KR20010071684A - 폴리케타이드 및 그들의 합성방법 - Google Patents

폴리케타이드 및 그들의 합성방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20010071684A
KR20010071684A KR1020007015000A KR20007015000A KR20010071684A KR 20010071684 A KR20010071684 A KR 20010071684A KR 1020007015000 A KR1020007015000 A KR 1020007015000A KR 20007015000 A KR20007015000 A KR 20007015000A KR 20010071684 A KR20010071684 A KR 20010071684A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plasmid
pks
loading module
module
domain
Prior art date
Application number
KR1020007015000A
Other languages
English (en)
Inventor
피터 프란시스 리드레이
제임스 스턴톤
제수스 코테스
해미쉬 알라스테어 얼빈 맥아서
Original Assignee
바이오티카 테크놀로지 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오티카 테크놀로지 리미티드 filed Critical 바이오티카 테크놀로지 리미티드
Publication of KR20010071684A publication Critical patent/KR20010071684A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D313/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than six members having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Polyoxymethylene Polymers And Polymers With Carbon-To-Carbon Bonds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Type I의 폴리케타이드 신다제 (PKS)는 다양한 익스텐션 도메인에 결합된 로딩 모듈을 포함하는 복합 다중효소이다. 제1 익스텐션 모듈은 로딩 도메인으로부터 아실 스타터 유니트를 받아들이고 각 익스텐션 모듈은 가공(추가의 환원)을 거칠 추가의 케타이드 유니트를 추가한다. 본인들은 일부 PKS 도메인에 의하여 점유된 Ksq 도메인이 탈카복실화, 예를 들면 (치환된) 말로닐로부터 (치환된) 아실을 생성하는 것을 알게 되었다. Type II PKS의 CLF 도메인은 유사한 활성을 갖고 있다. 이러한 도메인을 포함하는 로딩 모듈을 그들을 정상적으로 점유하지 않은 PKS에 삽입하면 스타터 유니트를 제어하는 것이 가능하다.

Description

폴리케타이드 및 그들의 합성방법{POLYKETIDES AND THEIR SYNTHESIS}
폴리케타이드는 에리트로마이신, 테트라사이클린, 래파마이신, 아버멕틴, 모넨신, 에포틸론 및 FK506과 같은 항생성 또는 기타의 약리학적 특성을 갖는 많은 화합물을 포함하는 거대하고 구조적으로 천연물의 다른 종류이다. 특히 폴리케타이드는스트렙토마이세스와 관련 악티노마이세트 박테리아에 의하여 풍부하게 생산된다. 폴리케타이드는 지방산 생합성에 유사한 방법으로 아실티오에스텔의 반복적이고 순차적인 응축에 의하여 합성되고 있다. 천연 폴리케타이드 중에 나타나는 거대 구조의 다양성은 스타터 또는 익스텐더 유니트로서 아세테이트 또는 프로피온네이트의 선택 또는 각개 응축 후에 관측되는 β-케토 그룹의 상이한 가공도에 의하여 유래되는 것이다. 가공 단계의 예로는 β-하이드록시아실- 로의 환원, 2-엔오일- 로의 탈수에 이은 환원 및 포화 아실티오에스텔로의 완전 환원이 있다. 이러한 가공 단계의 구조화학적 성과는 체인 연장의 각 사이클에서 나타난다.
폴리케타이드의 생합성은 폴리케타이드 신다제로 알려진 체인-형성 효소의 그룹에 의하여 시작된다. 악티노마이세트에서는 두 종류의 폴리케타이드 신다제(PKS)가 알려졌다. 마크로라이드 에리트로마이신, 올레안도마이신, 애버멕틴 및 래파마이신에 대한 PKS로 대표되는 한 종류의 속칭 Type I PKS는 폴리케타이드 체인 익스텐션의 각 사이클에 대하여 상이한 셋트 또는 "모듈"의 효소로 구성된다. 하나의 예를 도1에서 볼 수 있다. (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348: 176-178; Donadio, S. et. al. Science (1991) 2523: 675-679; Swan, D. G. et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242: 358-362; MacNeil, D. J. et. al. Gene (1992) 115: 119-125; Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843)
본 발명에 사용된 용어인 "익스텐션 모듈"은 폴리케타이드 체인 익스텐션의 한 사이클을 달성하는 β-케토아실-ACP 신다제("KS") 도메인으로부터 다음 아실 캐리어 단백질("ACP") 도메인까지의 인접 도메인 셋트를 의미한다. "로딩 모듈"이란 용어는 PKS에 대한 스타터 유니트의 로딩을 달성하여 일차 익스텐션 모듈의 KS 도메인에까지 이용될 수 있는 인접 도메인의 임의 그룹에 대하여 사용한다. 에리트로마이신 생합성의 경우에는, 형성된 폴리케타이드의 길이가 체인 절단 티오에스테라제/사이클라제 활성제를 포함하는 에리트로마이신 생성 PKS의 효소 도메인의 유전학적 엔지니어링을 이용하는 특수한 재배치에 의하여 변경될 수 있다(Cortes et al. Science (1995) 268: 1487-1489; Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1995) 117: 9105-9106).
에리트로마이신-생성 PKS (6-디옥시에리트로놀리드 B 신다제, DEBS로 알려짐)의 모듈 5에 있는 케토리덕타제 도메인의 DNA 인코딩 부분의 프레임 내 결실은 에리트로마이신 유사체 5,6-디디옥시-3-α-마이카로실-5-옥소에리트로놀리드 B, 5,6-디디옥시-5-옥소에리트로놀리드 B 및 5,6-디디옥시, 6-β-에폭시-5-옥소에리트로놀리드 B의 형성을 가져오는 것으로 알려 졌다(Donadio, S. et al. Science (1991) 252: 675-679). 유사하게 해당하는 PKS-인코딩 DNA의 유전학적 엔지니어링과 이들의사카로폴리스포라 에리트라에로의 도입에 의한 DEBS 내의 모듈 4의 에노일리덕타제 내에 있는 활성 사이트 잔여분의 분리는 6,7-앤하이드로에리트로마이신 C의 생성을 가져온다 (Donadio, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7119-7123).
국제출원 WO 93/13663호에는 변성된 폴리케타이드를 생산할 수 있는 유전학적 제조방법의 한 형태가 기재되어 있다. 그러나 많은 시도가 비생산적이라는 보고가 있었다(Hutchinson, C. R. 및 Fujii, I. Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49: 201-238; 231페이지). 마크로사이클릭 면역억압성 폴리케타이드 래파마이신의 생합성을 지배하는 모듈 Type I PKS를 인코딩하는스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 유래되는 유전자의 완전한 DNA 염기서열은 알려졌다 (Schwecke, T. et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839-7843). DNA 염기서열은 수탁번호 X86780호로 EMBL/Genbank 데이터베이스에 기탁되었다.
Type II PKS로 명명된 PKS의 두 번째 종류는 방향족 화합물을 위한 신다제로 표현된다. Type II PKS는 체인 익스텐션을 위한 효소 활성체의 단일 셋트 만을 포함하고 연속 사이클 중에 적절하게 재사용된다(Bibb, M. J. et al. EMBO. J. (1989) 8: 2727-2736; Sherman, D. H. et al. EMBO. J. (1989) 8: 2717-2725; Fernandez-Moreno, M. A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278-19290). Type II PKS에 대한 "익스텐더" 유니트는 통상적으로 아세테이트 유니트이며, 특정 사이클라제의 존재는 완성된 체인을 방향족 생성물로 환화시키는데 바람직한 경로를 지시한다 (Hutchinson, C. R.과 Fujii, I. Annu. Rev. Microbiol. (1995) 49: 201-238). 하이브리드 폴리케타이드는 클론 Type II PKS 유전자-함유 DNA를 상이한 Type II PKS 유전자 클러스터를 포함하는 다른 균주에 도입하므로서 얻어졌는바, 예를 들면스트렙토마이세스 코엘리칼라로부터 얻은 악티노르호딘, 불루-피그먼트 폴리케타이드에 대한 유전자 클러스터로부터 유래된 DNA를스트렙토마이세스 갈릴레우스의 안트라퀴논 폴리케타이드-생성 균주 속에 도입하여 얻어진다 (Bartel, P. L. et al. J. Bacteriol. (1990) 172: 4816-4826).
스트렙토마이세스 코엘리칼라호스트 셀에 발현되었을 때의 Type II PKS에 있는 폴리케타이드 체인 익스텐션에 요구되는 최소한의 도메인 수("최소한도 PKS")는 예를 들면 국제출원 WO 95/08548에 기재되어 있는바와 같이actI 유전자의 생성물인 다음에 기재된 세 개의 폴리펩타이드를 포함한다. 첫째 KS; 둘째 KS에 유사하지만 KS의 필수적인 활성 사이트 잔여물, 즉 시스테인 잔여물이 글루타민 잔여물에 의하여 치환되거나 또는whiE유전자 생성물 (Chater, K.F. 및 Davis, N.K. Mol. Microbiol. (1990) 4: 1679-1691) 과 같은 스포어 피그먼트에 대한 PKS의 경우 글루타민산 잔여물(도2-5)에 의하여 치환된 끝과 끝이 아미노산 염기 서열로 끝나는 CLF; 및 최종적으로 ACP. CLF는 예를 들면 국제특허출원 WO 95/08548에 기재되어 있으며 최소 PKS에 의하여 생성된 폴리케타이드 체인의 길이를 결정하는 요소이다. 그렇지만 옥타케타이드 악티노르호딘에 대한 CLF가스트렙토마이세스 글라우세센스의 호스트 세포에 있는 데카케타이드 테트라세노마이신에 대한 CLF를 치환하는데 사용되는 경우에는 폴리케타이드 생성물이 데카케타이드로부터 옥타케타이드로 변경되지 않는다는 것이 알려졌는바(Shen, B. et al. J. Am. Chem. Soc. (1995) 117: 6811-6821), CLF의 정확한 역할은 불분명하게 남아 있다. 또 하나의 명명에서는 이해의 부족을 반영하여 KS를 KSα라 명명하고, CLF는 KSβ로 명명하는 것이 제안되었다 (Meurer, G. et al. Chemistry and Biology (1997) 4: 433-443). 아세테이트 스타터 유니트와 아세테이트 익스텐더 유니트가 Type II PKS에 로딩되는 메카니즘은 알려지지 않았지만, 말로닐-CoA: 호스트 세포의 지방산 신다제의 ACP 아실트란스퍼라제는 Type II PKS에 대하여 동일한 기능을 하는 것으로 알려졌다 (Revill, W. P. et al. J. Bacteriol. 1995) 177: 3946-3952).
국제특허 WO 95/08548호에는 하이브리드 폴리케타이드를 얻기 위하여 다른타입의 Type II PKS 유전자로부터 이질성 DNA에 의한 악티노르호딘 PKS 유전자의 치환에 대하여 기재되어 있다. 또한 동일한 국제특허 WO 95/08548호에는 악티노르호딘에 대한 천연 유전자 클러스터가 없는스트렙토마이세스 코엘리칼라균주의 구조와스트렙토마이세스 코엘리칼라로부터 분리한 저-카피 넘버 벡타 SCP2로부터 유도된 플라스미드 pRM5의 균주 (Bibb, M. J. 와 Hopwood, D. A. J. Gen. Micro.Biol. (1981) 126: 427)와 이질성 PKS-인코딩 DNA가 악티노르호딘 유전자 클러스터 (Fernandez-Moreno, M. A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278-19290)의 서로 다른 Act I / Act III프로모터 부위의 제어하에 발현되는 용도가 기재되어 있다. 또한 플라스미드 pRM5는 특이성 활성효소 유전자 단백질, Act II-orf4에 대하여 인코딩하는 악티노르호딘 생합성 유전자로부터 유래된 DNA를 포함한다.AcyII-orf4 단백질은 act I / act II 2방향성 프로모터의 제어하에 놓여 있는 유전자의 번역에 필요하고 식물성 균사에서 정지상까지 생장하는 전위 중에 유전자 발현을 활성화한다 (Hallam, S. E. et al. Gene (1988) 74: 305-320).
스트렙토마이세스중의 Type II 클러스터는 경로 특성 활성효소 유전자에 의하여 활성화되는 것으로 알려 졌다 (Narva, K. E. 및 Feitelson, J. S. J. Bacteriol. (1990) 172: 326-333; Stutzman-Engwall, K. J. et al. J. Bacteriol. (1992) 174: 144-154; Fernandez-Moreno, M. A. et al. Cell (1991) 66: 769-780; Takano, E. et al. Mol. Microbiol. (1992) 6: 2797-2804; Takano, E. et al. Mol. Microbiol. (1992) 7: 837-845). DnrI 유전자 생성물은 DnrI과 ActII-orf4 단백질이 동일한 타겟에 작용하는 것을 암시하면서S. 코엘리칼라의actII-orf4 유전자에서의 돌연변이를 보완한다. 유전자(srmR)는 마크로라이드 폴리케타이드 스피라마이신의 Type I PKS 유전자 클러스터에 근접하게 위치하는 것으로 알려졌다 (EP 0 524 832 A2). 이 유전자들은 특히 마크로라이드 항생성 스피라마이신의 생성을 활성화하지만 그러한 유전자의 다른 예는 발견되지 않았다. 또한 Type I PKS 유전자를 활성화시키는 활성효소의 ActII-orf4/DnrI/RedD 패밀리의 유사체도 알려지지 않았다.
비록 의학적으로 중요한 다수의 폴리케타이드가 검증되었지만, 아직까지도 향상된 약리학적 특성을 갖고 있거나 또는 완전히 새로운 생화학적 특성을 갖는 새로운 폴리케타이드를 개발할 필요성이 요구되고 있다. Type I PKS에 의하여 제조된 복합 폴리케타이드들은 특히 유용한바, 이들은 구충제, 살충제, 면역억압제, 항미제 또는 항박테리아제로서의 용도를 갖는 화합물을 포함한다. 이러한 물질들은 구조적인 복합성 때문에 신규한 폴리케타이드는 화학적인 합성이나 또는 기존 폴리케타이드의 화학적인 변질에 의하여 쉽게 얻을 수 없다.
따라서, 설계되는 하이브리드 PKS 유전자의 전부 또는 대부분이 존재할 수 있고 요구하는 폴리케타이드 생성물을 생성할 수 있도록 각개 모듈을 실질적으로 배치할 수 있는 현실성이 있는 특수한 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
국제특허출원 PCT/GB97/01819호에는 PKS 유전자(특히 Type I)의 어셈블리가 최소한 하나의 익스텐션 모듈에 뒤이은 1로딩 모듈을 인코딩한다고 기재되어 있다. 도1에는 DEBS 유전자의 조직이 도시되었다. 제1 오픈 리딩 프레임은 다음의 세 모듈로 구성된 제1 멀티엔자임 또는 카셋트 (DEBS 1)를 인코딩한다: 로딩 모듈 (ery-load)과 두 익스텐션 모듈 (모듈 1과 2). 로딩 모듈은 아실트란스퍼라제와 아실 캐리어 단백질을 포함한다. 이러한 사실은 WO 93/13663호의 도 1과 대비되는 것이다. 이는 ORF1이 오직 두 개의 모듈로 구성되었음을 보여주는 것으로서, 그 중 첫째 것은 실제적으로 로딩 모듈과 제1 익스텐션 모듈이다.
PCT/GB97/01819호에는 로딩 모듈과 최소한 하나의 익스텐션 모듈을 포함하는 하이브리드 PKS 유전자 어셈블리가 개괄적으로 기재되었다. 또한 PCT/GB97/01818호에는 애버멕틴-생성 폴리케타이드 신다제용 광범위-특이성 로딩 모듈을 정상 로딩 모듈 대신에 에리트로마이신 PKS용 제1 다중효소 성분 (DEBS 1)에 이식하므로서 하이브리드 PKS 유전자 어셈블리를 구성하는 방법이 기재되었다 (Marseden, A. F. A. et al. Science (1998) 279: 199-202). 일부의 신규 폴리케타이드는 예를 들면 출원중인 PCT/GB97/01810호에 기재된 바와 같이 하이브리드 PKS 유전자 어셈블리를 사용하여 제조할 수 있다. 특히 국제특허출원 PCT/GB97/01819호에는 래파마이신-생성 폴리케타이드 신다제용 로딩 모듈을 정상 로딩 모듈 대신에 에리트로마이신 PKS 용 제1 다중효소 성분 (DEBS 1)에 이식하므로서 하이브리드 PKS 유전자 어셈블리를 구성하는 방법이 기재되었다. 래파마이신 PKS의 로딩 모듈은 CoA 리가제 도메인, 이노일리덕타제 ('ER") 도메인 및 ACP를 포함하고 있어서 천연 스타터 유니트 3,4-디하이드록시사이클로헥산 카르복실산을 포함하는 적당한 유기산들이 PKS 로딩 도메인에서 활성화될 수 있고 ER 도메인에 의한 환원의 유무에 관계없이 익스텐션 모듈 1의 KS의 분자내 로딩용 ACP로 전이된다는 점에서 DEBS의 로딩 모듈및 애버멕틴 PKS와 다르다 (Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995) 92: 7839-7843).
DNA 염기서열은 16-멤버 마크로라이드 폴리케타이드의 생성을 지배하는 수개의 Type I PKS 유전자 클러스터에 대하여 공개되었는바, 이러한 Type I PKS 유전자 클러스터에는스트렙토마이세스 프라디애로부터의 티로신 PKS (EP 0 791 655 A2),스트렙토마이세스 카엘레스티스로부터의 니다마이신 PKS (Kavakas, S. J. et al. J. Bacteriol. (1998) 179: 7515-7522) 및스트렙토마이세스 앰보패시엔스로부터의 스피라마이신 PKS가 포함된다. 모든 이러한 유전자 염기서열들은 통상적으로 이들이 DEBS의 로딩 모듈 및 애버멕틴 PKS의 로딩 모듈과는 달리 익스텐션 모듈의 KS 도메인, AT 도메인 및 ACP (도6)와 공통점이 있으면서도 전술한 모듈과 다른 PKS의 로딩 모듈을 갖고 있음을 보여준다. 부수적인 N-말단 KS-유사 도메인은 이들이 각개 경우 글루타민(단일 문자 표기법으로 Q로 표시함) 잔여물에 의한 β-케토아실-ACP 신다제 활성에 필수적인 활성 사이트 시스테인 잔여물의 치환에 의하여 익스텐션 KS와 다르므로 이들은 KSq라는 이름을 갖고 있다. KSq 도메인의 역할은 알려지지 않았지만 (Kavakas, S. J. et al. J. Bacteriol. (1998) 179: 7515-7522), 티로신, 니다마이신 및 스피라마이신의 스타터 유니트가 프로피오네이트, 아세테이트 및 아세테이터 유니트, 즉 DEBS에서와 같은 동일한 형태의 스타터 유니트로 나타나기 때문에 16-멤버 마크로라이드용 PKS 중에 이러한 도메인이 존재한다는 것은 놀라운 사실이다. KSq 도메인에 인접한 AT는 ATq 도메인이라 명명하였다.
티로신 PKS의 전체 로딩 모듈이S. 앰보파시엔스중의 스피라마이신 PKS에 있는 유사 로딩 모듈을 치환하였을 때 (Kuhstoss et al. Gene (1996) 183: 231-236), 스타팅 유니트의 특성은 아세테이트로부터 프로피오네이트로 변경되도록 정하여 진다. KSq 도메인의 역할은 알려지지 않았기 때문에, 마크로라이드의 고율 생산에서는 KSq 도메인의 중요성이나 또는 스타터 유니트에 관련된 다수의 폴리케타이드 생성물이 얻어지도록 하는 KSq-함유 로딩 모듈의 중요성은 밝혀졌다는 기록은 없다. 이러한 결과에 대한 설명은 다음과 같다: "다음에 기재한 실험은 Type I PKS 시스템 중의 AT 도메인이 각개 합성단계에서 적당한 기질을 선택한다는 가설에 대한 강력한 실험적 지지를 제공한다" (Kuhstoss et al. Gene (1996) 183: 231-236 페이지 235에서). 이 논문의 저자는 Type II PKS 시스템 내의 CLF 단백질 유사체가 기재하고 있고 전술한 단백질은 체인 길이를 결정하는데 사용된다고 기재하고 있다. 그들은 또한 "KSq는 유사한 기능을 나타낼 수 있으나, 이러한 기능이 6-DEB 또는 래파마이신 같은 기타의 복합 폴리케타이드의 합성에는 불필요하지 않으면서 이러한 16-멤버 폴리케타이드의 합성에는 필요한지 불분명하다고 지적하고 있다. 어떤 경우에는 KSq가 각 단계의 합성에서 기질 선택에 불필요하게 포함된다." (Kuhstoss et al. Gene (1996) 183: 231-236)
유전자 엔지니어링이 DEBS의 로딩 모듈을 제거하기 위하여 이용되는 경우, 생성되는S. 에리트라아애중의 절결된 DEBS는 프로피오네이트 스타터 유니트를 포함하는 저농도의 에리트로마이신의 생산을 계속한다 (Pereda, A. et al. Microbiology (1995) 144: 543-553). 동일한 문헌에는 전술한 절결된 DEBS에 있는 익스텐션 모듈 1의 메틸말로닐-CoA-특정 AT가 래파마이신 PKS의 익스텐션 모듈에서 말로닐-CoA-특정 AT에 의하여 치환되었을 때, 생성물은 프로피오네이트 스타터 유니트를 포함하는 저농도의 에리트로마이신이며 스타터 유니트의 원래의 기능이 모듈 1의 AT에 의하여 효소에 로드된 (메틸)말로닐 그룹의 탈카복실화가 아니고 프로피오닐-CoA에 의한 익스텐션 모듈 1의 KS의 직접적인 아실화임을 나타낸다고 기술하고 있다. 이는 부분적으로 정제된 DEBS1+TE, DEBS로부터 유도되고 (Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1995) 117: 9105-9106) DEBS1-TE에 기능적으로 동일한 (Brown, M. J. B. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1995) 1517-1518; Cortes, J. et al., Science (1991) 2523: 675-679) 절결된 2 모듈 PKS를 사용하며, DEBS용 스타터 유니트의 근원이 모듈 1에 로드되고 모듈 1의 KS에 의하여 탈카복실화된 메틸말로네이트 유니트를 포함할 수 있다고 (Pieper, R. et al., Biochemistry (1997) 36: 1846-1851) 기재된 종래의 보고와는 상반되는 것이다. DEBS1-TE 단백질이 재조합S. 에리트라애의 추출물로부터 완전히 정제되었을 때는 전술한 특정 디카복실라제 활성효소를 포함하지 않고 (Weissmann, K. et al., Biochemistry (1998)37,11012-11017) 스타터 유니트가 실질적으로 익스텐션 모듈 1의 KS에 의하여 중개된 익스텐션 유니트의 탈카복실화로부터 나오지 않는다는 것을 확인하고 있다.
DEBS 로딩 모듈은 프로피오네이트 단독의 경우보다 약간 넓은 특이성을 갖고 있으며, 이러한 로딩 모듈을 포함하는 PKS가 에리트로마이신 제조용 천연 호스트인S. 에리트라애(예를 들면 Cortes, J. et al., Science (1995) 268: 1487-1489 참조) 또는S. 코엘리칼라와 같은 이질성 호스트 (Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 11612-11613; Brown, M. J. B. et al., J. Chem. Soc. Chem.Commun. (1995) 1517-1519) 중의 하나에 발현된 PKS의 일부인 경우에는 특히 아세테이터 스타터 유니트가 시험관 내와 생체 내에 둘다 사용할 수 있는 것으로 알려졌다. 정제된 DEBS1-TE를 사용하는 시험관 내 실험에서는 프로피오닐-CoA와 아세틸-CoA가 로딩 모듈에 각각 프로피오네이트와 아세테이트 유니트를 효과적으로 공급하는 다른 기질임을 보여 주었다 (Wiessmann, K. E. H. et al. Chemistry and Biology (1995) 2: 583-589; Pieper, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1995) 117: 11373-11374). 아세테이트와 프로피오네이트 스타서 유니트간의 비교적인 생산량은 사용된 호스트 세포에 나타나는 프로피오닐-CoA와 아세틸-CoA의 세포외 농도에 영향받는다 (예를 들면, Kao, C. M. et al. Science (1994) 265: 509-512; Pereda, A. et al. Microbiology (1995) 144: 543-553). 국제특허출원 PCT/GB97/01819에 기재된 바와 같이, 재조합 DEBS 또는 DEBS 로딩 모듈을 포함하는 다른 하이브리드 PKS가S. 에리트라애에 과발현되었을 때 생성물은 아세테이트 또는 프로피오네이트 스타터 유니트의 존재에 의하여 성분들이 다른 혼합물로 되므로 생산량은 호스트 PKS의 발현 정도에 의하여 결정된다.
아세테이트 및 프로피오네이트 스타터 유니트와 폴리케타이드의 혼합물을 형성함이 없이 특이한 스타터 유니트의 특이성 배합이 달성되도록 하는 현실적인 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다. 놀랍게도 16-멤버 마크로라이드 티로신, 니다마이신 및 스피라마이신용 PKS 중의 로딩 도메인의 역할은 애버멕틴 PKS와 DEBS의 로딩 도메인의 역할과 다르다는 것을 알게 되었다. 티로신 PKS의 KSq 도메인과 관련 AT 도메인인 ATq는 함께 프로피오네이트 스타터 유니트의 고도의 특이성 생산에 책임이 있는 것으로 알려졌는바, 그 이유는 ATq가 메틸말로닐-CoA의 로딩에 특이성이 있으면서 전술한 바와 같이 프로피오닐-CoA에는 특이성이 없고, KSq는 로딩 모듈의 ACP 도메인에 부착된 프로피오네이트 유니트를 형성하고 체인 익스텐션 의 초기에 익스텐션 모듈 1의 KS로 전사되도록 하기 위한 효소-결합 메틸말로네이트 유니트의 고도 특이성 탈카복실화에 책임이 있기 때문이다. 유사하게, 스피라마이신과 니다마이신 PKS의 ATq 및 인접한 KSq는 앞에서 지적한 바와 같이 아세테이트 유니트 보다는 말로네이트 유니트의 특이성 로딩에 책임이 있고 폴리케타이드 체인 익스텐션을 위한 아세테이트 스타터 유니트를 제공하기 위한 뒤이은 특이성 탈카복실화에 대하여 책임이 있다.
전술한 16-멤버 마크로라이드용 PKS 뿐만 아니라 일부의 14-멤버 마크로라이드용 PKS, 특히스트렙토마이세스 안티바이티쿠스(도7-9)로부터의 올리안도마이신 PKS와 일부 폴리에텔 이오노포어 폴리케타이드의 PKS, 특히스트렙토마이세스 시나모네시스(도7-9)로부터의 추상적인 모네신 PKS는 KSq 도메인, ATq 도메인 및 ACP를 포함하는 로딩 도메인을 갖고 있다. 도 4에는 검증된 KSq 도메인의 염기서열과 결합된 인접 ATq 도메인의 염기서열이 도시되어 있는바, 이 도면은 KSq 도메인 내에 보존된 활성 사이트 글루타민(Q) 잔여분과 모든 익스텐션 AT 도메인 내에 보존되고 ATq 도메인 내에 완전하게 보존된 알기닌 잔여분을 보여준다. 이러한 잔여분은 DEBS나 에버멕틴 PKS 로딩 모듈의 AT 도메인 내에 있는 알기닌이 아니라는 사실이 특이하며, AT용 기질은 카복실화되지 않은 아실-CoA 에스텔이다 (Haydock, S. F. et al. FEBS Setters (1995) 374: 246-248). 약자 ATq는 익스텐션 AT로부터 바로인접한 KSq의 C-터미날에 나타나는 AT 도메인을 구분하기 위하여 사용하고, 그 외의 다른 중요성이 없다.
본 발명은 재조합 합성방법에 의하여 신규한 폴리케타이드, 특히 12-, 14- 및 16-멤버 링 마크로라이드를 제조하기 위한 방법과 (효소 시스템, 핵산, 벡타 및 배양액을 포함하는) 물질을 제조하는 방법 및 이러한 방법으로 제조된 신규한 폴리케타이드에 관한 것이다. 상이한 폴리케타이드 생합성 유전자로부터 유도될 수 있는 폴리케타이드 생합성 유전자와 그들의 부분들은 12-, 14- 및 16-멤버 마크로라이드와 같은 예상할 수 있는 구조의 특정 신규 폴리케타이드의 제조에 사용될 수 있도록 제조될 수 있다. 본 발명은 또한 아세테이트 스타터 유니트, 프로피오네이트 유니트 또는 특이한 스타터 유니트를 갖는 마크로라이드를 제조하기 위하여 다른 유전자와 함께 천연 스타터 유니트를 인코딩하는 유전 물질의 치환에도 관계되는바, 이 경우 상이한 스타터 유니트를 포함하는 부산물의 생성을 최소화하도록 하여야 한다.
도1은 6-디옥시에리트로놀리드 B 신다제(DEBS), 6-디옥시에리트로놀리드 B(6-DEB)를 생성하는 모듈 PKS, 에리트로마이신 A의 전구체의 역할을 보여주는 다이아그램이고,
도2-5는 대표적인 Type II 유전자 클러스터의 KS 도메인과 CLF 도메인의 아미노산 염기서열 대조표이다. KS 도메인의 활성 사이트 시스테인(C)은 도면에 화살표로 표시하였고, CLF 도메인의 글루타민(Q)과 글루타민산(E)과 함께 일열로 배열하였다. 사용된 약자와 Genbank/EMBL 수탁번호는 다음과 같다: GRA:스트렙토마이세스 비올라세오라버(X63449) 유래의 그라나티신; HIR:사카로폴리스포라 히르수타(M98258) 유래의 미지 폴리케타이드; ACT:스트렙토마이세스 코엘리칼라(X63449) 유래의 악티노르호딘; CIN:스트렙토마이세스 시나모넨시스(Z11511) 유래의 미지 폴리케타이드; VNZ:스트렙토마이세스 베네주엘래(L33245) 유래의 자도마이신; NOG:스트렙토마이세스 노갈래터(Z48262) 유래의 안트라사이클린;TCM:S. 글라우체센스(M80674) 유래의 테트라세노마이신; DAU:스트렙토마이세스sp. C5 (L34880) 유래의 다우노마이신; PEU:스트렙토마이세스 포이세티우스(L35560) 유래의 독소루비신; WHI:스트렙토마이세스 코엘리칼라(X55942) 유래의 백색 기공 피그먼트.
도6은 세 개의 16-멤버 마크로라이드인 티로신, 스피라마이신 및 니다마이신에 대한 PKS의 유전자 조직을 보여준다.
도7-9는 니다마이신, 프라테놀리드(스피라마이신), 모넨신, 올리안도마이신 및 티로신에 대한 PKS의 디도메인을 로딩하는 KSq-ATq의 아미노산 염기서열을 보여준다. 디도메인을 로딩하는 모넨신과 올리안도마이신에 대한 염기서열은 종래에 알려지지 않았다.
도10은 6-디옥시에리트로놀리드 B를사카로폴리스포라 에리트라애에서 에리트로마이신 A로 변환시키는 효소적 단계를 보여준다.
도11은 플라스미드 pJLK117의 구성을 보여주는 다이아그램이다.
도12는 올리고뉴클레오타이드의 구조를 보여준다.
본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명하는바, 실시예는 발명의 기술적 범위를 한정시키는 것은 아니다.
모든 NMR 스펙트라는 특별히 지정하지 않는 한 브룩커 500mHz DMX를 사용하여 CDCl3에서 측정하였고, 피크 위치는 ppm으로 표현되었다. NMR 구조에 나타나는 원자번호는 표준 명명을 대표하는 것이 아니지만 특정한 실시예에 대하여는 NMR 데이타와 관계가 있다.
HPLC 방법
방법 A
칼럼 물 대칭 5_Cl8 2.1mm x 150mm
유속 0.29 ml/min
이동상 조성성분: 12분 동안 A:B(22:78)에서 A:B(38:62)까지,
이어서 15분 동안에 걸쳐 A:B(80:20)까지.
1분간 유지. 다음 시료전에 재평형.
A=아세토니트릴 및 B=10% 아세트니트릴 및
0.02% TFA중의 0.01M 암모늄아세테이트
방법 B
칼럼 물 대칭 5_Cl8 2.1mm x 150mm
유속 0.29 ml/min
이동상 조성성분: 18분 동안 28:72 아세토니트릴:10mM12 NH4OAc에서
50:50까지. 25분까지 50;50 유지.
28:72까지 원상복귀. 7분 동안 평형.
기구 APCI 공급원을 갖는 휴렛팩카드 1100으로 준비.
수돗물 배지
글루코스 5g/l
트립톤 5g/l
효모 추출물 2.5g/l
EDTA 36mg/l
수돗물 전체 용량 1리터까지
ERY-P 배지
덱스트로즈 50g/l
누트리소이(상표) 분말 30g/l
(NH4)2SO43g/l
NaCl 5g/l
CaCO36g/l
수돗물 전체 용량 1리터까지
pH 7.0으로 조절
본 발명의 한 형태는 로딩 모듈과 다수의 익스텐션 모듈을 포함하는 PKS 다중효소나 그 일 부분 또는 이들을 인코딩하는 핵산을 제공하는바,
(a) 로딩 모듈은 말로닐 또는 치환된 말로닐 잔여분을 로딩하여 로딩된 잔여분을 탈카복실화하므로서 익스텐션 모듈로의 전환을 위한 아세틸 또는 치환된 아세틸( 이 용어는 프로피오닐을 포함한다)을 제공하고,
(b) 익스텐션 모듈들 또는 최소한 하나의 익스텐션 모듈은 (최소한 하나는 로딩 모듈에 인접함) 임의 치환된 말로닐 잔여분의 탈카복실화에 영향을 주는 로딩 모듈과 천연적으로 관련되지 않는다.
일반적으로 로딩 모듈은 ACP (아실 캐리어 단백질) 도메인을 포함할 수도 있다.
로딩 모듈의 탈카복실화 기능성은 KS(케토신다제)-형 도메인에 의하여 제공된다. 이러한 KS형 도메인은 활성 사이트 중의 필수적인 시스테인 잔여분 대신에 글루타민 잔여분을 점유하도록 하므로서 통상적인 익스텐션 모듈의 KS와 다른 것이다. 이것은 Ksq라 부른다. 이것은 "천연적"일 수 있으나, 예를 들면 익스텐션 모듈의 KS와 같은 상이한 KS를 인코딩하는 핵산의 사이트-방향성 돌연변이로부터 생성되도록 하는 유전학적 방법으로 만들 수도 있다.
또한 탈카복실화 기능성은 Type II PKS 시스템에 나타나는 일반형의 CLF-형도메인에 의하여 제공될 수도 있다.
로딩 기능성은 활성 사이트 중의 알기닌 잔여분을 갖는 통상적인 익스텐션 모듈의 AT 도메인에 비유되는 AT(아실트란스퍼라제)-형 도메인에 의하여 제공될 수 있으나, 예를 들면 DEBS나 애버멕틴 PKS 시스템에 아세테이트와 프로피오네이트를 로딩하는 로딩 모듈의 AT 도메인의 경우는 그렇지 않다. 이것은 Atq라 부른다. 또한 이것은 "천연적"일 수도 있고, 예를 들면 익스텐션 모듈의 AT의 돌연변이에 의하여 유전학적으로 만들 수도 있다.
일반적으로 로딩 모듈은 다음의 형태일 수 있다.
Ksq-ATq-ACP
식 중, ACP는 아실 캐리어 단백질이다.
본 발명의 다른 형태는 특별히 요구하는 스타터 유니트를 제공하는 전술한 바와 같은 로딩 모듈을 결합하는 PKS 다중효소를 제공하므로서 독점적으로 요구하는 스타터 유니트만을 갖는 폴리케타이드를 합성하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 다중효소를 인코딩하는 핵산을 제공하는 단계와 이 핵산이 발현될 수 있는 유기체에 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 형태는 벡타와 형질전환제 유기체 및 다중효소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양액에도 관계된다. 바람직한 예는 상이한 스타터 유니트를 갖는 폴리케타이드가 존재하지 않도록 함을 특징으로 하는 요구하는 스타터 유니트를 갖는 폴리케타이드를 생산하는 배양물이다. 예를 들면, 에리트로마이신은 프로피오네이트 대신에 아세테이트 스타터 유니트의 결합에 의하여 생산되는 유사체로부터 실질적으로 생산된다.
바람직하게는 하이브리드 PKS가 로딩 모듈과 2 내지 7 익스텐션 모듈 및 체인 말단 효소( 일반적으로 티오에스테라제)를 인코딩한다.
절대적으로 또는 거의 절대적으로 아세테이트 스타터 유니트를 포함하는 12-, 14- 또는 16-멤버 마크로라이드를 제조하기 위하여는 12-, 14- 또는 16-멤버 마크로라이드를 생산하는 PKS 유전자용 타입 KSq-ATq-ACP 의 로딩 모듈을 제공하는 것이 유리한데, 전술한 PKS 유전자 어셈블리는 악티노마이세트 호스트 세포에 고농도로 나타난다. 이러한 목적에 특히 적당한 PKS는 에리트로마이신, 메티마이신, 올레안도마이신, 티로신, 스피라마이신, 미데카마이신 및 니다마이신의 생합성에 사용되는 PKS 성분들로서, 이들 모두에 대한 유전자와 모듈라 조직의 최소한 일부는 알려졌다. 특히 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈을 인코딩하는 유전자의 적당한 공급원은 뒤이어 아세테이트 스타터 유니트로 탈카복실화되는 말로네이트 유니트의 로딩에 특이성이 있는 올레안도마이신, 스피라마이신, 니다마이신, 메티마이신 및 모넨신의 로딩 모듈이다.
유사하게 절대적으로 또는 거의 절대적으로 아세테이트 스타터 유니트를 포함하는 마크로라이드를 생산하기 위하여는 로딩 모듈이 색다른 특성을 나타내는 마크로라이드인 리파마이신, 애버멕틴, 래파마이신, 이뮤노마이신 및 FK506를 생산하는 PKS 유전자 어셈블리용 타입 KSq-ATq-ACP 의 로딩 모듈을 제공하는 것이 유리하고 이러한 유전자와 모듈 조직의 모두는 최소한 부분적으로 알려졌으며, 전술한 PKS 유전자 어셈블리는 악티노마이세트 호스트 세포에 고농도로 나타난다. 타입KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈을 인코딩하는 특히 적당한 유전자 공급원은 아세테이트 스타터 유니트로 탈카복실화되는 말로네이트 유니트의 로딩에 특이성이 있는 올레안도마이신, 스피라마이신, 니다마이신, 메티마이신 및 모넨신의 로딩 모듈이다.
유사하게 절대적으로 또는 거의 절대적으로 프로피오네이트 스타터 유니트를 포함하는 12-, 14- 또는 16-멤버 마크로라이드를 제조하기 위하여는 12-, 14- 또는 16-멤버 마크로라이드를 생산하는 PKS 유전자 어셈블리용 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩모듈을 제공하는 것이 유리하며, 전술한 PKS 유전자 어셈블리는 악티노마이세트 호스트 세포에고농도로 나타난다. 특히 이러한 목적에 적당한 PKS들로는 에리트로마이신, 메티마이신, 올레안도마이신, 티로신, 스피라마이신, 미데카마이신 및 니다마이신의 생합성용 PKS 성분들이 있으며, 이들 전부에 대한 유전자와 모듈 조직은 최소한 부분적으로 알려졌다. 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈을 인코딩하는 유전자의 적당한 공급원으로는 프로피오네이트 스타터 유니트로 탈카복실화되는 메틸말로네이트 유니트의 로딩에 특이성이 있는 티로신의 로딩 모듈이 있다.
유사하게 절대적으로 또는 거의 절대적으로 프로피오네이트 스타터 유니트를 포함하는 마크로라이드를 제조하기 위하여는 로딩 모듈이 색다른 특성을 보유한 마크로라이드인 리파마이신, 아버멕틴, 래파마이신, 이뮤노마이신 및 FK506을 생산하는 PKS 유전자 어셈블리용 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈을 제공하는 것이 유리하다. 전술한 모두에 대한 유전자와 모듈 조직은 최소한 부분적으로 알려졌으며, 전술한 PKS 유전자 어셈블리는 악티노마이세트 호스트 세포에 고농도로 나타난다. 특히 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈을 인코딩하는 유전자의 적당한 공급원으로는프로피오네이트 스타터 유니트로 탈카복실화되는 메틸말로네이트 유니트의 로딩에 특이성이 있는 티로신의 로딩 모듈이 있다.
타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈에서 도메인과 그들의 부분들은 동일한 공급원으로부터 유도될 수도 있고 상이한 공급원으로부터 유도될 수도 있으며, 천연 도메인 또는 인공 도메인을 포함할 수도 있다. 예를 들면, ATq 도메인은 말로네이트 유니트의 로딩 또는 메틸말로이네이트 유니트의 로딩에 대한 특이성을 갖는 Type I PKS의 익스텐션 모듈로부터 유도된 AT 도메인에 의하여 치환될 수 있고, KSq 도메인은 각각 메틸말로네이트 유니트 또는 말로네이트 유니트에 잘 맞는 특징을 갖도록 선택될 수 있다.
또한 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈에 있는 KSq 도메인은 Type II PKS의 CLF 폴리펩타이드에 의하여 치환될 수 있다. 따라서 유일하게 체인 길이를 결정하는 인자로서 앞에서 인정한 것과는 달리, CLF는 KSq 도메인의 유사체이고, 그가 갖고 있는 다른 활성 외에도 말로네이트 유니트에 결합되도록 하는 탈카복실화제로서의 작용을 할 수 있어야 함을 알 수 있다.
Type II PKS의 CLF 도메인이 탈카복실화 작용을 갖는 특성은 본인들에게 Type II 시스템에 유용한 간섭, 예를 들면 일부 발효과정에 얻을 수 있는 수율을 향상시키는 간섭을 안출하도록 하였다. 많은 공업적인 고수율 발효는 불필요한 스타터의 혼입에 기인하는 혼합물을 만들어 낸다. 이러한 사실은 특히 불필요한 스타터를 생성하는 보조 유전자를 갖는 경우에 많이 나타난다. CLF 유전자는 생성물에 불필요한 아실 유니트가 혼입되도록 하는 불필요한 아실 종을 생성하는 작용을할 수 있다. 예를 들면, 옥시테트라사이클린 생성물은 생소한 말론아미도 스타터를 포함한다. 그렇지만 CLF 도메인의 불필요한 활성은 대신 아세틸의 혼입을 가져오는 일부의 탈카복실화를 야기할 수 있다. 유사하게 다우노마이신 합성은 CLF 도메인의 기생 활성에 대한 책임이 있는 생소한 스타터를 포함한다.
일반적으로 CLF 도메인의 (탈카복실화를 위한) 활성 사이트는 글루타민 잔여븐을 포함한다. 본인들은 도메인의 탈카복실 활성이 변종에 의하여 제거될 수 있으며, Gln 잔여기가 (예를 들면) Ala로 전환됨을 발견하였다.
따라서 본 발명의 또 하나의 형태는 Type II PKS 의 CLF 도메인의 Gln 잔여기가 탈카복실화 활성을 억제하는 Type II (방향족) 폴리케타이드의 합성 시스템과 합성방법을 제공한다. 사이트-특이성 돌연변이 기술은 당해 업계에 잘 알려져 있다.
타입 KSq-ATq-ACP 의 로딩 모듈은 PCT/GB97/01819 및 PCT/GB97/01810호에서와 같이 제조된 하이브리드 PKS에 연결될 수도 있다. 특히 이러한 로딩 모듈은 PCT/GB97/01819 및 PCT/GB97/01810호에 기재된 바와 같이 14-멤버 마크로라이드신규 유도체를 생산하는 하이브리드 PKS를 인코딩하는 유전자 어셈블리에 결합되는 것이 유리하다.
본 발명은 또한 타입 KSq-ATq-ACP의 로딩 모듈과 함께 제공되는 PKS 어셈블리, 전술한 어셈블리를 포함하는 벡타 및 이들을 발현시킬 수 있는 형질변환 유기체를 제공한다. 형질변환 유기체는 재조합 플라스미드를 잠복시킬 수도 있고, 또한 플라스미드들이 통합될 수도 있다. 내부 염기서열을 갖는 플라스미드들은 호스트의 염색체의 특이성 결합 사이트(att)에 결합된다. 형질변환 유기체들은 에리트로마이신(도10 참조)과 기타의 폴리케타이드의 생산에 정상적인 생합성적인 변이의 전부 또는 일부를 실시하므로서 최초 생성물을 변이시킬 수도 있다. 돌연변이 유기체는 정상 경로의 일부가, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 "천연" 하이드록실 그룹 또는 슈가 그룹이 없이도 생성물을 생산하도록 봉쇄되게 만들 수도 있다. 따라서 본 발명은 형질변환 유기체에 의하여 직접 또는 간접적으로 생산할 수 있는 신규한 폴리케타이드에도 관계된다. 이러한 폴리케타이드에는 효소적인 변이가 진행된 폴리케타이드를 포함된다.
본 발명의 또 하나의 형태는 스타터 유니트에 관한 한 현재까지 가능한 것 보다 더 순수한 형태의 종래 얻어진 폴리케타이드와 신규의 폴리케타이드를 제공하는 것이다. 이러한 폴리케타이드는 다음의 조건에서 "천연물"이거나 또는 해당하는 "천연" 화합물과 다를 수 있는 12-, 14- 및 16-멤버 마크로라이드를 포함한다:
a) 임의 -CH(OH)-의 입체화학이 독립적으로 선택될 수 있는 하나 또는 그 이상의 케타이드 유니트의 산화상태에서 (예를 들면 그룹 -CO-, -CH(OH)-, 알켄-CH- 및 -CH2-중에서 임의 선택)
b) 천연 메틸 측쇄의 결여에서, 또는
c) 천연 메틸 및/또는 메틸 이외의 다른 링 치환기의 입체화학에서.
또한 전술한 a) 내지 c)중의 한 조건에서 검증된 천연 생성물로부터 상이성을 갖는 12-, 14- 및 16-멤버 마크로라이드의 유도체들을 제조할 수도 있다.
비-PKS 효소에 의하여, 예를 들면 하이드록실화, 에폭시화, 글리코실화 및 메틸화와 같은 추가의 가공을 거친 전술한 폴리케타이드의 유도체도 제조할 수 있다.
본 발명은 아세테이트 또는 프로피오네이트 스타터 유니트를 갖느냐 하는 차이만이 있는 생성물의 혼합물이 형성됨이 없이 공지된 복합 폴리케타이드와 신규한 폴리케타이드를 얻는 새로운 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 스타터 유니트가 천연 Type I PKS의 익스텐션 모듈로부터 유도된 생소한 특이성을 갖는 AT 의 효소-결합 생성물에 KSq 도메인이 작용하여 유도된 생소한 스타터 유니트인 신규한 폴리케타이드를 제조하는 방법에도 관계된다. 특히 FK 506 PKS 유전자 클러스터의 익스텐션 모듈 4의 AT는 알릴 측쇄를 결합시키고, 니다마이신 PKS 유전자 클러스터의 익스텐션 모듈 6의 AT는 구조 HOCH2-의 측쇄를 결합시키며, 스피라마이신의 익스텐션 모듈 5와 모넨신의 익스텐션 모듈 5의 AT는 에틸 측쇄를 결합시킨다. 각개 경우, KSq 도메인은 천연적으로 프로피오네이트-특이성인 것이 바람직하다. 또한 Type I PKS의 익스텐션 모듈로부터 나온 KS는 다른 잔여기에 의하여 치환되는 활성 사이트 시스테인 잔여분의 방향성 돌연변이에 의하여 결합 카복실화 아실 티오에스텔을 탈카복실화할 수 있는 KSq 도메인으로 전환될 수 있다. 아세틸-CoA의 결여하에 Type I PKS와 함께 많은 기계학적인 특징을 나타내는 동물성 지방산 신다제는 증명할 수 있는 말로닐-CoA 디카복실라제 활성을 갖는다 (Kresze, G. B. et al. Eur. J. Biochem. (1997) 79: 191-199). 지방산 신다제는 이오도아세트아미드와같은 아실화제로 처리되었을 때, KS의 활성 사이트 시스테인의 특이성 변위에 의하여 불활성화되며, 생성되는 단백질은 향상된 말로닐-CoA 디카복실라제 활성을 갖는다. 디카복실라제로의 지방산 KS 도메인의 변환은 KS 도메인과 Type I PKS의 KSq 도메인 사이의 유전학적으로-결정된 변화를 나타낸다. 글루타민 측쇄의 크기와 양극성은 카복스아미도-시스테인의 것과 극히 유사하다. 생소한 알킬말로네이트 유니트의 탈카복실을 위하여 사용되는 KSq는 생소한 알킬말로네이트의 탈카복실화를 최적으로 하기 위하여 생소한 AT를 제공하는 동일한 Type I PKS의 동일한 익스텐션 모듈로부터 선택하는 것이 바람직하며, 사용되는 ACP는 동일한 익스텐션 모듈의 ACP가 바람직하다.
변경된 로딩 모듈을 결합시키는 PKS 유전자를 발현시키는데 적당한 플라스미드 벡타와 유전학적으로 가공된 세포는 Type I의 하이브리드 유전자의 발현에 적당한 것으로 PCT/GB97/01819호에 기재된 바와 같은 것들이 있다. 효과적인 호스트의 예로는사카로폴리스포라 에리트라에, 스트렙토마이세스 코엘리칼라, 스트렙토마이세스 아버미틸리스, 스트렙토마이세스 그리서푸스쿠스, 스트렙토마이세스 시나모네시스, 스트렙토마이세스 프라디애,스트렙토마이세스 롱기스포로플라부스, 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스, 마이크로모노스포라 그리서루비다, 스트렙토마이세스 라사리엔시스, 스트렙토마이세스 베네주엘래, 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스, 스트렙토마이세스 리비단스, 스트렙토마이세스 리모수스, 스트렙토마이세스 알부스, 아미콜라톱시스 메디테라네이 및 스트렙토마이세스 추쿠바에니스등이 있다.이러한 것들은 예를 들면 SCP2*-유도 플라스미드가S. 코엘리칼라, S. 아버미틸리스및S. 그리서푸스쿠스와 같은 자발적으로 복제되는 것으로 알려진 호스트와 SCP2*-유도 플라스미드가 플라스미드 삽입물과 염색체에 있는 염기서열 사이의 상동 재조합을 통하여 염색체에 결합된사카로폴리스포라 에리트라에같은 다른 호스트 및 자멸 플라스미드 벡타에 의하여 변환된 모든 벡타들이 있다.
이하 본 발명을 도면에 의하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.
실시예 1
재조합 벡타 pPFL43의 구성
플라스미드 pCJR24를 PCT/GB97/01819호에 기재된 방법으로 제조한다.pPFL43은 추정상의 모넨신 PKS 로딩 모듈(S. 시나모넨시스로부터 분리), DEBS 익스텐션 모듈 1과 2 및 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 하이브리드 폴리케타이드 신다제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 pCJR24-기초 플라스미드이다. 플라스미드 pPFL43은 다음과 같이 구성된다. 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCATATGGCCGCATCCGCGTCAGCGT-3' 및
5'-GGCTAGCGGGTCCTCGTCCGTGCCGAGGTCA-3'
는S. 시나모넨시스또는 주형으로서의S. 시나모넨시스의 염색체 DNA로부터 추상의 모넨신-생성 PKS 유전자의 5' 말단을 포함하는 코스미드를 사용하여 추상의 모넨신-생성 로딩 모듈을 인코딩하는 DNA를 증폭하는데 사용된다. 3.3 kbp의 PCR 생성물을 겔 전기영동방법으로 정제한 다음, T4 폴리뉴클레오타이드로 처리하고, Sma I으로 다이제스쳔과 알칼성 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 플라시미드 pPFL40를 체크한다. 플라스미드 pPFL40은 제한 패턴 및 염기서열 분석에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pHD30H는 애버멕틴 로딩 모듈, 에리트로마이신 익스텐션 모듈 1과 2 및 에리티오에스테라제 도메인을 포함하는 플라스미드 pNEWAVETE (PCT/GB97/01810)의 유도체이다. 플라스미드 pNEWAVETE는 EcoRI와 HinDIII로 절단하고 폴리펩타이드에 대한 C-말단 폴리히스티딘의 추가분을 인코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드 링커가 삽입된다. 다음의 올리고뉴클레오타이드:
5'-AATTCACATCACCATCACCATCACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3' 및
5'-AGCTTCTAGATGGCCAGACCTCCTACTAGTGATGGTGATGGTGATGTG-3'
은 함께 융합되며, 복합체는 EcoRI- 및 HinDIII-절단 pNEWAVETE에 결합된다. 생성된 플라스미드는 NdeI 및 XbaI로 절단하고 동일한 두 효소로 미리 절단한 플라스미드 pCJR24에 결합시켜 플라스미드 pND30His를 생성한다.
플라스미드 pPFL40은NdeI과NheI으로 다이제스팅되고, 3.3 kbp 프래그먼트는 전기영동에 의하여 정제한 다음, 미리NdeI 및NheI으로 다이제스팅되고 알카리 포스페타제로 처리된 pND30-His에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 플라시미드 pPFL43을 체크한다. 플라스미드 pPFL43은 제한 패턴 분석에 의하여 확인되었다.
실시예 2
S. 에리트라애 JC2/pPFL43의 구성
플라스미드 pPFL43은S. 에리트라애JC2 원형질체를 형질전환하는데 사용된다. 잔여 DEBS 유전자가 실질적으로 제거된 균주 JC2의 구성은 PCT/GB97/01819에 기재되어 있다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 콜로니들은 로딩 모듈을 인코딩하는 mon PKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합된 pPFL43의 존재를 검사하는데 사용되었다.
실시예 3
S. 에리트라애 JC2/pPFL43을 사용한 폴리케타이드의 생산
균주S. 에리트라애JC2/pPFL43의 동결 현탁물을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지에서 접종시킨다. 접종된 배지를 28-30℃에서 7일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH=3.0으로 조절한다. 육즙을 2배량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고, 추출액을 합쳐서 동량의 포화 염화나트륨 용액으로 세척하여 무수 황산나트륨 위에서 건조한 다음 감압 하에 에틸아세테이트를 제거하여 조 생성물을 얻는다. 생성물은 다음의 구조식을 갖고 있으며, MS, GC-MS 및1H NMR 시험결과 진짜 시료와 일치함을 알게 되었다:
실시예 4
S. 에리트라애 NRRL2338/pPFL43의 구성
플라스미드 pPFL43은S. 에리트라애NRRL2338 원형질체를 형질전환하는데 사용된다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 콜로니들은 로딩 모듈을 인코딩하는monPKS프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체 속에 결합된 pPFL43의 존재를 검사하는데 사용되었다. pPFL43의 결합된 카피를 갖는 클론은 이러한 방법으로 선발하였다.
실시예 5a
Sacch. 에리트라애 NRRL2338/pPFL43을 사용한 13-메틸-에리트로마이신 A 및 B의 생산
실시예2에서와 같이 제조된 모넨신-로더-D1TE DNA 삽입물에 의하여 치환된 와일드-타입 로딩 도메인으로 구성된 배양물사카로폴리스포라 에리트라애NRRL2338(pPFL43)를 300ml 엘렌마이어 플라스크 중에 들어 있는 50㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 수돗물 배지 30ml에 접종하였다. 29℃에서 배양한 3일 후, 이 플라스크를 300ml 플라스크에 들어 있는 ERY-P 배지 300ml에 접종시키는데 사용하였다. 육즙을 6일 동안 29℃에서 200rpm으로 교반하면서 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, NaOH를 사용하여 육즙의 pH를 8.5로 조절하고 전체 육즙을 2배량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 지마크 터보부이에이피 엘부이 이베포레이터를 사용하여 질소 흐름 중에서 45℃로 증발 건조시킨 다음, 추출액을 16배로 농축하기 위하여 0.0625 배량의 메탄올에서 재구성하였다. 생성물의 구조는 방법 A에 의한 LC/MS에 의하여 확인하였다. 4.0분 지체시간 피크가 관찰되었으며, 주성분은 13-메틸 에리트로마이신 A 에 필요한 720 (M+H)+의m/z 값을 나타내었다. 제2 피크는 13-메틸-에리트로마이신 B에 필요한 지체시간 6.4분과 704 (M+H)+의m/z값이 관찰되었다.
실시예 5b
8리터 규모에서 Sacch. 에리트라애 NRRL2338(pPFL43)를 사용한 13-메틸-에리트로마이신 A 및 B의 생산 및 회수
사카로폴리스포라 에리트라애NRRL2338(pPFL43)를 2.8리터 페른바하 플라스크 속에 들어 있는 50㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 수돗물 배지 1000ml에 접종하였다. 29℃에서 3일간 배양한 후, 이 플라스크를 14리터 짜리 마이크로펌 발효용기(미국, 뉴저지 에디슨, 뉴브룬스윅 사이엔티픽 콤파니, 인코포레이티드 제품)에 들어 있는 8 리터의 ERY-P 배지에 접종시키는데 사용하였다. 육즙은 NaOH 또는 H2SO4(15%)를 사용하여 pH를 6.9 및 7.3 사이로 조절하고 800 rpm으로 교반하면서 8리터/분의 통기속도로 공기를 공급하면서 28℃에서 배양한다. 물을 가하여 용량을 유지하면서 24시간 동안 방치한다. 발효는 167시간 동안 계속되었다. 이 기간이 경과한 다음, 발효기에서 꺼낸 육즙 시료의 pH를 NaOH를 사용하여 8.5로 조절하여 13-메틸-에리트로마이신 A 및 B의 존재를 확인한 다음, 동량의 에틸아세테이트로 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 지마크 터보부이에이피 엘부이 이베퍼레이터를 사용하여 질소 흐름 중에서 45℃로 증발 건조시킨 다음, 추출액을 4배로 농축하기 위하여 0.25 배량의 메탄올에서 재구성하였다. 생성물의 구조는 방법 A에 의한 LC/MS에 의하여 확인하였다. 4.1분 지체시간 피크가 관찰되었으며, 주성분은 13-메틸-에리트로마이신 A 에 필요한 720 (M+H)+의m/z 값을 나타내었다. 제2 피크는 13-메틸-에리트로마이신 B에 필요한 지체시간 6.6분과 704 (M+H)+의m/z값이 관찰되었다.
약 2.8g의 13-메틸-에리트로마이신 A를 포함하는 육즙 35리터를 생성물의 회수를 위하여 가공한다. 육즙을 파일롯 크기의 세라플로 세라믹 유니트를 통하여 여과하고 500ml 엑스에이디-16 수지 컬럼에 충전한다. 100% 메탄올을 사용하여 생성물을 용출시켰다. 175ml 시지-161 흡수 컬럼을 만들고 20% 메탄올/물로 평형을 만들었다. 제품 용액의 일부를 20% 메탄올과 혼합하고 컬럼에 넣은 결과 제품이 올라가는 것이 관찰되지 않았다. 40% 메탄올/물로 컬럼을 세척한 결과 현저한 정도의 불순물 제거에 실패하였다. 50% 메탄올/물로 용출시킨 결과, 두종의 주 불순물인 13-메틸-에리트로마이신 B와 분해 생성물인 13-메틸-디하이드로에리트로마이신 A로부터 생성물의 색층분석적인 분리가 이루어졌다. 가장 순수한 부분을 합치고 10% 이하의 메탄올 농도를 갖도록 약 75% 용량으로 되게 증발시켰다. 13-메틸-에리트로마이신 A의 추출을 개선하기 위하여 고체 중탄산나트륨을 총 농도가 250mM로 될 때까지 첨가하였다. 수성 추출액 층을 메틸렌 클로라이드를 사용하여 두 번 추출하는바, 매회 전체량의 반정도의 메틸렌 클로라이드를 사용하였다. 전체 추출액을 담황색 고체가 나타날 때까지 증발시켰다. 조 생성물인 결정을 실온에서 메틸렌클로라이드에 용해시키고 헥산으로 메틸렌 클로라이드의 농도가 15%로 될 때까지 희석시켜 13-메틸-에리트로마이신 A를 정제하였다. 탁한 용액을 -10℃에서 ~30분 동안 유지하고 액체를 제2 플라스크에 딸아 낸 결과, 대부분의 불순물이 오일 상태로 남아 있었다. 플라스크를 -10℃에서 철야 방치하고 다음날 여과하여 백색 결정의 13-메틸-에리트로마이신 A를 얻었다. 351 육즙 용량에 대한 대충의 작업에 의하여 약 300mg의 13-메틸-에리트로마이신 A 가 분리되었다.
증발된 모액 약 100g은 13-메틸-에리트로마이신 B를 분리하기 위하여 사용한다. 잔류 13-메틸-에리트로마이신 A는 초산 수용액(pH 5)으로 최초 시료를 반복 추출하여 제거하였다. 뒤이어 메틸렌 클로라이드 층을 메틸렌 클로라이드 중의 20% 메탄올을 사용하는 실리카 겔 700g에서 크로마토그래피하였다. LC/MS에 의하여 측정된 바와 같이 13-메틸-에리트로마이신 B가 많이 함유된 분류물을 합치고, 검은 오일 ~11.0g이 얻어질 때까지 증발시켰다. 오일을 최소량의 메탄올에 용해시키고 앰버크롬 시지-161 수지 컬럼에 넣었다. 13-메틸-에리트로마이신 B가 탈이온수 중의 40% 메탄올과 함께 시간당 2층 용량으로 용출되었다. 한층 용량 분류물을 수집하고 LC/MS에 의하여 검사하였다. 42부터 62까지의 유분을 합치고 탈이온수로 ~20% 메탄올까지 희석한 다음, 중탄산나트륨으로 pH 7.5까지 중화하였다. 생성된 용액을 4 리터의 메틸렌 클로라이드로 한꺼번에 추출하고 ~500ml까지 농축한 다음, 무수 황산마그네슘 위에서 건조하였다. 여과하여 황산마그네슘을 제거한 다음, 여액을 증발시켜 ~110mg의 담갈색 고체를 얻었다. 110mg의 조 13-메틸-에리트로마이신 B를 ~3.0ml의 HPLC급 아세토니트릴에 용해시키고, 20cm x 20cm, 2mm 두께의 실리카겔 박막 크로마토그래피(PTLC) 판에 넣었다. 판을 60:40 메탄올:아세토니트릴로 전개시켰다. PTLC 판(옥소 투시)로부터 실리카의 요구하는 부분을 제거하고 HPLC급 아세톤으로 추출하였다. 아세톤 추출물을 증발시켜 투명한 고체 12.1 mg을 얻었다.
13-메틸-에리트로마이신 A 및 13-메틸-에리트로마이신 B 시료의 동정은 매스 스펙트로스코피(LC/MS 방법 B) 및 NMR 스펙트로스코피에 의하여 확인되었다. 13-메틸-에리트로마이신 A 시료 피크는 13-메틸-에리트로마이신 A에 요구되는 720 (M+H)+의m/z값을 갖는 4.7분 지체시간을 갖고 있었다. 13-메틸-에리트로마이신 B 시료 피크는 13-메틸-에리트로마이신 B에 요구되는 704 (M+H)+의m/z값을 갖는 7.6분 지체시간을 갖고 있었다
NMR, 13-메틸-에리트로마이신 A
NMR, 13-메틸에리트로마이신 B
# 13C-PRM #Hattached 1H-PRM
1 80.50 1 4.15
2 40.62 1 2.15
4 45.17 1 2.84
5 84.08 1 3.62
6 9.86 3 1.18
7 97.26 1 4.88
8 176.48 0
9 15.25 3 1.22
11 75.98 0
12 35.43 2 2.42/1.61
16 103.75 1 4.46
17 38.77 2 2.09/1.72
18 27.67 3 1.51
20 73.09 0
21 66.20 1 4.06
22 70.27 1 5.58
23 71.24 1 3.28
25 45.49 1 2.81
26 78.29 1 3.06
28 21.91 3 1.28
29 19.03 3 1.33
30 41.61 1 1.65
31 18.73 3 1.29
32 65.94 1 2.53
34 69.52 1 3.55
35 219.92 0
36 19.03 3 1.21
38 49.97 3 3.36
39 70.17 1 3.88
40 9.27 3 0.95
41 29.12 2 1.73/1.28
43 21.80 3 1.27
44 39.87 1 3.07
47 40.74 3 2.35
48 40.74 3 2.35
49 9.62 3 1.04
실시예 6
재조합 벡타 pPFL42의 구성
pPFL42는 티로신-생성 PKS 로딩 모듈, 에리트로마이신 익스텐션 모듈 1과 2 및 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 하이브리드 폴리케타이드 신다제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 pCJR24-기초 플라스미드이다. 플라스미드 pPFL42는 다음과 같이 구성된다.
다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCATATGACCTCGAACACCGCTGCACAGAA-3' 및
5'-GGCTAGCGGCTCCTGGGCTTCGAAGCTCTTCT-3' 는 주형으로서 cos6T(S. 프라디애로부터 나온 티로신-생성 PKS 유전자를 포함하는 코스미드) 또는S. 프라디애로부터 나온 염색체 DNA를 사용하여 티로신-생성 로딩 모듈을 인코딩하는 DNA를 증폭하는데 사용된다. 3.3 kbp의 PCR 생성물을 겔 전기영동방법으로 정제한 다음, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하여 플라스미드 pUC18에 결합시킨 후, Sma I으로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 플라스미드 pPFL39를 체크한다. 플라스미드 pPFL39는 제한 패턴 및 염기서열 분석에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pPFL39는NdeI 및NheI로 다이제스팅하고 3.3 kbp 프래그먼트는 전기영동법으로 정제한 다음NdeI와NheI로 다이제스팅하여 알카리 포스페타제로 처리한 pND30에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 pPFL42에 대하여 체크하였다. 플라스미드 pPFL42는 제한분석에 의하여 확인하였다.
실시예 7
S. 에리트라애 JC2/pPFL42의 구성
플라스미드 pPFL42는S. 에리트라애JC2 원형질체를 형질전환하는데 사용된다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 콜로니들은 로딩 모듈을 인코딩하는 tyl PKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합된 pPFL42의 존재를 검사하는데 사용되었다.
실시예 8
S. 에리트라애 JC2/pPFL42을 이용한 폴리케타이드의 생산
균주S. 에리트라애JC2/pPFL42의 동결 현탁물을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지에서 접종시킨다. 접종된 배지를 28-30℃에서 수일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH=3.0으로 조절한다. 육즙을 2배량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고, 추출액을 합쳐서 동량의 포화 염화나트륨 용액으로 세척하여 무수 황산나트륨 위에서 건조한 다음 감압하에 에틸아세테이트를 제거하여 조생성물을 얻는다. 생성물은 다음의 구조식을갖고 있으며, MS, GC-MS 및1H NMR 시험결과 진짜 시료와 일치함을 알게 되었다:
실시예 9
S. 에리트라애 NRRL2338/pPFL42의 구성
플라스미드 pPFL42는S. 에리트라애NRRL2338 원형질체를 형질전환하는데 사용된다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 클론들은 로딩 모듈을 인코딩하는 tyl PKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합된 pPFL42의 존재를 검사하는데 사용되었다. pPFL42의 결합된 카피를 갖는 복제물은 이러한 방법으로 선발하였다.
실시예 10
S. 에리트라애 JC2/pPFL42를 사용한 폴리케타이드의 생산
균주S. 에리트라애JC2/pPFL42의 동결 현탁물을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을포함하는 eryP 배지에서 접종시키고, 접종된 배지를 28-30℃에서 7일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH=9.0으로 조절한다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고, 용매를 증발 제거한다. 생성물은 HPLS/MS에 의하여 분석하고 마크로라이드가 다음의 구조식을 갖고 있으며, 진짜 시료와 일치함을 알게 되었다. 불완전한 PKS 후가공에 의하여 나타나는 에리트로마이신 B 및 D도 함께 검출되었다.
실시예 11
플라스미드 pPFL35의 구성
pPFL35는 로딩 모듈, DEBS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈 및 체인 말단 티오에스테라제로 조성된 PKS 유전자를 포함하는 pCJR24-기초 플라스미드이다. 로딩 모듈은 래파마이신 PKS의 모듈 2의 말로닐-CoA-특이성 AT에 융화되고 DEBS 로딩 도메인 ACP에 결합된 올리안도마이신 PKS의 로딩 모듈에서 나온 KSq 도메인 DNA를 포함한다. pPFL35는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 통하여 구성된다:
뉴클레오타이드 1279로부터 뉴클레오타이드 1690까지 연장된S. 에리트라애로부터 얻은eryAI 유전자의 411 bp DNA 시그먼트 (Donadio, S. et al. Science (1991) 2523: 675-679)는 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드 플라이머를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다:
5'-TGGACCGCCGCCAATTGCCTAGGCGGGCCGAACCCGGCT-3' 및
5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCC-3'
새로운PstI와HindIII 사이트가 제1 익스텐션 모듈의 측면에 접하도록 도입된 pT7-7 및 DEBS1-TE로부터 유도된 플라스미드 지정 pKSW로부터 얻은 DNA를 주형으로 사용한다. 441 bp PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고,SmaI으로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기 반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고, 각개 클론들은 요구하는 플라스미드 pPFL26에 대하여 체크하였다. 삽입물에 접하고 있는 새로운MfeI 및AvrII 사이트는 pUC18의EcoRI 사이트에 인접되어 있다. 플라스미드 pPFL26은 제한 패턴과 아미노산 염기서열 분석에 의하여 확인되었다.
MfeI 제한 사이트는 112 bp로부터 DEBS의 로딩 모듈의 프로피오닐-CoA:ACP 트란스퍼라제를 인코딩하는 DNA의 5' 말단까지 위치하고 있다. 플라스미드 pKSW는MfeI과PstI으로 다이제스팅되고MfeI과PstI로 플라스미드 pPFL26를 다이제스팅하여 얻은 411 bp 삽입물과 결합된다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론들은 요구하는 플라스미드 pPFL27을 체크한다. 플라스미드 pPFL27은 DEBS 로딩 모듈, DEBS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈 및 DEBS 체인 말단 티오에스테라제를 함유하는 PKS 유전자를 포함한다. 플라스미드 pPFL27은 제한패턴에 의하여 확인되었다. 플라스미드 pPFL27은NdeI 및AvrII으로 다이제스팅되고 플라스미드 pM06 (PCT/GB97/01819)을NdeI과AvrII로 다이제스팅하여 유도한 4.6 kbp 삽입물에 결합된다. 플라스미드 pM06은 DEBS 로딩 모듈, DEBS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈 및 DEBS 체인 말단 티오에스테라제를 포함한다. 그러나 제1 익스텐션 모듈 내의 메틸말로네이트-특이성 AT를 인코딩하는 DNA 시그먼트가rapPKS의 모듈 2의 말로네이트-특이성 AT를 인코 딩하는 DNA에 의하여 치환된 경우에는 예외이다. 결합 혼합물은 전기작용성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 플라스미드 pPFL28을 체크한다. 플라스미드 pPFL28은 DEBS의 제1 및 제2 모듈과 DEBS 체인 말단 티오에스테라제에 이어 DEBS 로딩 모듈,rapPKS의 모듈 2의 말로네이트-특이성 AT 및 DEBS 로딩 모듈의 ACP를 포함한다. 플라스미드 pPFL28은 제한 분석에 의하여 확인되었다.
뉴클레오타이드 1671로부터 뉴클레오타이드 3385까지 증폭되는S. 안티바이오티쿠스의oleAI 유전자로부터 유래된 KSq 도메인을 인코딩하는 DNA 시그먼트는 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 주형으로서스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스유래의 염색체 DNA를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다:
5'-CCACATATGCATGTCCCCGGCGAGGAA-3' 와
5'-CCCTGTCCGGAGAAGAGGAAGGCGAGGCCG-3'
PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리되고Sma I로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합된다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B를 형질전환하는데 사용되고 각개 클론들은 요구하는 플라스미드 pPFL31을 체크한다. 삽입물에 붙어 있는 새로운NdeI 사이트는 폴리링커 pUC18의EcoRI에 인접되어 있으며, 새로운BspEI 사이트는 링커 부위의HindIII 사이트에 붙어 있다. 플라스미드 pPFL31은 제한분석에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pPFL31은NdeI과AvrII로 다이제스팅하고, 삽입물은NdeI과AvrII로 다이제스팅한 플라스미드 pPFL28과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B를 형질전환하는데 이용되며, 클론들은 요구하는 플라스미드 pPFL32를 위하여 체크하였다. 플라스미드 pPFL32는 제한분석에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pPFL32는NdeI과XbaI으로 다이제스팅하고NdeI과XbaI으로 다이제스팅하여 전기영동법으로 정제한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B를 형질전환하는데 이용되며, 클론들은 요구하는 플라스미드 pPFL35에 대하여 체크하였다. 플라스미드 pPFL35는 제한분석에 의하여 확인하였다.
실시예 12
S. 에리트라애 JC2 / pPFL35의 구성
플라스미드 pPFL35는S. 에리트라애JC2 원형질체를 형질전환하는데 사용하였다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 콜로니들은 모듈 2 아실트란스퍼라제에 인코딩하는rapPKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합한 pPFL42의 존재를 검사하는데 사용되었다. pPFL35의 결합된 카피를 갖는 클론은 이러한 방법으로 선발하였다.
실시예 13
S. 에리트라애 JC2/pPFL35를 이용한 폴리케타이드의 생산
균주S. 에리트라애JC2/pPFL35의 동결 현탁물을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지에서 접종시킨다. 접종된 배지를 28-30℃에서 7일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH=3.0으로 조절한다. 육즙을 2배량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고, 추출액을 합쳐서 동량의 포화 염화나트륨 용액으로 세척하여 무수 황산나트륨 위에서 건조한 다음 감압 하에 에틸아세테이트를 제거하여 조 생성물을 얻는다. 생성물은 다음의 구조식을 갖고 있으며, MS, GC-MS 및1H NMR 시험결과 진짜 시료와 일치함을 알게 되었다:
실시예 14
S. 에리트라애 NRRL2338/pPFL35의 구성
플라스미드 pPFL35는S. 에리트라애NRRL2338 원형질체를 형질전환하는데 사용하였다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지(야마모토 등)에서 선발하였다. 수개의 콜로니들은 모듈 2 AT에 인코딩하는rapPKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합한 pPFL35의 존재를 검사하는데 사용되었다. pPFL35의 결합된 카피를 갖는 복제물은 이러한 방법으로 선발하였다.
실시예 15
Sacch. 에리트라애 NRRL2338(pPFL35)을 사용한 13-메틸-에리트로마이신 A 및 B의 생산
실시예14에서와 같이 제조된 올리안도마이신 KSQ-래파마이신 AT2-D1TE DNA 삽입물에 의하여 치환된 와일드-타입 로딩 도메인으로 구성된 배양물사카로폴리스포라 에리트라애NRRL2338(pPFL35)를 300ml 엘렌마이어 플라스크 중에 들어 있는 50㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 수돗물 배지 30ml에 접종하였다. 29℃에서 2일간 배양한 후, 이 플라스크를 300ml 플라스크에 들어 있는 ERY-P 배지 300ml에 접종시키는데 사용하였다. 육즙을 6일 동안 29℃에서 200rpm으로 교반하면서 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, NaOH를 사용하여 육즙의 pH를 8.5로 조절하고 전체 육즙을 2배량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 지마크 터보부이에이피 엘부이 이베퍼레이터를 사용하여 질소 흐름 중에서 45℃로 증발 건조시킨 다음, 추출액을 4배로 농축하기 위하여 0.25 배량의 메탄올에서 재구성하였다. 생성물의 구조는 방법 A에 의한 LC/MS에 의하여 확인하였다. 피크는 4.0분 지체시간에서 관찰되었으며, 주성분은 13-메틸 에리트로마이신 A (C36H65NO13) 에 필요한 720 (M+H)+의m/z 값을 나타내었다. 제2 피크는 에리트로마이신 B에 필요한 지체시간 6.4분과 704 (M+H)+의m/z값으로 관찰되었다.
실시예 16
재조합 벡타 pPFL44의 구성
pPFL44는 스피라마이신 PKS 로딩 모듈, 에리트로마이신 익스텐션 모듈 1과 2 및 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 하이브리드 폴리케타이드 신다제를 인코딩하는 유전자를 포함하는 pCJR24-기초 플라스미드이다. 플라스미드 pPFL44는 다음과 같이 구성된다.
다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCATATGTCTGGAGAACTCGCGATTTCCCGCAGT-3' 및
5'-GGCTAGCGGGTCGTCGTCGTCCCGGCTG-3'
홉우드 등(1985)에 의하여 기재된 방법에 의하여 제조된 스피라마이신 생성제S. 암보파시엔스로부터 나온 염색체 DNA를 사용하여 스피라마이신-생성 로딩 모듈을 인코딩하는 DNA를 증폭하는데 사용된다. 3.3 kbp의 PCR 생성물을 겔 전기영동방법으로 정제한 다음, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고SmaI으로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 플라스미드 pPFL41를 체크한다. 플라스미드 pPFL41은 제한 패턴 및 염기서열 분석에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pPFL41은NdeI 및NheI로 다이제스팅하고 3.3 kbp 프래그먼트는 전기영동법으로 정제한 다음NdeI와NheI로 다이제스팅하여 알카리 포스페타제로 처리한 pND30 (avePKS 로딩 모듈, 익스텐션 모듈 1 과 2 또는 DEBS 및 DEBS 티오에스테라제를 삽입물로서 갖고 있는 플라스미드 pCJR24로부터 유도된 플라스미드)(PCT/GB97/01810)에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 클론은 요구하는 pPFL44에 대하여 체크하였다. 플라스미드 pPFL44는 제한분석에 의하여 확인하였다.
실시예 17
S. 에리트라애 JC2 / pPFL44의 구성
플라스미드 pPFL44는S. 에리트라애JC2 원형질체를 형질전환하는데 사용하였다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 클론들은 로딩 모듈을 인코딩하는 srm PKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합한 pPFL44의 존재를 검사하는데 사용되었다. pPFL44의 결합된 카피를 갖는 클론은 이러한 방법으로 선발하였다.
실시예 18
S. 에리트라애 JC2/pPFL44를 사용한 폴리케타이드의 생산
균주S. 에리트라애JC2/pPFL44의 동결 현탁물을 5㎍/ml의 티오스트렙톤을포함하는 eryP 배지에서 접종시키고, 접종된 배지를 28-30℃에서 수일 동안 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 여과하여 균사를 제거하고 pH를 pH=3.0으로 조절한다. 육즙을 2배 량의 에틸아세테이트로 두 번 추출하고, 추출물을 합쳐서 동량의 포화 나트륨 용액으로 세척하고 무수 황산나트륨위에서 건조한 다음 감압하에 용매를 증발 제거하여 조 생성물을 얻는다. 생성물은 GC-MS 및1H NMR 분석결과, 다음의 구조를 갖고 있으며 진짜 물질과 동일함을 보여 주었다.
실시예 19
S. 에리트라애 NRRL2338/pPFL44의 구성
플라스미드 pPFL44는S. 에리트라애NRRL2338 원형질체를 형질전환하는데 사용된다. 티오스트렙톤 저항성 콜로니들은 10㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 R2T20 배지에서 선발하였다. 수개의 클론들은 로딩 모듈을 인코딩하는 스피라마이신 PKS 프래그먼트를 포함하는 DIG-표식 DNA로 그들의 유전학적 DNA를 서던 블로트 하이브리디제이션하므로서 염색체속에 결합한 pPFL44의 존재를 검사하는데 사용되었다. pPFL44의 결합된 카피를 갖는 클론은 이러한 방법으로 선발하였다.
실시예 20
Sacch. 에리트라애 NRRL2338(pPFL44)을 사용한 13-메틸-에리트로마이신 A 및 B의 생산
스피라마이신 로더-D1TE DNA 삽입물에 의하여 치환된 와일드-타입 로딩 도메인으로 구성된 배양물사카로폴리스포라 에리트라애NRRL2338(pPFL44)를 300ml 엘렌마이어 플라스크에 들어 있는 50㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 수돗물 배지 30ml에 접종하였다. 29℃에서 배양한 3일 후, 이 플라스크를 300ml 플라스크에 들어 있는 ERY-P 배지 300ml에 접종시키는데 사용하였다. 육즙을 6일 동안 29℃에서 200rpm으로 교반하면서 배양한다. 이 기간이 경과한 다음, NaOH를 사용하여 육즙의 pH를 8.5로 조절하고 전체 육즙을 동량의 에틸아세테이트로 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 지마크 터보부이에이피 엘부이 이베퍼레이터를 사용하여 질소 흐름 중에서 45℃로 증발 건조시킨 다음, 추출액을 16배로 농축하기 위하여 0.0625 배량의 메탄올에서 재구성하였다. 생성물의 구조는 방법 A에 의한 LC/MS에 의하여 확인하였다. 피크는 4.0분 지체시간에서 관찰되었으며, 주성분은 13-메틸 에리트로마이신 A (C36H65NO13)에 필요한 720 (M+H)+의m/z 값을 나타내었다. 제2 피크는 13-메틸에리트로마이신 B (C36H65NO12)에 필요한 지체시간 6.4분과 704 (M+H)+의m/z값으로 관찰되었다.
실시예 21
플라스미드 pJLK114의 구성
pJLK114는 ery 로딩 모듈, ery PKS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈 및 ery 체인 말단 티오에스테라제로 조성된 ery PKS 유전자를 포함하는 pCJR24-기초 플라스미드이지만, 아실트란스퍼라제의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 시그먼트가 다음의 제한 효소: AvrII, BglII, SnaB1, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I 및 HpaI의 인식 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드에 의하여 치환된 것이다. 이 플라스미드는 도6과 같이 다수의 중간 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pJLK02의 구성
S.에리트라애의 eryAI 유전자의 1.47 kbp DNA 프래그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드와 주형으로서 플라스미드 pNTEP2(Oliynik. M. et al.Chemistry and Biology(1996) 3: 833-839; WO98/01546)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다.
5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' 및
5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3'
PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 콜로니들을 그들의 플라스미드 함량을 알아보기 위해 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK02는 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK03의 구성
S.에리트라애의 eryAI 유전자의 1.47 kbp DNA 프래그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 뉴클레오타이드와 주형으로서 플라스미드 pNTEPH를 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다.
5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3' 및
5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3'
PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 콜로니들을 그들의 플라스미드 함량을 알기위해 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK03은 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK04의 구성
플라스미드 pJLK02는 PstI와 HpaI로 다이제스팅하고, 1.47 kbp 삽입물을 PstI와 HpaI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK03과 결합시켰다. 결합 혼합물은 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 알기 위해 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK04는 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK05의 구성
플라스미드 pJLK01(PCT/GB97/01819)은 PstI와 AvrII로 다이제스팅하고, 460 bp 삽입물을 PstI와 AvrII로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK04와 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK04는 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK07의 구성
플라스미드 pJLK05는 ScaI와 XbaI로 다이제스팅하고, 플라스미드 pNTEPH는 NdeI와 ScaI로 다이제스팅하여, 두 프래그먼트를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시켰다. 결합 혼합물은 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK07은 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK114의 구성
두 합성 올리고뉴클레오타이드 Plf와 Plb(도12)를 각각 TE-완충액에 용해시켰다. 각개 용액(0.5nmol/㎕) 10㎕을 혼합하고 2분 동안 65℃로 가열한 다음 서서히 실온까지 냉각하였다. 플라스미드 pJLK07은 AvrII와 HpaI으로 다이제스팅하고, 융합된 올리고뉴클레오타이드와 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK114는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK117은 ery 로딩 모듈, ery PKS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈 및 ery 체인 말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는 pCJR24-기초 플라스미드이지만, 아실트란스퍼라제의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 시그먼트가 다음의 제한 효소: AvrII, BglII, SnaB1, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I 및 NheI의 인식 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드 링커에 의하여 치환된 것이다.
이 플라스미드는 도11과 같이 다수의 중간 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pJLK115의 구성
플라스미드 pJLK114를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고, 9.9 kbp의 삽입물은 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pUC18과 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK115는 제한 패턴에의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK116의 구성
플라스미드 JLK13 (PCT/GB97/01819)를 Bsu36I 및 XbaI로 다이제스팅하고, 1.1 kbp 프래그먼트는 14를 Bsu361 및 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK115와 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK116은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK117의 구성
플라스미드 pJLK116을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고, 9.9 kbp의 프래그먼트는 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK117은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 11
플라스미드 pJLK29의 구성
플라스미드 pJLK29는 rap PKS의 모듈 10의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs로 삽입된 것을 제외하고 pJLK117-기초 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pJKL121.1의 구성
모듈 10의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 하이그로스코피쿠스의 rapB 유전자의 2.2 kbp DNA 시그먼트를 프라이머인 다음의 올리고뉴클레오타이드와 주형으로서 코스미드 cos 26 (Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843)을 ScaI와 SphI로 다이제스팅하여 얻은 7 kbp를 이용하는 PCR에 의하여 증폭하였다.
5'-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' 및
5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3'
PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드로 처리한 다음, SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK121.1은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK29의 구성
플라스미드 pJLK121.1은 BglII와 NheI로 다이제스팅하고, 2.2 kbp 프래그먼트는 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK29는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 24
플라스미드 pJLK50의 구성
모듈 2의 ACP의 시작부터 모듈 3의 시작까지의 DNA 시그먼트를 인코딩하는S. 에리트라애의에리트로마이신 PKS 유전자 클러스터의 6.1 kbp DNA 시그먼트를 프라이머인 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드와 주형인 플라스미드 pBAM25(Best, D. J. et al. Eur. J. Biochem. (1992) 204: 39-49에 의한 pBK25)를 이용하여 증폭하였다.
5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' 및
5'-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3'
PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK50는 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인하였다.
실시예 25
S. 에리트라애 균주 JLK10의 구성
균주 JLK10은 ery 모듈 2(예를 들면 KR 도메인)의 환원성 루프가 래파마이신 모듈 10의 환원성 루프에 의하여 치환된 균주 2338의 변이종이다. 이 균주는 다음과 같은 구성을 갖는 플라스미드 pJLK54를 이용하여 구성한다.
플라스미드 pJLK54의 구성
플라스미드 pJLK54는 ery 로딩 모듈, ery 클러스터의 제1, 제2 및 제3 익스텐션 모듈 및 ery 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는 pJLK29-기초 플라스미드이지만, 아실트란스퍼라제의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 DNA 시그먼트가 래파마이신의 모듈 10의 동일 시그먼트에 의하여 치환된 것이다.
이 플라스미드는 다음과 같이 구성된다.
pJLK50을 NheI로 다이제스팅하고, 6.1 kbp 삽입물은 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK29와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK54는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK54의 구성을 위한 플라스미드 ppJLK54의 용도 및 TKL 유도체의 생산
플라스미드 pJLK54 5 ㎍을 S. 에리트라애 NRRL2338의 원형질체를 형질전환하기 위하여 사용되었으며, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니를 분리하였다. 다수의 콜로니로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 분석하였다.
S. 에리트라애 균주 JLK10의 구성 및 13-메틸-10,11-디하이드로-에리트로마이신 A의 제조에 대한 이용
S. 에리트라애 균주 JLK10는 ery 모듈 2, 예를 들면 케토리덕타제의 환원성 루프가 래파마이신 모듈 10의 환원성 루프에 의하여 치환된 S. 에리트라애 NRRL2338의 돌연변이체이다. 이 균주는 플라스미드 pJLK54가 결합된 S. 에리트라애 NRRL2338로부터 시작하여 구성된다. S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK54는 결합된 플라스미드의 손실과 함께 제2 교차성 부수물을 가져오는 수 단계의 비선택성 생장을 거친다. 돌연변이체 버전을 갖는 DEBS1에 대하여 코딩하는 에리트로마이신 유전자의 치환이 일어나는 클론은 서던 블로트 하이브리제이션에 의하여 확인되었다. 이러한 클론의 하나는 S. 에리트라애 균주 JLK10이라 명명하고 SM3 배지(eryP 배지도 동일한 결과를 나타내었다)에 접종하고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 9까지 조절한다. 상등액은 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물은 HPLC/MS, MS/MS 및 1H-NMR에 의하여 분석하였다. 다음의 마크로라이드 C-13 메틸 에리트로마이신이 확인되었다 (후-PKS 효소에 의하여불완전하게 가공된 생성물응 수반함).
실시예 26
플라스미드 pPFL50의 구성
pPFL50은 KR1 (일부), ACP1 및 에리트로마이신 PKS와 에리트로마이신 TE의 모듈 2를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 제거된 pPFL43-기초 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같이 구성된다. 플라스미드 pPFL43을 SfuI와 XbaI로 다이제스팅하여 6.5 kbp 프래그먼트를 제거하였다. 5' 오버행을 클리나우 프래그먼트 DNA 폴리머라제 I로 채우고 플라스미드를 재순환시킨다. 결합 혼합물은 전기작용성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었으며, 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 체크하였다. 요구하는 플라스미드 pPFL50은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
S. 에리트라애 JLK10/pPFL50의 구성
플라스미드 pPFL50은S. 에리트라애균주 JLK10의 원형질체를 형질전환하는데 사용되었으며, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수 개의 콜로니로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 유사 염색체 DNA 부위에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 균주 JLK10/pPFL50은 5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 SM3 배지(5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지는 유사한 결과를 가져온다)에 접종시키고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9까지 조절한다. 상등액은 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물은 HPLC/MS, MS/MS 및 1H-NMR에 의하여 분석하였다. 마크로라이드 C-13 메틸-10,11-디하이드로-에리트로마이신 A가 확인되었다. (후-PKS 효소에 의하여 가공된 불와전 생성물을 수반하였다)
S. 에리트라애 NRRL2338/pPFL50의 구성
플라스미드 pPFL50 5㎍은 S. 에리트라애 NRRL2338의 원형질체를 형질전환하기 위하여 사용되었으며, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니를 분리하였다. 다수의 콜로니로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 염색체 DNA의 유사 부위에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 NRRL2338/pPFL50은 5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 SM3 배지(5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지는 유사한 결과를 가져온다)에 접종시키고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9.5까지 조절한다. 상등액은 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물은 HPLC/MS, MS/MS 및 1H-NMR에 의하여 분석하였다. 마크로라이드 C-13 메틸에리트로마이신 A가 확인되었다. (후-PKS 효소에 의하여 가공된 불와전 생성물을 수반하였다)
플라스미드 pCB121의 구성
플라스미드 pCB121은 에리트로마이신 모듈 1 AT와 에리트로마이신 모듈 KR의 부분에 이어 모넨신 로딩 모듈과 모넨신 모듈 1의 KS를 포함하는 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pPFL45의 구성
로딩 모듈의 ACP 부분과 모듈 1의 KS를 인코딩하는 스트렙토마이세스 시나모넨시스의 모넨신 유전자 클러스터의 1.8 kbp DNA 시그먼트는 프라이머인 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드와 주형인 S. 시나모넨시스 또는 S. 시나모넨시스의 염색체 DNA로부터 얻은 모넨신 PKS 유전자의 5' 단부를 포함하는 코스미드를 이용하는 PCR에 의하여 증폭된다.
5'-CGTTCCTGAGGTCGCTGGCCCAGGCGTA-3' 및
5'-CGAAGCTTGACACCGCGGCGCGGCGCGG-3'
PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리한 다음, Sma I으로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페타제로 처리한 플라스미드 pUC18에 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개클론은 요구하는 플라스미드 함량에 대하여 검사한다. 플라스미드 pPFL45는 제한 패턴에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pPFL47의 구성
플라스미드 pPFL45는 NdeI와 Bsu36I로 다이제스팅하고, 2.6 kbp 프래그먼트는 NdeI와 Bsu36I로 다이제스팅한 플라스미드 pPFL43에 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 콜로니는 요구하는 플라스미드 함량에 대하여 검사한다. 플라스미드 pPFL47은 제한 패턴에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pCB135의 구성
플라스미드 pCJR24를 HindIII로 다이제스팅하고 5' 오버행을 클레노우 프래그먼트 DNA 폴리머라제 I로 채워서 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되며, 각개 콜로니는 요구하는 플라스미드 함량에 대하여 검사한다. 플라스미드 pPFL135은 제한 패턴에 의하여 확인하였으나 HindIII의 인식 사이트는 없었다.
플라스미드 pKSW1의 구성
플라스미드 pKS1W는 KS1 범위에 도입된 유일한 제한 사이트를 갖는 DEBS1TE-유도 트리케타이드 신다제를 포함하는 pNTEP2 (PCT/GB97/01810)-유도 벡타이다.플라스미드 pKS1W는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 얻어진다.
플라스미드 pMO09, pMO10 및 pM013의 구성
플라스미드 pMO09에 대한 PCR 증폭을 위하여는 돌연변이성 프라이머로서 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드가 사용되는바, 그 중의 하나는 MunI 사이트이고 다른 것은 PstI 사이트이다.
5'-GCGCGCCAATTGCGTGCACATCTCGAT-3' 및
5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3'
플라스미드 pMO10에 대한 PCR 증폭을 위하여는 돌연변이성 프라이머로서 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드가 사용되는바, 그 중의 하나는 HindIII를 포함하고 다른 것은 EcoRV 사이트를 포함한다.
5'-GTCTCAAGCTTCGGCATCAGCGGCACCAA-3' 및
5'-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3'
플라스미드 pMO113에 대한 PCR 증폭을 위하여는 돌연변이성 프라이머로서 다음과 같은 올리고뉴클레오타이드가 사용되는바, 그 중의 하나는 PstI 사이트를 포함하고 다른 것은 HindIII 사이트를 포함한다.
5'-GATGGCCTGCAGGCTGCCCGGCGGTGTGAGCA-3' 및
5'-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3'
PCR은 Pwo DNA 폴리머라제를 사용하여 주형인 pNTEP2(GB97/01810)에서 실시되는바, 10% (vol/vol) 디메틸설폭사이드의 존재 하에 다음의 조건으로 실시된다: 1회 사이클 96℃ (1 분), 50℃에서의 아닐링 (3 분), 72℃에서의 익스텐션 (1 분); 25회 사이클 96℃ (1 분), 50℃에서의 아닐링 (1 분), 72℃에서의 익스텐션 (1 분). 생성물은 단부-회복되었고, SmaI으로 다이제스팅된 pUC18에 결합되었다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었다. 플라스미드 DNA는 각개 콜로니들로부터 제조하였다. pMO09 (3.8 kbp), pMO10 (3.9 kbp) 및 pM013 (4.3 kbp)에 대한 플라스미드들은 제한 패턴과 DNA 염기서열 분석에 의하여 확인되었다.
플라스미드 pMO11의 구성
프라스미드 pMO13은 HindIII으로 다이제스팅하고, 1.2 kbp 삽입물은 HindIII으로 다이제스팅된 pMO10에 결합시켰다. 결합 혼합물은E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었다. 요구하는 플라스미드 (5.0 kbp)는 제한 패턴으로 확인하였으며, pMO11로 확인되었다.
플라스미드 pMO12의 구성
프라스미드 pMO09는 PstI로 다이제스팅하고, 1.6 kbp 삽입물은 PstI로 다이제스팅된 pMO11에 결합시켰다. 결합 혼합물은E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었다. 요구하는 플라스미드 (6.6 kbp)는 제한 패턴으로 확인하였으며, pMO12로 확인되었다.
플라스미드 pKS1W의 구성
플라스미드 pMO12는 MunI와 EcoRV로 다이제스팅하고, 3.9 kbp 프래그먼트는 MunI와 EcoRV로 다이제스팅된 pNTEPH( 하기 참조 )에 결합시켰다. 결합 혼합물은E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용되었다. 요구하는 플라스미드 (13. kbp)는 제한 패턴으로 확인하였으며, pKS1W로 확이되었다.
플라스미드 pNTEPH의 구성
플라스미드 pNTEPH는 pNTEP2로부터 HindIII 사이트를 제거하여 제조하였다. 플라스미드 pNTEP2는 HindIII로 다이제스팅하고 5' 오버행은 클레노우 프래그먼트 DNA 폴리머라제 I로 채워서 재결합시켰다. 요구하는 플라스미드 (13.6 kbp)는 제한 패턴으로 확인하였다.
플라스미드 pCB136의 구성
플라스미드 pKSW1을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고, 11.2kbp 프래그먼트는 NdeI와 XbaI로 다이제스팅된 플라스미드 pCB135와 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용하였으며, 각개 콜로니는 요구하는 플라스미드 함량에 대하여 체크했다. 플라스미드 pCB136은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pCB137의 구성
플라스미드 pCB136을 SfuI와 XbaI로 다이제스팅하고, 6.5 kbp를 제거하였다. 5' 오버행은 클레노우 프래그먼트 폴리머라제 I로 채워서 재결합시켰다. 요구하는 플라스미드는 제한 패턴으로 확인하였다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용하였으며, 각개 콜로니는 요구하는 플라스미드 함량에 대하여 체크했다. 플라스미드 pCB137은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pCB121의 구성
플라스미드 pPFL47을 NdeI와 HindIII로 다이제스팅하고, 4.4kbp 삽입물은 NdeI와 HindIII로 다이제스팅된 플라스미드 pCB137과 결합시켰다. 결합 혼합물은 전기반응성E. coliDH10B 세포를 형질전환하는데 사용하였으며, 각개 콜로니는 요구하는 플라스미드 함량에 대하여 체크했다. 플라스미드 pCB121은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예
S.에리트라애 JLK10/pCB121의 구성
5㎍의 플라스미드 pCB121은 S. 에리트라애 JLK10의 원형질체를 형질전환하는데 사용하였고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수 개의 콜로니로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 유사 염색체 DNA 부위에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 균주 JLK10/pCB121은 5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 SM3 배지(5 ㎍/ml의티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지는 유사한 결과를 가져온다)에 접종시키고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9까지 조절한다. 상등액은 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물은 HPLC/MS, MS/MS 및 1H-NMR에 의하여 분석하였다. 마크로라이드 C-13 메틸-10,11-디하이드로-에리트로마이신 A가 확인되었다. (후-PKS 효소에 의하여 가공된 불와전 생성물을 수반하였다)
실시예
S. 에리트라애 NRRL2338/pCB121의 구성
5㎍의 플라스미드 pCB121은 S. 에리트라애 NRRL2338의 원형질체를 형질전환하는데 사용하였고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수 개의 콜로니로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 유사 염색체 DNA 부위에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디제이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 균주 NRRL2338/pPFL50은 5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 SM3 배지(5 ㎍/ml의 티오스트렙톤을 포함하는 eryP 배지는 유사한 결과를 가져온다)에 접종시키고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH 9까지 조절한다. 상등액은 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매를 증발 제거하였다. 생성물은 HPLC/MS, MS/MS 및 1H-NMR에 의하여 분석하였다. 마크로라이드 C13-에리트로마이신 A가 확인되었다. (후-PKS 효소에 의하여 가공된 불와전 생성물을 수반하였다)
비록 본 발명은 실시예에서 상세하게 설명하였지만, 실시예가 발명의 범위를 한정시키는 것은 아니다. 전술한 본 발명은 우선적으로 전체 또는 일부의 이종 Ksq-함유 로딩 모듈을 포함하는 Type I PKS 유전자 어셈블리의 구성과 이러한 유전자를 합성 중간체 또는 항생제와 같은 생물학적 활성을 갖는 폴리케타이드를 생산하는데 사용되는 용도에 대하여 기재하였다. 다른 PKS 유전자 셋트로부터의 전체 또는 부분적인 이종 Ksq-함유 로딩 모듈이 DEBS의 로딩 모듈을 치환하거나 또는 상이한 PKS 유전자 어셈블리에 치환된다는 것은 당해업계에 종사하는 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 알 수 있을 것이다. 또한 메틸말로닐-CoA와 Ksq에 뒤이은 Atq에 의한 말로닐-CoA의 효과적인 차별화에 의하여 나타나는 부수적인 특징은 스타터 특성이 서로 다른 혼합물보다 단일 생성물의 생산을 극대화하는 DEBS 로딩 모듈과 많은 다른 PKS 유전자의 특성인 프로피오닐-CoA와 아세틸-CoA 사이의 차별화가 없는 것이 좋다는 것을 알 수 있다. 이러한 혼합물을 회피하는 것은 수율을 증가시키고 복잡하고 어려운 분리공정을 요구하지 않게 된다.

Claims (15)

  1. 로딩 모듈과 다수의 익스텐션 모듈을 포함하는 PKS 다중 효소를 제공하므로서 요구하는 스타터 유니트를 독점적으로 갖고 있는 폴리케타이드를 생산하는 방법에 있어서, 전술한 로딩 모듈은 임의 치환된 말로닐을 로딩하고 전술한 인접한 익스텐션 모듈 중 하나로 전이되도록 하기 위한 해당하는 임의 치환된 아세틸 잔여물을 제공하기 위하여 로딩된 잔여물을 탈카복실화하도록 되었고, 익스텐션 모듈의 최소한 하나는 타겟 폴리케타이드가 (미치환된) 아세테이트 스타터 유니트의 결합에 의한 13-메틸 그룹을 갖는 14-멤버 마크로라이드가 아니라는 전제하에 탈카복실화에 영향을 미치는 로딩 모듈과 천연적으로 결합되지 않음을 특징으로 하는 폴리케타이드 생산 시스템.
  2. 제1항에서, 아세테이트 스타터가 전이된 전술한 인접 익스텐션 모듈이 탈카복실화에 영향을 미치는 로딩 모듈과 천연적으로 결합되지 않았음을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제1항 또는 2항에서, 로딩 모듈의 탈카복실화 기능성이 활성 사이트에 있는 글루타민 잔여물 또는 시스테인 이외의 다른 잔여물을 갖는 케토신다제-타입에 의하여 제공됨을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제1항 또는 2항에서, 로딩 모듈의 탈카복실화 기능성이 CLF-타입 도메인에 의하여 제공됨을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제1항 내지 4항 중의 한 항에서, 로딩 모듈의 로딩 기능성이 활성 사이트에 있는 알기닌 잔여물을 갖는 아실트란스퍼라제에 의하여 제공됨을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제1항 내지 5항 중의 한 항에서, 로딩 모듈이 아실 캐리어 단백질을 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제1항 내지 3항, 5항 또는 6항 중의 한 항에서, 최소한 로딩 모듈의 Ksq 도메인이 올리안도마이신, 스피라마이신, 니다마이신, 메트마이신 또는 모넨신의 PKS 다중 효소의 로딩 모듈에 해당함을 특징으로 하는 시스템.
  8. 청구항 1 내지 7중의 하나에 기재된 시스템의 DNA 또는 전술한 폴리케타이드 화합물을 합성하는 능력을 갖는 변이종에 의하여 발현될 수 있는 PKS 다중 효소.
  9. 청구항 8의 PKS 다중 효소를 인코딩하는 핵산.
  10. 청구항 9에 정의된바와 같은 핵산을 함유하는 벡타.
  11. 청구항 1 내지 7중의 하나에 의한 시스템을 포함하는 형질전환 유기체.
  12. 청구항 11에 의한 유기체를 배양하는 단계와 폴리케타이드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리케타이드 생산방법.
  13. 전술한 폴리케타이드가
    (a) 아세테이트 스타터 유니트를 갖는 12- 및 16-멤버 마크로라이드,
    (b) 프로피오네이트 스타터 유니트를 갖는 12-, 14- 및 16-멤버 마크로라이드,
    (c) 아세테이트 스타터 유니트 또는 프로피오네이트 스타터 유니트를 갖는 리파마이신, 애버멕틴, 래파마이신, 이뮤노마이신 및 FK506의 변이종,
    (d) 스타터 유니트가 알릴 및 하이드록시메틸로부터 선택된 측쇄에 나타나는 폴리케타이드 중에서 선택된 전술한 청구항 중의 한 항에 따른 시스템, 다중효소, 핵산, 벡타, 유기체 또는 방법.
  14. 스타터 유니트에 의하여 제공된 측쇄에 있는 모체 폴리케타이드와 다른 모체 폴리케타이드의 변이종.
  15. 와일드 타입 신다제가 불필요한 스타터를 생산하기 위한 탈카복실화에 영향을 미치는 CLF 도메인을 포함하는 타입 II 폴리케타이드 신다제(PKS)를 함유하는 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 타입 II 폴리케타이드 제조방법에서, 전술한 유기체가 전술한 CLF 도메인의 탈카복실화 활성을 억제하도록 유전학적으로 가공된 PKS를 포함함을 특징으로 하는 방법.
KR1020007015000A 1998-06-29 1999-06-29 폴리케타이드 및 그들의 합성방법 KR20010071684A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9814006.4A GB9814006D0 (en) 1998-06-29 1998-06-29 Polyketides and their synthesis
GB9814006.4 1998-06-29
PCT/GB1999/002044 WO2000000618A2 (en) 1998-06-29 1999-06-29 Polyketides and their synthesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010071684A true KR20010071684A (ko) 2001-07-31

Family

ID=10834580

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007015000A KR20010071684A (ko) 1998-06-29 1999-06-29 폴리케타이드 및 그들의 합성방법
KR1020007014999A KR20010071683A (ko) 1998-06-29 1999-06-29 폴리케타이드 및 그들의 합성방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007014999A KR20010071683A (ko) 1998-06-29 1999-06-29 폴리케타이드 및 그들의 합성방법

Country Status (23)

Country Link
US (3) US7148045B1 (ko)
EP (2) EP1091971B1 (ko)
JP (2) JP2002519014A (ko)
KR (2) KR20010071684A (ko)
CN (2) CN1316001A (ko)
AT (2) ATE321137T1 (ko)
AU (2) AU763230B2 (ko)
BR (2) BR9911710A (ko)
CA (2) CA2335523A1 (ko)
CZ (2) CZ20004913A3 (ko)
DE (2) DE69930510T2 (ko)
ES (1) ES2341403T3 (ko)
GB (1) GB9814006D0 (ko)
HK (1) HK1034536A1 (ko)
HU (2) HUP0105179A2 (ko)
ID (2) ID27419A (ko)
IL (2) IL140438A0 (ko)
MX (2) MXPA00012936A (ko)
NZ (2) NZ509600A (ko)
PL (2) PL345575A1 (ko)
TR (2) TR200003770T2 (ko)
WO (2) WO2000000500A2 (ko)
YU (2) YU82500A (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7738015B2 (en) * 1997-10-09 2010-06-15 Fotonation Vision Limited Red-eye filter method and apparatus
US7630006B2 (en) * 1997-10-09 2009-12-08 Fotonation Ireland Limited Detecting red eye filter and apparatus using meta-data
GB9814622D0 (en) * 1998-07-06 1998-09-02 Biotica Tech Ltd Polyketides,their preparation,and materials for use therein
US6458771B1 (en) 1999-04-16 2002-10-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
US6590083B1 (en) 1999-04-16 2003-07-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Ketolide antibacterials
GB9912563D0 (en) * 1999-05-28 1999-07-28 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
US7033818B2 (en) 1999-10-08 2006-04-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant polyketide synthase genes
US6524841B1 (en) 1999-10-08 2003-02-25 Kosan Biosciences, Inc. Recombinant megalomicin biosynthetic genes and uses thereof
DK1278881T3 (da) 2000-04-13 2010-05-10 Biotica Tech Ltd Glycosylerede hybrid-produkter og deres fremstilling og anvendelse
KR101016561B1 (ko) * 2002-02-19 2011-02-22 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 신규한 스피노신 생산 폴리케타이드 신타제
EP1967520A2 (en) 2002-07-16 2008-09-10 Biotica Technology Limited Production of polyketides and other natural products
GB0327720D0 (en) * 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Erythromycins and process for their preparation
GB0327721D0 (en) * 2003-11-28 2003-12-31 Biotica Tech Ltd Polyketides and their synthesis
GB0417852D0 (en) 2004-08-11 2004-09-15 Biotica Tech Ltd Production of polyketides and other natural products
US8569023B2 (en) 2008-03-28 2013-10-29 The Regents Of The University Of California Producing dicarboxylic acids using polyketide synthases
CN102014623A (zh) * 2008-04-29 2011-04-13 加利福尼亚大学董事会 使用聚酮化物合酶制备生物燃料
GB0904540D0 (en) 2009-03-17 2009-04-29 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
US8765431B2 (en) * 2009-07-23 2014-07-01 The Regents Of The University Of Michigan Method for enzymatic production of decarboxylated polyketides and fatty acids
WO2011009938A2 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Universite Henri Poincare Nancy 1 Stambomycin and derivatives, their production and their use as drugs
GB0914589D0 (en) 2009-08-20 2009-09-30 Biotica Tech Ltd Novel compounds and methods for their production
US8852902B2 (en) 2010-11-22 2014-10-07 The Regents Of The University Of California Producing a trimethylpentanoic acid using hybrid polyketide synthases
KR102363621B1 (ko) 2013-04-04 2022-02-25 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 매크롤라이드 그리고 그의 제조방법 및 용도
CN106998685A (zh) 2014-10-08 2017-08-01 哈佛大学的校长及成员们 14‑元酮内酯及其制备和使用方法
JP2018509452A (ja) 2015-03-25 2018-04-05 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 修飾デソサミン糖をもつマクロライドおよびその使用
CN106591388A (zh) * 2016-10-13 2017-04-26 中国农业科学院生物技术研究所 具有聚酮类化合物合成功能的基因Dr2091
EP3585796B1 (en) 2017-02-22 2021-06-16 ISR Immune System Regulation Holding AB (publ) Novel immune stimulating macrolides
JP7100652B2 (ja) 2017-02-22 2022-07-13 アイエスアール イミューン システム レギュレイション ホールディング アクチエボラグ（パブル） 新規免疫刺激マクロライド
CA3064619A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa
EP3768277A1 (en) 2018-03-23 2021-01-27 Isr Immune System Regulation Holding Ab (Publ) Combinations of macrolide compounds and immune checkpoint inhibitors

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141926A (en) * 1990-04-18 1992-08-25 Abbott Laboratories Erythromycin derivatives
JPH09505983A (ja) * 1993-09-20 1997-06-17 ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 新規ポリケチドの組換え産生
US5672491A (en) * 1993-09-20 1997-09-30 The Leland Stanford Junior University Recombinant production of novel polyketides
US5712146A (en) * 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
ATE286133T1 (de) * 1995-07-06 2005-01-15 Univ Leland Stanford Junior Zellfreie synthese von polyketiden
ATE451455T1 (de) * 1996-07-05 2009-12-15 Biotica Tech Ltd Hybridpolyketidesynthase i gen
JPH10303641A (ja) * 1997-04-23 1998-11-13 Mitsubishi Electric Corp 発振器及び無線機
NZ500693A (en) * 1997-04-30 2004-01-30 Kosan Biosciences Inc Combinatorial polyketide libraries produced using a modular PKS gene cluster as scaffold
AP1060A (en) * 1998-01-02 2002-04-23 Pfizer Prod Inc Novel erythromycin derivatives.

Also Published As

Publication number Publication date
ATE321137T1 (de) 2006-04-15
ID27419A (id) 2001-04-05
WO2000000500A2 (en) 2000-01-06
GB9814006D0 (en) 1998-08-26
YU82500A (sh) 2004-03-12
CZ20004913A3 (cs) 2001-11-14
MXPA00012936A (es) 2002-06-21
DE69930510D1 (de) 2006-05-11
YU82700A (sh) 2003-10-31
JP2002519014A (ja) 2002-07-02
MXPA00012885A (es) 2002-07-02
DE69942149D1 (en) 2010-04-29
AU765257B2 (en) 2003-09-11
IL140440A0 (en) 2002-02-10
CA2331764A1 (en) 2000-01-06
HK1034536A1 (en) 2001-10-26
CA2335523A1 (en) 2000-01-06
CZ20004912A3 (cs) 2001-08-15
PL345575A1 (en) 2001-12-17
NZ509600A (en) 2004-03-26
US7148045B1 (en) 2006-12-12
EP1090123B1 (en) 2006-03-22
US7198922B2 (en) 2007-04-03
ID28285A (id) 2001-05-10
ES2341403T3 (es) 2010-06-18
IL140438A0 (en) 2002-02-10
ATE461289T1 (de) 2010-04-15
WO2000000500A3 (en) 2000-03-16
AU4524799A (en) 2000-01-17
AU763230B2 (en) 2003-07-17
CN1316001A (zh) 2001-10-03
PL345578A1 (en) 2001-12-17
CN1315956A (zh) 2001-10-03
TR200003770T2 (tr) 2001-04-20
WO2000000618A3 (en) 2000-04-27
EP1090123A2 (en) 2001-04-11
KR20010071683A (ko) 2001-07-31
JP4489947B2 (ja) 2010-06-23
JP2002519032A (ja) 2002-07-02
HUP0105179A2 (hu) 2002-05-29
BR9911710A (pt) 2001-03-20
AU4524599A (en) 2000-01-17
EP1091971A2 (en) 2001-04-18
WO2000000618A2 (en) 2000-01-06
HUP0102945A2 (hu) 2001-12-28
DE69930510T2 (de) 2006-12-07
CA2331764C (en) 2008-03-11
TR200003771T2 (tr) 2001-10-22
BR9911712A (pt) 2001-03-20
US20050090461A1 (en) 2005-04-28
US20060240528A1 (en) 2006-10-26
EP1091971B1 (en) 2010-03-17
NZ509601A (en) 2004-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010071684A (ko) 폴리케타이드 및 그들의 합성방법
EP0910633B1 (en) Hybrid polyketide synthase I gene
US20010016598A1 (en) Erythromycins and process for their preparation
US7001747B1 (en) Nucleic acid molecules encoding modified polyketide synthases containing polylinkers and uses thereof
US6524841B1 (en) Recombinant megalomicin biosynthetic genes and uses thereof
JP2002516090A (ja) 組換えナルボノライドポリケチドシンターゼ
US6960453B1 (en) Hybrid polyketide synthases combining heterologous loading and extender modules
JP2009213479A (ja) ポリケチド類及びそれらの合成

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid