BR9911898B1 - processos para a produção de uma segunda molécula de ácido nucléico útil para a preparação de policetìdeo sintases, para a produção de um produto de fermentação contendo um policetìdeo, e para a produção de um policetìdeo. - Google Patents

Description

"PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UMA SEGUNDA MOLÉCULADE ÁCIDO NUCLÉICO ÚTIL PARA A PREPARAÇÃO DEPOLICETÍDEO SINTASES, PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DEFERMENTAÇÃO CONTENDO UM POLICETÍDEO, E PARA APRODUÇÃO DE UM POLICETÍDEO".

A presente invenção diz respeito a policetídeos, suapreparação, e materiais para uso neles.

Os policetídeos são uma classe grande e estruturalmentediversa de produtos naturais que incluem muitos compostos possuindoantibióticos ou outras propriedades farmacológicas, tais comoeritromicina, tetraciclinas, rapamicina, avermectina, ionóforos de poliéter,e FK506.

Em particular, os policetídeos são abundantemente produzidospor estreptomicinas e bactérias actinomicetes relacionadas. Elas sãosintetizadas pela condensação por etapa repetida dos aciltioésteres em umamaneira análoga àquela da biossíntese de ácido graxo. A maior diversidadeestrutural observada entre os policetídeos naturais surge da seleção de(geralmente) acetato ou propionato como unidades "iniciadoras" ou"prolongadoras"; e da diferença de grau do processamento do grupo β-cetoobservado após cada condensação. Exemplos de etapas de processamentoincluem a redução de β-hidroxiacil-, redução seguida pela desidratação de 2-enoil-, e redução completa do aciltioéster saturado. O resultado daestereoquímica destas etapas de processamento é também específica paracada ciclo de extensão da cadeia.

A biossíntese de policetídeos é iniciada por um grupo deenzimas de formação de cadeia conhecido como policetídeo sintase (PKSs).Duas classes de policetídeo sintase foram descritas em actinomicetos.Entretanto, os novos policetídeos e processos que são o objeto da presenteinvenção dizem respeito principalmente a PKSs Tipo I, representadas pelasPKSs para a eritromicina macrolídeos, rapamicina e avermectina. As PKSsTipo I contêm uma série ou "módulo diferente de enzimas para cada ciclo deextensão da cadeia de policetídeo (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176-178; Donadio, S. et al. Science (1991) 252:675-679; MacNeil, D. J. et al.Gene (1991) 115:119-125; Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA(1995) 92:7839-7843 e ver por exemplo, a Figura 1 aqui, ou Figuras 2a e 3 daWO 98/01546); visto que as PKSs Tipo II são representadas pela sintase paraos compostos aromáticos e contém apenas uma série única de atividadesenzimáticas para a extensão da cadeia. Estas são reutilizadas comoapropriado em ciclos sucessivos.

Um módulo completo impondo a redução completa contémum domínio da sintase cetoacil-ACP (KS); um domínio de proteína portadorde acila (ACP); um acil-CoA:aciltransferase ACP (AT) para carregamento daunidade prolongadora; e uma cetoreductase (KR), uma desidratase (DH) e umdomínio enoilreductase (ER) para a realização do processamento do grupo β-ceto. Desde que estes domínios tenham atividade enzímica, eles podemtambém ser referidos aqui como "enzimas", embora isto não seja destinadopara envolver qualquer coisa ao redor de sua ligação estrutural a outrosdomínios de PKS. Similarmente, as seqüências de ácido nucleico codificandotais domínios podem também ser referidas como "genes", embora isto nãoseja destinado para envolver qualquer coisa ao redor da presença, ou de outramaneira, de regiões regulatórias separadas para os domínios diferentes deuma PKS.

A presente invenção particularmente diz respeito a processospara a preparação de policetídeos mediante a substituição da alça redutiva (osegmento do final da AT até o começo da ACP compreendendo ou um KR ouum KR e um DH ou um KR, um DH e um ER) em um módulo selecionado deum grupo de gene de policetídeo sintase Tipo I pelo segmento equivalente domesmo ou de um grupo de gene de PKS diferente, ou por um segmentotransformado ou sintético, dessa forma gerando novos policetideos sintasehíbridos que produzem policetideos com extensão diferente de redução e/ouestereoquímica em uma maneira prognosticável.

Para evitar dúvida, o termo "módulo de extensão", comousado em seguida, se refere a uma série de domínios de uma PKS Tipo I,cada um tendo atividade enzimática, que participa em um ciclo de extensãoda cadeia de policetídeo. Mais particularmente, um módulo de extensãocompreende KS, AT, uma alça redutiva (compreendendo um ou mais de KR,DH e ER), e ACP.

Raramente, a alça redutiva pode incluir outros domínios. Porexemplo, yersiniabacter, que possui uma PKS misturada e sintase depolipeptídeo, possui um domínio de transferase de metila.

Foi notificado que a substituição da alça redutiva do módulo 2em DEBSITE com o segmento equivalente do módulo 3 do gene PKSeritromicina (Tipo I) produz uma cetolactona tricetídea quando expressa emS. coelicolor CH999 (Bedford, D. et al. Chemistry and Biology (1996)3:827-831).

Similarmente, a substituição da alça redutiva de módulo 2 emDEBSITE com o segmento equivalente de módulo 5 da PKS eritromicinaproduz uma lactona tricetídea com a estrutura prognosticada e estereoquímicaquando expressa em S. coelicolor CH999 (McDaniel, R. et al. Chemistry andBiology (1997) 4:667-674). Ao contrário, quando a mesma experiência foirealizada usando a alça redutiva de módulo 6 da PKS eritromicina apenasuma cetolactona pode ser isolada (McDaniel, R. et al. Chemistry and Biology(1997)4:667-674).

Em uma outra experiência foi mostrado, que a alça redutiva demódulo 2 em um sistema trimodular compreendendo o domínio de carga, oprimeiro, segundo e terceiro módulo de extensão e o TE do gene ery podetambém ser substituído pelo segmento equivalente de módulo 4 da PKSrapamicina compreendendo um domínio KR e DH produzindo umatetracetina com a ligação dupla prognosticada quando expressa em S.coelicolor CH999 (McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soe. (1997) 119:4309-4310). No mesmo sistema a alça redutiva de módulo 2 foi substituída pelosegmento equivalente de módulo 1 da PKS rapamicina compreendendo umdomínio KR, um DH e um ER produzindo uma tetracetina com o nível deoxidação prognosticado em C-5 quando expresso em S. coelicolor CH999(Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soe. (1997) 119:11339-11340). Ao contrário,quando se usa o segmento correspondente de módulo 4 do gene PKSeritromicina apenas um policetídeo com uma ligação dupla na posiçãopertinente pode ser observada e não, como alguém prognosticaria, reduçãototal (Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soe. (1997) 119:11339-11340).

Em duas experiências similares a alça redutiva de módulo 2 nosistema trimodular foi substituída pelo segmento correspondente de módulo 2da PKS rapamicina contendo um domínio KR e um DH inativo e pelodomínio KR de módulo 4 da PKS rap (a alça redutiva do módulo rap 4contém um domínio KR e um DH). Ambas as construções são apresentadaspara produzir uma lactona tricetídea com uma estereoquímica diferente em C-3 (Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soe. (1998) 120:2478-2479).

Em todos os exemplos descritos acima os mesmos sítios derestrição, PstI e XbaI, foram usados para juntar os fragmentos de DNA (alocalização do sítio PstI é idêntica ao sítio PstI usado no sistema descritoabaixo e o sítio XbaI está no mesmo lugar como o sítio Bsy36I).

Um modelo foi proposto para a estrutura da sintase DEB, ondeos domínios redutivos formam uma alça que se situa do lado de fora donúcleo formado pelos domínios KS, AT e o ACP (Staunton et al. NatureStructural Biology (1996) 3:188-192). Além disso, foi observado que DEBSlé hidrolisado por enzimas proteolíticas em localizações específicas quemarcam os limites dos domínios (Aparicio, J. F. et al. J. Biol. Chem. (1994)269: 8524-8528). Estes sítios proteolíticos são observados principalmente emregiões articuladoras e parece portanto ideal para juntar os fragmento nacercania próxima destes sítios. Exemplos destes são documentados em WO98/01546.

Em um aspecto a invenção fornece ácido nucleico(particularmente DNA) codificando pelo menos parte de um policetídeosintase Tipo I (PKS), dita parte compreendendo pelo menos parte de ummódulo de extensão, em que o ácido nucleico tem um poli-ligante com sítiosmúltiplos de enzima de restrição no lugar de uma ou mais genes codificandoas enzimas associadas com a redução.

Em outro aspecto a invenção fornece ácido nucleico(particularmente DNA) codificando pelo menos parte de um policetídeosintase Tipo I, dita parte compreendendo pelo menos parte de um módulo deextensão, em que o ácido nucleico tem um poli-ligante com sítios múltiplosde enzima de restrição que faz conexão do ácido nucleico codificando (pelomenos parte) AT com o ácido nucleico codificando (pelo menos parte) ACP.

Tais ácidos nucleicos podem ter um ácido nucleico adicional,que codifica uma ou mais enzimas redutivas, inserido no poli-ligante comodescrito com mais detalhe abaixo. Tal inserção é preferivelmente executadoseguinte a digestão dos ácido nucleicos contendo poli-ligante por duasenzimas de restrição. De modo a fornecer uma seleção dos sítios de inserção,o poli-ligante preferivelmente inclui pelo menos três sítios de restrição, maispreferivelmente pelo menos quatro, e mais preferivelmente pelo menos seisou oito sítios de restrição.

O poli-ligante pode ser fornecido pela introdução de ácidonucleico exagenoso (geralmente sintético) no ácido nucleico codificandoPKS Tipo I, ou pode ser fornecido mediante o planejamento da seqüência queexiste do ácido nucleico codificando PKS Tipo I. Por exemplo, para alcançara este, os sítios de restrição podem ser planejados (por exemplo, pormutagênese direcionado no sítio) em seqüências a montante e/ou a jusante(preferivelmente ambos) de onde a seqüência de codificação da enzimaredutiva ausente normalmente ficaria, particularmente nas seqüências quecodificam os articuladores de polipeptídeo entre a(s) enzima(s) redutiva(s) edomínios adjacentes.

O poli-ligante desejavelmente inclui pelo menos alguns dosseguintes sítios de restrição: AvrII; BglII; SnaBI; PstI; SpeI; NsiI; Bsu361;NheI; e HpaI. Mais desejavelmente o poli-ligante inclui pelo menos quatrodestes sítios.

Preferivelmente pelo menos alguns dos sítios de restriçãoincluídos no poli-ligante são ausentes do resto do ácido nucleico em que ele éincorporado. Desejavelmente pelo menos alguns dos sítios incluídos no poli-ligante são raros ou ausentes nas seqüências do ácido nucleico de ocorrêncianatural que codificam as enzimas redutivas de outras PKSs (preferivelmenteTipo I). Desejavelmente, pelo menos dois dos sítios estão ausentes de pelomenos cerca da metade, mais desejavelmente pelo menos cerca de trêsquartos, de enzimas redutivas codificando seqüências de ácido nucleicoconhecidas de PKSs. Preferivelmente os sítios de restrição são ricos emresíduos AeT, uma vez que os genes PKS tendem a ser ricos emresíduos G e C.

Desejavelmente os ácidos nucleicos da invenção codificam ummódulo de carga e/ou um ou mais módulos de extensão. Variedades comreferência a mais detalhes de módulos de carga podem ser observadas emnosso pedido de patente internacional co-pendente, intitulado "Polyketidesand their synthesis" depositado em 29 de junho de 1999.

Em um outro aspecto a invenção fornece ácido nucleicogeralmente como indicado acima, mas tendo outro ácido nucleico codificandouma ou mais enzimas redutivas (por exemplo, KR e/ou DH e/ou ER) inseridono poli-ligante. O ácido nucleico inserido pode codificar uma ou maisenzimas redutivas do mesmo policetídeo sintase como aquela do ácidonucleico em que o poli-ligante é inserido, mas de um módulo de extensãodiferente. Alternativamente, o ácido nucleico inserido pode ser exagenoso,codificando uma ou mais enzimas redutivas de uma PKS natural diferente ousintase de ácido graxo, ou pode ser sintético ou pode ser transformado a partirde um ácido nucleico de ocorrência natural que codifica uma ou maisenzimas redutivas de uma PKS ou sintase de ácido graxo. Preferivelmente, oácido nucleico inserido codifica uma ou mais enzimas redutivas da mesma oude outra PKS Tipo I ou sintase de ácido graxo, mas alternativamente podecodificar uma ou mais enzimas redutivas de uma PKS Tipo II ou sintase deácido graxo.

Os genes codificando numerosos exemplos de PKSs Tipo Iforam sequenciados e estas seqüências apresentadas no DNA publicamentedisponível e dados de base da seqüência da proteína incluindo Genbank,EMBL e Swissprot. Por exemplo, as seqüências estão disponíveis para asPKSs que governam a síntese de, respectivamente, eritromicina (Cortes, J. etal. Nature (1990) 348:176-178; número de acesso X62569, Donadio, S. et al.Science (1991) 252:675-679; número de acesso M63677); rapamicina(Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1995) 92:7839-7843;número de acesso X86780); rifamicina (August et al. (1998); número deacesso AF40570); e tilosina (Eli Lily, número de acesso U78289), entreoutros. Além disso, a figura 7 aqui mostra a seqüência de ácido nucleicocodificando os dois primeiros módulos da PKS avermectina da S. avermitilis;isto pode ser usado como uma fonte alternativa para os suplementos usadosem alguns dos exemplos.

É evidente para aqueles habilitados na técnica que a seqüênciatotal similarmente entre os ácidos nucleicos codificando os domínioscomparáveis ou módulos de PKSs Tipo I diferentes é suficientementeelevada, e a organização do domínio de diferentes PKSs Tipo I assimconsistente entre os microorganismos de produção de policetídeo diferente,em que os processos para se obter novos policetídeos híbridos descritos napresente invenção serão geralmente aplicáveis a todas as PKSs Tipo Imodulares naturais ou seus derivados.

Em outros aspectos, a presente invenção fornece vetores, taiscomo plasmídeos ou fagos (preferivelmente plasmídeos), incluindo ácidosnucleicos como definidos nos aspectos acima e células hospedeiras(particularmente da espécie Streptomyces) transfectadas com tais ácidosnucleicos ou construções.

Em mais um outro aspecto, a presente invenção fornecepolicetídeos sintases expressamente por células hospedeiras como definidoacima. Tais policetídeos sintases podem se desejado ser isoladas a partir dascélulas hospedeiras por processos rotineiros, embora é geralmente preferívelnão faze-lo.

Em outros aspectos a invenção fornece processos de criaçãode novas PKSs funcionais e ácidos nucleicos codificando-as por meio deinserção de ácido nucleico codificando enzimas redutivas em poli-ligantescomo indicado acima; e de novos policetídeos quando produzidos por taisPKS s.

Em mais um outro aspecto, a presente invenção fornece novosprocessos para a produção específica ou preferencial de policetídeosparticulares, usando os materiais e processos como definido nos aspectosanteriores. Por exemplo, a presente invenção fornece processos para ageração por fermentação direta de desidroavermectinas C22-C23, tais comoivermectina (ver por exemplo, os Exemplos 25 e 26), e de avermectina Blsubstancialmente livre de avermectinas B2 (ver por exemplo, os Exemplos 27e 28).

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece novospolicetídeos e novos estereoisômeros de policetídeos, tais como policetídeosparticulares produzidos de acordo com um ou mais dos Exemplos.

De modo a permitir a troca da alça redutiva no módulo 2 dogene PKS eritromicina no sistema DEBSITE (Cortes J. et al. (1995)268:1487-1489) um poli-ligante (sítio de clonagem múltipla (mcs)) foiinserido no lugar da alça redutiva de módulo 2, dessa forma gerando ummódulo mínimo compreendendo um KS, um AT e um ACP. (Este sistema éainda funcional e produzo uma cetolactona (ver exemplos 2 e 4)) O mcscontém sítios de reconhecimento únicos para 9 enzimas de restrição.

Estes novos sítios de restrição estão situados parcialmente noDNA codificando uma região articuladora próxima as posições onde opolicetídeo sintase é hidrolisado por enzimas proteolíticas (vide supra).Enquanto alguns dos sítios de restrição se situam nas regiões de codificaçãodo DNA de baixa homologia, outros estão situados nas regiões altamenteconservadas de codificação do DNA (Figura 1). A introdução de sítios dereconhecimento para as enzimas AvrII, BglII, Bsu36I e NheI não muda aseqüência do aminoácido no módulo DEBS 2. Nos outros cinco casos(SnaBI, PstI, SpeI5 Nsi5 HpaI) a seqüência de aminoácido é mudada (Figura2). Estas mudanças não afetam a atividade da proteína (ver exemplo 6).

Porque dois dos sítios de restrição cobrem as mesmas bases,foi decidido construir dois plasmídeos contendo mcs diferente (pJLK114 eρ JLKl 17).

O uso de um mcs oferece as seguintes vantagens sobre umsítio único de restrição em cada lado da alça redutiva:

1) posições adequadas para juntar os fragmentos de DNA (20combinações diferentes) podem ser selecionados para cada alça redutivadiferente, dessa forma evitando mudanças desfavoráveis na seqüência deaminoácido.

2) enzimas que se dividem dentro da alça podem serevitadas; e

3) a inserção da alça pode ser executada em uma maneiracombinatória.

Os presentes inventores fizeram outra surpreendentedescoberta em que resultados diferentes podem ser obtidos usando o mesmoácido nucleico contendo poli-ligante e o mesmo ácido nucleico codificandouma ou mais enzimas redutivas, quando o ácido nucleico codificando uma oumais enzimas redutivas for incorporado em sítios diferentes no poli-ligante.

Por exemplo, nos Exemplos 7 e 8, a alça redutiva do módulo rapamicina 13foi inserida no módulo ery 2 para efetuar a redução completa da cadeia depolicetídeo como o resultado do segundo módulo de extensão. Os produtosde lactona tricetida desejados foram obtidos com bom rendimento. Noentanto, nos Exemplos 37 e 38, a mesma alça redutiva, ou série de domínios,do módulo rap 13 foi inserido em essencialmente a mesma posição nomódulo ery 2 como nos exemplos 7 e 8, exceto que sítios de restriçãodiferentes do poli-ligante foram usados (AvrII e HpaI no lugar de BglII eNsiI) e quantidades significativas de subprodutos foram obtidos. Taissubprodutos incluíram lactonas tricetídeas em que C-3 foi ou ceto ou hidróxi,mostrando que simplesmente alterando os sítios usados para trocar a alçaredutiva faz diferença entre obter o produto desejado e obter uma misturaindesejável do produto desejado com os produtos da redução incompleta.

Similarmente, nos Exemplos 31 e 32, quando os sítios PstI eBsu36I foram usados para inserir os domínios redutivos do móduloavermectina 1 (plasmídeo pGMS2) no lugar da alça redutiva do módulo ery2, o produto esperado foi produzido, mas também uma quantidade substancialde cetolactona. Na experiência dos Exemplos 29 e 30, quando os sítios BglIIe NheI foram usados (plasmídeo pJLK30) dificilmente qualquer subprodutode cetolactona foi produzido, embora as quantidade de lactona estiveram emuma faixa similar em cada caso.Quando, totalmente de forma análoga aos Exemplos 29 e 30,no Exemplo 14 os mesmos sítios BglII e NheI foram usados para substituir aalça redutiva do módulo ery 2 com a alça redutiva do módulo tilosina 1(plasmídeo pJLK35), as mesmas lactonas tricetidas objetos foram produzidascomo nos Exemplos 30 e 32, mas com rendimento muito mais elevado,embora acompanhadas de alguma cetolactona, demonstrando que alçasredutivas diferentes podem ser mais vantajosamente inseridas em diferentessítios de restrição.

Nos Exemplos 33 e 34, quando os sítios BglII e NheI foramusados para inserir os domínios redutivos de módulo avermectina 2(plasmídeo pJLK31) os produtos esperados foram produzidos como osprodutos principais. Na experiência dos Exemplos 35 e 36, quando os sítiosSnaBI e Bsu36I foram usados (plasmídeo pGMS4) apenas quantidades detraço de uma mistura de lactona tricetida pode ser obtido.

Assim, a presente invenção fornece a oportunidade, osprodutos desejados e prognosticados não devem ser obtidos quando uma alçaredutiva particular for inserida em um PKS particular, de simples ajuste dosítio de inserção mediante o uso de enzimas de restrição diferentes tendosítios no poli-ligante. Como demonstrado pelos exemplos comparativosacima, tal reajuste pode dramaticamente afetar o resultado e rendimento dasíntese de policetídeo.

EXEMPLO 1

Construção do plasmídeo pJLK114

O plasmídeo pJLK114 é um plasmídeo com base pCJR24contendo um gene PKS compreendendo o módulo de carga ery, o primeiro eo segundo módulos de extensão da PKS ery e a tioesterase terminando nacadeia ery exceto que o segmento de DNA entre o final da aciltransferase e ocomeço do ACP do segundo módulo de extensão ery foi substituído por umarticulador de oligonucleotídeo sintético contendo os sítios dereconhecimento das seguintes enzimas de restrição: AvrII, BglII, SnaBI, PstI,SpeI, NsiI, Bsu36I e HpaI. Foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue (Figura 3).

Construção do plasmídeo pJLK02

O fragmento de DNA de aproximadamente 1,47 kbp do geneeryAI de S. erythraea foi amplificado por PCR usando como iniciadores osoligonucleotídeos sintéticos:

5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' e 5 '-ATGTT AACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3' eplasmídeo pNTEP2 (Oliynyk, M. et al., Chemistry and Biology (1996) 3:833-839; WO 98/01546) como modelo. O produto PCR foi tratado compolinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foilinearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK02 desejado foi identificado por seu padrão derestrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK02

O fragmento de DNA de aproximadamente 1,12 kbp do geneeryAI de S. erythraea foi amplificado por PCR usando como iniciadores osoligonucleotídeos sintéticos:

5 '-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3' e5'-CTTCTAG ACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3' e

plasmídeo pNTEPH como modelo. O produto PCR foi tratado compolinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foilinearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK03 desejado foi identificado por seu padrão derestrição e seqüência de DNA.

Construção de plasmídeo pJLK04

O plasmídeo pJLK02 foi digerido com PstI e HpaI e o 1,47kbp inserido foi ligado com o plasmídeo pJLK03 que foi digerido com PstI eHpaI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK04 desejado foi identificado por seu padrão derestrição.

Construção de plasmídeo pJLK05

O plasmídeo pJLKOl (PCT/GB97/01819) foi digerido comPstI e AvrII e o 460 bp inserido foi ligado com o plasmídeo pJLK04 que foidigerido com PstI e AvrII. A mistura de ligação foi usada para transformarcélulas E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foramverificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK05 desejado foiidentificado por seu padrão de restrição.

Construção de plasmídeo pJLK07

O plasmídeo pJLK05 foi digerido com ScaI e XbaI e oplasmídeo pNTEP2 foi digerido com NdeI e ScaI e estes dois fragmentosforam ligados com o plasmídeo pCJR24 que foi digerido com NdeI e XbaI. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DH10Beletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK07 desejado foi identificado por seu padrão derestrição.

Construção de plasmídeo pJLK114

Os dois oligonucleotídeos sintéticos plf e plb (Figura 4) foracada um dissolvido em tampão TE. 10 μΐ de cada solução (0,5 nmol/μΐ) forammisturadas e aquecidas por 2 minutos a 65°C e então lentamente esfriadaspara baixo da temperatura ambiente. O plasmídeo pJLK07 foi digerido comAvrII e HpaI e ligado com os oligonucleotídeos recozidos. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pJLKl 14 desejado foi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 2

Uso do plasmídeo pJLKl 14 para a construção de S. erythraea JC2/pJLKl 14 ea produção de derivados TKL.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK114 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 (cepa depositada como No.NCIMB 40802. WO 98/01546) e colônias resistentes thiostrepton estáveisforam isoladas. De várias colônias o total de DNA foi obtido e analisado porhibridização Southern blot, para confirmar que o plasmídeo tem se integradono gene TE. O JC2/pJLK114 foi chapeado em agar SM3 (5,0 g de glicose,50,0 g de maltodextrina MD30E, 25,0 g de farinha de soja Arkasoy, 3,0 g demelaço (beterraba), 0,25 g de K2HPO4, 2,5 g de CaCO3, 22,0 g de agardestilada em água para 1 litro pH = 7,0) contendo 50 μg/ml de thiostrepton edeixado cultivar por doze dias em 30°C. 1 cm3 (500 μΐ) da placa foihomogeneizada e extraída com uma mistura de 1,2 ml de acetato de etila e 20μl de ácido fórmico. O solvente foi decantado e removido por evaporação e oresíduo dissolvido em metanol e analisado por espectroscopia de massaGC/MS e eletropulverização. Os produtos principais foram identificadoscomo ácido-5-lactona (4S, 5R)-5-hidróxi-2,4-dimetil-3-oxo-n-hexanóico ecomo ácido-ô-lactona (4S, 5R)-5-hidróxi-2,4-dimetil-3-oxo-n-heptanóico.

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EXEMPLO 3

Construção do plasmídeo pJLK117

O plasmídeo pJLK117 é um plasmídeo com base pCJR24contendo um gene PKS compreendendo o módulo de carga ery, o primeiro eo segundo módulos de extensão da PKS ery e a tioesterase terminando nacadeia ery exceto que o segmento de DNA entre o final da aciltransferase e ocomeço do ACP do segundo módulo de extensão ery foi substituído por umarticulador de oligonucleotídeo sintético contendo os sítios dereconhecimento das seguintes enzimas de restrição: AvrII, BglII, SnaBI, PstI5SpeI, NsiI, Bsu36I e NheI.

Foi construído através de vários plasmídeos intermediárioscomo se segue (Figura 3).

Construção do plasmídeo ρJLKl 15

O plasmídeo ρJLKl 14 foi digerido com NdeI e XbaI e oinserido de aproximadamente 1,47 kbp foi ligado com o plasmídeo pUC18que foi digerido com NdeI e XbaI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLKl 15 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

Construção de plasmídeo pJLKlló

O plasmídeo pJLK13 (PCT/GB97/01819) foi digerido comBsu36I e XbaI e o fragmento de 1,1 kbp foi ligado com o plasmídeopJLKl 15 que foi digerido com Bsu36I e XbaI. A mistura de ligação foi usadapara transformar células E. coli DH10B eletrocompetentes e colôniasindividuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeopJLKl 16 desejado foi identificado por seu padrão de restrição.

Construção de plasmídeo pJLK117

O plasmídeo pJLKlló foi digerido com NdeI e XbaI e ofragmento de 9,9 kbp foi ligado com o plasmídeo pCJR24 que foi digeridocom NdeI e XbaI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DH10B eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK117 desejado foi identificado porseu padrão de restrição.

EXEMPLO 4

Uso do plasmídeo pJLKl 17 para a construção de S. erythraea JC2/pJLKl 17 ea produção de derivados TKL.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK117 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no gene TE. O JC2/pJLK117 foi chapeado emagar SM3 contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12dias em 3O0C. 1 cm2 (0,5 ml) da placa foi homogeneizada e extraída com umamistura de 1,2 ml de acetato de etila e 20 μΐ de ácido fórmico. O solvente foidecantado e removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Osprodutos principais foram identificados como ácido-ô-lactona (4S, 5R)-5-hidróxi-2,4-dimetil-3-oxo-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (4S, 5R)-5-hidróxi-2,4-dimetil-3-oxo-n-heptanóico.

<formula>formula see original document page 17</formula>

EXEMPLO 5

Construção do plasmídeo pJLK25

O plasmídeo pJLK25 é um plasmídeo com base pJLK114exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva do segundomódulo do gene eritromicina PKS foi inserido no mcs.

Foi construído através de vários plasmídeos intermediárioscomo se segue.

Construção do plasmídeo pJLK118O fragmento de DNA de aproximadamente 1,4 kbp do geneeryAI de S. erythraea codificando a alça redutiva de módulo 2 foi amplificadopor PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeos sintéticos:

5'-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-3' e5'-TAATGC ATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-3' e

pNTEP2 como modelo. O produto PCR foi tratado com polinucleotídeocinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado peladigestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pJLK118 desejado foi identificado por seu padrão de restrição eseqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK23

O plasmídeo pJLK118 foi digerido com SpeI e NsiI e ofragmento de 1,4 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 15 que foi digeridocom SpeI e NsiI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK23 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

Construção de plasmídeo pJLK25

O plasmídeo pJLK23 foi digerido com NdeI e XbaI e ofragmento de aproximadamente 11,2 kbp foi ligado com o plasmídeo pCJR24que foi digerido com NdeI e XbaI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK25 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 6

Uso do plasmídeo PJLK25 para a construção de S. erythraea JC2/pJLK25 e aprodução de tricetídeos.Aproximadamente 5 de plasmídeo pJLK25 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no gene TE. O JC2/pJLK25 foi chapeado em agarSM3 contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 diasem 30°C. 1 cm2 (0,5 ml) da placa foi homogeneizada e extraída com umamistura de 1,2 ml de acetato de etila e 20 μΐ de ácido fórmico. O solvente foidecantado e removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Osprodutos principais foram identificados (por comparação com o materialautêntico) como ácido-ô-lactona (2R, 3S, 4S, 5R)-5,3-hidróxi-2,4-dimetil-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 3S, 4S, 5R)-5,3-hidróxi-2,4-dimetil-n-heptanóico.

<formula>formula see original document page 19</formula>

15 EXEMPLO 7

Construção do plasmídeo pJLK28

O plasmídeo pJLK28 é um plasmídeo com base pJLK117exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva do módulo 13 dorap PKS foi inserido no mcs. Foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue. (Figura 5)Construção do plasmídeo pJLK120

O fragmento de DNA de aproximadamente 3,2 kbp do generapC de S. hygroscopicus codificando a alça redutiva de módulo 13 foiamplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:5'-TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-3' e5 '-TAATGC ATCGACCTCGTTGCGTGCCGCGGT-3' ecosmídeo cos 31 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA92:7839-7843) como modelo. O produto PCR foi tratado compolinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foilinearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK120 desejado foi identificado por seu padrão derestrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK28

O plasmídeo pJLK120 foi digerido com BglII e NsiI e ofragmento de 3,2 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 17 que foi digeridocom BglII e NsiI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK28 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 8

Uso do plasmídeo PJLK28 para a construção de JC2/pJLK28 e a produção detricetídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK28 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O JC2/pJLK28 foi chapeado em agar SM3contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 dias em30°C. 1 cm2 (0,5 ml) da placa foi homogeneizada e extraída com uma misturade 1,2 ml de acetato de etila e 20 μΐ de ácido fórmico. O solvente foidecantado e removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Osprodutos principais foram identificados (por comparação com o materialautêntico) como ácido-Ô-lactona (2R, 4S, 5R)-2,4-dimetil-5-hidróxi-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 4S, 5R)-2,4-dimetil-5-hidróxi-n-heptanóico.

<formula>formula see original document page 21</formula>

EXEMPLO 9

Construção do plasmídeo pJLK41

O plasmídeo pJLK41 é um plasmídeo com base pJLK117exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva do módulo 4 doery PKS foi inserido no mcs. Foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue. (Figura 5)Construção do plasmídeo pJLK32.3

O segmento de DNA de aproximadamente 3,2 kbp do geneeryAII de S. erythraea codificando a alça redutiva de módulo 4 foiamplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:

5 '-ATAGATCTGCCTACCCGTTCGAACACCAGCGTTC-3'e 5 '-ATCCTC AGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGC AGCTT-3' e cosmídeo cos4B (cosmídeo contendo a eritromicinaPKS) como modelo. O produto PCR foi tratado com polinucleotídeo cinaseT4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado pela digestãocom SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura de ligação foiusada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colôniasindividuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeopJLK32 desejado foi identificado por seu padrão de restrição e seqüência deDNA.Construção do plasmídeo pJLK38

O plasmídeo pJLK32.3 foi digerido com BglII e Bsu36I e ofragmento de 3,2 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 16 que foi digeridocom BglII e Bsu36I. A mistura de ligação foi usada para transformar célulasE. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadaspor seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK38 desejado foi identificado porseu padrão de restrição.

Construção do plasmídeo pJLK41

O plasmídeo pJLK38 foi digerido com BdeI e XbaI e ofragmento de aproximadamente 13 kbp foi ligado com o plasmídeo pCJR24que foi digerido com BdeI e XbaI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK41 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 10

Uso do plasmídeo PJLK41 para a construção de JC2/pJLK41 e a produção detricetídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK41 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O JC2/pJLK41 foi chapeado em agar SM3contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 dias em3O0C. 1 cm2 (0,5 ml) da placa foi homogeneizada e extraída com uma misturade 1,2 ml de acetato de etila e 20 μΐ de ácido fórmico. O solvente foidecantado e removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Osprodutos principais foram identificados (por comparação com o materialautêntico) como ácido-ô-lactona (2R, 4S, 5R)-2,4-dimetil-5-hidróxi-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 4S, 5R)-2,4-dimetil-5-hidróxi-n-heptanóico.

<formula>formula see original document page 23</formula>

EXEMPLO 11

Construção do plasmídeo pJLK29

O plasmídeo pJLK29 é um plasmídeo com base pJLK117exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva do módulo 10 dorap PKS foi inserido no mcs. Foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue. (Figura 5)

Construção do plasmídeo ρJLKl 21.1

O segmento de DNA de aproximadamente 2,2 kbp do generapB de S. hygroscopicus codificando a alça redutiva de módulo 10 foiamplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:

5 '-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' e 5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3' e como modeloum fragmento de aproximadamente 7 kbp, que foi obtido pela digestão decosmídeo cos 26 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA92:7839-7843) com ScaI e SphI. O produto PCR foi tratado compolinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foilinearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK121.1 desejado foi identificado por seu padrãode restrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK29

O plasmídeo ρJLK121.1 foi digerido com BglII e NheI e ofragmento de 2,2 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLKl 17 que foi digeridocom BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK29 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 12

Uso do plasmídeo pJLK29 para a construção de S. erythraea JC2/pJLK29 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK29 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O JC2/pJLK29 foi usado para inocular 30ml do meio SM3 contendo 5 μg/ml de thiostrepton em um frasco de 250 mlcom uma fonte única para reduzir a formação de grumos, agitado em 300 rpme em 30°C. Após 8 dias o caldo foi centrifugado, o sobrenadante ajustadopara pH 3 e extraído três vezes com um volume igual de acetato de etila. Osolvente foi removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa HPLC e eletropulverização e, apósconversão para o éster metílico com trimetilsilila-diazometano por GC/MS.

Os produtos principais foram identificados (por comparação com o materialautêntico) como ácido (4S, 5R)-5-hidróxi-2,4-dimetil-n-hex-2-enóico e comoácido (4S, 5R)-5-hidróxi-2,4-dimetil-n-hept-2-enóico.

EXEMPLO 13

Construção do plasmídeo pJLK35

O plasmídeo pJLK35 é um plasmídeo com base pJLK117exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva do módulo 1 datilosina PKS foi inserido no mcs. Foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue. (Figura 5)Construção do plasmídeo pJLK33.1

O segmento de DNA de aproximadamente 1,6 kbp do genetilosina PKS de S. fradiae codificando a alça redutiva de módulo 1 foiamplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:

5 '-TAAGATCTCCCTACCCCTTCAACCAC-3' e 5'-GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-3' e cosmídeo 6T (cosmídeocontendo os genes PKS produzindo tilosina) como modelo. O produto PCRfoi tratado com polinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeopUC18, que foi linearizado pela digestão com SmaI e depois tratado comfosfatase alcalina. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK33.1 desejado foi identificado porseu padrão de restrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK35

O plasmídeo pJLK33.1 foi digerido com BglII e NheI e ofragmento de 1,6 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 17 que foi digeridocom BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK35 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 14

Uso do plasmídeo pJLK35 para a construção de S. erythraea JC2/pJLK35 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK35 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmideo tem se integrado no TE. O JC2/pJLK35 foi chapeado em agar SM3contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 dias em30°C. 1 cm2 (0,5 ml) da placa foi homogeneizada e extraída com uma misturade 1,2 ml de acetato de etila e 20 μΐ de ácido fórmico. O solvente foidecantado e removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Osprodutos principais foram identificados (por comparação com o materialautêntico) como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-heptanóico.

<formula>formula see original document page 26</formula>

EXEMPLO 15

Construção do plasmideo pRIF7

O plasmideo pRIF7 é um plasmideo com base pJLK117exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva do módulo 7 darifamicina PKS foi inserido no mcs. Foi construído através de váriosplasmídeos intermediários como se segue. (Figura 5)

Construção do plasmideo pUCRIF7

O segmento de DNA de aproximadamente 2,1 kbp do generifamicina PKS de Amycolatopsis mediterranei codificando a alça redutiva demódulo 7 foi amplificado por PCR usando como iniciadores osoligonucleotídeos sintéticos:

5 '-CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-3' e 5'-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT-3' e cosmídeo 6(cosmídeo partindo em 35727 e indo além de 76199, números de acordo como número de acesso AF040570) como modelo. O produto PCR foi tratadocom polinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, quefoi linearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatasealcalina. A mistura de ligação foi usada para transformar células E. coliDHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seuteor de plasmídeo. O plasmídeo pUCRIF7 desejado foi identificado por seupadrão de restrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pRIF7

O plasmídeo pUCRIF7 foi digerido com SnaBI e NheI e ofragmento de 2,1 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLK117 que foi digeridocom SnaBI e NheI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pRIF7 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 16

Uso do plasmídeo pRIF7 para a construção de S. erythraea JC2/pRIF7 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pRIF7 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O JC2/pRIF7 foi chapeado em agar SM3contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 dias em30°C. 1 cm2 da placa foi homogeneizada e extraída com uma mistura de 1,2ml de acetato de etila e 20 μΐ de ácido fórmico. O solvente foi decantado eremovido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol e analisado porespectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Os produtos principaisforam identificados (por comparação com o material autêntico) como ácido-δ-Iactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-hexanóico e comoácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-heptanóico.

<formula>formula see original document page 28</formula>

EXEMPLO 17

Construção do plasmídeo pJLK52

O plasmídeo pJLK52 é um plasmídeo com base em pJLK35contendo um gene PKS compreendendo o módulo de carga ery, o primeiro, osegundo e o terceiro módulos de extensão do grupo ery e o tioesteraseterminando na cadeia ery exceto que o segmento de DNA entre o final daaciltransferase e o começo da ACP do segundo módulo de extensão ery foisubstituído pelo segmento equivalente de módulo 1 da tilosina PKS.

Foi construído através de vários plasmídeos intermediárioscomo se segue.

Construção do plasmídeo pJLK50

O segmento de DNA de aproximadamente 6,1 kbp do grupode gene eritromicina PKS de S. erythraea codificando o fragmento de DNAdo começo da ACP de módulo 2 até o começo da ACP de módulo 3 foiamplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:

5'-TACCTG AGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' e 5 '-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3' eplasmídeo pBAM25 como modelo. O produto PCR foi tratado compolinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foilinearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK50 desejado foi identificado por seu padrão derestrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK52

O plasmídeo pJLK50 foi digerido com NheI e o 6,1 kbpinserido foi ligado com o plasmídeo pJLK35 que foi digerido com NheI. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK52 desejado foi identificado por seu padrão derestrição.

EXEMPLO 18

Uso do plasmídeo pJLK52 para a construção de S. erythraeaNRRL2338/pJLK52 e a produção de tetracetídeos e macrolídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK52 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea NRRL2338 e as colôniasresistentes thiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total deDNA foi obtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmarque o plasmídeo tem se integrado no TE.

S. erythraea NRRL2338/pJLK52 foi usado para inocular omeio SM3 contendo 5 μΐ/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se porsete a doze dias em 28 a 30°C. Após este tempo o caldo foi centrifugado e opH do sobrenadante ajustado para pH = 9,5. O sobrenadante foi entãoextraído três vezes com um volume igual de acetato de etila e o solvente foiremovido por evaporação. O resíduo foi dissolvido em metano e analisadopor GC/MS, por HLPC/MS e MS-MS. Tetracetídeos foram identificados porGC/MS. Os componentes principais foramMS e IH-NMR (foi acompanhado por produtos de processamento incompletopor enzimas pós-PKS).

EXEMPLO 19

Construção do plasmídeo pJLK53

O plasmídeo pJLK53 é um plasmídeo com base em pJLK28contendo um gene PKS compreendendo o módulo de carga ery, o primeiro, osegundo e o terceiro módulos de extensão do grupo ery e o tioesteraseterminando na cadeia ery exceto que o segmento de DNA entre o final daaciltransferase e o começo da ACP do segundo módulo de extensão ery foisubstituído pelo segmento equivalente de módulo 13 da rapamicina PKS. Foiconstruído como se segue.

O plasmídeo pJLK50 foi digerido com NheI e o 6,1 kbpinserido foi ligado com o plasmídeo pJLK28 que foi digerido com NheI. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK53 desejado foi identificado por seu padrão derestrição.

EXEMPLO 20

Uso do plasmídeo pJLK53 para a construção de S. erythraeaNRRL2338/pJLK53 e a produção de derivados de TKL.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK53 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea NRRL2338 e as colôniasresistentes thiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total deDNA foi obtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmarque o plasmídeo tem se integrado no TE.

S. erythraea NRRL2338/pJLK53 foi usado para inocular omeio SM3 contendo 5 μΐ/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se porsete a dez dias em 28 a 30°C. Após este tempo o caldo foi centrifugado e opH do sobrenadante ajustado para pH = 9,5. O sobrenadante foi entãoextraído três vezes com um volume igual de acetato de etila e o solvente foiremovido por evaporação. O resíduo foi dissolvido em metano e analisadopor GC/MS, por HLPC/MS e MS-MS. Tetracetídeos foram identificados porGC/MS. O componente principal foi

<formula>formula see original document page 31</formula>

MS e IH-NMR (foi acompanhado por produtos de processamento incompletopor enzimas pós-PKS).

<formula>formula see original document page 31</formula>EXEMPLO 21

Construção do plasmídeo pJLK54

O plasmídeo pJLK54 é um plasmídeo com base em pJLK29contendo um gene PKS compreendendo o módulo de carga ery, o primeiro, osegundo e o terceiro módulos de extensão do grupo ery e o tioesteraseterminando na cadeia ery exceto que o segmento de DNA entre o final daaciltransferase e o começo da ACP do segundo módulo de extensão ery foisubstituído pelo segmento equivalente de módulo 10 da rapamicina PKS.

Foi construído como se segue.

O plasmídeo pJLK50 foi digerido com NheI e o 6,1 kbpinserido foi ligado com o plasmídeo pJLK29 que foi digerido com NheI. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DH10Beletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pJLK54 desejado foi identificado por seu padrão derestrição.

EXEMPLO 22

Uso do plasmídeo pJLK54 para a construção de S. erythraeaNRRL2338/pJLK54 e a produção de derivados de tetracetídeos emacrolídeos.

Aproximadamente 5 μg de plasmídeo pJLK54 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea NRRL2338 e as colôniasresistentes thiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total deDNA foi obtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmarque o plasmídeo tem se integrado no TE.

S. erythraea NRRL2338/pJLK54 foi usado para inocular omeio SM3 contendo 5 μΐ/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se porsete a dez dias em 28 a 30°C. Após este tempo o caldo foi centrifugado e opH do sobrenadante ajustado para pH = 9,5. O sobrenadante foi entãoextraído três vezes com um volume igual de acetato de etila e o solvente foiremovido por evaporação. O resíduo foi dissolvido em metano e analisadopor GC/MS, por HLPC/MS e MS-MS. Tetracetídeos foram identificados por

O seguinte macrolideo foi identificado por HPLC/MS, MS-MS e IH-NMR (foi acompanhado por produtos de processamento incompletopor enzimas pós-PKS).

Avermectinas

EXEMPLO 23

Construção do plasmídeo ρJLKl36

O plasmídeo pJLK136 é um plasmídeo com base em pWHM3compreendendo a região de flanqueamento a montante e a jusante da alçaredutiva do módulo 2 do gene avermectina PKS e o gene de resistênciaeritromicina inserido no mcs que faz conexão destes dois fragmentos. Oplasmídeo pWHM3 é descrito em Vara J et al, J Bacteriol 1989, 171: 5872-5881. O plasmídeo pJLK136 foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue (Figura 6).

Construção do ρJLKl30

O segmento de DNA de aproximadamente 2,4 kbp do geneavermectina PKS de S. avermitilis codificando a região a montante da alçaredutiva de módulo 2 foi amplificado por PCR usando como iniciadores osoligonucleotídeos sintéticos:

5'-GACGCCGAACTTCCTTCGGCATCAGCCCCCGCGAAG-3' e 5' -GAGCTAG AC AGGTGGGGAGATCTAGGTGGGTGTGGGTGTGGGTTGGTTGTGGTGGTGGGTGA-3' e plasmídeo pIG22(Galloway, I. S. (1998) Thesis, University of Cambridge, UK) como modelo.

O produto PCR foi tratado com polinucleotídeo cinase T4 e depois ligadocom plasmídeo pUC18, que foi linearizado pela digestão com SmaI e depoistratado com fosfatase alcalina. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK130 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição e seqüência de DNA.

Construção do pJLK131

O segmento de DNA de aproximadamente 2,0 kbp do geneavermectina PKS de S. avermitilis codificando a região a jusante da alçaredutiva de módulo 2 foi amplificado por PCR usando como iniciadores osoligonucleotídeos sintéticos:

5'-GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-3' e 5'-GGG AATTCCTCGAGG ATG ACGTGGGCGTTGGTGC-3' eplasmídeo pIG25 (Galloway, I. S. (1998) Thesis, University of Cambridge,UK) como modelo. O produto PCR foi tratado com polinucleotídeo cinase T4e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado pela digestão comSmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura de ligação foi usadapara transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colôniasindividuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeopJLK131 desejado foi identificado por seu padrão de restrição e seqüência deDNA.

Construção do plasmídeo pJLK132O plasmídeo ρJLKl31 foi digerido com NheI e XbaI e oinserido de aproximadamente 2,4 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl31que foi digerido com NheI e XbaI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK132 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

Construção do plasmídeo pJLK133

O plasmídeo pJLK117 foi digerido com BglII e NheI e oinserido de aproximadamente 0,1 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLK132que foi digerido com BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK132 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

Construção do pJLK134

O segmento de DNA de aproximadamente 1,9 kbp do grupode gene eritromicina de S. erythraea codificando a resistência da eritromicinafoi amplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:

5'-TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-3' e 5'-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGGTCCGCCG-3' e plasmídeo pRH3(Dhillon, N, et al. Molecular Microbiology (1989) 3:1405-1414) comomodelo. O produto PCR foi tratado com polinucleotídeo cinase T4 e depoisligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado pela digestão com SmaI edepois tratado com fosfatase alcalina. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK134 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição e seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pJLK135

O plasmídeo pJLK134 foi digerido com BglII e NheI e oinserido de aproximadamente 1,9 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLKl33que foi digerido com BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK135 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

Construção do plasmídeo pJLK136

O plasmídeo pJLK135 foi digerido com EcoRI e o inserido deaproximadamente 6,3 kbp foi ligado com o plasmídeo pWHM3 que foidigerido com EcoRI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pJLK136 desejado foi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 24

Uso de plasmídeo pJLK136

Aproximadamente 10 μg de plasmídeo ρJLKl36 foram usadospara transformar protoplastos de S. avermitilis (MacNeil, D. J. e Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218) e thiostreptonestável e colônias resistentes de eritromicina foram isoladas. As colôniasindividuais foram selecionadas e subcultivadas quatro vezes em meio líquidonão seletivo seguido pela preparação e regeneração de protoplastos (meio deacordo com MacNeil T. et al J. Bacteriol. (1993) 175:2552-2563). Ascolônias sensíveis a thiostrepton e resistentes a erytromicina foram isoladas ecaracterizadas por hibridização Southern blot. Uma tal colônia foi designadaS. avermitilis/JLKl.

EXEMPLO 25

Construção do plasmídeo pJLK137

O plasmídeo pJLK120 foi digerido com BglII e NsiI e oinserido de aproximadamente 3,2 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLK133que foi digerido com BglII e NsiI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células Ε. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK137 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

Construção do plasmídeo pJLK138

O plasmídeo ρJLKl37 foi digerido com EcoRI e o inserido deaproximadamente 7,6 kbp foi ligado com o plasmídeo pWHM3 que foidigerido com EcoRI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pJLK138 desejado foi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 26

Uso de plasmídeo ρJLKl38

Aproximadamente 10 μg de plasmídeo pJLK138 foram usadospara transformar protoplastos de S. avermitilis (MacNeil, D. J. e Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218) e thiostreptonestável e as colônias resistentes de eritromicina foram isoladas. As colôniasindividuais foram selecionadas e subcultivadas quatro vezes em meio líquidonão seletivo seguido pela preparação e regeneração de protoplastos (meio deacordo com MacNeil T. et al J. Bacteriol. (1993) 175:2552-2563). Ascolônias sensíveis a thiostrepton e erytromicina foram isoladas ecaracterizadas por hibridização Southern blot. Uma colônia de S.avermitilis/pJLK138 foi usada para inocular o meio líquido (fermentação deacordo com Pang, C-H, et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66). As culturasforam colhidas e os produtos isolados e purificados como descrito naliteratura (Pang, C-H, et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66). Os produtosforam analisados por HPLC/MS e IH-NMR e o seguinte composto pode seridentificado:<formula>formula see original document page 38</formula>

EXEMPLO 27

Construção do plasmídeo pJLK139

O plasmídeo pJLK121.1 foi digerido com BglII e NheI e ofragmento de 2,2 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLK133 que foi digeridocom BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK139 desejado foi identificado porseu padrão de restrição.

Construção do plasmídeo ρJLKl 40

O plasmídeo pJLK139 foi digerido com EcoRI e o inserido deaproximadamente 6,6 kbp foi ligado com o plasmídeo pWHM3 que foidigerido com EcoRI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pJLK140 desejado foi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 28

Uso de plasmídeo pJLK140

Aproximadamente 10 μg de plasmídeo pJLK140 foram usadospara transformar protoplastos de S. avermitilis (MacNeil, D. J. e Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218) e thiostreptonestável e as colônias resistentes de eritromicina foram isoladas. As colôniasindividuais foram selecionadas e subcultivadas quatro vezes em meio líquidonão seletivo seguido pela preparação e regeneração de protoplastos (meio deacordo com MacNeil Τ. et al J. Bacteriol. (1993) 175:2552-2563). Ascolônias sensíveis a thiostrepton e erytromicina foram isoladas ecaracterizadas por hibridização Southern blot. Uma colônia de S.avermitilis/pJLK140 foi usada para inocular o meio líquido (fermentação deacordo com Pang, C-H, et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66). As culturasforam colhidas e os produtos isolados e purificados como descrito naliteratura (Pang, C-H5 et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66). Os produtosforam analisados por HPLC/MS e IH-NMR e o seguinte composto pode seridentificado:

EXEMPLO 29

Construção do plasmídeo pJLK30

pJLK30 é um plasmídeo com base em ρJLKl 17 exceto que oDNA codificando a alça redutiva do módulo 1 da avermectina PKS foiinserido no poli-ligante usando os sítios de restrição BglII e NheI. Foiconstruído através de vários plasmídeos intermediários.

Construção do plasmídeo pIG67

O segmento de DNA de aproximadamente 1,7 kbp daavermectina PKS de S. avermitilis codificando a alça redutiva de módulo 1foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos sintéticoscomo iniciadores:

5'-CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-3' e 5'-TGGGCT AGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGTG-3' ecomo modelo ou plasmídeo pIG155, que contém os primeiros dois módulosda avermectina PKS clonada no plasmídeo pT7-7, ou DNA cromossômico deStreptomyces acermitilis. O produto PCR foi tratado com polinucleotídeocinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado peladigestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pIG67 desejado foi identificado por seu padrão de restrição e porseqüência de DNA.

Construção do plasmídeo ρJLK30

O plasmídeo pIG67 foi digerido com BglII e NheI e ofragmento de 1,7 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLKl 17 que foi digeridocom BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK30 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 30

Uso do plasmídeo pJLK30 para a construção de S. erythraea JC2/pJLK30 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 mg de plasmídeo pJLK30 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O JC2/pJLK30 foi chapeado em agar SM3contendo 50 mg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 dias em30°C. 1 cm2 da placa foi homogeneizada e extraída com uma mistura de 1,2ml de acetato de etila com 20 ml de ácido fórmico. O solvente foi decantado eevaporado. O resíduo foi dissolvido em metanol e analisado porespectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Os produtos principaisforam identificados como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-heptanóico. Quase nenhuma da 3-cetolactona correspondentepode ser detectado.

EXEMPLO 31

Construção do plasmídeo pGMS2

pGMS2 é um plasmídeo com base em ρJLKl 17 exceto que oDNA codificando a alça redutiva do módulo 1 da avermectina PKS foiinserido no poli-ligante usando os sítios de restrição PstI e Bsu36I. Foiconstruído através de vários plasmídeos intermediários.

Construção do plasmídeo pIG68

O segmento de DNA de aproximadamente 1,7 kbp do gene daavermectina PKS de S. avermitilis codificando a alça redutiva de módulo 1foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos sintéticoscomo iniciadores:

5'-GGCTGC AG AGCTC AC AGCCGGGTGCCGG ATCCGGTT-3' e 5 '-TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-3' ecomo modelo ou plasmídeo pIG155, que contém os primeiros dois módulosda avermectina PKS clonadas no plasmídeo pT7-7, ou DNA cromossômicode Streptomyces avermitilis. O produto PCR foi tratado com polinucleotídeocinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado peladigestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. A mistura deligação foi usada para transformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes ecolônias individuais foram verificadas por seu teor de plasmídeo. Oplasmídeo pIG68 desejado foi identificado por seu padrão de restrição e porseqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pGMSl

O plasmídeo pIG68 foi digerido com PstI e Bsu36I e ofragmento de 1,7 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 16 que foi digeridocom PstI e Bsu36I. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pGMSl desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

Construção do plasmídeo pGMS2

O plasmídeo pGMS2 foi digerido com NdeI e XbaI e ofragmento de aproximadamente 11,5 kbp foi ligado com o plasmídeo pCJR24que foi digerido com NdeI e XbaI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pGMS2 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 32

Uso do plasmídeo pGMS2 para a construção de S. erythraea JC2/pGMS2 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 mg de plasmídeo pGMS2 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O S. erythraea JC2/pGMS2 foi chapeadoem agar SM3 contendo 50 μg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-sepor 12 dias em 3 O0C. 1 cm2 da placa foi homogeneizada e extraída com umamistura de 1,2 ml de acetato de etila com 20 ml de ácido fórmico. O solventefoi decantado e evaporado. O resíduo foi dissolvido em metanol e analisadopor espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Os produtosprincipais foram identificados como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-heptanóico (total de 17 mg/l), e também umaquantidade substancial da 3-cetolactona correspondente (5,5 mg/l).<formula>formula see original document page 43</formula>

EXEMPLO 33

Construção do plasmídeo pJLK31

pJLK31 é um plasmídeo com base em ρJLKl 17 exceto que oDNA codificando a alça redutiva do módulo 2 da avermectina PKS foiinserido no poli-ligante usando os sítios de restrição BglII e NheI. Foiconstruído através de vários plasmídeos intermediários.Construção do plasmídeo pIG69

O segmento de DNA de aproximadamente 2,4 kbp do gene daavermectina PKS de S. avermitilis codificando a alça redutiva de módulo 2foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos sintéticoscomo iniciadores:

ACTACTG-3' e 5 '-CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-3' e como modelo ou plasmídeo pIG155, que contém osprimeiros dois módulos da avermectina PKS clonadas no plasmídeo pT7-7,ou DNA cromossômico de Streptomyces avermitilis. O produto PCR foitratado com polinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeopUC18, que foi linearizado pela digestão com SmaI e depois tratado comfosfatase alcalina. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pIG69 desejado foi identificado por seupadrão de restrição e por seqüência de DNA.Construção do plasmídeo pJLK31

O plasmídeo pIG69 foi digerido com BglII, NheI e DraI e ofragmento de 2,4 kbp foi ligado com o plasmídeo pJLK117 que foi digerido

5'-CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCcom BglII e NheI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK31 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 34

Uso do plasmídeo pJLK31 para a construção de S. erythraea JC2/pJLK31 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 mg de plasmídeo pJLK31 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O S. erythraea JC2/pJLK31 foi chapeadoem agar SM3 contendo 50 mg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-sepor 12 dias em 3 O0C. 1 cm2 da placa foi homogeneizada e extraída com umamistura de 1,2 ml de acetato de etila com 20 ml de ácido fórmico. O solventefoi decantado e evaporado. O resíduo foi dissolvido em metanol e analisadopor espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Os produtosprincipais foram identificados como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-diidróxi-2,4-dimetil-n-heptanóico (total de 30 mg/litro).

<formula>formula see original document page 44</formula>

EXEMPLO 35

Construção do plasmídeo pGMS4

pGMS4 é um plasmídeo com base em ρJLKl 17 exceto que oDNA codificando a alça redutiva do módulo 2 da avermectina PKS foiinserido no poli-ligante usando os sítios de restrição SnaBI e Bsu36I. Foiconstruído através de vários plasmídeos intermediários.Construção do plasmídeo pIG70

O segmento de DNA de aproximadamente 2,4 kbp do gene daavermectina PKS de S. avermitilis codificando a alça redutiva de módulo 2foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos sintéticoscomo iniciadores:

5'-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-3' e 5 '-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-3' como modelo ou plasmídeo pIG155, que contém os primeiros doismódulos da avermectina PKS clonadas no plasmídeo pT7-7, ou DNAcromossômico de Streptomyces avermitilis. O produto PCR foi tratado compolinucleotídeo cinase T4 e depois ligado com plasmídeo pUC18, que foilinearizado pela digestão com SmaI e depois tratado com fosfatase alcalina. Amistura de ligação foi usada para transformar células E. coli DHlOBeletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas por seu teor deplasmídeo. O plasmídeo pIG70 desejado foi identificado por seu padrão derestrição e por seqüência de DNA.

Construção do plasmídeo pGMS3

O plasmídeo pIG70 foi digerido com SnaBI, Bsu36I e DraI e ofragmento de 2,4 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 16 que foi digeridocom SnaBI e Bsu36I. A mistura de ligação foi usada para transformar célulasE. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadaspor seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pGMS3 desejado foi identificado porseu padrão de restrição.

Construção do plasmídeo pGMS4

O plasmídeo pGMS2 foi digerido com NdeI e XbaI e ofragmento de aproximadamente 12,4 kbp foi ligado com o plasmídeo pCJR24que foi digerido com NdeI e XbaI. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pGMS4 desejadofoi identificado por seu padrão de restrição.

EXEMPLO 36

Uso do plasmídeo pGMS4 para a construção de S. erythraea JC2/pGMS4 e aprodução de tricetídeos.

Aproximadamente 5 mg de plasmídeo pGMS4 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O S. erythraea JC2/pGMS4 foi chapeadoem agar SM3 contendo 50 mg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-sepor 12 dias em 3 O0C. 1 cm2 da placa foi homogeneizada e extraída com umamistura de 1,2 ml de acetato de etila com 20 ml de ácido fórmico. O solventefoi decantado e evaporado. O resíduo foi dissolvido em metanol e analisadopor espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Apenas traços deprodutos tricetídeos putativos foram detectados.

EXEMPLO 37

Construção do plasmídeo pJLK27

O plasmídeo pJLK27 é um plasmídeo com base em pJLKl 14exceto que o fragmento de DNA codificando a alça redutiva de módulo 13 darap PKS foi inserido no mcs. Foi construído através de vários plasmídeosintermediários como se segue.

Construção do plasmídeo pJLK120a

O segmento de DNA de aproximadamente 3,2 kbp do generapC de S. hygroscopicus codificando a alça redutiva de módulo 13 foiamplificado por PCR usando como iniciadores os oligonucleotídeossintéticos:

5 '-TACCTAGGCACCACCACAACCCGGGTA-3' e 5'-

TAC AATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-3' e cosmídeo cos 31(Schwecke, Τ. et ai. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7839-7843) comomodelo. O produto PCR foi tratado com polinucleotideo cinase T4 e depoisligado com plasmídeo pUC18, que foi linearizado pela digestão com SmaI edepois tratado com fosfatase alcalina. A mistura de ligação foi usada paratransformar células E. coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuaisforam verificadas por seu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK120adesejado foi identificado por seu padrão de restrição e seqüência de DNA.Construção do plasmídeo pJLK27

O plasmídeo pJLK120a foi digerido com AvrII e HpaI e ofragmento de 3,2 kbp foi ligado com o plasmídeo ρJLKl 14 que foi digeridocom AvrII e HpaI. A mistura de ligação foi usada para transformar células E.coli DHlOB eletrocompetentes e colônias individuais foram verificadas porseu teor de plasmídeo. O plasmídeo pJLK27 desejado foi identificado por seupadrão de restrição.

EXEMPLO 38

Uso do plasmídeo pJLK27 para a construção de JC2/pJLK27 e a produção detricetídeos.

Aproximadamente 5 mg de plasmídeo pJLK27 foram usadospara transformar protoplastos de S. erythraea JC2 e as colônias resistentesthiostrepton estáveis foram isoladas. De várias colônias o total de DNA foiobtido e analisado por hibridização Southern blot, para confirmar que oplasmídeo tem se integrado no TE. O JC2/pJLK27 foi chapeado em agar SM3contendo 50 mg/ml de thiostrepton e deixado desenvolver-se por 12 dias em30°C. 1 cm2 (0,5 ml) da placa foi homogeneizada e extraída com uma misturade 1,2 ml de acetato de etila com 20 ml de ácido fórmico. O solvente foidecantado e removido por evaporação e o resíduo dissolvido em metanol eanalisado por espectroscopia de massa GC/MS e eletropulverização. Osprodutos principais foram identificados (por comparação com o materialautêntico) como ácido-ô-lactona (2R, 4S, 5R)-2,4-dimetil-5-hidróxi-n-hexanóico e como ácido-ô-lactona (2R, 4S, 5R)-2,4-dimetil-5-hidróxi-n-heptanóico (total de 41 mg/l), com algumas das 3-cetolactonascorrespondentes (total de 12 mg/l) e 3-hidroxilactonas (total de 2,8 mg).

<formula>formula see original document page 48</formula>

Todos os documentos e depósitos de seqüência aqui referidossão explícita e individualmente aqui incorporados por referência.

Claims (25)

1. Processo para a produção de uma segunda molécula deácido nucléico útil para a preparação de policetídeo sintases (PKSs),caracterizado pelo fato de compreender:(a) prover uma primeira molécula de ácido nucléicocodificando pelo menos parte de uma policetídeo sintase (PKS) Tipo I, ditaparte compreendendo pelo menos parte de um módulo de extensão contendopelo menos um domínio redutor selecionado dentre um domínio de β-cetoredutase (KR), um domínio de desidratase (DH) e um domínio deenoilredutase (ER);(b) retirar uma porção de dita primeira molécula de ácidonucléico que corresponde a dito pelo menos um domínio redutor; e(c) inserir um poli-ligante com múltiplos sítios de enzimas derestrição na dita primeira molécula de ácido nucléico no lugar de dita porçãoque corresponde a dito pelo menos um domínio redutor.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que tudo da dita primeira molécula de ácido nucléicocorrespondendo a domínios redutores de dita molécula de extensão é retiradoe substituído pelo dito poli-ligante.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o poli-ligante conecta ácido nucléico codificando pelomenos parte de uma enzima acil transferase ao ácido nucléico codificandopelo menos parte de uma proteína transportadora de acila.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos alguns dos sítios de restriçãoincluídos no poli-ligante estão ausentes da segunda molécula de ácidonucléico.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, caracterizado pelo fato de que o poli-ligante inclui pelo menos alguns dosseguintes sítios de restrição: AvrII, BglII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36JNheI e HpaI.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, caracterizado pelo fato de que a dita parte de uma policetídeo sintaseTipo I codificada pela primeira molécula de ácido nucléico adicionalmenteinclui um módulo de carregamento.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 6, caracterizado pelo fato de que a dita parte de uma policetídeo sintaseTipo I codificada pela primeira molécula de ácido nucléico adicionalmenteinclui um ou mais módulos de extensão adicionais.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 7, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa adicional (d) de inserir umaseqüência de ácido nucléico no poli-ligante, em que o ácido nucléico inseridocodifica um ou mais domínios redutores.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que dito um ou mais domínios redutores é/são um domínio de β-cetoredutase, de desidratase e/ou de uma enoilredutase.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que dito um ou mais domínios redutores inclui(em) pelo menosum domínio de β-cetoredutase.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que pelo menos um de dito um ou mais domíniosredutores é de um módulo de extensão diferente da mesma policetídeo sintasecomo dita pelo menos parte de uma policetídeo sintase Tipo I.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de dito um ou maisdomínios redutores é de uma policetídeo sintase diferente da PKS pelo menosparte da qual é codificada pelo dita primeira molécula de ácido nucléico.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 12, caracterizado pelo fato de que dita segunda molécula de ácidonucléico é incorporada em um vetor.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 13, caracterizado pelo fato de que uma célula hospedeira é transfectada,transformada ou conjugada com um ácido nucléico ou vetor como produzidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é uma célula da espécie Streptomyces.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de S. erythraea ou S.avermitilis.

17. Processo para a produção de um produto de fermentaçãocontendo um policetídeo, caracterizado pelo fato de incluir a etapa decultivação de uma célula hospedeira preparada pelo processo como definidoem qualquer uma das reivindicações 14 a 16.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é transformada, transfectada ouconjugada com um ácido nucléico ou vetor produzido pelo processo comodefinido em qualquer uma das reivindicações 8 a 12.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o produto de fermentação contém uma diidroavermectinaC22-C23, substancialmente livre de outros macrolídeos.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a diidroavermectina é ivermectina.

21. Processo de acordo coma reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o produto de fermentação contém uma avermectina Blsubstancialmente livre de avermectinas B2.

22. Processo para a produção de um policetídeo, caracterizadopelo fato de incluir as etapas de:i. fornecer um produto de fermentação pelo processo dareivindicação como definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 21; eii. pelo menos parcialmente purificar um policetídeo a partirde dito produto de fermentação.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que o policetídeo é uma avermectina.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que a avermectina é uma avermectina B1.

25. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que a avermectina é uma avermectina B1.