；R6为CH3,R7为德糖胺；R8为CH3；R9为克拉定糖(R12为CH3)；而R11为CH3
10．用于生产加入乙酸起子单位的14元大环内酯的系统，所述系统包含编码并布置以表达PKS多酶的DNA，所述DNA包含一个装载组件和多个延伸组件；其中在所述表达的多酶中，所述装载组件被改变以装载丙二酰残基，然后实现所述装载的残基的脱羧，以提供乙酸起子单位，所述乙酸起子单位被转移至一个相邻的所述延伸组件；并且其中所述延伸组件或至少其中之一不是与实现脱羧的装载组件天然相连的。
11．按照权利要求10的系统，其中所述大环内酯为如权利要求4-9中任一项定义的式1化合物。
12．按照权利要求10或11的系统，其中所述乙酸起子单位被转移到的所述相邻的延伸组件与实现脱羧的装载组件不是天然相连的。
13．按照权利要求10、11或12的系统，其中所述装载组件的脱羧功能性由在所述活性位点具有一个谷氨酰胺残基的酮合酶型结构域提供。
14．按照权利要求10、11或12的系统，其中所述装载组件的脱羧功能性由CLF型结构域提供。
15．按照权利要求14的系统，其中所述CLF型结构域基本上如图2中所示的任一种。
16．按照权利要求10-15中任一项的系统，其中所述装载组件的装载功能性有在所述活性位点具有一个精氨酸残基的酰基转移酶型结构域提供。
17．按照权利要求10-16中任一项的系统，其中所述装载组件包括一个酰基载体蛋白。
18．按照权利要求10-13、16或17中任一项的系统，其中至少所述装载组件的KSQ结构域对应于夹竹桃霉素、螺旋霉素、尼达霉素、酒霉素或莫能霉素的PKS多酶的装载组件。
19．可由权利要求10-18中任一项的系统的DNA或具有合成式1化合物能力的变异体表达的PKS多酶。
20．编码权利要求19的PKS多酶的核酸。
21．含有权利要求20中定义的核酸的载体。
22．包含按照权利要求10-18中任一项的系统的转化生物体。
23．按照权利要求7、8或9的方法，所述方法包括培养按照权利要求22的生物体并回收式1化合物。
24．按照权利要求23的方法，其中所述大环内酯为权利要求4-9中任一项中定义的式1化合物。
25．按照权利要求10-24中任一项的系统、生物体或方法，其中大多数延伸组件对应于选自红霉素、那波霉素、苦霉素、兰卡霉素、久慈霉素或巨大霉素的一种PKS的延伸组件，或其能指导大环内酯合成的突变体或变异体。
CN99810052A 1998-06-29 1999-06-29 聚酮化合物及其合成 Pending CN1315956A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9814006.4A GB9814006D0 (en) 1998-06-29 1998-06-29 Polyketides and their synthesis
GB9814006.4 1998-06-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1315956A true CN1315956A (zh) 2001-10-03

Family

ID=10834580

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99810073A Pending CN1316001A (zh) 1998-06-29 1999-06-29 聚酮化合物及其合成
CN99810052A Pending CN1315956A (zh) 1998-06-29 1999-06-29 聚酮化合物及其合成

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN99810073A Pending CN1316001A (zh) 1998-06-29 1999-06-29 聚酮化合物及其合成

Country Status (23)

Country Link
US (3) US7148045B1 (zh)
EP (2) EP1090123B1 (zh)
JP (2) JP2002519014A (zh)
KR (2) KR20010071683A (zh)
CN (2) CN1316001A (zh)
AT (2) ATE461289T1 (zh)
AU (2) AU765257B2 (zh)
BR (2) BR9911712A (zh)
CA (2) CA2335523A1 (zh)
CZ (2) CZ20004913A3 (zh)
DE (2) DE69942149D1 (zh)
ES (1) ES2341403T3 (zh)
GB (1) GB9814006D0 (zh)
HK (1) HK1034536A1 (zh)
HU (2) HUP0105179A2 (zh)
ID (2) ID28285A (zh)
IL (2) IL140440A0 (zh)
MX (2) MXPA00012885A (zh)
NZ (2) NZ509601A (zh)
PL (2) PL345575A1 (zh)
TR (2) TR200003771T2 (zh)
WO (2) WO2000000618A2 (zh)
YU (2) YU82500A (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7738015B2 (en) * 1997-10-09 2010-06-15 Fotonation Vision Limited Red-eye filter method and apparatus
US7630006B2 (en) * 1997-10-09 2009-12-08 Fotonation Ireland Limited Detecting red eye filter and apparatus using meta-data
GB9814622D0 (en) * 1998-07-06 1998-09-02 Biotica Tech Ltd Polyketides,their preparation,and materials for use therein
US6590083B1 (en) 1999-04-16 2003-07-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
US6399582B1 (en) 1999-04-16 2002-06-04 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
GB9912563D0 (en) * 1999-05-28 1999-07-28 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
US7033818B2 (en) 1999-10-08 2006-04-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant polyketide synthase genes
US6524841B1 (en) * 1999-10-08 2003-02-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant megalomicin biosynthetic genes and uses thereof
EP1278881B1 (en) 2000-04-13 2009-12-30 Biotica Technology Limited Hybrid glycosylated products and their production and use
KR101016561B1 (ko) * 2002-02-19 2011-02-22 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 신규한 스피노신 생산 폴리케타이드 신타제
EP1655372A3 (en) 2002-07-16 2008-01-16 Biotica Technology Limited Production of polyketides and other natural products
GB0327721D0 (en) * 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
GB0327720D0 (en) * 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Erythromycins and process for their preparation
GB0417852D0 (en) 2004-08-11 2004-09-15 Biotica Tech Ltd Production of polyketides and other natural products
JP2011516045A (ja) * 2008-03-28 2011-05-26 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ポリケチドシンターゼを使用するジカルボン酸の生成法
JP2011519860A (ja) * 2008-04-29 2011-07-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ポリケチドシンターゼを使用するバイオ燃料の生成
GB0904540D0 (en) 2009-03-17 2009-04-29 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
US8765431B2 (en) * 2009-07-23 2014-07-01 The Regents Of The University Of Michigan Method for enzymatic production of decarboxylated polyketides and fatty acids
EP2456777A2 (en) 2009-07-24 2012-05-30 Université Henri Poincaré - Nancy 1 Stambomycin and derivatives, their production and their use as drugs
GB0914589D0 (en) 2009-08-20 2009-09-30 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
US8852902B2 (en) 2010-11-22 2014-10-07 The Regents Of The University Of California Producing a trimethylpentanoic acid using hybrid polyketide synthases
MX2015014026A (es) 2013-04-04 2016-08-03 Harvard College Macrolidos y metodos para su preparacion y uso.
JP2017531663A (ja) 2014-10-08 2017-10-26 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ １４員ケトライドならびにそれらの調製および使用の方法
JP2018509452A (ja) 2015-03-25 2018-04-05 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 修飾デソサミン糖をもつマクロライドおよびその使用
CN106591388A (zh) * 2016-10-13 2017-04-26 中国农业科学院生物技术研究所 具有聚酮类化合物合成功能的基因Dr2091
CA3053874A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Immune System Regulation Holding Ab Novel immune stimulating macrolides
AU2018225390B2 (en) 2017-02-22 2021-07-22 ISR Immune System Regulation Holding AB (publ) Novel immune stimulating macrolides
CN110914425B (zh) 2017-06-06 2024-06-25 齐默尔根公司 用于改良刺糖多孢菌的高通量(htp)基因组工程改造平台
CA3094747A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 ISR Immune System Regulation Holding AB (publ) Combinations of macrolide compounds and immune checkpoint inhibitors

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141926A (en) * 1990-04-18 1992-08-25 Abbott Laboratories Erythromycin derivatives
US5712146A (en) * 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
US5672491A (en) * 1993-09-20 1997-09-30 The Leland Stanford Junior University Recombinant production of novel polyketides
DK0725778T3 (da) * 1993-09-20 2001-12-17 Univ Leland Stanford Junior Rekombinant produktion af hidtil ukendte polyketider
AU706445B2 (en) * 1995-07-06 1999-06-17 Brown University Research Foundation Cell-free synthesis of polyketides
EP0910633B1 (en) * 1996-07-05 2009-12-09 Biotica Technology Limited Hybrid polyketide synthase I gene
JPH10303641A (ja) * 1997-04-23 1998-11-13 Mitsubishi Electric Corp 発振器及び無線機
CA2288030A1 (en) * 1997-04-30 1998-11-05 Kosan Biosciences, Inc. Combinatorial polyketide libraries produced using a modular pks gene cluster as scaffold
AP1060A (en) * 1998-01-02 2002-04-23 Pfizer Prod Inc Novel erythromycin derivatives.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010071683A (ko) 2001-07-31
ATE321137T1 (de) 2006-04-15
TR200003771T2 (tr) 2001-10-22
US20050090461A1 (en) 2005-04-28
AU765257B2 (en) 2003-09-11
GB9814006D0 (en) 1998-08-26
CA2335523A1 (en) 2000-01-06
HUP0105179A2 (hu) 2002-05-29
EP1090123A2 (en) 2001-04-11
US7148045B1 (en) 2006-12-12
ES2341403T3 (es) 2010-06-18
EP1090123B1 (en) 2006-03-22
IL140438A0 (en) 2002-02-10
MXPA00012936A (es) 2002-06-21
CZ20004912A3 (cs) 2001-08-15
AU763230B2 (en) 2003-07-17
JP2002519032A (ja) 2002-07-02
ID28285A (id) 2001-05-10
US7198922B2 (en) 2007-04-03
WO2000000618A3 (en) 2000-04-27
WO2000000500A2 (en) 2000-01-06
CA2331764A1 (en) 2000-01-06
DE69942149D1 (en) 2010-04-29
CA2331764C (en) 2008-03-11
NZ509600A (en) 2004-03-26
HUP0102945A2 (hu) 2001-12-28
BR9911710A (pt) 2001-03-20
WO2000000500A3 (en) 2000-03-16
EP1091971B1 (en) 2010-03-17
YU82500A (sh) 2004-03-12
NZ509601A (en) 2004-04-30
AU4524599A (en) 2000-01-17
AU4524799A (en) 2000-01-17
PL345575A1 (en) 2001-12-17
ID27419A (id) 2001-04-05
DE69930510D1 (de) 2006-05-11
TR200003770T2 (tr) 2001-04-20
WO2000000618A2 (en) 2000-01-06
MXPA00012885A (es) 2002-07-02
CN1316001A (zh) 2001-10-03
DE69930510T2 (de) 2006-12-07
JP2002519014A (ja) 2002-07-02
BR9911712A (pt) 2001-03-20
HK1034536A1 (en) 2001-10-26
IL140440A0 (en) 2002-02-10
JP4489947B2 (ja) 2010-06-23
ATE461289T1 (de) 2010-04-15
YU82700A (sh) 2003-10-31
US20060240528A1 (en) 2006-10-26
KR20010071684A (ko) 2001-07-31
PL345578A1 (en) 2001-12-17
EP1091971A2 (en) 2001-04-18
CZ20004913A3 (cs) 2001-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1315956A (zh) 聚酮化合物及其合成
JP5514185B2 (ja) Ｎｒｐｓ−ｐｋｓ遺伝子群ならびにその操作および有用性
CN1179046C (zh) 新型红霉素、其制备方法、用途和含其的药物组合物
Weinig et al. Melithiazol biosynthesis: further insights into myxobacterial PKS/NRPS systems and evidence for a new subclass of methyl transferases
Heneghan et al. The programming role of trans-acting enoyl reductases during the biosynthesis of highly reduced fungal polyketides
AU765821B2 (en) Methods for making polyketides
Frank et al. Spiroketal polyketide formation in Sorangium: identification and analysis of the biosynthetic gene cluster for the highly cytotoxic spirangienes
US7452693B2 (en) Discrete acyltransferases associated with type I polyketide synthases and methods of use
Petković et al. Substrate specificity of the acyl transferase domains of EpoC from the epothilone polyketide synthase
CN1316002A (zh) 聚酮化合物、其制备和其中所用的材料
JP2023012549A (ja) 改変ストレプトマイセス・フンジシディカス分離株およびその使用
US8852902B2 (en) Producing a trimethylpentanoic acid using hybrid polyketide synthases
US8383392B2 (en) Transformant and method for production of non-natural antibiotic
CN102260644A (zh) 一株淡黄色链霉菌突变菌株，构建方法及其用途
CN101812103B (zh) 基因工程改造六-甲基水杨酸合成酶并组合生物合成螺环乙酰乙酸内酯类抗生素
JP2004049100A (ja) ミデカマイシンの生合成遺伝子
JP2006280220A (ja) ミデカマイシン高生産菌
Macpherson Biosynthesis of polyketides produced by marine microbes.
JP2004089156A (ja) ビセニスタチン合成酵素遺伝子クラスター、ビセニサミン糖転移酵素ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードする遺伝子
EP1520025A2 (en) Nucleic acid molecules involved in the synthesis of melithiazols

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication