MXPA00012894A - Policetidos, su preparacion y materiales para usarse en los mismos. - Google Patents

Abstract

Se describen las moleculas de acido nucleico que codifican para al menos parte de una policetido-sintasa de Tipo I, y que tienen un poliligador con sitios multiples de enzima de restriccion en lugar de uno o mas genes PKS que codifican para las enzimas asociadas con la reduccion, que incluye ademas opcionalmente el acido nucleico incorporado dentro del poliligador, el acido nucleico codifica ademas para una o mas enzimas reductivas; los plasmidos que incorporan tales acidos nucleicos; las celulas huesped transfectadas con tales plasmidos; y los metodos relacionados a estos.

Description

POLICETIDOS, SU PREPARACIÓN Y MATERIALES PARA EL USO DE LOS MISMOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los policétidos/ a su preparación, y a los materiales para el uso en los mismos. Los policétidos son una clase grande y estructuralmente diversa de productos naturales que incluyen muchos compuestos que poseen propiedades antibióticas u otras propiedades farmacológicas/ tales como la eritromicina, tetraciclinas, rapamicina, avermectina, ionóferos de poliéter, y FK506. En particular, los policétidos son abundantemente producidos por Streptomyces y bacterias actino icetas relacionadas. Éstos son sintetizados por la condensación gradual repetida de los aciltioésteres de una manera análoga a aquella de la biosíntesis de ácidos grasos. La mayor diversidad estructural encontrada entre los policétidos naturales surge de la selección de (usualmente) acetato o propionato como unidades iniciadoras' extensoras"; y a partir del REF: 125992 diferente grado de procesamiento del grupo ß-ceto observado después de cada condensación. Los ejemplos de pasos de procesamiento incluyen la reducción a ß-hidroxiacil-, la reducción seguida por la deshidratación al 2-enoil-, y la reducción completa a la aciltioéster saturado. El rendimiento estereoquimico de estos pasos de procesamiento es también especificado para cada ciclo de la extensión de cadena. La biosíntesis de los policétidos es iniciada por un grupo de enzimas formadoras de cadena conocidas como policétido-sintasas (PKSs). Han sido descritas dos clases de policétido-sintasas en actino icetos. No obstante, los novedosos policétidos y los procesos que son el objetivo de la presente invención se refieren principalmente a las PKSs del Tipo I, representadas por las PKSs para los macrólidos eritromicina, rapamicina y aver ectina. Las PKSs del Tipo I contienen un grupo diferente o "módulo" diferente de enzimas para cada ciclo de la extensión de cadena de policétidos (Cortes, J. Et al. Nature (1990) 348: 176-178; Donadío, S. et al. Science (1991) 252: 675-679; MacNeil, D.J. et al. Gene (1991) 115: 119-125; Sch ec e, T. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1995) 92: 7839-7843 y ver por ejemplo la Figura 1 en la presente o Figuras 2a y 3 de WO98/01546) ; mientras que las PKSs del Tipo II son representadas por las sintasas para los compuestos aromáticos y contienen únicamente un grupo simple de actividades enzimáticas para la extensión de la cadena. Éstas son reutilizadas como sea apropiado en ciclos sucesivos. Un módulo completo que dicta la reducción completa contiene un dominio de cetoacil-ACP-sintasa (KS); un dominio de proteina portadora de acilo (ACP) ; una acil-CoA: CP-aciltransferasa (AT) para la carga de la unidad extensora; y un dominio de cetorreductasa (KR) , una deshidratase (DH) y una enoilrreductasa (ER) para el logro del procesamiento del grupo ß-ceto. Ya que estos dominios tienen actividad enzimática, éstos pueden también ser denominados en la presente como "enzimas", aunque no se pretende que esto implique nada respecto a su relación estructural a otros dominios de PKS. Similarmente, las secuencias de ácido nucleico que codifican para tales dominios pueden también ser denominadas como "genes", aunque no se pretende que esto implique nada respecto a la presencia o de otro modo de las regiones reguladoras separadas para los diferentes dominios de una PKS.

La presente invención se refiere particularmente a los procesos para preparar los policétidos al reemplazar el rizo reductivo de (el segmento desde el extremo del AT hasta el comienzo del ACP que comprende ya sea un KR o un KR y un DH o un KR, un DH y un ER) en un módulo seleccionado de un cúmulo de genes de la policétido-sintasa del Tipo I por el segmento equivalente a partir del mismo o de un cúmulo diferente de genes PKS, o por un segmento mutado o sintético, con lo cual se generan las nuevas policétido-sintasas híbridas que producen policétidos con diferente grado de reducción y/o estereoquímica de una manera predecible. Para evitar- dudas, el término "módulo de extensión" como se utiliza más adelante en la presente, se refiere a un grupo de dominios de una PKS de Tipo I, que tiene cada una actividad enzimática, que participan en un ciclo de la extensión de la cadena de policétido. Más particularmente, un módulo de extensión comprende KS, AT, un rizo reductivo (que comprende uno o más de KR, DH y ER) , y ACP. Raramente, el rizo reductivo puede incluir otros dominios. Por ejemplo yersiniabacter, que posee una PKS mixta y la polipéptido-sintasa, posee un dominio de metil-transferasa . Se ha reportado que el reemplazo del rizo reductivo del módulo 2 en DEBS1TE con el segmento equivalente del módulo 3 del gen PKS de la eritromicina (Tipo I) produce una tricétido-cetolactona cuando se expresa en S. coelicolor CH999 (Bedford, D. et al. Chemistry and Biology (1996) 3: 827-831) . Similarmente, el reemplazo del rizo reductivo del módulo 2 en DEBS1TE con el segmento equivalente del módulo 5 de PKS de eritromicina, produce una tricétido-lactona con la estructura predicha y la estereoquímica predicha cuando se expresa en S. coelicolor CH999 (McDaniel, R. Et al. Chemistry and Biology (1997) 4: 667-674). Por el contrario, cuando el mismo experimento fue llevado a cabo utilizando el rizo reductivo del módulo 6 de PKS de eritromicina únicamente pudo ser aislado o aislada una cetolactona (McDaniel, R. Et al. Chemistry and Biology (1997) 4: 667-674). En un experimento adicional se ha mostrado que el rizo reductivo del módulo 2 en un sistema trimodular que comprende el dominio de carga, el primero, segundo y tercer módulo de extensión y el TE del gen ery, puede también ser sustituido por el segmento equivalente del módulo 4 de la PKS de rapamicina que comprende un dominio KR y DH que produce un tetracétido con el doble enlace predicho cuando se expresa en S. coelicolor CH999 (McDaniel, R. Et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: 4309-4310) . En el mismo sistema el rizo reductivo del módulo 2 ha sido reemplazado por el segmento equivalente del módulo 1 de la PKS de rapamicina que comprende un dominio KR, un DH y un ER, produciendo un tetracétido con el nivel de oxidación predicho en el carbono 5 cuando se expresa en S. coelicolor CH999 (Kao, C. M et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: 11339-11340) . Por el contrario, cuando se utiliza el segmento correspondiente del módulo 4 del gen PKS de la eritromicina, únicamente un policétido con un doble enlace en la posición relevante pudo ser observado y no, como se podria predecir, la reducción completa (Kao, C.M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119: 11339-11340). En dos experimentos similares, el rizo reductivo del módulo 2 en el sistema trimodular ha sido sustituido por el segmento correspondiente del módulo 2 de la PKS de rapamicina que contiene un dominio KR y un dominio DH inactivo y el dominio KR del módulo 4 del PKS de rap (el rizo reductivo del módulo 4 de rap contiene un KR y un dominio DH) . Se reporta que ambas construcciones producen una tricétido-lactona con una diferente estereoquímica en el carbono 3 (Kao, C. M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 2478-2479). En todos los ejemplos descritos anteriormente, los mismos sitios de restricción, PstI y Xbal, han sido utilizados para unir los fragmentos de ADN (la ubicación del sitio PstI es idéntica al sitio PstI utilizado en el sistema descrito más adelante y el sitio Xbal está en el mismo lugar que el sitio Bsu36I) . Ha sido propuesto un modelo para la estructura de la DEB-sintasa, donde los dominios reductivos forman un rizo que yace fuera del núcleo formado por los dominios de KS, AT y ACP (Staunton et al. Nature structural biology (1996) 3: 188-192) . Además, se ha encontrado que DEBS1 es hidrolizado por las enzimas proteoliticas en ubicaciones especificas que marcan los limites de los dominios (Aparicio, J.F. et al. J. Biol. Chem (1994) 269: 8524-8528) . Estos sitios proteoli ticos son encontrados principalmente en regiones ligadoras y parecen por lo tanto ideales para unir los fragmentos en vecindad estrecha a estos sitios. Los ejemplos de esto se documentan en O98/01546. En un aspecto la invención proporciona el ácido nucleico (particularmente ADN) que codifica para al menos parte de una policétido-sintasa (PKS) de tipo I, comprendiendo dicha parte al menos parte de un módulo de extensión, en donde el ácido nucleico tiene un poliligador con sitios de enzimas de restricción múltiples en lugar de uno o más genes que codifican para las enzimas asociadas con la reducción . En otro aspecto más, la invención proporciona ácido nucleico (particularmente ADN) que codifica para al menos parte de una policétido-sintasa Tipo I, comprendiendo dicha parte al menos parte de un módulo de extensión, en donde el ácido nucleico tiene un poliligador con los sitios de enzimas de restricción múltiples que conectan el ácido nucleico que codifica (al menos parte de) AT al ácido nucleico que codifica (al menos parte de) ACP. Dichos ácidos nucleicos pueden tener un ácido nucleico adicional, el cual codifica para una o más enzimas reductivas, insertadas dentro del poliligador como se describe con más detalle más adelante. Tal inserción es preferentemente realizada después de la digestión de los ácidos nucleicos que contienen el poliligador por dos enzimas de restricción. Con el fin de proporcionar una elección de los sitios de inserción, el poliligador preferentemente incluye al menos tres sitios de restricción, más preferentemente al menos cuatro, y todavía más preferentemente al menos seis u ocho sitios de restricción. El poliligador puede ser proporcionado mediante la introducción de ácido nucleico exógeno (usualmente sintético) dentro del ácido nucleico que codifica para PKS Tipo I, o puede ser proporcionado mediante la manipulación por ingeniería genética de la secuencia existente del ácido nucleico que codifica para PKS Tipo I. Por ejemplo, para lograr lo último, los sitios de restricción pueden ser manipulados mediante ingeniería genética (por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio) dentro de las secuencias corriente arriba y/o corriente abajo (5' y/o 3') (preferentemente ambas) de donde la secuencia que codifica para la enzima reductiva, ausente, podria normalmente encontrarse, particularmente dentro de las secuencias que codifican para los ligadores polipeptidicos entre la o las enzimas reductivas y los dominios adyacentes. El poliligador incluye deseablemente al menos algunos de los siguientes sitios de restricción: Avrll, Bglll; SnaBI; PstI; Spel; Nsil; Bsu361; Nhel; y Hpal. De manera más deseable, el poliligador incluye al menos cuatro de estos sitios. Preferentemente al menos algunos de los sitios de restricción incluidos en el poliligador están ausentes del resto del ácido nucleico dentro del cual éste es incorporado. De manera deseable, al menos uno de los sitios incluidos en el poliligador son no comunes en o están ausentes de las secuencias de ácido nucleico de origen natural las cuales codifican para las enzimas reductivas de otras PKSs (preferentemente de Tipo I) . De manera deseable, al menos dos de los sitios están ausentes al menos de aproximadamente la mitad, más deseablemente al menos de aproximadamente tres cuartos, de las secuencias de ácido nucleico conocidas que codifican para las enzimas reductivas de PKSs. Preferentemente, los sitios de restricción son ricos en residuos A y T, ya que los genes de PKS tienden a ser ricos en residuos G y C.

De manera deseable, los ácidos nucleicos de la invención codifican para un módulo de carga y/o uno o más módulos de extensión. Más detalles concernientes a las variedades de módulos de carga pueden ser encontrados en nuestra solicitud de patente internacional copendiente, titulada "Policétidos y su sintesis", presentada el 29 de junio de 1999. En otro aspecto más, la invención proporciona el ácido nucleico en general como es indicado anteriormente, pero que tiene además el ácido nucleico que codifica para una o más enzimas reductivas (por ejemplo KR y/o DH y/o ER) insertadas dentro del poliligador. El ácido nucleico insertado puede codificar para una o más enzimas reductivas de la misma policétido-sintasa que aquella del ácido nucleico dentro del cual se inserta el poliligador, pero de un módulo de extensión diferente. Alternativamente, el ácido nucleico insertado puede ser exógeno, codificando para una o más enzimas reductivas a partir de una PKS natural diferente o de la sintasa de ácido graso diferente, o puede ser sintética y puede ser mutada a partir de un ácido nucleico de origen natural el cual codifica para una o más enzimas reductivas de una PKS o sintasa de ácido graso. Preferentemente, el ácido nucleico insertado codifica para una o más enzimas reductivas a partir de la misma o de otra PKS del Tipo I u otra sintasa de ácido graso, pero alternativamente, ésta puede codificar para una o más enzimas reductivas a partir de una PKS Tipo II o sintasa de ácido graso. Los genes que codifican para numerosos ejemplos de PKSs del Tipo I han sido secuenciados y estas secuencias descritas en el ADN públicamente disponible y las bases de datos de secuencia de proteina incluyendo Genbank, EMBL, y Swissprot. Por ejemplo las secuencias son disponibles para las PKSs que gobiernan la síntesis de, respectivamente, la eritromicina (Cortes, J. Et al. Nature (1990) 348: 176-178; número de acceso X62569, Donadio, S. et al. Science (1991) 252: 675-679; número de acceso M63677); rapamicina (Schwecke, T. Et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1995) 92: 7839-7843); número de acceso X86780); rifamicina (August et al. (1998); número de acceso AF040570); y tilosina (Eli Lily, número de acceso U78289), entre otros. Además, la Figura 7 en la presente muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica para los primeros dos módulos de la PKS de avermectina proveniente de S . avermi ti l i s; ésta puede ser utilizada como una fuente alternativa para los insertos en algunos de los ejemplos. Es aparente para aquellos expertos en la técnica que la similitud secuencial completa entre los ácidos nucleicos que codifican para los dominios comparables o los módulos de diferentes PKSs de Tipo I es suficientemente alta, y la organización del dominio de diferentes PKSs de Tipo I tan consistente entre diferentes microorganismos productores de policétido, que los procesos para la obtención de novedosos policétidos híbridos descritos en la presente invención, serán en general aplicables a todas las PKSs de Tipo I modulares, naturales o sus derivados . En aspectos adicionales, la presente invención proporciona vectores, tales como los plásmidos o fagos (preferentemente plásmidos), incluyendo los ácidos nucleicos como se definen en los aspectos anteriores y las células huésped (particularmente de la especie Strep t omyces ) transfectadas con cada uno de los ácidos nucleicos o las construcciones. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona las policétido-sintasas expresables por las células huésped como se define anteriormente. Tales policétido-sintasas pueden, si se desea, ser aisladas de las células huésped mediante métodos rutinarios, aunque es usualmente preferible no hacerlo asi. En aspectos adicionales la invención proporciona los métodos de la creación de novedosas PKS's funcionales y los ácidos nucleicos que las codifican, por medio de la inserción de las enzimas reductivas que codifican para el ácido nucleico dentro de los poliligadores como es indicado anteriormente; y los novedosos policétidos como son producidos por tales PKS's. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona los novedosos procesos para la producción especifica o preferencial de los policétidos particulares, utilizando los materiales y métodos como se definen en los aspectos previos. Por ejemplo, la presente invención proporciona los procesos para la generación mediante fermentación directa de dihidroavermectinas de 22 a 23 átomos de carbono, tales como iver ectina (ver por ejemplo, los Ejemplos 25 y 26), y de las avermectinas Bl sustancialmente libres de avermectinas B2 (ver por ejemplo, los Ejemplos 27 y 28) .

En otro aspecto más, la presente invención proporciona los novedosos policétidos y los novedosos esteroisómeros de los policétidos, tales como los policétidos particulares producidos de acuerdo con uno o más de los Ejemplos. Con el fin de hacer posible el intercambio del rizo reductivo en el módulo 2 del gen PKS de la eritromicina en el sistema DEBS1TE (Cortes J. Et al. (1995) 268: 1487-1489) ha sido insertado un poliligador (sitio de clonación múltiple) (mes)) en lugar del rizo reductivo del módulo 2, con lo cual se genera un módulo minimo que comprenden una KS, un AT y un ACP. (Este sistema es todavía funcional y produce una cetolactona (ver Ejemplos 2 y 4)). El mes contiene sitios de reconocimiento únicos para 9 enzimas de restricción. Estos novedosos sitios de restricción están situados parcialmente en el ADN que codifica para una región ligadora cerca de las posiciones donde la policétido-sintasa es hidrolizada para las enzimas proteoliticas (ver arriba) . Mientras que algunos de los sitios de restricción yacen en el ADN que codifica para las regiones de baja homología, otros están situados en el ADN que codifica para las regiones altamente conservadas (Figura 1). La introducción de los sitios de reconocimiento para las enzimas Avrll, Bglll, Bsu36I y Nhel no cambia la secuencia de aminoácidos en DEBS módulo 2. En los otros cinco casos (SnaBI, PstI, Spel, Nsi, Hpal) la secuencia de aminoácidos está cambiada (Figura 2) . Estos cambios no afectan la actividad de la proteina (ver Ej emplo 6) . Debido a que dos de los sitios de restricción cubren las mismas bases, se decidió construir dos plásmidos que contenían diferentes mes (pJLK114 y pJLK117) . El uso de un mes ofrece las siguientes ventajas sobre un sitio de restricción simple sobre cada lado del rizo reductivo: 1) las posiciones adecuadas para unir los fragmentos de ADN (20 diferentes combinaciones) pueden ser elegidas para cada rizo reductivo diferente con lo cual se evitan cambios desfavorables en la secuencia de aminoácidos; 2) las enzimas que cortan dentro del rizo pueden ser evitadas; y 3) la inserción del rizo puede ser realizada de una manera combinatoria. Los presentes inventores han realizado el descubrimiento sorprendente adicional de que pueden ser obtenidos diferentes resultados utilizando el mismo ácido nucleico que contiene poliligador y el mismo ácido nucleico que codifica para una o más enzimas reductivas, cuando el ácido nucleico que codifica para una o más enzimas reductivas es incorporado en diferentes sitios en el poliligador. Por ejemplo, en los Ejemplos 7 y 8 el rizo reductivo del módulo 13 de la rapamicina fue insertado en el módulo 2 de ery para dar origen a la reducción completa de la cadena de policétido como el resultado del segundo módulo de extensión. Los productos de tricétido-lactona deseados fueron obtenidos con buen rendimiento. Sin embargo, en los Ejemplos 37 y 38, el mismo rizo reductivo o grupo de dominios, a partir del módulo 13 de rap fue insertado esencialmente dentro de la misma posición en el módulo 2 de ery como en los Ejemplos 7 y 8, salvo que se utilizaron diferentes sitios de restricción del poliligador (Avrll y Hpal en vez de Bglll y Nsil) y cantidades significativas de subproductos fueron obtenidas. Tales subproductos incluyeron tricétido-lactonas en las cuales el carbono 3 fue ya sea ceto o hidroxilo, mostrando que alternando simplemente los sitios utilizados para permutar el rizo reductivo, hizo la diferencia entre la obtención del producto deseado y la obtención de una mezcla no deseable del producto deseado con los productos de la reducción incompleta. Similarmente, en los Ejemplos 31 y 32, cuando los sitios PstI y Bsu36I fueron utilizados para insertar los dominios redutivos del módulo 1 de la avermectina (plásmido pGMS2) en lugar del rizo reductivo del módulo 2 de ery, el producto esperado fue producido, pero también una cantidad sustancial de cetolactona. En el experimento de los Ejemplos 29 y 30, cuando los sitios Bglll y Nhel fueron utilizados (plásmido pJLK30) difícilmente fue producido cualquier subproducto de cetolactona, aunque las cantidades de lactona estuvieron en un intervalo similar en cada caso. Completamente de manera análoga a los Ejemplos 29 y 30, en el Ejemplo 14 cuando los mismos sitios Bglll y Nhel fueron utilizados para reemplazar el rizo reductivo del módulo 2 de ery con el rizo reductivo del módulo 1 de tilosina (plásmido pJLK35) , se produjeron las mismas tricétido-lactonas objetivo como en los Ejemplos 30 y 32 pero con mucho mayor rendimiento, aunque acompañado por alguna cetolactona, demostrando que diferentes rizos reductivos pueden ser más ventajosamente insertados dentro de diferentes sitios de restricción. En los Ejemplos 33 y 34, cuando los sitios Bglll y Nhel fueron utilizados para insertar los dominios reductivos del módulo 2 de la avermectina (plásmido pJLK31) se produjeron los productos esperados como los productos principales. En el experimento de los Ejemplos 35 y 36, cuando los sitios SnaBI y Bsu36I fueron utilizados (plásmido pGMS4) únicamente pudieron ser obtenidas cantidades en trazas de una mezcla de tricétido-lactona. De este modo, la presente invención proporciona la oportunidad, si son obtenidos los productos deseados y predichos cuando se inserta un rizo reductivo particular dentro de una PKS particular, del ajuste simple del sitio de inserción mediante el uso de diferentes enzimas de restricción que tienen sitios en el poliligador. Como se demostró por los ejemplos comparativos anteriores, tal reajuste puede afectar dramáticamente el resultado y el rendimiento de la sintesis del policétido .

Ejemplo 1 Construcción del plásmido pJLK114 El plásmido pJLK114 es un plásmido basado en pCJR24 que contiene un gen PKS que comprende el módulo de carga de ery, el primero y segundo módulos de extensión de la PKS de ery y la tioesterasa de terminación de cadena de ery excepto que el segmento de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el comienzo del ACP del segundo módulo de extensión de ery, ha sido sustituido por un ligador oligonucletidico sintético que contiene los sitios de reconocimiento de las siguientes enzimas de restricción: Avrll, Bglll, SnaBI, PstI, Spel, Nsil, Bsu36I y Hpal. Éste fue construido via los diversos plásmidos intermediarios como sigue (Figura 3).

Construcción del plásmido pJLK02 El fragmento de ADN de aproximadamente 1.47 kpb del gen eryAI de S . erythraea fue amplificado por PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' y 5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3' y el plásmido pNTEP2 (Oliynyk, M. et al., Chemistry and Biology (1996) 3: 833-839; WO98/01546) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUC18, el cual habia sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con la fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células electrocompetentes de E . coli DH10B y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK02 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK03 El fragmento de ADN de aproximadamente 1.12 kpb del gen eryAI de S . erythra ea fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3' y 5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3' y el plásmido pNTEPH como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual habia sido linearizado por digestión con Smal y luego tratado con la fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar células electroco petentes de E . coli DH10B y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido despeado pJLK03 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Contrucción del plásmido pJLK04 El plásmido pJLK02 fue digerido con PstI y Hpal y el inserto de 1.47 kpb fue ligado con el plásmido pJLK03 el cual habia sido digerido con PstI y Hpal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK04 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK05 El plásmido pJLKOl ( PCT/GB97/ 01819 ) fue digerido con PstI y Avrll y el inserto de 460 pares de bases fue ligado con el plásmido pJLK04 el cual habia sido digerido con PstI y Avrll. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK05 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK07 El plásmido pJLK05 fue digerido con Seal y Xbal y el plásmido pNTEP2 fue digerido con Ndel y Seal y estos dos fragmentos fueron ligados con el plásmido pCJR24 el cual habia sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura fue utilizada para trasformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK07 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK114 Los dos oligonucleótidos sintéticos Plf y Plb (Figura 4) fueron cada uno disueltos en el amortiguador TE. 10 µl de cada solución (0.5 nmol/µl) se mezclaron y se calentaron por 2 minutos a 65°C y luego se enfriaron lentamente hasta la temperatura ambiente. El plásmido pJLK07 fue digerido con Avrll y Hpal y ligado con los oligonucleótidos recocidos. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células electrocompetentes de E . coli DH10B y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK114 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 2 Uso del plásmido pJLK114 para la construcción de S . erythra ea JC2/pJLK114 y la producción de derivados de TKL Aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK114 se utilizaron para transformar los protoplastos de S . erythra ea JC2 (cepa depositada como No. NCIMB 40802. WO98/01546) y las colonias resistentes a la tiostreptona estable fueron aisladas. A partir de las diversas colonias se obtuvo el ADN total y se analizó mediante hibridación de manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del gen TE. JC2/pJLK114 fue sembrado en placa sobre agar SM3 (5.0 g de glucosa, 50.0 g de maltodextrina MD30E, 25.0 g de harina de soya Arkasoy, 3.0 g de melazas (remolacha), 0.25 g de K2HP04, 2.5 g de CaC03, 22.0 g de agar, agua destilada hasta 1 litro pH = 7.0) que contiene 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce dias a 30°C. 1 cm2 (500 µl) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorroclo . Los productos principales fueron identificados como d-lactona del ácido (4S,5R)-5-hidroxi-2 , 4-dimetil-3-oxo-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (4S, 5R) -5-hidroxi-2, 4-dimetil-3-oxo-n-heptanoico .

Ejemplo 3 Construcción del plásmido pJLK117 El plásmido pJLK117 es un plásmido basado en PCJR24 que contiene un gen PKS que comprende el módulo de carga de ery, el primero y segundo módulos de extensión de la PKS de ery y la tioesterasa de terminación de cadena de ery excepto que el segmento de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el comienzo del ACP del segundo módulo de extensión de ery ha sido sustituido por un ligador oligonucleotidico sintético que contiene los sitios de reconocimiento de las siguientes enzimas de restricción: Avrll, Bglll, SnaBI, PstI, Spel, Nsil, Bsu36I y Nhel. Éste se construyó via los diversos plásmidos intermediarios como sigue (Figura 3) .

Construcción del plásmido pJLK115 El plásmido pJLK114 fue digerido con Ndel y Xbal y el inserto de aproximadamente 9.9 kpb fue ligado con el plásmido pUC18 el cual habia sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes, y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK115 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK116 El plásmido pJLK13 ( PCT7GB97/ 01819 ) fue digerido con Bsu36I y Xbal y el fragmento de 1.1 kpb fue ligado con el plásmido pJLK115 el cual habia sido digerido con Bsu36I y Xbal. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK116 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK117 El plásmido pJLK116 fue digerido con Ndel y Xbal y el fragmento de 9.9 kpb fue ligado con el plásmido pCJR24 el cual habia sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células electrocompetentes de E . coli DH10B, y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK117 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 4 Uso del plásmido pJLK117 para la construcción de 5. erythraea JC2/pJLK117 y la producción de derivados de TKL Se utilizaron aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK117 para transformar los protoplastos de S . erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. De varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE. JC2/pJLK117 fue sembrado en placas sobre agar SM3 que contenia 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce dias a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml ) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocio . Los productos mayores fueron identificados como la d-lactona del ácido (4S, 5R) -5-hidroxi-2, 4-dimetil-3-oxo-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido ( 4S, 5R) -5-hidroxi-2 , 4-dimetil-3-oxo-n-heptanoico .

Ejemplo 5 Construcción del plásmido pJLK25 El plásmido pJLK25 es un plásmido basado en pJLK114, excepto que el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del segundo módulo del gen PKS de la eritromicina ha sido insertado dentro del mes. éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue.

Construcción del plásmido pJLKlld El fragmento de ADN de aproximadamente 1.4 kpb del gen eryAI de S . erythra ea que codifica para el rizo reductivo del módulo 2, fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5'-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-3' y 5'- TAATGCATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-3' y PNTEP2 como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCl?, el cual habia sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con la fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK118 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK23 El plásmido pJLKlld fue digerido con Spel y Nsil y el fragmento de 1.4 kpb fue ligado con el plásmido pJLKH5 el cual habia sido digerido con Spel y Nsil. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK23 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK25 El plásmido pJLK23 fue digerido con Ndel y Xbal y el fragmento de aproximadamente 11.2 kpb fue ligado con el plásmido pCJR24 el cual habia sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK25 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 6 Uso del plásmido pJLK25 para la construcción de JC2/pJLK25 de S . erythra ea y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK25 para transformar los protoplastos de S . erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. De varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE. JC2/pJLK25 fue sembrado en placas sobre agar SM3 que contenia 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 , ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados (por comparación con el material auténtico) como la d-lactona del ácido (2R, 3S, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2 , 4-dimetil-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 3S, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2, 4-dimetil-n-heptanoico .

Ejemplo 7 Construcción del plásmido pJLK28 El plásmido pJLK28 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 13 del PKS de rap ha sido insertado dentro del mes. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue. (Figura 5) Construcción del plásmido pJLK120 El segmento de ADN de aproximadamente 3.2 kpb del gen rapC de S . hygroscopi cus que codifica para el rizo reductivo del módulo 13, fue amplificado mediante PCR, utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-3' y 5'- TAATGCATCGACCTCGTTGCGTGCCGCGGT-3' y el cósmido eos 31 (Shwecke, T. Et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92: 7839-7843) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con la fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK120 fue identificado por su patrón de restricción y el secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK28 El plásmido pJLK120 fue digerido con Bglll y Nsil y el fragmento de 3.2 kpb fue ligado con el plásmido pJLK117 el cual había sido digerido con Bglll y Nsil. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido.

El plásmido deseado pJLK28 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 8 Uso del plásmido pJLK28 para la construcción de JC2/pJLK28 y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK28 para transformar los protoplastos de S . erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. De varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE. JC2/pJLK28 fue sembrado en placas sobre agar SM3 que contenía 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados (mediante comparación con el material auténtico) como la d-lactona del ácido (2R, 4S, 5R) -2, 4-dimetil-5-hidroxi-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 4S, 5R) -2, 4-dimetil-5-hidroxi-n-heptanoico .

Ejemplo 9 Construcción del plásmido pJLK41 El plásmido pJLK41 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 4 de la PKS de ery ha sido insertado dentro del mes. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue. (Figura 5) .

Construcción del plásmido pJLK32.3 El segmento de ADN de aproximadamente 3.2 kpb del gen eryAII de S . erythraea que codifica para el rizo reductivo del módulo 4 fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -ATAGATCTGCCTACGTACCCGTTCGAACACCAGCGCTTC-3' y 5'-ATCCTCAGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGCAGCTT-3' y el cósmido cos4B (cósmido que contiene la PKS de eritromicina) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la plinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con la fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK32.3 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK38 El plásmido pJLK32.3 fue digerido con Bglll y Bsu36I y el fragmento de 3.2 kpb fue ligado con el plásmido pJLKH6 el cual había sido digerido con Bglll y Bsu36I. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las • colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK3d fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pJLK41 El plásmido pJLK3d fue digerido con Ndel y Xbal y el fragmento de aproximadamente 13 kpb fue ligado con el plásmido pCJR24 el cual había sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK41 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 10 Uso del plásmido pJLK41 para la construcción de JC2/pJLK41 y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK41 para transformar los protoplastos de S . erythra ea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. De varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE. JC2/pJLK41 fue sembrado en placas sobre agar SM3 que contenía 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados (mediante comparación con el material auténtico) como la d-lactona del ácido (2S, 4S, 5R) -2, 4-dimetil-5-hidroxi-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2S, 4S, 5R) -2, 4-dimetil-5-hidroxi-n-heptanoico .

Ejemplo 11 Construcción del plásmido pJLK29 El plásmido pJLK29 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 10 de la PKS de rap ha sido insertado dentro del mes. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue. (Figura 5).

Construcción del plásmido pJLK121.1 El segmento de ADN de aproximadamente 2.2 kpb del gen rapB de S . hygroscopi cus que codifica para el rizo reductivo del módulo 10 fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' y 5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3' y como plantilla un fragmento de aproximadamente 7 kpb, el cual ha sido obtenido mediante digestión del cósmido cos 26 (Sch ecke, T. Et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92: 7839-7843) con Seal y Sphl. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK121.1 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK29 El plásmido pJLK121.1 fue digerido con Bglll y Nhel y el fragmento de 2.2 kpb fue ligado con el plásmido pJLK117 el cual había sido digerido con Bglll y Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK29 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 12 Uso del plásmido pJKL29 para la construcción de JC2/pJLK29 de S . erythra ea y la producción de tricétidos Aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK29 fueron utilizados para transformar los protoplastos de S . erythra ea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la triostreptona . A partir de varias colonias se obtuvo el ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE. JC2/pJLK29 se utilizó para inocular 30 ml del medio SM3 que contenía 5 µg/ml de tiostreptona en un matraz de 250 ml con un resorte simple para reducir la aglomeración, agitando a 300 rpm y a 30°C. Después de 8 días el caldo se centrifugó, el sobrenadante se ajustó a pH 3 y se extrajo tres veces con un volumen igual de acetato de etilo. El solvente se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante HPLC y espectroscopia de masa de electrorrocío y, después de la conversión al éster metílico con el trimetilsilil-diazometano por GC/MS.

Los productos mayores fueron identificados (por comparación con el material auténtico) como el ácido (4S, 5R) -5-hidroxi-2, 4-dimetil-n-hex-2-enoico y como el ácido (4S, 5R) -5-hidroxi-2, 4-dimetil-n-hept-2-enoico .

Ejemplo 13 Construcción del plásmido pJLK35 El plásmido pJLK35 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 1 de la PKS de tilosina ha sido insertado dentro del mes. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue. (Figura 5) .

Construcción del plásmido pJLK33.1 El segmento de ADN de aproximadamente 1.6 kpb del gen de PKS de la tilosina de S . fradi ae que codifica para el rizo reductivo del módulo 1 fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5'-TAAGATCTCCCTACGTACCCCTTCAACCAC-3' y 5'-GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-3' y el cósmido 6T (cósmido que contiene los genes de PKS productores de tilosina) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUC18, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK33.1 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK35 El plásmido pJLK33.1 fue digerido con Bglll y Nhel y el fragmento de 1.6 kpb fue ligado con el plásmido pJLK117 el cual había sido digerido con Bglll y Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK35 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 14 Uso del plásmido pJLK35 para la construcción de S . erythraea JC2/pJLK35 y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK35 para transformar los protoplastos de S . erythra ea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. De varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE. JC2/pJLK35 fue sembrado en placas sobre agar SM3 que contenía 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados (por comparación con el material auténtico) como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2 , 4-dimetil-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2, 4-dimetil-n-heptanoico .

Ejemplo 15 Construcción del plásmido pRIF7 El plásmido pRIF7 es un plásmido basado en pJLK117 que contiene el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 7 de la PKS de rifamicina que ha sido insertada dentro del mes. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue. (Figura 5).

Construcción del plásmido pUCRIF7 El segmento de ADN de aproximadamente 2.1 kpb del gen de la PKS de rifamicina de Amycol a topsi s medi terranei que codifica para el rizo reductivo del módulo 7 fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-3' y 5'-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT y el cósmido 6 (cósmido comenzando en 35727 y más allá del 76199, números de acuerdo al número de acceso AF040570) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pUCRIF7 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pRIF7 El plásmido pUCRIF7 fue digerido con SnaBI y Nhel y el fragmento de 2.1 kpb fue ligado con el plásmido pJLK117 el cual habia sido digerido con SnaBI y Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pRIF7 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 16 Uso del plásmido pRIF7 para la construcción de JC2/pRIF7 de S . erythra ea y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 µg del plásmido pRIF7 para transformar los protoplastos de S . erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. De varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se ha integrado dentro del TE.

JC2/pRIF7 fue sembrado en placas sobre agar SM3 que contenía 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml ) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 µl de ácido fórmico. El solvente se decantó y se eliminó mediante evaporación y el residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados (por comparación con el material auténtico) como la d-lactona del ácido (2S, 3S, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2 , 4-dimetil-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2, 4-dimetil-n-heptanoico .

Ejemplo 17 Construcción del plásmido pJLK52 El plásmido pJLK52 es un plásmido basado en pJLK35 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga de ery, el primero, el segundo y el tercer módulos de extensión del cúmulo ery y la tioesterasa de terminación de cadena de ery, excepto que el segmento de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el comienzo del ACP del segundo módulo de extensión de ery ha sido sustituido por el segmento equivalente del módulo 1 de la PKS de tilosina. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue.

Construcción del plásmido pJLK50 El segmento de ADN de aproximadamente 6.1 kpb del cúmulo de genes de PKS de eritromicina de S . erythra ea que codifica para el fragmento de ADN proveniente del comienzo del ACP del módulo 2 al comienzo del ACP del módulo 3, fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' y 5'-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3' y el plásmido pBAM25 como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK50 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK52 El plásmido pJLK50 fue digerido con Nhel y el inserto de 6.1 kpb fue ligado con el plásmido pJLK35 el cual había sido digerido con Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK52 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 18 Uso del plásmido pJLK52 para la construcción de S . erythra ea NRRL2338/pJLK52 y la producción de tetracétidos y macrólidos Aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK52 fueron utilizados para transformar protoplastos de S. erythra ea NRRL233d y se aislaron las colonias estables resistentes a la triostreptona . A partir de varias colonias se aisló el ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se había integrado en el TE. S . erythra e NRRL2338/pJLK52 fue utilizado para inocular el medio SM3 que contenía 5 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por siete a doce días a 28-30°C. Después de este tiempo, el caldo se centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH = 9.5. El sobrenadante fue luego extraído tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el solvente se eliminó mediante evaporación. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS por HPLC/MS y MS-MS. Los tetracétidos fueron identificados mediante GC/MS. Los componentes mayores fueron El siguiente macrólido fue identificado mediante HPLC/MS, MS-MS y RMN 2H (éste estuvo acompañado por productos de procesamiento incompletos por las enzimas post-PKS) .

Ejemplo 19 Construcción del plásmido pJLK53 El plásmido pJLK53 es un plásmido basado en pJLK26 que contiene un gen PKS que comprende el módulo de carga de ery, el primero, el segundo y el tercer módulo de extensión del cúmulo ery y la tioesterasa de terminación de cadena de ery, excepto que el segmento de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el comienzo del ACP del segundo módulo de extensión de ery, ha sido sustituido por el segmento equivalente del módulo 13 de la PKS de rapamicina. Esto fue construido como sigue. El plásmido pJLK50 fue digerido con Nhel y el inserto de 6.1 kpb fue ligado con el plásmido pJLK2d que había sido digerido con Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK53 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 20 Uso del plásmido pJLK53 para la construcción de S . erythraea NRRL2338/pJLK53 y la producción de derivados de TKL Aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK53 fueron utilizados para transformar protoplastos de S . erythra ea NRRL2338 y se aislaron las colonias estables resistentes a la triostreptona . A partir de varias colonias se aisló el ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se había integrado en el TE. S . erythra e NRRL2338/pJLK53 fue utilizado para inocular el medio SM3 que contenía 5 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por siete a diez días a 28-30°C. Después de este tiempo, el caldo se centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH = 9.5. El sobrenadante fue luego extraído tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el solvente se eliminó mediante evaporación. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS por HPLC/MS y MS-MS. Los tetracétidos fueron identificados mediante GC/MS. El componente mayor fue El siguiente macrólido fue identificado mediante HPLC/MS, MS-MS y RMN 1E (éste estuvo acompañado por productos de procesamiento incompletos por las enzimas post-PKS) .

Ejemplo 21 Construcción del plásmido pJLK54 El plásmido pJLK54 es un plásmido basado en pJLK29 que contiene un gen PKS que comprende el módulo de carga de ery, el primero, el segundo y el tercer módulos de extensión del cúmulo ery y la tioesterasa de terminación de cadena de ery, excepto que el segmento de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el comienzo del ACP del segundo módulo de extensión de ery, ha sido sustituido por el segmento equivalente del módulo 10 de la PKS de rapamicina. Esto fue construido como sigue. El plásmido pJLK50 fue digerido con Nhel y el inserto de 6.1 kpb fue ligado con el plásmido pJLK29 que había sido digerido con Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK54 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 22 Uso del plásmido pJLK54 para la construcción de S . erythra ea NRRL2338/pJLK54 y la producción de derivados de tetracétido y macrólidos Aproximadamente 5 µg del plásmido pJLK54 fueron utilizados para transformar protoplastos de S . erythraea NRRL233d y se aislaron las colonias estables resistentes a la triostreptona . A partir de varias colonias se aisló el ADN total y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern, para confirmar que el plásmido se había integrado en el TE. S . erythra e NRRL2336/pJLK54 fue utilizado para inocular el medio SM3 que contenía 5 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por siete a diez días a 28-30°C. Después de este tiempo, el caldo se centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH = 9.5. El sobrenadante fue luego extraído tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el solvente se eliminó mediante evaporación. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS por HPLC/MS y MS-MS. Los tetracétidos fueron identificados mediante GC/MS. Los componentes mayores fueron El siguiente macrólido fue identificado mediante HPLC/MS, MS-MS y RMN aH (éste estuvo acompañado por productos - de procesamiento incompletos por las enzimas post-PKS) .

Avermectinas Ejemplo 23 Construcción de pJLK136 El plásmido pJLK136 es un plásmido basado en pWHM3 que comprende la región flanqueante con dirección hacia arriba (5') y con dirección hacia abajo (3') del rizo reductivo del módulo 2 del gen PKS de la avermectina y el gen de resistencia a la eritromicina insertado en el mes que conecta estos dos fragmentos. El plásmido p HM3 es descrito en Vara J. y colaboradores, J. Bacteriol. 1989, 171: 5872-5881. El plásmido pJLK136 fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue (Figura 6) .

Construcción de pJLK130 El segmento de ADN de aproximadamente 2.4 kpb del gen PKS de la avermectina de S . a vermi ti li s que codifica para la región con dirección hacia arriba (5') del rizo reductivo del módulo 2 fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -GACGCCGAATTCTTCGGCATCAGCCCCCGCGAAG-3' Y 5'- GAGCTAGCAGGTGGGGAGATCTAGGTGGGTGTGGGTGTGGGGTTGGTTGTGG TGGTGGGTGTA-3' y el plásmido pIG22 (Gallo ay, I. S. (1998) Tesis, Univesity of Cambridge, Reino Unido) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura utilizada para transformar células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK130 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción de pJLK131 El segmento de ADN de aproximadamente 2.0 kpb del gen PKS de la avermectina de S . a vermi tili s que codifica para la región con dirección hacia abajo (3') del rizo reductivo del módulo 2 fue modificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-3' y 5'-GGGAATTCCTCGAGGATGACGTGGGCGTTGGTGC-3' y el plásmido pIG25 (Galloway, I. S. (1998) Tesis University of Cambridge, Reino Unido) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado por digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK131 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción de plásmido pJLK132 El plásmido pJLK130 fue digerido con Nhel y Xbal y el inserto de aproximadamente 2.4 kpb fue ligado con el plásmido pJLK131 el cual había sido digerido con Nhel y Xbal. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales se verificaron para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK132 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción de plásmido pJLK133 El plásmido pJLKH7 fue digerido con Bglll y Nhel y el inserto de aproximadamente 0.1 kpb fue ligado con el plásmido pJLK132 el cual había sido digerido con Bglll y Nhel. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales se verificaron para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK133 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción de pJLK134.

El segmento de ADN de aproximadamente 1.9 kpb del cúmulo de genes de eritromicina de S. erythraea que codifica para la resistencia a la eritromicina fue amplificado por PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-3' y 5'-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGTCCGCCG-3 y el plásmido pRH3 (Dhillon, N. y colaboradores, Molecular Microbiology (1969) 3:1405-1414) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado por digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK134 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción de plásmido pJLK135 El plásmido pJLK134 fue digerido con Bglll y Nhel y el inserto de aproximadamente 1.9 kpb fue ligado con el plásmido pJLK133 el cual había sido digerido con BglIII y Nhel. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales se verificaron para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK135 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción de plásmido pJLK136 El plásmido pJLKl35 fue digerido con EcoRI y el inserto de aproximadamente 6.3 kpb fue ligado con el plásmido pWHM3 el cual había sido digerido con EcoRI y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK136 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 24 Uso del plásmido pJLK136 Se utilizaron aproximadamente 10 µg del plásmido pJLK136 para transformar los protoplastos de S . a vermi ti l i s (MacNeil, D. J. y Klapko, C. M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218) y se aislaron las colonias estables y resistentes a la tiostreptona y a la eritromicina. Se seleccionaron las colonias individuales y se subcultivaron cuatro veces en medio líquido no selectivo, seguido por la preparación y regeneración de los protoplastos (medio de acuerdo a McNeil T. y colaboradores J. Bacteriol. (1993) 175:2552-2563). Las colonias sensibles a la tiostreptona y resistentes a la eritromicina se aislaron y caracterizaron por hibridación por manchado de Southern. Una colonia tal fue designada S . avermi ti li s/JLKl .

Ejemplo 25 Construcción del plásmido pJLK137 El plásmido pJLK120 fue digerido con Bglll y Nsil y el inserto de aproximadamente 3.2 kpb fue ligado con el plásmido pJLK133 el cual había sido digerido con Bglll y Nsil. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes, y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK137 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción de plásmido pJLK138 El plásmido pJLK137 fue digerido con EcoRI y el inserto de aproximadamente 7.6 kpb fue ligado con el plásmido pWHM3 el cual había sido digerido con EcoRI y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK138 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 26 Uso del plásmido pJLK138 Se utilizaron aproximadamente 10 µg del plásmido pJLK138 para transformar los protoplastos de S . avermi ti li s (MacNeil, D. J. y Klapko, C. M. Journal of Industrial Microbiology (1967) 2:209-218) y se aislaron las colonias estables y resistentes a la tiostreptona y a la eritromicina. Se seleccionaron las colonias individuales y se subcultivaron cuatro veces en medio líquido no selectivo, seguido por la preparación y regeneración de los protoplastos (medio de acuerdo a McNeil T. y colaboradores J. Bacteriol. (1993) 175:2552-2563) . Las colonias sensibles a la tiostreptona y resistentes a la eritromicina se aislaron y caracterizaron por hibridación por manchado de Southern. Un colonia de S . a vermi ti li s/pJ K140 fue utilizada para inocular el medio líquido (fermentación de acuerdo a Pang, C-H. y colaboradores J. Antibiotics (1995) 48:59-66). Los cultivos fueron cosechados y los productos aislados y purificados como se describe en la literatura (Pang, C-H. y colaboradores J. of Antibiotic (1995) 48:59-66) . Los productos fueron analizados mediante HPLC/MS (Cromatografía Líquida de Alta Resolución/Espectroscopia de Masa) y RMN-aH (Resonancia Magnética Nuclear de Protones) y pudo ser identificado el siguiente compuesto: Ejemplo 27 Construcción del plásmido pJLK139 El plásmido pJLK121.1 fue digerido con Bglll y Nhel y el fragmento de 2.2 kpb fue ligado con el plásmido pJLK133 el cual había sido digerido con Bglll y Nhel. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales se verificaron para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK139 fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción de plásmido pJLK140 El plásmido pJLK139 fue digerido con EcoRI y el inserto de aproximadamente 6.6 kpb fue ligado con el plásmido p HM3 el cual había sido digerido con EcoRI y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK140 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 28 Uso del plásmido pJLK140 Se utilizaron aproximadamente 10 µg del plásmido pJLK140 para transformar los protoplastos de S . avermi ti li s (MacNeil, D. J. y Klapko, C. M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2:209-218) y se aislaron las colonias estables y resistentes a la tiostreptona y a la eritromicina. Se seleccionaron las colonias individuales y se subcultivaron cuatro veces en medio líquido no selectivo, seguido por la preparación y regeneración de los protoplastos (medio de acuerdo a McNeil T. y colaboradores J. Bacteriol. (1993) 175:2552-2563) . Las colonias sensibles a la tiostreptona y resistentes a la eritromicina se aislaron y caracterizaron por hibridación por manchado de Southern. Un colonia de S . a vermi ti l i s/pJLK140 fue utilizada para inocular el medio líquido (fermentación de acuerdo a Pang, C-H. y colaboradores J. Antibiotics (1995) 48:59-66) . Los cultivos fueron cosechados y los productos aislados y purificados como se describe en la literatura (Pang, C-H. y colaboradores J. of Antibiotic (1995) 48:59-66). Los productos fueron analizados mediante HPLC/MS y RMN-1H y pudo ser identificado el siguiente compuesto: Ejemplo 29 Construcción del plásmido pJLK30 PJLK30 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 1 de la PKS de la avermectina ha sido insertado dentro del poliligador utilizando los sitios de restricción Bglll y Nhel. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios .

Construcción del plásmido pIG67 El segmento de ADN de aproximadamente 1.7 kpb del gen de la PKS de la avermectina de S . avermi tili s que codifica para el rizo reductivo del módulo 1 fue amplificado mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos sintéticos como cebadores : 5' -CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-3' y 5'-TGGGCTAGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGT-3' y como plantilla ya sea el plásmido pIG155, el cual contiene los primeros dos módulos de la PKS de la avermectina clonada dentro del plásmido pT7-7, o el ADN cromosómico de Streptomyces a vermi ti li s . El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado por digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pIG67 fue identificado por su patrón de restricción y por el secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK30 El plásmido pIG67 fue digerido con Bglll y Nhel y el inserto de aproximadamente 1.7 kpb fue ligado con el plásmido pJLK117 el cual había sido digerido con Bglll y Nhel. La mezcla de ligadura se utilizó para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes, y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK30 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 30 Uso del plásmido pJLK30 para la construcción de S. erythraea. JC2/pJLK30 y la producción de tricétidos Aproximadamente 5 mg del plásmido pJLK30 fueron utilizados para transformar protoplastos de S . erythra ea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. Se obtuvo el ADN total de varias colonias y se analizó mediante hibridación por manchado Southern para confirmar que el plásmido se había integrado dentro TE. S . erythra ea JC2/pJLK30 se sembró en placas sobre agar SM3 que contenía 50 mg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce dias a 30°C. 1 cm2 de placa fue homogeneizado y extraído con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo y 20 ml de ácido fórmico. El solvente se decantó y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y por espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2 , 4-dimetil-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2 , 4-dimetil-n-heptanoico (total de 25 mg/l) . Casi ninguna de las 3-cetolactonas correspondientes pudo ser detectada.

Ejemplo 31 Construcción del plásmido pGMS2 PGMS2 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 1 de la PKS de avermectina ha sido insertado dentro del poliligador utilizando los sitios de restricción PsTI y Bsu36l. Éste fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios .

Construcción del plásmido pIG68 El segmento de ADN de aproximadamente 1.7 kpb del gen de la PKS de la avermectina de S . avermi ti l i s que codifica para el rizo reductivo del módulo 1 fue amplificado mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos sintéticos como cebadores : 5'-TGGCTGCAGAGCTCACAGCCGGGTGCCGGATCCGGTT-3' y 5' -TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-3' y como plantilla ya sea el plásmido pIG155, el cual contiene los primeros dos módulos de la PKS de avermectina clonada dentro del plásmido pT7-7, o el ADN cromosómico de Strept omyces a vermi ti li s . El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUC18, el cual había sido linearizado por digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pIG68 fue identificado por su patrón de restricción y por secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pGMSl El plásmido pIG68 fue digerido con PstI y Bsu36I y el fragmento de 1.7 kpb fue ligado con el plásmido pJLK116 el cual había sido digerido con PstI y Bsu36I. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pGMSl fue identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pGMS2 El plásmido pGMSl fue digerido con Ndel y Xbal y el fragmento de aproximadamente 11.5 kpb fue ligado con el plásmido pCJR24 el cual había sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . col i DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pGMS2 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 32 Uso del plásmido pGMS2 para la construcción de S , erythraea JC2/pGMS2 y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 mg del plásmido pGMS2 para transformar los protoplastos de S . erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. Se obtuvo el ADN total a partir de varias colonias y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern para confirmar que el plásmido se había integrado dentro del TE. S . erythra ea JC/pGMS2 fue sembrado en placa sobre agar SM3 que contenía 50 µg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo con 20 ml de ácido fórmico. El solvente se decantó y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos fueron identificados como d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2, 4-dimetil-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S, 5R) -5, 3-dihidroxi-2 , 4-dimetil-n-heptanoico (total de 17 mg/litro) , y también una cantidad sustancial de la 3-cetolactona correspondiente (5.5 mg/litro).

E emplo 33 Construcción del plásmido pJLK31 pJLK31 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 2 de la PKS de avermectina ha sido insertado dentro del poliligador utilizando los sitios de restricción Bglll y Nhel. Este fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios .

Construcción del plásmido pIG69 El segmento de ADN de aproximadamente 2.4 kpb del gen de la PKS de avermectina de S . avermi ti li s que codifica para el rizo reductivo del módulo 2 fue amplificado mediante PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos sintéticos como cebadores : 5' -CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCACTACTG-3' y 5' -CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-3' y como plantilla ya sea el plásmido pIG155, el cual contiene los primeros dos módulos de la PKS de avermectina clonada dentro del plásmido pT7-7, o el ADN cromosómico de Strept omyces a vermi ti l i s . El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUC18, el cual había sido linearizado por digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pIG69 fue identificado por su patrón de restricción y por secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK31 El plásmido pIG69 fue digerido con Bglll, Nhel y Dral y el fragmento de 2.4 kpb fue ligado con el plásmido pJLK117 el cual había sido digerido con Bglll y Nhel. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK31 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 34 Uso del plásmido pJLK31 para la construcción de S. erythraea JC2/pJLK31 y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 mg del plásmido pJLK31 para transformar los protoplastos de S. erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. Se obtuvo el ADN total a partir de varias colonias y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern para confirmar que el plásmido se había integrado dentro del TE. S. erythraea JC/pJLK31 fue sembrado en placa sobre agar SM3 que contenía 50 mg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo con 20 ml de ácido fórmico. El solvente se decantó y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío. Los productos principales fueron identificados como la d-lactona del ácido (2R, 3R, 4S,5R) -5,3-dihidroxi-2, 4-dimetil-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R,3R, 4S,5R)-5,3-dihidroxi-2, 4-dimetil-n-heptanoico (total de 30 mg/litro) .

Ejemplo 35 Construcción del plásmido pGMS4 pGMS4 es un plásmido basado en pJLK117 excepto que el ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 2 de la PKS de avermectina ha sido insertado dentro del poliligador utilizando los sitios de restricción SnaBI y Bsu36I. Este se construyó vía varios plásmido intermediarios.

Construcción del plásmido pIG70 El segmento de ADN de aproximadamente 2.4 kpb del gen de la PKS de avermectina de S. avermitilis que codifica para el rizo reductivo del módulo 2 , fue amplificado por PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos sintéticos como cebadores : 5'-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-3' y 5'-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-3' como plantilla ya sea el plásmido pIG155, el cual contiene los primeros dos módulos de la PKS de avermectina clonada dentro del plásmido pT7-7, o el ADN cromosómico de Streptomyces avermi tili s . El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pIG70 fue identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pGMS3 El plásmido pIG70 fue digerido con SnaBI, Bsu36I y Dral y el fragmento de 2.4 kpb fue ligado con el plásmido pJLK116 el cual había sido digerido con SnaBI y Bsu36l. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pGM23 fu identificado por su patrón de restricción.

Construcción del plásmido pGMS4 El plásmido pGMS2 fue digerido con Ndel y Xbal y el fragmento de aproximadamente 12.4 kpb fue ligado con el plásmido pCJR24 el cual había sido digerido con Ndel y Xbal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pGMS4 fue identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 36 Uso del plásmido pGMS4 para la construcción de 5, erythraea. JC2/pGMS4 y la producción de tricétidos Se utilizaron aproximadamente 5 mg del plásmido pGMS4 para transformar los protoplastos de S . erythraea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. Se obtuvo el ADN total a partir de varias colonias y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern para confirmar que el plásmido se había integrado dentro del TE. S . erythra ea JC/pGMS4 fue sembrado en placa sobre agar SM3 que contenía 50 mg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo con 20 ml de ácido fórmico. El solvente se decantó y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Únicamente se detectaron trazas de productos de tricétido putativos.

Ejemplo 37 Construcción del plásmido pJLK27 El plásmido pJLK27 es un plásmido basado en pJLK114 excepto que el fragmento de ADN que codifica para el rizo reductivo del módulo 13 de la PKS de rap ha sido insertado dentro del mes. Este fue construido por medio de varios plásmidos intermediarios como sigue.

Construcción del plásmido pJLK120a El segmento de ADN de aproximadamente 3.2 kpb del gen rapC de S . hygroscopi cus que codifica para el rizo reductivo del módulo 13 fue amplificado mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos sintéticos: 5' -TACCTAGGCACCACCACAACCCGGGTA-3' y 5'-TACAATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-3' y el cósmido cos 31 (Schwecke, T. et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci.

EUA 92: 7839-7d43) como plantilla. El producto de PCR fue tratado con la polinucleótido-cinasa T4 y luego ligado con el plásmido pUCld, el cual había sido linearizado mediante digestión con Smal y luego tratado con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E . coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK120a fu identificado por su patrón de restricción y secuenciamiento de ADN.

Construcción del plásmido pJLK27 El plásmido pJLK120a fue digerido con Avrll y Hpal y el fragmento de 3.2 kpb fue ligado con el plásmido pJLK114 el cual había sido digerido con Avrll y Hpal. La mezcla de ligadura fue utilizada para transformar las células de E. coli DH10B electrocompetentes y las colonias individuales fueron verificadas para su contenido de plásmido. El plásmido deseado pJLK27 fu identificado por su patrón de restricción.

Ejemplo 38 Uso del plásmido pJLK27 para la construcción de JC2/pJLK27 y la producción de trisétidos Se utilizaron aproximadamente 5 mg del plásmido pJLK27 para transformar los protoplastos de S . erythra ea JC2 y se aislaron las colonias estables resistentes a la tiostreptona. Se obtuvo el ADN total a partir de varias colonias y se analizó mediante hibridación por manchado de Southern para confirmar que el plásmido se había integrado dentro del TE. S . erythra ea JC/ pJLK27 fue sembrado en placa sobre agar SM3 que contenía 50 mg/ml de tiostreptona y se dejó desarrollar por doce días a 30°C. 1 cm2 (0.5 ml ) de la placa se homogeneizó y se extrajo con una mezcla de 1.2 ml de acetato de etilo con 20 ml de ácido fórmico. El solvente se decantó y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol y se analizó mediante GC/MS y espectroscopia de masa de electrorrocío . Los productos mayores fueron identificados (mediante comparación con el material auténtico) como la d-lactona del ácido (2R, 4S, 5R) -2, 4-dimetil-5-hidroxi-n-hexanoico y como la d-lactona del ácido (2R, 4S, 5R) -2 , 4-dimetil-5-hidroxi-n-heptanoico (total de 41 mg/litro) , con alguna de las 3-cetolactonas correspondientes (total de 12 mg/litro) y las 3-hidroxilactonas (total de 2.8 mg) .

Todos los documentos y los depósitos de secuencias a los que se hace referencia en la presente son explícita e individualmente incorporados por referencia en la presente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (27)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos parte de una policétido-sintasa Tipo I, comprendiendo dicha parte al menos parte de un módulo de extensión, caracterizado el ácido nucleico porque tiene, en lugar de uno o más genes que codifican para las enzimas asociadas con la reducción, un poliligador con sitios de enzima de restricción múltiples.

2. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el poliligador está en lugar de todos los genes que codifican para las enzimas que están asociadas con la reducción y las cuales están normalmente incluidas en dicho módulo de extensión.

3. Un ácido nucleico que codifica para al menos parte de una policétido-sintasa de Tipo I, dicha parte comprende al menos parte de un módulo de extensión, caracterizado el ácido nucleico porque tiene un poliligador con múltiples sitios de enzima de restricción, cuyo poliligador conecta el ácido nucleico que codifica para al menos parte de una enzima acil-transferasa, al ácido nucleico que codifica para al menos parte de una proteína portadora de acilo.

4. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos alguno de los sitios de restricción incluidos en el poliligador están ausentes del ácido nucleico que codifica para la policétido-sintasa de Tipo I.

5. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos alguno de los sitios de restricción incluidos en el poliligador son no comunes en o están ausentes de otras secuencias de ácido nucleico de origen natural que codifican para las enzimas reductivas de las policétido-sintasas de Tipo I.

6. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque el poliligaldor incluye al menos algunos de los siguientes sitios de restricción: Avrll, Bglll; Snal; PstI; Spel; Nsil; Bsu36I; Nhel; y Hpal.

7. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque codifica además para un módulo de carga.

8. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque codifica además para uno o más módulos de extensión adicionales.

9. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque incluye además una secuencia de ácido nucleico incorporada dentro del poliligador, cuyo ácido nucleico incorporado codifica para una o más enzimas reductivas.

10. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque una o más enzimas reductivas es/son una ß-cetorreductasa, una deshidratasa y/o una enoilreductas .

11. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque una o más enzimas reductivas incluyen al menos una ß-cetorreductasa .

12. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10 ó la reivindicación 11, caracterizado porque al menos una o más de las enzimas reductivas es proveniente de un módulo de extensión diferente de la misma policétido-sintasa que al menos parte de una policétido-sintasa de Tipo I.

13. Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque al menos una o más de las enzimas reductivas es proveniente de una diferente policétido-sintasa .

14. Un vector, caracterizado porque incluye un ácido nucleico de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

15. Una célula huésped, caracterizada porque es transfectada, transformada o conjugada con un ácido nucleico o un vector como se define de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

16. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque es una célula de una especie de Strept omyces .

17. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es una célula de S . erythraea o S . avermi tili s .

18. Un método para producir un ácido nucleico que codifica para una novedosa plicétido-sintasa, caracterizado el método porque incluye los pasos de: i) proporcionar un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y ii) incorporar dentro de dicho ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una enzima reductiva.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una enzima reductiva es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13.

20. Un método para producir un producto de fermentación que contiene un policétido, caracterizado el método porque incluye el paso de cultivar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 15.

21. Un producto de fermentación, caracterizado porque contiene una dihidroavermectina de 22 a 23 átomos de carbono, sustancialmente libre de otros macrólidos.

22. Un producto de fermentación de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la dihidroavermectina es ivermectina.

23. Un producto de fermentación, caracterizado porque contiene una avermectina Bl sustancialmente libre de avermectinas B2.

24. Un método para producir un policétido, caracterizado el método porque incluye los pasos de: i) proporcionar un producto de fermentación que resulte del método de conformidad con la reivindicación 20, o un producto de fermentación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23; y ii) purificar al menos parcialmente un policétido de dicho producto de fermentación.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el policétido es una avermectina.

26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la avermectina es una avermectina Bl.

27. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la avermectina es una avermectina B2.