KR20010074652A - 폴리케타이드, 그 제조방법 및 제조방법에 사용되는 물질 - Google Patents

폴리케타이드, 그 제조방법 및 제조방법에 사용되는 물질 Download PDF

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KR20010074652A
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죠안 로렌츠 켈렌베르거
피터 프란시스 리드레이
제임스 스턴톤
김 죠넬 스터츠만-엔그웰
해미쉬 알라스테어 얼빈 맥아서
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바이오티카 테크놀로지 리미티드
디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이
화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 Type I 폴리케타이드 신다제의 최소한 일부분을 인코딩하고 환원에 관계되는 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 PKS 유전자 대신에 다중 제한효소 사이트를 갖는 폴리링커를 갖고 있으며, 임의로 추가의 폴리링커에 결합된 핵산을 포함하고, 추가로 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산; 전술한 핵산을 결합시키는 플라스미드; 전술한 플라스미드에 의하여 변환된 호스트 세포; 및 그에 관련되는 방법에 관한 것임.

Description

폴리케타이드, 그 제조방법 및 제조방법에 사용되는 물질{POLYKETIDES, THEIR PREPARATION, AND MATERIALS FOR USE THEREIN}
"익스텐션"이라는 용어는 폴리케타이드 체인 익스텐션의 한 사이클을 달성하는 효소 활성체를 갖는 Type I PKS의 도메인 셋트에 대하여 사용한다. 특히 익스텐션 모듈은 KS, AT, 환원성 루프 (KR, DH 및 ERdml 하나 또는 그 이상을 포함함) 및 ACP를 포함한다.
환원성 루프는 다른 도메인을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 혼합 PKS와 폴리펩타이드 신다제를 갖고 있는 예르시니아박터는 메틸 트란스퍼라제를 포함한다.
DEBSlTE에 있는 모듈 2의 환원성 루프를 (Type I) 에리트로마이신 PKS 유전자의 모듈 3의 동등한 시그먼트로 치환하면 S. 코엘리칼라 CH999에서 발현되었을 때 트리케타이드 케토락톤을 얻을 수 있다는 보고가 있었다 (Bedford, D. et al. Chemistry and Biology (1996) 3: 827-831).
유사하게, DEBSlTE에 있는 모듈 2의 환원성 루프를 에리트로마이신 PKS의 모듈 5의 동등한 시그먼트로 치환하면 S. 코엘리칼라에서 발현되었을 때 예정된 구조와 입체화학을 갖는 트리케타이드 락톤을 얻을 수 있다 (McDaniel, R. et al. Chemistry and Biology (1997) 4: 667-674). 반대로 동일한 실험이 에리트로마이신 PKS의 모듈 6의 환원성 루프를 사용하여 진행되었을 때는 오직 케토락톤 만이 분리되었다 (McDaniel, R. et al. Chemistry and Biology (1997) 4: 667-674).
다른 실험에서는, 로딩 도메인, 제1, 제2 및 제3 익스텐션 모듈과 ery 유전자의 TE를 포함하는 트리모듈 시스템에 있는 모듈 2의 환원성 루프는 S. 코엘리칼라에서 발현되었을 때 KR과 DH 도메인을 포함하는 래파마이신 PKS의 모듈 4의 동등한 시그멘트에 의하여 치환되어 예정된 2중 결합을 갖는 트리케타이드가 형성됨을 보여주었다 (McDaniel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: 4309-4310). 동일한 시스템에서 모듈 2의 환원성 루프는 S. 코엘리칼라에서 발현되었을 때 KR과 DH 및 ER 도메인을 포함하는 래파마이신 PKS의 모듈 1의 동등한 시그멘트에 의하여 치환되어 C-5에 예정된 산화 레벨을 갖는 트리케타이드를 형성하였다 (Kao. C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: 11339-11340). 반대로, 에리트로마이신 PKS의 모듈 4의 해당하는 시그먼트를 사용하였을 때는 관련된 위치에 2중 결합을 갖는 폴리케타이드만이 관찰되었고 예정된바와 같은 완전한 환원은 나타나지 않았다 (Kao. C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: 11339-11340). 두 유사한 실험에서, 트리모듈 시스템에 있는 모듈 2의 환원성 루프는 KR과 불활성 DH 도메인을 포함하는 래파마이신 PKS의 모듈 2의 해당하는 시그먼트 및 rap PKS의 모듈 4의 KR 도메인에 의하여 치환되었다 (rap 모듈 4의 환원성 루프는 KR 및 DH 도메인을 포함함). 두 구성은 C-3 에 상이한 입체화학을 갖는 트리케타이드 락톤을 얻는 것으로 보고되었다 (Kao. C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 2478-2479).
전술한 모든 예에서는 동일한 제한 사이트, PstI와 XbaI가 DNA 프래그먼트를 결합시키는데 사용되었다 (PstI 사이트의 위치는 다음에 설명하는 시스템에 사용된 PstI 사이트에 일치하고, XbaI 사이트는 Bsu36I와 같은 위치에 있다).
모델은 환원성 도메인이 KS, AT 및 ACP도메인에 의하여 형성된 코어 외측에 위치하는 루프를 형성하는 DEB 신다제의 구조에 대하여 제안되었다 (Staunton et al. Nature Structural Biology (1996) 3:188-192). 더구나, DEBSl은 도메인의 경계를 표시하는 특이성 위치에서 단백질분해성 효소에 의하여 가수분해된다는 것을 알게 되었다 (Aparicio, J. F. et al. J. Biol. Chem. (1994) 269: 8524-8528). 이러한 단백질분해성 사이트는 주로 링커 부위에서 발견되고, 이들은 이러한 사이트에 인접한 프래그먼트를 결합시키는 것으로 보인다. 이러한 예는 WO98/01546호에 기재되어 있다.
본 발명은 폴리케타이드, 그 제조방법 및 제조방법에 사용되는 물질에 관한 것이다.
폴리케타이드는 에리트로마이신, 테트라사이클린, 래파마이신, 애버멕틴, 모넨신, 에포틸론 및 FK506과 같은 항생성 또는 기타의 약리학적 특성을 갖는 많은 화합물을 포함하는 천연물의 거대하고 구조적으로 다른 종류이다.
특히 폴리케타이드는 스트렙토마이세스와 관련 악티노마이세트 박테리아에 의하여 풍부하게 생산된다. 폴리케타이드는 지방산 생합성에 유사한 방법으로 아실티오에스텔의 반복적이고 순차적인 응축에 의하여 합성되고 있다. 천연 폴리케타이드 중에 나타나는 거대 구조의 다양성은 스타터 또는 익스텐더 유니트로서 아세테이트 또는 프로피온네이트의 선택 또는 각개 응축 후에 관측되는 β-케토 그룹의 상이한 가공도에 의하여 유래되는 것이다. 가공 단계의 예로는 β-하이드록시아실- 로의 환원, 2-에노일- 로의 탈수에 이은 환원 및 포화 아실티오에스텔로의 완전 환원이 있다. 이러한 가공 단계의 구조화학적 성과는 체인 연장의 각 사이클에서 나타난다.
폴리케타이드의 생합성은 폴리케타이드 신다제로 알려진 체인-형성 효소의그룹에 의하여 시작된다. 악티노마이세트에서는 두 종류의 폴리케타이드 신다제(PKS)가 알려 졌다. 마크로라이드 에리트로마이신, 올레안도마이신, 애버멕틴 및 래파마이신에 대한 PKS로 대표되는 한 종류의 속칭 Type I PKS는 폴리케타이드 체인 익스텐션의 각 사이클에 대하여 상이한 셋트 또는 "모듈"의 효소로 구성된다. 하나의 예를 도1에서 볼수 있다. (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348: 176-178; Donadio, S. et. al. Science (1991) 252: 675-679; MacNeil, D. J. et. al. Gene (1991) 115: 119-125; Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7839-7843)
반면, Type II PKS는 방향족 화합물의 합성에 의하여 발현되며 오직 체인 익스텐션을 위한 효소적 활성체의 단일 셋트만을 포함한다. 이들은 연속 사이클에 재사용된다.
충분한 환원을 지시하는 완전한 모듈은 익스텐더 모듈의 로딩을 위한 케토아실-ACP 신다제 (KS)도메인; 아실 캐리어 단백질 도메인 (ACP); 아실-CoA:ACP 아실트란스퍼라제 (AT) 및 β-케토 그룹의 점유를 달성하기 위한 케토리덕타제(KR); 디하이드라타제(DH) 및 에노일리덕타제(ER)를 포함한다. 이러한 도메인들은 효소 활성을 갖고 있으므로 비록 다른 PKS 도메인에 대한 그들의 구조적인 관계에 대한 어떤 것을 암시하는 것으로 생각되지 않지만 이들은 "효소"라 할 수 있다. 유사하게, 전술한 도메인응 인코딩하는 핵산 염기서열은 비록 PKs의 상이한 도메인에 대한 격리된 조정 부위 또는 기타 부위에 대한 어떤 것을 암시하는 것으로 생각되지 않지만 "유전자"라 할 수 있다.
본 발명은 특히 동일하거나 상이한 PKS 유전자 클러스터로부터 나온 동등한 시그먼트에 의하거나 또는 돌연변이되거나 또는 합성된 시그먼트에 의하여 Type I 폴리케타이드 신다제 유전자 클러스터에 있는 환원성 루프(AT의 끝으로부터 KR, 또는 KR과 DH, 또는 KR, DH 또는 ER을 포함하는 ACP의 시작까지의 시그먼트)를 치환하므로서 예정된 방법으로 상이한 범위의 환원 및/또는 입체화학을 갖는 폴리케타이드를 생산하는 새로운 하이브리드 폴리케타이드 신다제를 생산하도록 하여 폴리케타이드를 생산하는 방법에 관계된다.
본 발명의 한 형태에서는 익스텐션 모듈의 최소한 일부를 포함하는 Type I 폴리케타이드 신다제(PKS)의 최소한 일부를 인코딩하는 핵산 (특히 DNA)을 제공하는바, 여기에서 핵산은 환원과 관련된 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자 대신에 다중 제한효소와 함께 폴리링커를 가지고 있다.
본 발명의 다른 형태에서는 익스텐션 모듈의 최소한 일부를 포함하는 Type I 폴리케타이드 신다제의 최소한 일부를 인코딩하는 핵산 (특히 DNA)를 제공하는바, 여기에서 핵산은 (최소한 일부의) ACP를 인코딩하는 핵산에 (최소한 일부의) AT를인코딩하는 핵산을 결합시키는 다중 제한 효소와 함께 폴리링커를 갖고 있다.
이러한 핵산들은 다음에 구체적으로 설명하는바와 같이 폴리링커에 삽입된 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 추가의 핵산을 갖고 있을 수 있다. 이러한 삽입은 폴리링커-함유 핵산을 두 제한 효소로 다이제스팅하므로서 달성된다. 삽입 사이트를 선택하기 위하여 폴리링커는 셋 이상의 제한 효소, 특히 네 제한 효소를 포함하는 것이 바람직하지만, 여섯 또는 여덟 개의 제한 효소를 포함할 수도 있다.
폴리링커는 Type I PKS-인코딩 핵산에 외부 (보통 합성) 핵산을 도입하므로서 제공될 수도 있고, 또한 Type I PKS-인코딩 핵산의 기존 염기서열을 가공하므로서 제공될 수도 있다. 예를 들면 후자를 달성하기 위하여는 환원성 효소-인코딩 염기서열이 놓여 있는 상류 및/또는 하류 (둘 다 좋다)의 염기서열로 가공될 수도 있고, 환원성 효소와 인접 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 인코딩하는 염기서열로 가공될 수도 있다.
폴리링커는 다음의 제한 사이트중의 최소한 일부를 포함하는 것이 바람직하다: AvrII, BglII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36l, NheI 및 HpaI. 가장 바람직한 것은 폴리링커가 전술한 사이트의 최소한 넷을 포함하는 것이다.
폴리링커에 포함된 최소한 일부의 제한 사이트는 결합된 핵산잔여물에는 나타나지 않는다. 폴리링커에 포함된 일부의 사이트는 비정상적이거나 또는 다른 (특히 Type I) PKS의 효소를 인코딩하는 천연적으로 나타나는 핵산 염기 서열에 존재하지 않는다. 사이트의 최소한 둘은 PKS의 환원성 효소를 인코딩하는 공지의 핵산 염기서열의 최소한 반에 나타나지 않거나 또는 최소한 3분지 2에도 나타나지 않는다. PKS 유전자가 G와 C 잔여물에 풍부하게 존재하는 반면, 제한 사이트는 A와 T 잔여물에 풍부하게 존재한다.
본 발명의 핵산은 로딩 모듈 및/또는 익스텐션 모듈의 하나 또는 그 이상을 인코딩한다. 더 상세하게 설명하면, 로딩 모듈의 관계되는 변이종들은 폴리케타이드 및 그들의 합성에 관계되는 본 발명자의 1999. 6. 29일자 출원에 나타나 있다.
본 발명의 다른 형태는 전술한 바와 같지만 폴리링커에 삽입된 하나 또는 그 이상의 환원성 효소 (예를 들면, KR 및/또는 DH 및/또는 ER)를 인코딩하는 추가의 핵산을 갖고 있다. 삽입된 핵산은 폴리링커가 삽입된 핵산의 것과 같지만 익스텐션 모듈이 다른 동일한 폴리케타이드 신다제의 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩할 수도 있다. 또한 삽입된 핵산은 상이한 천연 PKS 또는 지방산 신다제로부터 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 외부의 것일 수도 있고, 합성된 것일 수도 있으며, 또한 천연 PKS 또는 지방산으로부터 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 천연적으로 나타나는 핵산으로부터 돌연변이된 것일 수도 있다. 삽입된 핵산은 동일하거나 다른 Type I PKS 또는 지방산 신다제로부터 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩할 수는 있지만, 삽입된 핵산이 동일하거나 다른 Type II PKS 또는 지방산 신다제로부터 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 것이 바람직하다.
Type I PKS를 인코딩하는 유전자들에 대한 다수의 예가 염기서열이 작성되고 이러한 염기서열들은 Genbank, EMBL 및 Swissprot를 포함하는 공개적으로 이용가능한 DNA 및 단백질 염기서열 데이터베이스에 기재되어 있다. 예를 들면, 염기서열들은 에리트로마이신 (Cortes, J. et al. Nature (1990) 348:176-178, 수탁번호 X62569; Donadio, S. et al. Science (1991) 252:675-679; 수탁번호 M63677), 래파마이신 (Schwecke. T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843, 수탁번호 X86780), 리파마이신 (August et al. (1998), 수탁번호 AF040570) 및 티로신 (Eli Lily, 수탁번호 U78289)의 합성을 지배하는 PKS에 대하여 이용할 수 있다. 더구나, 도8-13은 S. 애버미틸리스로부터 나온 애버멕틴 PKS의 첫 번째 두 모듈을 인코딩하는 핵산 염기서열을 보여준다. 이 염기서열은 특정된 실시예에 사용된 삽입물에 대한 다른 공급원으로 이용될 수도 있다.
당해업계의 숙련자들은 상이한 Type I PKS의 대비될 수 있는 도메인 또는 모듈을 인코딩하는 핵산들 사이의 전체 염기 서열은 유사성이 대단히 높고, 상이한 Type I PKS의 도메인 조직은 상이한 폴리케타이드-생성 미생물사이에서도 일치하므로 본 발명에 기재된 신규의 하이브리드 폴리케타이드는 모든 천연 모듈 Type I PKS 또는 그들의 유도체에 이용할 수 있다는 것을 분명하게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 형태는 전술한 발명의 형태에서 정의된바와 같은 핵산과 전술한 핵산 또는 구조물로 복제된 호스트 세포(특히스트렙토마이세스종)를 포함하는 플라스미드나 파지와 같은(특히 플라스미드) 벡타를 제공한다.
본 발명의 또 다른 형태는 전술한 바와 같은 호스트 세포에 의하여 발현될 수 있는 폴리케타이드 신다제를 제공한다. 전술한 폴리케타이드 신다제는 필요에 따라 상투적인 방법에 의하여 분리될 수도 있다. 그러나 이러한 방법이 꼭 좋은것만은 아니다.
본 발명의 또 다른 형태는 신규의 기능성 PKS 및 환원성 효소를 인코딩하는 핵산을 전술한 바와 같이 폴리링커에 삽입하므로서 전술한 기능성 PKS를 인코딩하는 핵산을 생성하는 방법 및 전술한 PKS에 의하여 제조되는 것과 같은 신규의 폴리케타이드를 또한 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 발명의 형태에서 정의된바와 같은 물질과 방법을 이용하여 특수한 폴리케타이드를 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 이버멕틴(실시예 25 및 26 참조) 같은 디하이드로애버멕틴의 직접 발효나 또는 B2 애버멕틴이 없는 B1 애버멕틴(실시예 27 및 28 참조)의 직접 발효에 의하여 폴리케타이드를 생상하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 하나의 다른 형태는 하나 또는 그 이상의 실시예에 의하여 제조된 특수한 폴리케타이드와 같은 신규의 폴리케타이드와 신규한 폴리케타이드의 입체 이성체를 제공한다.
DEBSlTE 시스템 (Cortes, J. et al. (1995) 268: 1487-1489)에서 에리트로마이신 PKS 유전자의 모듈 2에 있는 환원성 루프의 교환이 이루어지도록 하기 위하여 폴리링커(다중 크로닝 사이트: mcs)가 KS, AT 및 ACP를 포함하는 최소의 모듈을 생성하도록 모듈 2의 환원성 루프의 위치에 도입되었다. ( 이 시스템은 기능성이 있으며 케토락톤을 생산한다: 실시예 2 및 4 참조) mcs는 9 제한 효소에 대한 유일한 인식 사이트를 포함한다.
이러한 새로운 제한 사이트는 폴리케타이드가 단백질분해 효소에 의하여 가수분해되는 위치에 근접한 링커 부위를 인코딩하는 DNA 내에 위치하고 있다 (위를 참고). 제한 사이트의 일부는 저 상동의 부위를 인코딩하는 DNA 내에 위치하고, 다른 제한 사이트 부분은 고도로 보존된 부위를 인코딩하는 DNA 내에 위치한다 (도1 참조). 효소 AvrII, BglII, Bsu36I 및 NheI에 대한 인식 사이트의 도입은 DEBS 모듈 2의 아미노산 염기서열을 변경시키지 않는다. 그 외 다섯 가지 경우(SnaBI, PstI, SpeI, NsI, HpaI)에는 아미노산 염기서열이 변한다 (도2 참조). 이러한 변화는 단백질의 활성에 영향을 미치지 않는다 (실시예6 참조).
제한 사이트의 둘은 동일한 염기를 카버하기 때문에 상이한 mcs (pJLK114 및 pJLK117)를 포함하는 두 플라스미드를 구성할 수 있다.
mcs의 사용은 환원성 루프의 일측에 있는 제한 사이트에 비하여 다음과 같은 이점을 제공한다:
1) DNA 프래그먼트들을 결합시키는 (20 상이한 조합) 적당한 위치가 각각 상이한 루프를 선택할 수 있어서 아미노산 서열의 바람직하지 않은 변화를 피할 수 있다.
2) 루프 내부에서 절단하는 효소를 피할 수 있다.
3) 루프 도입이 조합방법에서 달성된다.
본 발명자들은 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 핵산이 폴리링커의 상이한 사이트에 결합되었을 때, 동일한 폴리링커-함유 핵산과 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 동일한 핵산을 사용하여 상이한 결과가 얻어진다는 놀라운 사실을 발견하였다.
예를 들면, 실시예 7과 8에서 래파마이신 모듈 13의 환원성 루프는 제2 익스텐션 모듈의 결과로서 폴리케타이드 체인의 완전한 환원을 가져오기 위하여 ery 모듈 2에 삽입된다. 요구하는 트리케타이드 락톤 생성물이 우수한 수율로 얻어진다. 그렇지만, 실시예 37와 38에서는, 실시예 7 및 8에서와 같이 ery 2 모듈의 동일한 위치에 삽입된 모듈 13의 동일한 환원성 루프 또는 도메인 셋트는 폴리링커의 상이한 제한 사이트가 사용되고 (BglII 및 NsiI 대신 AvrII 및 HpaI) 상당한 량의 부산물이 생성되도록 한다. 이러한 부산물은 C-3가 케토나 하이드록시 중의 하나인 트리케타이드 락톤을 포함하는바, 이는 환원성 루프를 교환하기 위하여 사용한 사이트를 간단하게 변경하는 것이 요구하는 생성물을 얻는 것과 불완전 환원의 생성물이 포함된 요구하는 생성물의 요구하지 않는 혼합물을 얻는 것의 차이를 가져오게 한다는 것을 보여준다.
유사하게, 실시예 31 및 32에서는, 사이트 PstI와 Bsu361이 ery 모듈 2의 환원성 루프 대신에 애버멕틴 모듈 1 (플라스미드 pGMS2)의 환원성 도메인을 삽입하기 위하여 사용되는 경우 기대하는 생성물이 생산되지만 실질적인 양의 케토락톤도 생산된다. 실시예 29와 30에서는, 사이트 BglII과 NheI가 사용되었을 때 (플라스미드 pJLK30) 케토락톤은 거의 생산되지 않지만 락톤의 양은 각개 경우 비슷한 범위였다.
실시예 29와 30에 유사하게, 동일한 사이트 BglI와 NheI가 ery 모듈 2의 환원성 루프를 티로신 모듈 1(플라스미드 pJLK35)의 환원성 루프로 치환하기 위하여 사용된 실시예 14에서는, 비록 약간의 케토락톤을 동반하지만 동일한 목적물인 트리케타이드 락톤이 실시예 30과 32에서와 같이 생산되었으며 보다 높은 수율로 생산되었다. 이는 상이한 환원성 루프가 가장 유리하게 상이한 제한 사이트에 삽입될 수도 있음을 보여준다.
실시예 33과 34에서는, 사이트 BglII와 NheI가 애버멕틴 모듈 2(플라스미드 pJLK31)의 환원성 루프를 치환하기 위하여 사용되는 경우, 기대하는 생성물이 주 생성물로서 생산되었다. 실시예 35와 36에서는, 사이트 SnaBI와 Bsu36I가 사용되는 경우 (플라스미드 pGMS4) 오직 미량의 트리케타이드 락톤 혼합물만이 얻어졌다.
따라서, 본 발명은 폴리링커에 사이트를 갖는 상이한 제한 효소의 사용에 의하여 삽입 사이트를 간단하게 조정하므로서 특수한 환원성 루프가 특수한 PKS 속으로 삽입되는 경우 요구하는 추정의 생성물을 얻을 수 있는 기회를 제공한다. 전술한 비교 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 전술한 재조정은 폴리케타이드의 생산량과 수율에 극적으로 영향을 미칠 수 있다.
실시예 1
플라스미드 pJLK114의 구성
플라스미드 pJLK114는 아실트란스퍼라제의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 DNA 시그먼트가 다음의 제한 효소: AvrII, BglII, SnabI, PstI, SpeI, NsiI,Bsu36I 및 HpaI의 인식 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드 링커에 의하여 치환된 것을 제외하고 ery 로딩 모듈, ery PKS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈과 ery 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는pCJR24-기초 플라스미드이다. 이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐서 구성된다 (도3 참조).
플라스미드 pJLK02의 구성
S. 에스트라애의 eryAI 유전자의 약 1.47 kbp 프래그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' 및
5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3'
와 주형으로서 플라스미드 pNTEP2(Olinyk, M. et al.Chemistry and Biology(1996) 3:833-839; WO98/01546)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK02는 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK03의 구성
S. 에리트라애의 eryAI 유전자의 약 1.12 kbp DNA 프래그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3' 및
5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3'
와 주형으로서 플라스미드 pNTEPH를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK03은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK04의 구성
플라스미드 pJLK02를 PstI와 HpaI로 다이제스팅하고 1.47 kbp 삽입물을 PstI와 HpaI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK03과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK04는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK05의 구성
플라스미드 pJLK01(PCT/GB97/01819)을 PstI와 AvrII로 다이제스팅하고 460 bp 삽입물을 PstI와 AvrII로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK04와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK05는 제한패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK07의 구성
플라스미드 pJLK05를 ScaI와 XbaI로 다이제스팅하고, 플라스미드 pNTEP2를 NdeI와 ScaI로 다이제스팅한 다음, 이들 두 프래그먼트를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK07은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK114의 구성
두 합성 올리고뉴클레오타이드 Plf와 Plb(도4 참조)를 각각 TE-완충액에 용해시켰다. 각개 용액(0.5nmol/㎕) 10㎕을 혼합하고 65℃에서 2분 동안 가열한 다음 서서히 실온으로 냉각하였다. 플라스미드 pJLK07을 AvrII와 HpaI로 다이제스팅하고 융합된 올리고뉴클레오타이드와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK114는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 2
S. 에리트라애 JC2/pJLK114의 구성을 위한 플라스미드 pJLK114의 사용과 TKL 유도체의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK114를 사용하여 S. 에리트라애 JC2(NCIMB 40802호로 기탁된 균주. WO98/01546호)의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK114를 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천(글루코스 5.0g, MD30E 말토덱스트린 50.0g, 아르카 콩 분말 25.0g, 당밀 3.0g, K2HPO40.25g, CaCO32.5g, 한천 22.0g, 증류수 1 리터까지, pH=7.0)에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1 cm2(500㎕)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 (4S, 5R)-5-하이드록시-2,4-디메틸-3-옥소-n-헥사노익산-δ-락톤 및 (4S, 5R)-5-하이드록시-2,4-디메틸-3-옥소-n-헵타노익산-δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 3
플라스미드 pJLK117의 구성
플라스미드 pJLK117은 아실트란스퍼라제의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의ACP의 시작 사이에 있는 DNA 시그먼트가 다음의 제한 효소: AvrII, BglII, SnabI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I 및 NheI의 인식 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드 링커에 의하여 치환된 것을 제외하고 ery 로딩 모듈, ery PKS의 제1 및 제2 익스텐션 모듈과 ery 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는 pCJR24-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐서 구성된다 (도3 참조).
플라스미드 pJLK115의 구성
플라스미드 pJLK114를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고 9.9 kbp 삽입물을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK115는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK116의 구성
플라스미드 pJLK13 (PCT/GB97/01819)을 Bsu36I와 XbaI로 다이제스팅하고 1.1 kbp 프래그먼트를 Bsu36I와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK115와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드pJLK116은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK117의 구성
플라스미드 pJLK116을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고 9.9 kbp 프래그먼트를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK117은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 4
S. 에리트라애 JC2/pJLK117의 구성을 위한 플라스미드 pJLK117의 사용과 TKL 유도체의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK117을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK117를 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1 cm2(0.5ml)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고GC/MS 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 (4S, 5R)-5-하이드록시-2,4-디메틸-3-옥소-n-헥사노익산-δ-락톤 및 (4S, 5R)-5-하이드록시-2,4-디메틸-3-옥소-n-헵타노익산-δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 5
플라스미드 pJLK25의 구성
플라스미드 pJLK25는 에리트로마이신 PKS 유전자의 제2 모듈의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 pJLK114-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pJLK118의 구성
모듈 2의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 에스트라애의 eryAI 유전자의 약 1.4 kbp DNA 프래그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-3' 및
5'-TAATGCATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-3'
와 주형으로서 플라스미드 pNTEP2를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK118은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK23의 구성
플라스미드 pJLK118을 SpeI와 NsiI로 다이제스팅하고 1.4 kbp 프래그먼트를 SpeI와 NsiI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK115와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK23은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK25의 구성
플라스미드 pJLK23을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고 11.2 kbp 프래그먼트를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK25는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 6
S. 에리트라애 JC2/pJLK25의 구성을 위한 플라스미드 pJLK25의 사용과 트리케타이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK25를 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK25를 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1 cm2(0.5ml)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜 물질과 비교하여 (2R, 3S, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헥사노익산-δ-락톤 및 (2R, 3S, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헵타노익산-δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 7
플라스미드 pJLK28의 구성
플라스미드 pJLK28은 rap PKS의 모듈 13의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.(도5-6 참조)
플라스미드 pJLK120의 구성
모듈 13의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 하이그로스코피쿠스의 rapC 유전자의 약 3.2 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-3' 및
5'-TAATGCATCGACCTCGTTGCGTGCCGCGGT-3'
와 주형으로서 플라스미드 코스미드 cos 31 (Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843)을 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK120은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK28의 구성
플라스미드 pJLK120을 BglII와 NsiI로 다이제스팅하고 3.2 kbp 프래그먼트를 BglII와 NsiI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK28은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 8
JC2/pJLK28의 구성을 위한 플라스미드 pJLK28의 사용과 트리케타이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK28을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK28을 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1cm2(0.5ml)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜 물질과 비교하여 (2R, 4S, 5R)-2,4-디메틸-5-하이드록시-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 4S,5R)-2,4-디메틸-5-하이드록시--n-헵타노익산 δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 9
플라스미드 pJLK41의 구성
플라스미드 pJLK41은 ery PKS의 모듈 4의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.(도5-6 참조)
플라스미드 pJLK32.2의 구성
모듈 4의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 에리트라애의 eryAII 유전자의 약 3.2 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-ATAGATCTGCCTACGTACCCGTTCGAACACCAGCGCTTC-3' 및
5'-ATCCTCAGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGCAGCTT-3'
와 주형으로서 코스미드 cos4B(에리트로마이신 PKS를 함유하는 코스미드)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK32.2는 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK38의 구성
플라스미드 pJLK32.3을 BglII와 Bsu36I로 다이제스팅하고 3.2 kbp 프래그먼트를 BglII와 Bsu36I로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK116과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK38은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK41의 구성
플라스미드 pJLK38을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고 13 kbp 프래그먼트를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK41은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 10
JC2/pJLK41의 구성을 위한 플라스미드 pJLK41의 사용과 트리케타이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK41을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK41을 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1 cm2(0.5ml)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜 물질과 비교하여 (2S, 4S, 5R)-2,4-디메틸-5-하이드록시-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2S, 4S, 5R)-2,4-디메틸-5-하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 11
플라스미드 pJLK29의 구성
플라스미드 pJLK29는 rap PKS의 모듈 10의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.(도5-6 참조)
플라스미드 pJLK121.1의 구성
모듈 10의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 하이그로스코피쿠스의 rapB 유전자의 약 2.2 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' 및
5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3'
와 주형으로서 플라스미드 코스미드 cos 26(Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843)을 ScaI와 SphI로 다이제스팅하여 얻은 7 kbp 프래그먼트를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK121.1은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK29의 구성
플라스미드 pJLK121.1을 BglII와 NheI로 다이제스팅하고 2.2 kbp 프래그먼트를 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK29는 제한 패턴에의하여 확인하였다.
실시예 12
JC2/pJLK29의 구성을 위한 플라스미드 pJLK29의 사용과 트리케타이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK29를 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK29를 250ml 플라스크 내의 티오스트렙톤 5 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천 배지 30ml에 접종하고 300rpm으로 흔들면서 30℃에서 배양하였다. 8일 후 육즙을 원심분리하고 상등액을 pH 3으로 조절한 다음, 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하였다. 용매를 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 HPLC 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하고, 메틸에스텔로 전환시킨 후 GC/MS에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜 물질과 비교하여 (4S, 5R)-5-하이드록시-2,4-디메틸-n-헥스-2-에노익산 및 (4S, 5R)-5-하이드록시-2,4-디메틸-n-헵트-2-에노익산으로 확인되었다.
실시예 13
플라스미드 pJLK35의 구성
플라스미드 pJLK35는 티로신 PKS의 모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.(도5-6 참조)
플라스미드 pJLK33.1의 구성
모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 파라디애의 티로신 PKS 유전자의 약 1.6 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TAAGATCTCCCTACGTACCCCTTCAACCAC-3' 및
5'-GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-3'
와 주형으로서 코스미드 6T(티로신-생성 PKS 유전자를 함유하는 코스미드)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK33.1은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK35의 구성
플라스미드 pJLK33.1을 BglII와 NheI로 다이제스팅하고 1.6 kbp 프래그먼트를 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK35는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 14
JC2/pJLK35의 구성을 위한 플라스미드 pJLK35의 사용과 트리케타이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK35를 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pJLK35를 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1 cm2(0.5ml)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜 물질과 비교하여 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헵타노익산 δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 15
플라스미드 pRIF7의 구성
플라스미드 pRIF7은 리파마이신 PKS의 모듈 7의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA 프래그먼트가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.(도5-6 참조)
플라스미드 pUCRIF7의 구성
모듈 7의 환원성 루프를 인코딩하는 아미콜라톱시스 메디테라네이의 리파마이신 PKS 유전자의 2.1 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-3' 및
5'-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT-3'
와 주형으로서 코스미드 6(수탁번호 AF040570호에 따라 35727부터 시작하여 76199 뒤까지 이르는 코스미드)을 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pUCRIF7은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pRIF7의 구성
플라스미드 pUCRIF7을 SnaBI와 NheI로 다이제스팅하고 2.1 kbp 프래그먼트를 SnaBI와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pRIF7은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 16
S. 에리트라애 JC2/pRIF7의 구성을 위한 플라스미드 pRIF7의 사용과 트리케타이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pRIF7을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. JC2/pRIF7을 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천에 치상하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천 판의 1 cm2(0.5ml)를 균질화시키고 에틸아세테이트 1.2ml과 포름산 20 ul의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발 제거한 다음, 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS및 전기분사 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜 물질과 비교하여 (2S, 3S, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헵타노익산 δ-락톤으로 확인되었다.
실시예 17
플라스미드 pJLK52의 구성
플라스미드 pJLK52는 아실트란스퍼라제의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 DNA 시그먼트가 티로신 PKS의 모듈 1의 해당하는 시그먼트에 의하여 치환된 것을 제외하고 ery 로딩 모듈, ery 클러스터의 제1, 제2 및 제3 익스텐션 모듈과 ery 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는 pJLK35-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pJLK50의 구성
모듈 2의 ACP의 시작부터 모듈 3의 ACP의 시작까지의 DNA 프래그먼트를 인코딩하는 S. 에리트라애의 에리트로마이신 PKS 유전자 클러스터의 약 6.1 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' 및
5'-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3'
와 주형으로서 플라스미드 pBAM25를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK50은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK52의 구성
플라스미드 pJLK50을 NheI로 다이제스팅하고 6.1 kbp 프래그먼트를 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK35와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK52는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 18
S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK52의 구성을 위한 플라스미드 pJLK52의 사용과 트리케타이드 및 마크로라이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK52를 사용하여 S. 에리트라애 NRRL2338의 원형질체를형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK35를 티오스트렙톤 5 ㎍/ml를 포함하는 SM3 배지에 접종하고 28-30℃에서 7일 내지 12일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH=9.5로 조절하였다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매는 증발 제거하였다 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS, HPLC/MS 및 MS-MS에 의하여 분석하였다. 테트라케타이드는 GC/MS에 의하여 확인되었다. 주성분은 다음의 구조식을 갖고 있었다.
HPLC/MS, MS-MS 및 1H-NMR에 의하여 다음 구조식의 마크로라이드가 확인되었다.(이 생성물은 후-PKS 효소에 의하여 불완전하게 처리되면서 생성된 부산물을 함유하고있었다)
실시예 19
플라스미드 pJLK53의 구성
플라스미드 pJLK53은 아실트란스퍼라제 의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 DNA 시그먼트가 래파마이신 PKS의 모듈 13의 동등한 시그먼트에 의하여 치환된 것을 제외하고 ery 로딩 모듈, ery 클러스터의 제1, 제2 및 제3 익스텐션 모듈과 ery 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는 pJLK28-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같이 구성된다.
플라스미드 pJLK50을 NheI로 다이제스팅하고 6.1 kbp 삽입물을 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK28과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK53은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 20
S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK53의 구성을 위한 플라스미드 pJLK53의 사용과 TKL 유도체의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK53을 사용하여 S. 에리트라애 NRRL2338의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK53을 티오스트렙톤 5 ㎍/ml를 포함하는 SM3 배지에 접종하고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH=9.5로 조절하였다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매는 증발 제거하였다 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS, HPLC/MS 및 MS-MS에 의하여 분석하였다. 테트라케타이드는 GC/MS에 의하여 확인되었다. 주성분은 다음의 구조식을 갖고 있었다.
HPLC/MS, MS-MS 및 1H-NMR에 의하여 다음 구조식의 마크로라이드가 확인되었다.(이 생성물은 후-PKS 효소에 의하여 불완전하게 처리되면서 생성된 부산물을 함유하고있었다)
실시예 21
플라스미드 pJLK54의 구성
플라스미드 pJLK54는 아실트란스퍼라제 의 끝과 제2 ery 익스텐션 모듈의 ACP의 시작 사이에 있는 DNA 시그먼트가 래파마이신 PKS의 모듈 10의 동등한 시그먼트에 의하여 치환된 것을 제외하고 ery 로딩 모듈, ery 클러스터의 제1, 제2 및 제3 익스텐션 모듈과 ery 체인-말단 티오에스테라제를 포함하는 PKS 유전자를 함유하는 pJLK29-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같이 구성된다.
플라스미드 pJLK50을 NheI로 다이제스팅하고 6.1 kbp 삽입물을 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK29와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK54는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 22
S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK54의 구성을 위한 플라스미드 pJLK54의 사용과 테트라케타이드 및 마크로라이드의 생산
5㎍의 플라스미드 pJLK54를 사용하여 S. 에리트라애 NRRL2338의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 NRRL2338/pJLK54를 티오스트렙톤 5 ㎍/ml를 포함하는 SM3 배지에 접종하고 28-30℃에서 7일 내지 10일 동안 배양하였다. 이 기간이 경과한 다음, 육즙을 원심분리하고 상등액의 pH를 pH=9.5로 조절하였다. 상등액을 동량의 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 용매는 증발 제거하였다 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS, HPLC/MS 및 MS-MS에 의하여 분석하였다. 테트라케타이드는 GC/MS에 의하여 확인되었다. 주성분은 다음의 구조식을 갖고 있었다.
HPLC/MS, MS-MS 및 1H-NMR에 의하여 다음 구조식의 마크로라이드가 확인되었다.(이 생성물은 후-PKS 효소에 의하여 불완전하게 처리되면서 생성된 부산물을 함유하고있었다)
실시예 23
플라스미드 pJLK136의 구성
플라스미드 pJLK136은 애버멕틴 PKS 유전자의 모듈 2의 환원성 루프의 상류와 하류 측면 부위와 두 플래그먼트를 연결하는 mcs에 삽입된 에리트로마이신 저항성 유전자를 포함하는 pWHM3-기초 플라스미드이다. 플라스미드 pWHM3은 Vara, J. et al. J. Bacteriol (1989) 171:5872-5881에 기재되어 있다.
플라스미드 pJLK136은 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.(도7 참조)
플라스미드 pJLK130의 구성
모듈 2의 환원성 루프의 상류 부위를 인코딩하는 S. 애버미틸리스의 애버멕틴 PKS 유전자의 2.4 kbp DNA 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-GACGCCGAATTCTTCGGCATCAGCCCCCGCGAAG-3' 및
5'-GAGCTAGCAGGTGGGGAGATCTAGGTGGGTGTGGGTGTGGGGTTGGTTGTGGTGGTGGGTGTA-3'
와 주형으로서 플라스미드 pIG22(GalloWay, I. S. (1998) Thesis. 영국, 캠브릿지 대학)을 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK130은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK131의 구성
모듈 2의 환원성 루프의 하류 부위를 인코딩하는 S. 애버미틸리스의 애버멕틴 PKS 유전자의 2.0 kbp DNS 시그먼트는 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-3' 및
5'-GGGAATTCCTCGAGGATGACGTGGGCGTTGGTGC-3'
와 주형으로서 플라스미드 pIG22(GalloWay, I. S. (1998) Thesis. 영국, 캠브릿지 대학)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK131은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK132의 구성
플라스미드 pJLK130을 NheI과 XbaI로 다이제스팅하고 2.4 kbp 프래그먼트를 NheI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK131과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK132는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK133의 구성
플라스미드 pJLK117을 BglII와 NheI로 다이제스팅하고 0.1 kbp 프래그먼트를 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK132와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK133은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK134의 구성
에리트로마이신 저항성 유전자를 인코딩하는 S. 에리트라애 의 에리트로마이신 유전자 클러스터의 1.9 kbp 시그먼트를 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-3' 및
5'-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGTCCGCCG-3'
와 주형으로서 플라스미드 pRH3(Dhilon, N. et al. Molecular Microbiology, (1989) 3: 1405-1414)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK134는 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK135의 구성
플라스미드 pJLK134를 BglII와 NheI로 다이제스팅하고 약 1.9 kbp 삽입물은 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK133과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK134는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK136의 구성
플라스미드 pJLK135를 EcoRI로 다이제스팅하고 약 6.3 kbp 삽입물은 EcoRI로 다이제스팅하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pWHM3과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK136은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 24
플라스미드 pJLK136의 사용
약 10㎍의 플라스미드 pJLK136을 사용하여 S. 애버미틸리스(MacNeil, D. J. 및 Klapko, C. M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218)의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 및 에리트로마이신 저항성 콜로니들을 분리하였다. 각개 콜로니들은 선발하여 비선택성 액체 배지 중에서 네 번 부차배양하고 원형질체의 제조 및 재생을 실시하였다(MacNeil, T. et al. J . Bacteriol. (1993) 175:2552-2563에 따른 배지). 티오스트렙톤 감응성 및 에리트로마이신 저항성 콜로니들을 분리하고 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. 이러한 콜로니의 하나를 S. 애버미틸리스/JLK1이라 표시하였다.
실시예 25
플라스미드 pJLK137의 구성
플라스미드 pJLK120을 BglII와 NsiI로 다이제스팅하고 약 3.2 kbp 삽입물은 BglII와 NhiI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK133과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK137은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK138의 구성
플라스미드 pJLK137을 EcoRI로 다이제스팅하고 약 7.6 kbp 삽입물은 EcoRI로 다이제스팅하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pWHM3과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK138은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 26
플라스미드 pJLK138의 사용
약 10㎍의 플라스미드 pJLK138을 사용하여 S. 애버미틸리스(MacNeil, D. J. 및 Klapko, C. M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218)의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 및 에리트로마이신 저항성 콜로니들을 분리하였다. S. 애버미틸리스/pJLK138의 한 콜로니는 각개 콜로니들은 선발하여 비선택성 액체 배지 중에서 네 번 부차배양하고 원형질체의 제조 및 재생을 실시하였다(MacNeil, T. et al. J . Bacteriol. (1993) 175:2552-2563에 따른 배지). 티오스트렙톤 및 에리트로마이신 감응성 콜로니들을 분리하고 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 애버미틸리스/pJLK138의 한 콜로니는 액체 배지에 접종하였다 (Pang, C-H. et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66에 의하여 발효). 배양액을 수집하고 생성물을 분리한 다음 문헌(Pang, C-H. et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66)에 기재된 바와 같이 정제하였다. 생성물은 HPLC/MS 및 1H NMR에 의하여 분석하고 다음의 화합물을 확인하였다.
실시예 27
플라스미드 pJLK139의 구성
플라스미드 pJLK121.1을 BglII와 NheI로 다이제스팅하고 약 2.2 kbp 삽입물은 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK133과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK139는 그들의 제한패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pJLK140의 구성
플라스미드 pJLK139를 EcoRI로 다이제스팅하고 약 6.6 kbp 삽입물은 EcoRI로 다이제스팅하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pWHM3과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK140은 그들의 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 28
플라스미드 pJLK140의 사용
약 10㎍의 플라스미드 pJLK140을 사용하여 S. 애버미틸리스(MacNeil, D. J. 및 Klapko, C. M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218)의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 및 에리트로마이신 저항성 콜로니들을 분리하였다. 각개 콜로니들을 선발하여 비선택성 액체 배지에서 네 번 부차배양하여 원형질체의 제조 및 재생을 실시하였다(MacNeil, T. et al. J . Bacteriol. (1993) 175:2552-2563에 따른 배지). 티오스트렙톤 및 에리트로마이신 감응성 콜로니들을 분리하고 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 애버미틸리스/pJLK140의 한 콜로니는 액체 배지에 접종하였다 (Pang, C-H. et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66에 의하여 발효). 배양액을 수집하고 생성물을 분리한 다음 문헌(Pang, C-H. et al J. of Antibiotics (1995) 48:59-66)에 기재된 바와 같이 정제하였다. 생성물은 HPLC/MS 및 1H NMR에 의하여 분석하고 다음의 화합물을 확인하였다.
실시예 29
플라스미드 pJLK30의 구성
플라스미드 pJLK30은 애버멕틴 PKS의 모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA가 제한 사이트 BglII와 NheI를 사용하는 폴리링커에 삽입된 것을 제외하고 플라스미드 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pIG67의 구성
모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 애버미틸리스의 애버멕틴 PKS 유전자의 약 1.7 kbp 시그먼트를 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-3'
5'-TGGGCTAGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGTG-3'
와 주형으로서 플라스미드 pT7-7에 클론된 애버멕틴 PKS의 처음 두 모듈을 포함하는 플라스미드 pIG155와 S. 애버미틸리스의 염색체 DNA중의 하나를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pIG67은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK30의 구성
플라스미드 pIG67을 BglII와 NheI로 다이제스팅하고 약 1.7 kbp 프래그먼트는 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK30은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 30
S. 에리트라애 JC2/pJLK30의 구성을 위한 플라스미드 pJLK30의 사용과 트리케타이드의 생산
약 5mg의 플라스미드 pJLK30을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 JC2/pJLK30을 티오스트렙톤 50 mg/ml를 포함하는 SM3 한천판에 접종하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천판 1cm2를 균질화하고 에틸아세테이트 1.2ml와 포름산 20ml의 혼합물로 추출하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헵타노익산 δ-락톤(총 25mg/l)으로 확인되었다. 해당하는 3-케토락톤은 검출되지 않았다.
실시예 31
플라스미드 pGMS2의 구성
플라스미드 pGMS2는 애버멕틴 PKS의 모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA가 제한 사이트 PstI와 Bsu36I를 사용하는 폴리링커에 삽입된 것을 제외하고 플라스미드 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pIG68의 구성
모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 애버미틸리스의 애버멕틴 PKS 유전자의 약 1.7 kbp 시그먼트를 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TGGCTGCAGAGCTCACAGCCGGGTGCCGGATCCGGTT-3'
5'-TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-3'
와 주형으로서 플라스미드 pT7-7에 클론된 애버멕틴 PKS의 처음 두 모듈을 포함하는 플라스미드 pIG155와 S. 애버미틸리스의 염색체 DNA중의 하나를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pIG68은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pGMS1의 구성
플라스미드 pIG68을 PstI와 Bsu36I로 다이제스팅하고 약 1.7 kbp 프래그먼트는 PstI와 Bsu36I로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK116과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pGMS1은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pGMS2의 구성
플라스미드 pGMS1을 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고 약 11.5 kbp 프래그먼트는 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pGMS2는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 32
S. 에리트라애 JC2/pGMS2의 구성을 위한 플라스미드 pGMS2의 사용과 트리케타이드의 생산
약 5mg의 플라스미드 pGMS2를 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 JC2/pGMS2를 티오스트렙톤 50 ㎍/ml를 포함하는 SM3 한천판에 접종하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천판 1cm2를 균질화하고 에틸아세테이트 1.2ml와 포름산 20ml의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 3R, 4S,5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헵타노익산 δ-락톤(총 17 mg/l)으로 확인되었다. 해당하는 3-케토락톤의 실질적인 양(5.5mg/l)이 검출되었다.
실시예 33
플라스미드 pJLK31의 구성
플라스미드 pJLK31은 애버멕틴 PKS의 모듈 2의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA가 제한 사이트 BglII와 NheI를 이용하는 폴리링커에 삽입된 것을 제외하고 플라스미드 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pIG69의 구성
모듈 2의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 애버미틸리스의 애버멕틴 PKS 유전자의 약 2.4 kbp 시그먼트를 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCACTACTG-3'
5'-CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-3'
와 주형으로서 플라스미드 pT7-7에 클론된 애버멕틴 PKS의 처음 두 모듈을 포함하는 플라스미드 pIG155와 S. 애버미틸리스의 염색체 DNA중의 하나를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pIG69는 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK31의 구성
플라스미드 pIG69를 BglII, NheI 및 DraI로 다이제스팅하고 약 2.4 kbp 프래그먼트는 BglII와 NheI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK117과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK31은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 34
S. 에리트라애 JC2/pJLK31의 구성을 위한 플라스미드 pJLK31의 사용과 트리케타이드의 생산
약 5mg의 플라스미드 pJLK31을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 JC2/pJLK31을 티오스트렙톤 50 mg/ml를 포함하는 SM3 한천판에 접종하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천판 1cm2를 균질화하고 에틸아세테이트 1.2ml와 포름산 20ml의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 3R, 4S, 5R)-5,3-디하이드록시-2,4-디메틸-n-헵타노익산 δ-락톤(총 30 mg/l)으로 확인되었다.
실시예 35
플라스미드 pGMS4의 구성
플라스미드 pGMS4는 애버멕틴 PKS의 모듈 1의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA가 제한 사이트 SnaBI와 Bsu36I를 사용하는 폴리링커에 삽입된 것을 제외하고 플라스미드 pJLK117-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pIG70의 구성
모듈 2의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 애버미틸리스의 애버멕틴 PKS 유전자의 약 2.4 kbp 시그먼트를 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-3' 및
5'-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-3'
와 주형으로서 플라스미드 pT7-7에 클론된 애버멕틴 PKS의 처음 두 모듈을 포함하는 플라스미드 pIG155와 S. 애버미틸리스의 염색체 DNA중의 하나를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pIG70은 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pGMS3의 구성
플라스미드 pIG70을 SnaBI, Bsu36I 및 DraI 로 다이제스팅하고 약 2.4 kbp 프래그먼트는 SnaBI와 Bsu36I로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK116과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pGMS3은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
플라스미드 pGMS4의 구성
플라스미드 pGMS2를 NdeI와 XbaI로 다이제스팅하고 약 12.4 kbp 프래그먼트는 NdeI와 XbaI로 다이제스팅한 플라스미드 pCJR24와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pGMS4는 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 36
S. 에리트라애 JC2/pGMS4의 구성을 위한 플라스미드 pGMS4의 사용과 트리케타이드의 생산
약 5mg의 플라스미드 pGMS4를 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 JC2/pGMS4를 티오스트렙톤 50 mg/ml를 포함하는 SM3 한천판에 접종하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천판 1cm2를 균질화하고 에틸아세테이트 1.2ml와 포름산 20ml의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 질량분석기에 의하여 분석하였다. 오직 미량의 추정 트리케타이드 생성물이 검출되었다.
실시예 37
플라스미드 pJLK27의 구성
플라스미드 pJLK27은 rap PKS의 모듈 13의 환원성 루프를 인코딩하는 DNA가 mcs에 삽입된 것을 제외하고 플라스미드 pJLK114-기초 플라스미드이다.
이 플라스미드는 다음과 같은 다수의 중간체 플라스미드를 거쳐 구성된다.
플라스미드 pJLK120a의 구성
모듈 13의 환원성 루프를 인코딩하는 S. 하이그로스코피쿠스의 rapC 유전자의 약 3.2 kbp 시그먼트를 프라이머로서 다음의 합성 올리고뉴클레오타이드:
5'-TACCTAGGCACCACCACAACCCGGGTA-3' 및
5'-TACAATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-3'
와 주형으로서 코스미드 cos 31(Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843)를 사용하는 PCR에 의하여 증폭된다. PCR 생성물은 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고 SmaI로 다이제스팅하여 선형화하고 알카리 포스페이타제로 처리한 플라스미드 pUC18과 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK120a는 제한 패턴 및 DNA 염기서열을 만들어서 확인하였다.
플라스미드 pJLK27의 구성
플라스미드 pJLK120a를 AvrII와 HpaI로 다이제스팅하고 약 3.2 kbp 프래그먼트는 AvrII와 HpaI로 다이제스팅한 플라스미드 pJLK114와 결합시킨다. 결합 혼합물은 전기반응성 E. coli DH10B 세포를 형질전환하는데 사용하고 각개 콜로니들은 그들의 플라스미드 함량을 검사하였다. 요구하는 플라스미드 pJLK27은 제한 패턴에 의하여 확인하였다.
실시예 38
S. 에리트라애 JC2/pJLK27의 구성을 위한 플라스미드 pJLK27의 사용과 트리케타이드의 생산
약 5mg의 플라스미드 pJLK27을 사용하여 S. 에리트라애 JC2의 원형질체를 형질전환하는데 사용하고, 안정한 티오스트렙톤 저항성 콜로니들을 분리하였다. 수개의 콜로니들로부터 총 DNA를 얻고 플라스미드가 TE 유전자에 결합되었는지 확인하기 위하여 서던 블로트 하이브리디세이션에 의하여 분석하였다. S. 에리트라애 JC2/pJLK27을 티오스트렙톤 50 mg/ml를 포함하는 SM3 한천판에 접종하고 30℃에서 12일 동안 배양하였다. 한천판 1cm2를 균질화하고 에틸아세테이트 1.2ml와 포름산 20ml의 혼합물로 추출하였다. 용매를 따라 내고 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고 GC/MS 및 질량분석기에 의하여 분석하였다. 주 생성물은 진짜와 대비하여 약간의 해당하는 3-케토락톤 (총 12 mg/l) 및 3-하이드록시락톤 (총2.8 mg)과 함께 (2R, 4S, 5R)-2,4-디메틸-5-하이드록시-n-헥사노익산 δ-락톤 및 (2R, 4S, 5R)-2,4-디메틸-5-하이드록시-n-헵타노익산 δ-락톤(총 41 mg/l)이 얻어졌다.
모든 문헌과 염기서열 기탁물은 개인적으로 인용하였다.

Claims (27)

  1. Type I 폴리케타이드 신다제의 최소한 일부분을 인코딩하는 핵산에 있어서, 전술한 부분은 익스텐션 모듈의 최소한 일부분을 포함하고, 핵산은 환원과 관련된 효소를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 유전자 대신에 다중 제한 효소 사이트를 갖는 폴리링커를 포함함을 특징으로 하는 핵산 분자.
  2. 제1항에서, 폴리링커가 환원과 관련되고 전술한 익스텐션 모듈 내에 포함된 효소를 인코딩하는 모든 유전자 대신에 포함되었음을 특징으로 하는 핵산.
  3. Type I 폴리케타이드 신다제의 최소한 일부분을 인코딩하는 핵산에 있어서, 전술한 부분은 익스텐션 모듈의 최소한 일부분을 포함하고, 핵산은 다중 제한 효소 사이트를 갖는 폴리링커를 포함하고 폴리링커는 아실트란스퍼라제 효소의 최소한 일부분을 인코딩하는 핵산을 아실 캐리어 단백질의 최소한 일부분을 인코딩하는 핵산에 연결하는 핵산.
  4. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 폴리링커에 포함된 제한 사이트의 최소한 일부분이 Type I 폴리케타이드 신다제-인코딩 핵산을 포함하지 않음을 특징으로 하는 핵산.
  5. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 폴리링커에 포함된 제한 사이트의 최소한 일부분이 흔하지 않은 것이거나 또는 Type I 폴리케타이드 신다제의 환원성 효소를 인코딩하는 기타의 천연적으로 나타나지 않는 핵산 염기서열을 갖고 있음을 특징으로 하는 핵산.
  6. 전술한 청구항 중의 한 항에서,폴리링커가 다음의 제한 사이트: AvrII, BglII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I, NheI 및 HpaI 중의 최소한 일부를 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  7. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 부가적으로 로딩 모듈을 인코딩함을 특징으로 하는 핵산.
  8. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 하나 또는 그 이상의 익스텐션 모듈을 인코딩함을 특징으로 하는 핵산.
  9. 전술한 청구항 중의 한 항에서, 추가로 하나 또는 그 이상의 환원성 효소를 인코딩하는 핵산에 결합된 폴리링커에 결합된 핵산 염기서열을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  10. 청구항 9에서, 전술한 하나 또는 그 이상의 환원성 효소가 β-케토리덕타제,디하이드라타제 및 에노일 리덕타제 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 핵산.
  11. 청구항 10에서, 전술한 하나 또는 그 이상의 환원성 효소가 최소한 β-케토리덕타제를 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  12. 청구항 10 또는 11항에서, 전술한 하나 또는 그 이상의 환원성 효소 중의 최소한 하나가 Type I 폴리케타이드 신다제의 최소한 일부분에서와 같이 동일한 폴리케타이드 신다제의 상이한 익스텐션 모듈에서 나온 것임을 특징으로 하는 핵산.
  13. 청구항 10 내지 12 중의 한 항에서, 전술한 하나 또는 그 이상의 환원성 효소 중의 최소한 하나가 상이한 폴리케타이드 신다제로부터 나온 것임을 특징으로 하는 핵산.
  14. 전술한 청구항 중의 한 항에서 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡타.
  15. 전술한 청구항 중의 한 항에 정의된 바와 같은 핵산이나 벡타로 변환되거나 형질전환되거나 또는 결합된 호스트 세포.
  16. 청구항 15에서,스트렙토마이세스종의 세포임을 특징으로 하는 호스트 세포.
  17. 청구항 15에서, S. 에리트라애 또는 S. 애버미틸리스의 세포임을 특징으로 하는 호스트 세포.
  18. 신규한 폴리케타이드 신다제를 인코딩하는 핵산을 생산하는 방법에 있어서, 이 방법이
    i. 전술한 청구항 1 내지 8에 정의된 핵산을 제공하는 단계와
    ii. 최소한 하나의 환원성 효소를 인코딩하는 핵산 염기서열을 전술한 핵산에 결합시키는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 핵산 생산방법.
  19. 청구항 18에서, 최소한 하나의 환원성 효소를 인코딩하는 핵산 염기서열이 청구항 9 내지 13중의 한 항에 정의된 것임을 특징으로 하는 방법.
  20. 폴리케타이드를 포함하는 발효생성물을 제조하는 방법에서, 이 방법이 청구항 15에 기재된 호스트 세포를 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  21. 다른 마크로라이드 없이 C22-C23 디하이드로애버멕틴을 함유하는 발효 생성물.
  22. 청구항 21에서, 디하이드로애버멕틴이 이버멕틴임을 특징으로 하는 발효 생성물.
  23. B2 애버멕틴 없이 B1 애버멕틴을 함유하는 발효 생성물.
  24. 폴리케타이드를 생산하는 방법에서, 이 방법이
    i. 청구항 20의 방법으로 나오는 발효생성물 또는 청구항 21-23 중의 어느 하나에 따른 발효 생성물을 제공하는 단계; 및
    ii. 전술한 발효생성물로부터 나온 폴리케타이드를 최소한 부분적으로 정제하는 단계
    를 포함하는 폴리케타이드 생산 방법.
  25. 제24항에서, 폴리케타이드가 애버멕틴임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에서, 애버멕틴이 B1 애버멕틴임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에서, 애버멕틴이 B1 애버멕틴임을 특징으로 하는 방법.
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