DE60033835T2

DE60033835T2 - Heterologe herstellung von polyketiden

Info

Publication number: DE60033835T2
Application number: DE60033835T
Authority: DE
Inventors: Daniel San Francisco SANTI; Larry San Carlos PECK; Linda Belmont DAYEM; James San Rafael KEALEY
Original assignee: Kosan Biosciences Inc
Current assignee: Kosan Biosciences Inc
Priority date: 1999-10-27
Filing date: 2000-10-27
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-10-28
Also published as: IL148934A0; ES2283323T3; EP1224300B1; MXPA02004153A; DE60033835D1; US7291486B2; US7011959B1; AU1105201A; US20040185541A1; NZ518259A; ATE356216T1; WO2001031035A2; EP1224300A2; US20020142401A1; EP1224300B9; JP2003512073A; US20090098615A1; WO2001031035A3; CA2388422A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Verfahren und Materialien zur Herstellung von Polyketiden durch rekombinante DNA Technologie zur Verfügung. Die Erfindung liegt auf den Gebieten der Landwirtschaft, Tierhaltung, Chemie, medizinischen Chemie, Medizin, Molekularbiologie, Pharmakologie und Veterinärtechnologie.
Hintergrund der Erfindung
Polyketide stellen eine große Familie von diversen Verbindungen dar, die aus 2-Kohlenstoffeinheiten durch eine Folge von Kondensationen und nachfolgenden Modifikationen synthetisiert werden. Polyketide treten in vielen Typen von Organismen auf, einschließlich Pilzen und mycelischen Bakterien, insbesondere den Aktinomyceten. Es gibt eine breite Vielzahl von Polyketid Strukturen, und die Klasse der Polyketide umfasst zahlreiche Verbindungen mit diversen Aktivitäten. Erythomycin, FK-506, FK-520, Megalomicin, Narbomycin, Oleandomycin, Picromycin, Rapamycin, Spinomycin und Tylosin sind Beispiele solcher Verbindungen. Wegen der Schwierigkeit Polyketid-Verbindungen durch traditionelle chemische Methodologie herzustellen, und der typischerweise geringen Produktion von Polyketiden in Wildtyp Zellen, gibt es ein beträchtliches Interesse verbesserte oder alternative Produktionsmittel für Polyketid Verbindungen zu finden (s. PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 93/13663; WO 95/08548; WO 96/40968; 97/02358; und 98/27203; Vereinigte Staaten Patent Nr. 4,874,748; 5,063,155; 5,098,837; 5,149,639; 5,672,491; 5,712,146; und 5,962,290; Fu et al., 1994, Biochemistry 33: 9321-9326; McDaniel et al., 1993, Science 262: 1546-1550; und Rohr, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34(8): 881-888).
Polyketide werden in der Natur durch Polyketid Synthase (PKS) Enzyme synthetisiert. Diese Enzyme, die Komplexe sind von multiplen großen Proteinen, sind den Synthasen ähnlich, die die Kondensierung von 2-Kohlenstoff Einheiten bei der Biosynthese von Fettsäuren katalysieren. PKS Enzyme sind durch PKS Gene kodiert, die gewöhnlich aus drei oder mehr offenen Leserahmen (ORFs) bestehen. Zwei Haupttypen von PKS Enzymen sind bekannt; diese unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung und Syntheseweise. Diese zwei Haupttypen von PKS Enzymen werden gemeinhin als Typ I oder „modulare" oder Typ II „iterative" PKS Enzyme bezeichnet. Ein dritter Typ von PKS, der primär in Pilzzellen gefunden wird, besitzt Merkmale sowohl von Typ I als auch Typ II Enzymen und wird als ein „fungales" PKS Enzym bezeichnet.
Modulare PKSs sind verantwortlich für die Herstellung einer großen Anzahl von 12-, 14- und 16-gliedrigen Marcrolid-Antibiotika einschließlich Erythomycin, Megalomicin, Methymycin, Narbomycin, Oleandomycin, Picromycin und Tylosin. Jedes ORF eines modularen PKS kann ein, zwei oder mehr „Module" einer Ketosynthase Aktivität umfassen, jedes Modul davon besteht aus wenigstens zwei (falls es ein Ladungsmodul ist) und typischer aus drei (für das einfachste Verlängerungsmodul) oder mehr enzymatischen Aktivitäten oder „Domänen". Diese großen multifunktionalen Enzyme (> 300,000 kDa) katalysieren die Biosynthese von Polyketid Macrolactonen durch Multischrittwege, die decarboxylierende Kondensationen zwischen Acylthioestern, gefolgt von Zyklen variierender β-Kohlenstoff Prozessierungsaktivitäten, umfassen (siehe O'Hagan, D. The polyketide metabolites; E. Horwood: New York, 1991). Während des vergangenen halben Jahrzehnts wurde das Studium der modularer PKS Funktion und Spezifität stark vereinfacht durch das Plasmid basierte Streptomyces coelicolor Expressionssystem, das mit den 6-Deoxyerythronolid B (6-dEB) Synthase (DEBS) Genen entwickelt wurde (siehe Kao et al., 1994, Science, 265: 509-512, McDaniel et al., 1993, Science 262: 1546-1557, und U.S. Patent Nr. 5,672,491 und 5,712,146).
Die Vorteile dieses Plasmid basierten genetischen Systems für DEBS sind, dass es die aufwändigen und begrenzten Techniken zur Manipulation des natürlichen DEBS Wirtsorganismus, Saccharopolyspora erythraea, überwindet, und die Komplexität der PKS Analyse durch Bereitstellen eines „sauberen" Wirtshintergrundes reduziert. Dieses System beschleunigte auch die Konstruktion der ersten kombinatorischen modularen Polyketid Bibliothek in Streptomyces (siehe PCT Veröffentlichungsnr. WO 98/49315 und 00/024907). Die Fähigkeit Aspekte der Polyketid Biosynthese durch genetische Manipulation der PKSs zu kontrollieren, wie Monomerselektion und Grad des β-Kohlenstoff Prozessierens, hat großes Interesse an der kombinatorischen Konstruktion neuer Antibiotika hervorgerufen (siehe Hutchinson, 1998, Curr. Opin. Microbiol. 1: 319-329; Carreras und Santi, 1998, Curr. Opin. Biotech. 9: 403-411; und U.S. Patent Nr. 5,712,146 und 5,672,491). Dieses Interesse führte zur Klonierung, Analyse von Genen und Manipulation mittels rekombinanter DNA Technologie, die für PKS Enzyme kodieren. Die sich ergebende Technologie erlaubt es, einen bekannten PKS Gen-Cluster zu manipulieren, um entweder das Polyketid durch das PKS auf höheren Niveaus zu produzieren als solche, die in der Natur auftreten, oder in Wirten, die sonst nicht das Polyketid produzieren. Die Technologie erlaubt einem auch, Moleküle zu produzieren, die strukturell verwandt sind mit, aber unterschiedlich von den Polyketiden, die von bekannten PKS Gen-Clustern produziert werden, sich von diesen jedoch unterscheiden.
Es hat ein großes Interesse an der Expression von Polyketiden gegeben, die durch Typ I und Typ II PKS Enzyme in Wirtszellen produziert werden, die normalerweise solche Enzyme nicht exprimieren. Zum Beispiel wurden Produktion der fungalen Polyketid 6-Methylsalicylsäure (6- MSA) in heterologen E. coli, Hefe- und Pflanzenzellen berichtet (siehe Kealey et al., Jan. 1998, Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic host, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505-9, U.S. Patent Nr. 6,033,883 und PCT Patentveröffentlichungsnr. 98/27203 und 99/02669). Heterologe Produktion von 6-MSA wurde benötigt oder beträchtlich erhöht durch Koexpression einer heterologen Acyl-Carrier-Protein-Synthase (ACPS) und dadurch dass, für E. coli, Medienzusätze hilfreich waren beim Erhöhen des Niveaus des Malonyl-CoA Substrats, die bei der 6-MSA Biosynthese verwendet wurde (siehe auch PCT Patentveröffentlichungsnr. 97/13845).
Khosla et al., Annu. Rev. Biochem. 1999 68: 219-253 beschreiben die heterologe Expression von ausgewählten phs Genen in einem geeigneten heterologen Wirt zur Untersuchung von Polyketid-Synthasen. Die Produktion bestimmter Metabolite in E. coli wird wegen des Fehlens bestimmter Vorläufer wie Methylmalonyl-CoA verhindert. Als eine Lösung dieses Problems wird vorgeschlagen den Zellen synthetische Nachahmer der notwendigen Substrate zu füttern. Stassi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 95. S. 7305-7309 Juni 1998 beschreibt die Produktion in Saccharopolyspora erythraea eines Erythromycin-Derivats durch Modifizieren einer AT-Domäne in einer Polyketid Synthase. Da das notwendige Substrat limitierend war, wurde Crotonyl-CoA Reductase in dem Stamm exprimiert.
Die Biosynthese anderer Polyketide benötigt Substrate, die nicht oder Malonyl-CoA sind oder zusätzlich zu Malonyl-CoA vorhanden sind. Solche Substrate schließen zum Beispiel Propionyl-CoA, 2-Methylmalonyl-CoA, 2-Hydroxymalonyl-CoA und 2-Ethylmalonyl-CoA ein. Von den Myriaden von Wirtszellen, die für die Verwendung als Polyketid produzierende Wirte möglich sind, produzieren viele solche Substrate nicht natürlich. In Anbetracht des Potentials zum Herstellen von wertvollen und nützlichen Polyketiden in großen Mengen in heterologen Wirtszellen, gibt es einen Bedarf für Wirtszellen, die in der Lage sind, die Substrate, die für die Polyketidsynthese benötigt werden, herzustellen. Die vorliegende Erfindung hilft dabei diesen Bedarf zu befriedigen durch das zur Verfügung stellen von rekombinanten Wirtszellen, Expressionsvektoren und Verfahren zum Herstellen von Polyketiden in diversen Wirtszellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Expressionsvektoren zum Herstellen von Produkten in Wirtszellen zur Verfügung, die sonst nicht in der Lage sind, diese Produkte wegen des Fehlens eines biosynthetischen Weges, um einen Vorläufer herzustellen, der für die Biosynthese der Produkte benötigt wird, herzustellen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verfügung, um die Menge eines Produktes, das in einer Wirtszelle produziert wird, zu erhöhen, indem rekombinante biosynthetische Wege zum Herstellen eines Vorläufers bereitgestellt werden, der in der Biosynthese eines Produktes verwendet wird.
In einer Ausführungsform produziert nicht die Wirtszelle den Vorläufer und die Wirtszelle wird durch das Einführen eines rekombinanten Expressionsvektors modifiziert, so dass sie den Vorläufer produzieren kann. In einer anderen Ausführungsform wird der Vorläufer in der Wirtszelle in kleinen Mengen produziert, und die Wirtszelle wird durch das Einführen eines rekombinanten Expressionsvektors modifiziert, so dass sie den Vorläufer in größeren Mengen produzieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vorläufer ein primärer Metabolit, der in einer ersten Zelle produziert wird, aber nicht in einer zweiten heterologen Zellen. Gemäß den Verfahren der Erfindung werden die Gene, die die Enzyme kodieren, die den primären Metaboliten in der ersten Zellen produzieren, in die zweite Zelle transferiert. Der Transfer wird mit einem Expressionsvektor der Erfindung durchgeführt. Der Expressionsvektor steuert die Expression der Gene und die die Produktion des Metaboliten in der zweiten Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Produkt ein Polyketid. Das Polyketid ist ein Polyketid, das entweder durch eine modulate, iterative oder fungale PKS synthetisiert wird. Der Vorläufer wird aus der Gruppe bestehend aus Malonyl-CoA, Propionyl-CoA, Methylmalonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA und Hydroxymalonyl-CoA oder Methoxymalonyl-CoA ausgewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform benützt das Polyketid Methylmalonyl-CoA in seiner Biosynthese. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Polyketid durch eine modulate PKS synthetisiert, die Methylmalonyl-CoA benötigt, um das Polyketid zu synthetisieren.
In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle entweder eine prokaryotische oder eurkaryotische Wirtszelle. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine E. coli Wirtszelle. In einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Hefe Wirtszelle. In einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Actinomycetes Wirtszelle einschließend aber nicht beschränkt auf eine Streptomyces Wirtszelle. In einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzen-Wirtszelle. In einer abgeleitet von einem PKS Gen. In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung rekombinante Wirtszellen bereit, die einen oder mehr Expressionsvektoren umfassen, die die Expression der Enzyme steuern, die den Vorläufer produzieren.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine rekombinante Wirtszelle bereit, die nicht nur einen Expressionsvektor der Erfindung umfasst, sondern auch einen Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, der so angeordnet ist, um die Expression einer PKS zu steuern. In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung rekombinanten Wirtszellen zur Verfügung, die den Vektor umfassen, der die PKS und ihre korrespondierendes Polyketid produziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtzelle ein E. coli- oder Hefe-Wirtszelle. Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung werden detaillierter in der folgenden Beschreibung, den Beispielen und dem unten angegebenen Anspruchssatz beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Module und Domänen von DEBS und die Biosynthese von 6-dEB aus Priopionyl-CoA und Methylmalonyl-CoA.
2 zeigt die Konstruktion von pSK-MUT, in dem vier PCR Fragmente sequenziert und zusammegesetzt wurden, um das vollständige Mutase-Gen in pSK-Bluescript zu bilden.
3 zeigt die Acyl-CoA Analyse in BL21(DE3) panD Stämmen in vivo.
4 zeigt die Ergebnisse der CoA Analyse von E. coli, das Methylmalonyl-CoA Mutase überexprimiert. Die Niveaus von ³H, das in den Fraktionen detektiert wurde, die aus der HPLC von zellfreien Extrakten aus mit ³H β-Alanin gefütterten E. coli gesammelt wurden, die entweder den pET Kontollvektor besaßen, die ohne Hydroxocobalamin (durchgehende Linie) gezogen wurden, den pET besaßen, die mit Hydroxocobalamin (gestrichelte und gepunktete Linie) gezogen wurden, den pET besaßen, die die Mutase überexprimierten und ohne Hydroxocobalamin (gestrichelte Linie) gezogen wurden oder pET besaßen, die die Mutase überexprimierten und mit Hydroxocobalamin (gepunktete Linie) gezogen wurden, gezeigt werden.
5 zeigt die drei Routen und biosynthetischen Wege für die Synthese von Methylmalonyl-CoA, die in Hefe hinein konstruiert werden können.
6 zeigt eine Acyl-CoA-Analyse von E. coli, die Methylmalonyl-CoA Mutase überexprimieren. Die Niveaus von ³H, die in den Fraktionen detektiert wurden, die aus der HPLC von zellfreien Extrakten aus ³H β-Alanin gefütterten E. coli gesammelt wurden, die entweder den pET Kontrollvektor (durchgehende Linie) oder pET, der die Mutase überexprimierte (gestrichelte Linie), werden gezeigt.
7 zeigt die Acyl-CoA Analyse in S. cerivisiae. Die Niveaus von ³H, die in den Fraktionen detektiert wurden, die aus der HPLC von zellfreien Extrakten aus ³H β-Alanin gefütterten S. cerevisiae nach 24 Stunden (durchgehende Linie), 48 Stunden (gestrichelte Linie) und 66 Stunden (gepunktete Linie) Wachstum gesammelt wurden, werden gezeigt.
8 zeigt die allgemeine Klonierungskassette.
9 zeigt ein allgemeines Verfahren zum Klonieren von Genen in die Hefeexpressionsvektoren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Wirtszellen und Expressionsvektoren zum Herstellen von Produkten in Wirtszellen zur Verfügung, die sonst nicht in der Lage sind, diese Produkte wegen des Fehlens eines biosynthetischen Weges herzustellen, so dass ein Vorläufer hergestellt wird, der für die Biosynthese des Produktes benötigt wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff rekombinant auf eine Zelle, Verbindung oder Zusammensetzung, die wenigstens zum Teil durch einen menschlichen Eingriff produziert wird, besonders durch die Modifikation des genetischen Materials einer Zelle. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verfügung, um die Menge eines Produktes, das in einer Wirtszelle produziert wird, zu erhöhen, indem rekombinante biosynthetische Wege zum Herstellen eines Vorläufers bereitgestellt werden, der in der Biosynthese eines Produktes verwendet wird.
In einer Ausführungsform produziert die Wirtszelle nicht den Vorläufer und die Wirtszelle wird durch das Einführen eines rekombinanten Expressionsvektors modifiziert, so dass sie den Vorläufer produzieren kann. In einer anderen Ausführungsform wird der Vorläufer in der Wirtszelle in kleinen Mengen produziert, und die Wirtszelle wird durch das Einführen eines rekombinanten Expressionsvektors modifiziert, so dass sie den Vorläufer in größeren Mengen produzieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vorläufer ein primärer Metabolit, der in einer ersten Zelle produziert wird, aber nicht in einer zweiten heterologen Zellen. Gemäß den Verfahren der Erfindung werden die Gene, die die Enzyme kodieren, die den primären Metaboliten in der ersten Zelle produzieren, in die zweite Zelle transferiert. Der Transfer wird mit einem Expressionsvektor der Erfindung durchgeführt. Der Expressionsvektor steuert die Expression der Gene und die die Produktion des Metaboliten in der zweiten Zelle. Die Erfindung in ihrer allgemeinsten Form betrifft das Einführen eines vollständigen oder teilweise metabolischen Weges aus einer Zelle in eine heterologe Wirtszelle. Die Erfindung umfasst auch die vollständige oder teilweise Modifikation eines existierenden metabolischen Weges in einer Zelle mittels des Einführens von heterologen genetischem Material in die Zelle. In allen Ausführungsformen ist die resultierende Zelle bezogen auf ihre zelluläre Physiologie und Biochemie in einer Weise verschieden, dass die Biosynthese, die Biodegradation, der Transport, die biochemische Modifikation oder die Niveaus der intrazellulären Metabolite die Produktion der gewünschten Produkte ermöglicht wird oder die Expression der gewünschten Produkte verbessert wird. Die Erfindung wird durch das Erhöhen des Niveaus der Polyketide, die in einem heterologen Wirt produziert werden und durch das Beschränken der chemischen Zusammensetzung der Produkte auf die gewünschten Strukturen veranschaulicht.
Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform das durch die Zellen produzierte Produkt ein Polyketid. Das Polyketid ist ein Polyketid, das entweder durch eine modulare, iterative oder fungale PKS synthetisiert wird. Der Vorläufer wird aus der Gruppe bestehend aus Malonyl-CoA, Propionyl-CoA, Methylmalonyl-CoA, Ethylmalonyl-CoA und Hydroxymalonyl oder Methoxymalonyl-CoA ausgewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform benützt das Polyketid Methylmalonyl-CoA in seiner Biosynthese. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polyketid durch eine modulare PKS synthetisiert, die Methylmalonyl-CoA benötigt, um das Polyketid zu synthetisieren.
Die Polyketid Klasse von natürlichen Produkten schließt Mitglieder mit vielfältigen strukturellen und pharmakologischen Eigenschaften ein (siehe Monaghan und Tkacz, 1990, Annu. Rev. Microbiol. 44: 271). Polyketide werden durch Polyketid Synthasen mittels sukzessiver Kondensationen von aktivierten Coenzym-A Thioester Monomeren zusammengebaut, die aus kleinen organischen Säuren wie Acetat, Propionat und Butyrat abgeleitet sind. Aktive Stellen, die für die Kondensation benötigt werden, schließen Acyltransferase (AT), Acyl Carrier Protein (ACP) und Beta-Ketoacylsynthase (KS) ein. Jeder Kondensationszyklus führt zu einer β-Ketogruppe, die alle, einige oder keine Serie von Prozessierungsaktivitäten durchmachen. Aktive Stellen, die diese Reaktionen durchführen, schließen Ketoreductase (KR), Dehydratase (DH) und Enoylreductase (ER) ein. Somit resultiert die Abwesenheit jeglicher Beta-Keto prozessierenden Domäne in dem Vorliegen eines Ketons, ein KR alleine führt zu einem Hydroxyl, ein KR und DH führen zu einem Alken, während eine KR, DH und ER Kombination zu einer vollständigen Reduktion eines Alkans führen. Nach Zusammenbau der Polyketidkette, wird das Molekül typischerweise einer Zyklisation(en) und einer Post-PKS-Modifikation unterzogen (z.B. Glykosylierung, Oxidierung, Acylierung), um die fertige aktive Verbindung zu erreichen.
Macrolide, wie Erythromycin und Megalomicin werden durch modulare PKSs (siehe Cane of al., 1998, Science 282: 63) synthetisiert. Für illustrative Zwecke wird die PKS, die das Erythromycin Polyketid erzeugt (6-Deoxyerythronolid B Synthase oder DEBS (siehe U.S. Patent Nr. 5,824,513), in 1 gezeigt. DEBS ist das am besten charakterisierte und am verbreitesten benützte modulare PKS System. DEBS synthetisiert das Polyketid 6-Deoxyerythronolid B (6-dEB) aus Propionyl-CoA und Methylmalonyl-CoA. In modularen PKS Enzymen, wie DEBS, werden die enzymatischen Schritte für jede Kondensations- und Reduktionsrunde innerhalb eines einzelnen „Moduls" des Polpeptids kodiert (d.h. ein distinktes Modul für jeden Kondensationszyklus). DEBS besteht aus einem Ladungsmodul und 6 Verlängerungsmodulen und einer Ketten terminierenden Thioesterase (TE) Domäne innerhalb dreier extrem großer Polypeptide, die durch drei offene Leseraster kodiert sind (ORFs, bezeichnet als eryAI, eryAII und eryAIII).
Jede der drei Polypeptiduntereinheiten von DEBS (DEBSI, DEBSII und DEBSIII) enthält zwei Verlängerungsmodule; DEBSI enthält zusätzlich das Ladungsmodul. Kollektiv katalysieren diese Proteine die Kondensation und korrekte Reduktion von 1 Propionyl-CoA Starteinheit und 6 Methylmalonyl CoA Verlängerungseinheiten. Module 1, 2, 5 und 6 enthalten KR Domänen; Modul 4 enthält einen kompletten Satz KR/DH/ER von reduktiven und Dehydratasedomänen; und Modul 3 enthält keine funktionale reduktive Domäne. Nach der Kondensation und den korrekten Dehydrations- und Reduktionsreaktionen, wird das Enzym gebundene Intermediat durch die TE am Ende von Verlängerungsmodul 6 lactonisiert, um 6-dEB zu bilden.
Genauer besteht das Ladungsmodul von DEBS aus zwei Domänen, einer Acyl-Transferase (AT) Domäne und einer Acyl Carrier Protein (ACP) Domäne. In anderen PKS Enzymen ist das Ladungsmodul nicht zusammengesetzt aus einer AT und einer ACP, sondern benützt stattdessen eine teilweise inaktivierte KS, eine AT und eine ACS. Diese inaktivierte KS wird in den meisten Fällen KS^Q genannt, wobei der hochgestellte Buchstabe die Abkürzung für die Aminosäure Glutamin ist, die statt des aktive Stellen Cysteins, das für Aktivität benötigt wird, vorliegt. Die AT Domäne des Ladungsmoduls erkennt ein bestimmtes Acyl-CoA (Propionyl für DEBS, das auch Acetyl akzeptieren kann) und überträgt es als ein Thiolester auf die APC des Ladungsmoduls. Danacherkennt die AT auf jedem der Verlängerungsmodule ein bestimmtes Verlängerungs-CoA (Methylmalonyl für DEBs) und überträgt es an die ACP von diesem Modul, um einen Thioester zu bilden. Sobald das PKS mit Acyl- und Malonyl-ACPs gleichzeitg geprimt ist, wandert die Acylgruppe des Ladungsmoduls, um einen Thiolester (Trans-Esterifizierung) an der KS des ersten Verlängungsmoduls zu bilden; in dieser Phase besitzt das Verlängerungsmodul 1 eine Acyl-KS und eine Methlymalonyl ACS. Die Acylgruppe, abgeleitet aus dem Ladungsmodul, wird dann kovalent an dem Alpha-Kohlenstoff der Malonyl-Gruppe angebracht, um eine Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung zu bilden, angetrieben durch begleitende Decarboxylierung, wodurch ein neues Acyl-ACP erzeugt wird, das ein um zwei Kohlenstoffatome längeres Rückgrat als die Ladungeinheit (Verlängerung oder Extension) besitzt. Die wachsende Polyketid Kette wird übertragen von dem ACP auf das KS des nächsten Moduls, und der Prozess setzt sich fort.
Die Polyketidkette, durch zwei Kohlenstoffatome pro Modul wachsend, wird sequentiell als ein kovalent gebundener Thiolester von Modul zu Modul, in einer fließbandartigem Prozess weitergereicht. Die Kohlstoffkette, die durch diesen Prozess allein hergestellt wird, würde ein Keton an jedem anderem Kohlenstoffatom besitzen, ein Polyketon produzierend, woher der Name Polyketid stammt. Jedoch wird gemeinhin die Beta-Ketogruppe jeder Zwei-Kohlenstoffeinheit modifiziert, gleich nachdem sie der wachsenden Polyketidkette hinzugefügt wurde, aber bevor sie auf das nächste Modul durch entweder eine KR, eine KR plus eine DH, oder eine KR, eine DH und eine ER übertragen wird. Wie oben angemerkt, können auch Module zusätzliche enzymatische Aktivitäten enthalten.
Sobald eine Polyketidkette durch das letzte Verlängerungsmodul einer PKS hindurchtritt, trifft es auf die Freisetzungsdomäne oder Thioesterase, gefunden an dem Carboxylende der meisten PKSs. Hier wird das Polyketid vom Enzym gespalten und üblicherweise zyklisiert. Das resultierende Polyketid kann weiter durch Abspalt- oder Modifikationsenzyme modifiziert werden; diese Enzyme fügen Kohlenhydratgruppen oder Methylgruppen hinzu, oder machen andere Modifikationen, d.h. eine Oxidierung oder Reduktion an dem Polyketid-Kernmolekül. Zum Beispiel schließen die letzten Schritte bei der Konversion von 6-dEB zu Erythromycin A die Aktivitäten einer Anzahl von Modifiktionsenzymen ein, wie: C-6 Hydroxylierung, Verknüpfung von Mycarose und Desosamin Zuckern, C-12 Hydroxylierung (die Erythromycin C produziert), und Konversion von Mycarose in Cladinose über O-Methylierung.
Durch diesen Überblick über die PKS und Post-PKS Modifikationsenzyme und ihre Substrate kann man besser die Vorzüge würdigen, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden. DEBS wird natürlicherweise in Saccharopolyspora erythraea produziert und wurde in eine Vielzahl von Streptomyces Spezies transferiert, wie S. coelicolor CH999 und S. lividans K4-114 und K4-155, in denen es ohne weitere Modifikation der Wirtszelle funktioniert, um 6-dEB zu produzieren. Somit machen S. erythraea, S. coelicolor und S. lividans die benötigten Vorläufer für die 6-dEB Synthese. Jedoch produzieren viele andere Nicht-Saccharopolyspora, Nicht-Streptomyces Wirtszellen nicht alle der benötigten Vorläufer oder produzieren diese nur in Mengen, die ausreichen, um nun einen sehr kleinen Teil der Polyketid-Biosynthese zu unterstützen.
In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle entweder eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine E. coli Wirtszelle. In einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Hefe Wirtszelle. In einer anderen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzen Wirtszelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle entweder eine E. coli oder Hefe Wirtszelle, das Produkt ist ein Polyketid und der Vorläufer ist Methylmalonyl-CoA.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen einen Promoter, der angeordnet ist, die Expression eines oder mehrerer Gene zu steuern, die die Enzyme kodieren, die für die Biosynthese eines Vorläufers benötigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promoter von einem PKS Gen abgeleitet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, ist der Promoter einer, der von einem Wirtszellengen oder von einem Virus oder Phagen abgeleitet ist, der normalerweise die Wirtszelle infiziert und zu dem Gen heterolog ist, das das biosynthetische Enzym kodiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine rekombinante Wirtszelle bereit, die nicht nur einen Expressionsvektor der Erfindung umfasst, sondern auch einen Expressionsvektor, der einen Promotor umfasst, der so angeordnet ist, um die Expression einer PKS zu steuern. In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung rekombinante Wirtszellen zur Verfügung, die den Vektor umfassen, der die PKS und ihr korrespondierendes Polyketid produziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtzelle eine E. coli oder Hefe Wirtszelle.
Weder E. coli noch Hefe produziert ausreichend Methylmalonyl CoA, um die Biosynthese großer Mengen von Polyketiden zu unterstützen, die Methylmalonyl-CoA bei ihrer Biosynthese benötigen, und die meisten Spezies produzieren überhaupt kein Methylmalonyl-CoA Substrat. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung E. coli, Hefe und andere Wirtszellen zur Verfügung, die Methylmalonyl-CoA in Mengen produzieren, die ausreichen, um eine Polyketid-Biosynthese zu unterstützen. In bevorzugten Ausführungsformen, produzieren die Zellen genügende Mengen von Methylmalonyl-CoA, um die Biosynthese von Polyketiden zu unterstützen, die Methylmalonyl-CoA für ihre Biosynthese in Mengen benötigen, die im Bereich von 1 μg/L, bis 1 mg/L, bis 10 mg/L, bis 100 mg/L, bis 1 g/L, bis 10 g/L liegen.
In einer Ausführungsform wurden die Wirtszellen der Erfindung modifiziert, um eine heterologe Methylmalonyl-CoA Mutase zu exprimieren. Dieses Enzym, das Succinyl-CoA in Methylmalonyl-CoA umwandelt (obgleich die Umkehrreaktion 20 Mal mehr begünstigt ist), wurde in E. coli mit einem Gen exprimiert, das aus Propionibakterien kloniert wurde, aber wegen des Mangels an Vitamin B12 inaktiv war. Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann dieses Enzym in einer aktiven Form in E. coli und anderen Wirtszellen entweder durch (konstitutives oder sonstiges) Exprimieren eines B12 Transportergens, wie dem endogenen E. coli Gen und/oder Verwenden eines Mediums, das B12 Aufnahme ermöglicht, hergestellt werden (wie hierin verwendet kann B12 sich auf den Vorläufer Hydroxocobalamin beziehen, der in B12 umgewandelt wird). Während bestimmte Methylmalonyl-CoA Mutasen das R-Isomer herstellen, einschließlich der Methylmalonyl-CoA Mutasen, die aus den Propionibakterien abgeleitet sind, kann das R-Isomer in das S-Isomer mit einer Epimerase umgewandelt werden. Zum Beispiel können Epimerase Gene von Propionibakterien oder Streptomyces für diesen Zweck verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform wurden die Wirtszellen der Erfindung modifiziert, um eine heterologe Propionyl-CoA Carboxylase zu exprimieren, die Propionyl-CoA in Methylmalonyl-CoA umwandelt. In dieser Ausführungsform kann man die Menge von Methylmalonyl-CoA Vorläufer durch Kultivieren der Zellen in einem Medium erhöhen, das mit Propionat supplementiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Wirtszellen E. coli Wirtszellen.
Somit benötigt gemäß den Verfahren der Erfindung die heterologe Produktion von bestimmten Polyketiden in E. coli, Hefe und anderen Wirtsorganismen sowohl die heterologe Expression einer gewünschten PKS als auch die Enzyme, die wenigstens einige der Substratmoleküle produzieren, die von der PKS benötigt werden. Diese Substratmoleküle, die Vorläufer genannt werden, werden normalerweise nicht als intrazelluläre Metaboliten in dem Wirtsorganismus gefunden oder kommen nur in geringen Mengen vor. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um die Zusammensetzung oder die Mengen der intrazellulären Metabolite innerhalb eines Wirtsorganismus zu produzieren oder modifizieren, in denen solche Metabolite normalerweise nicht vorkommen oder in nicht-optimalen Mengen vorhanden sind.
Eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft das Einführen und Modifizieren der biochemischen Wege für die Methylmalonyl-CoA Biosynthese. Methylmalonyl-CoA, wie oben angemerkt, ist ein Substrat, das für die Synthese von Polyketiden von vielen Polyketid Synthasen benötigt wird. Einige der bekannten biochemischen Wege für die intrazelluläre Produktion von Methylmalonyl-CoA verwenden Enzyme und ihre entsprechenden Gene, die in bestimmten Organismen gefunden werden. Diese Enzyme und Gene wurden nicht in anderen Organismen gefunden oder sind auf andere Weise nicht optimal. Diese anderen Organismen schließen diejenigen ein, die auf andere Weise als heterologe Wirte für die Produktion von Polyketiden nützlich sein konnten. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, um einen Wirtsorganismus so zu konstruieren, dass er eine neue oder modifizierte Fähigkeit besitzt Methylmalonyl-CoA und/oder die Mengen der Methylmalonyl-CoA in dem Wirt zu erhöhen oder zu erniedrigen.
Wie oben angemerkt, sind zwei biochemische Wege, die Methylmalonyl-CoA involvieren, für diese Aspekte der Erfindung besonders relevant. Diese Wege sind der Methylmalonyl-CoA Mutase Weg, hiernach als der MUT Weg bezeichnet, und der Propionyl-CoA Carboxylase Weg, hiernach als der PCC Weg bezeichnet.
Der MUT Weg schließt die Enyzme Methylmalonyl-CoA Mutase (5.4.99.2, unter Verwendung des Nummerierungssystems, das durch das „Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" entwickelt wurde), Methylmalonyl-CoA Epimerase (5.1.99.1) und Malonyl-CoA Decarboxylase (4.1.1.9) ein. Der biochemische Weg schließt die Umwandlung von Succinyl-CoA in (R)-Methylmalonyl-CoA über die Wirkung von Methylmalonyl-CoA Mutase (5.4.99.2) ein, gefolgt von der Umwandlung von (R)-Methylmalonyl-CoA in (S)-Methylmalonyl-CoA durch die Wirkung von Methylmalonyl-CoA Epimerase (5.1.99.1). (S)-Methylmalonyl-CoA ist ein Substrat, das von zahlreichen Polyketid Synthasen verwendet wird. Das Enzym Malonyl-CoA Decarboxylase (4.1.1.9) katalysiert die Decarboxylierung von Malonyl-CoA, aber es wurde auch berichtet, dass es die Decarboxylierung von (R)-Methylmalonyl-CoA katalysiert, um Propionyl-CoA zu bilden. Propionyl-CoA ist ein Substrat, das von einigen Polyketid Synthasen verwendet wird.
Der PCC Weg schließt die Enzyme Propionyl-CoA Carboxylase (6.4.1.3) und Propionyl-CoA Synthetase (6.2.1.17) ein. Der biochemische Weg schließt die Umwandlung von Propionat in Propionyl-CoA durch die Wirkung von Propionyl-CoA Synthetase (6.2.1.17) gefolgt von der Umwandlung von Propionyl-CoA in (S)-Methylmalonyl-CoA durch die Wirkung der Propionyl- CoA Carboxylase (6.4.13) ein. (S)-Methylmalonyl-CoA ist das Substrat, das von vielen Polyketid Synthasen verwendet wird.
Eine veranschaulichende Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet spezifische Enzyme aus diesen Wegen. Wie die Fachleute nach Betrachtung dieser Beschreibung erkennen werden, kann die Erfindung auch mit zusätzlichen und/oder alternativen Enzymen, die in den MUT und PCC Wegen involviert sind, durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Erfindung auch mit zusätzlichen und alternativen Wegen für die Methylmalonyl-CoA und anderen intrazellulären Metaboliten durchgeführt werden.
Die Verfahren dieser Erfindung involvieren das Einführen von genetischem Material in einen Wirtsstamm der Wahl, um die zelluläre Physiologie und Biochemie des Wirts zu modifizieren oder zu ändern. Durch das Einführen von genetischem Material erwirbt der Wirtsstamm neue Eigenschaften, z.B. die Fähigkeit einen neuen oder größere Mengen eines intrazellulären Metaboliten zu produzieren. In einer veranschaulichenden Ausführungsform der Erfindung resultiert das Einführen von genetischem Material in den Wirtsstamm in einer neuen oder modifizierten Fähigkeit, Methylmalonyl-CoA zu produzieren. Das genetische Material, das in den Wirtsstamm eingeführt wird, enthält ein Gen(e) oder Teile von Genen, die für ein oder mehr Enzyme kodieren, die in der Biosynthese/Biodegradation von Methylmalonyl-CoA involviert sind und kann auch zusätzliche Elemente für die Expression und/oder Regulation der Expression dieser Gene enthalten, z.B. Promotorsequenzen. Spezifische Gensequenzen, die für Enzyme kodieren, die in der Biosynthese/Biodegradation von Methylmalonyl-CoA involviert sind, sind unten aufgeführt.
Eine geeignetes Methylmalonyl-CoA Mutase (5.4.99.2) Gen kann aus Streptomyces cinnamonensis isoliert werden (siehe Birch et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 3511-3519, mit dem Titel "Cloning, sequencing, and expression of the Gen encoding methylmalonyl-coenzyme A mutase from Streptomyces cinnamonensis"). Dieses Enzym ist ein Enzym mit zwei Untereinheiten; die A- und B-Untereinheit kodierende Sequenzen sind verfügbar unter dem Genbank Zugriffscode L10064. Andere geeignete Methylmalonyl-CoA Gene können aus Propionibacterium shermanii isoliert werden (siehe Marsh et al., 1989, Biochem. J. 260: 345-352, mit dem Titel "Cloning and structural characterization of the gene coding for adenosylcobalamin-dependent methylmalonyl CoA mutase from Propionibacterium shermanii"). Alternativ kann ein geeignetes Methylmalonyl-CoA Mutase Gen aus Porphyromonas gingivalis isoliert warden (siehe Jackson et al., 1995, Gene 167: 127-132, mit dem Titel "Cloning, expression and sequence analysis of the genes encoding the heterodimeric methylmalonyl CoA mutase of Porphyromonas gingivalis W50"). Alternativ kann ein geeignetes Methylmalonyl-CoA Mutase Gen aus den Quellen isoliert werden, die in der folgenden Tabelle eines partiellen BLAST Rechercheberichts vermerkt sind oder aus zusätzlichen BLAST Analysen isoliert werden.
Ergebnisse der BLAST Suche der NCBI Datenbank für Methlymalonyl-CoA Mutase mutA

gb|L10064|STMMUTA Streptomyces cinnamonensis 931 0.0 (Suchsequenz)
gb|AD000015|MSGY175 Mycobacterium tuberculosis Sequenz 300 7e-80
emb|Z79701|MTCY277 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 300 7e-80
gb|AD000001|MSGY456 Mycobacterium tuberculosis Sequenz 238 8e-76
emb|X14965|PSMUTAB Propionibacterium shermanii mutA 268 5e-70
gb|L30136|POYMCMAB Porphyromonas gingivalis 137 9e-31
gb|AE000375|AE000375 Escherichia coli K-12 MG1655 134 1e-29
gb|U28377|ECU28377 Escherichia coli K-12 Genom; 134 1e-29
emb|X66836|ECSERAICI E. coli serA, iciA, sbm Gen 133 1e-29
gb|AF080073|SMPCAS2 Sinorhizobium meliloti 130 2e-28
ref|NM_000255.1|MUT| Homo sapiens 113 2e-23
dbj|AP000006|AP000006 Pyrococcus horikoshii OT3 110 2e-22
emb|AJ248285.1|CNSPAX03 Pyrococcus abyssi 109 3e-22
emb|X51941|MMMMCOAM Maus mRNA 109 3e-22 35
gb|AE000952|AE000952 Archaeoglobus fulgidus Sektion 155 104 9e-21,
emb|AJ237976.1|SCO237976 Streptomyces coelicolor icmA Gen 103 2e-20
dbj|AP000062.1|AP000062 Aeropyrum pernix genomische DNA 102 3e-20
gb|U67612|SCU67612 Streptomyces cinnamonensis Coenzym B12 98 7e-19
gb|AE001015|AE001015 Archaeoglobus fulgidus Sektion 92 97 1e-18
emb|X59424|BFOF4 Bacillus firmus OF4 Gene zur ATP Bindung 82 7e-14

mutB

gb|L10064|STMMUTA Streptomyces cinnamonensis 1379 0.0 (Suchsequenz)
gb|AD000001|MSGY456 Mycobacterium tuberculosis 1018 0.0
emb|Z79701|MTCY277 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 1017 0.0
gb|AD000015|MSGY175 Mycobacterium tuberculosis Sequenz 1017 0.0
emb|X14965|PSMUTAB Propionibacterium shermanii 996 0.0
gb|L30136|POYMCMAB Porphyromonas gingivalis methylmalonyl 882 0.0
ref|NM_000255.1|MUT|Homo sapiens methylmalonyl Coenzym A 855 0.0
emb|X51941|MMMMCOAM Maus mRNA 32 0.0
gb|U28377|ECU28377 Escherichia coli K-12 Genom 798 0.0
gb|AE000375|AE000375 Escherichia coli K-12 MG1655 798 0.0
emb|X66836|ECSERAICI E. coli serA, iciA, sbm Gene 797 0.0
gb|AF080073|SMPCAS2 Sinorhizobium meliloti 782 0.0
gb|AE001015|AE001015 Archaeoglobus fulgidus 516 e-145
dbj|AP000062.1|AP000062 Aeropyrum pernix genomische DNA 408 e-139
emb|AJ248285.1|CNSPAX03 Pyrococcus abyssi vollständiges Genom 486 e-135
dbj|AP000006|AP000006 Pyrococcus horikoshii OT3 genomische DNA 480 e-133
gb|AE000952|AE000952 Archaeoglobus fulgidus Sektion 155 467 e-130
emb|Z35604.1|CEZK1058 Caenorhabditis elegans Cosmid ZK1058 316 e-109
emb|AJ237976.1|SCO237976 Streptomyces coelicolor icmA 377 e-103
gb|U67612|SCU67612 Streptomyces cinnamonensis Coenzym 372 e-101
emb|AL035161|SC9C7 Streptomyces coelicolor Cosmid 9C7 359 2e-97
gb|U28335|MEU28335 Methylobacterium extorquens 351 4e-95
gb|AF008569|AF008569 Streptomyces collinus Coenzym 337 8e-91
gb|U65074|ECU65074 Escherichia coli Chromosome 275 3e-72
gb|M37500|HUMMUT03 Humane methylmalonyl CoA Mutase 202 3e-50
gb|AF178673.1|AF178673 Streptomyces cinnamonensis 183 1e-44
emb|Z49936.1|CEF13B10 Caenorhabditis elegans Cosmid F13B10 138 2e-41
gb|M37499|HUMMUT02 Humane Methylmalonyl-CoA Mutase 112 4e-23
dbj|AP000001.1|AP000001 Pyrococcus horikoshii OT3 genomische DNA 106 2e-21
emb|AJ248283.1|CNSPAX01 Pyrococcus abyssi vollständige Mutase 106 2e-21
gb|M37503|HUMMUT06 Humane Methylmalonyl-CoA Mutase 101 7e-20
gb|M37508|HUMMUT11 Humane Methylmalonyl-CoA Mutase 86 3e-15
gb|M37509|HUMMUT12 Humane Methylmalonyl-CoA Mutase 80 3e-13
gb|M37501|HUMMUT04 Humane Methylmalonyl-CoA Mutase 77 2e-12

Methylmalonyl-CoA Mutase benötigt B12 (Adenosylcobalamin) als einen essentiellen Cofaktor für die Aktivität. Eine der Schwierigkeiten bei der Expression von aktiver Methylmalonyl-CoA Mutase in einem heterologen Wirt ist, dass der Wirtsorganismus nicht genügende oder überhaupt keine Mengen dieses Cofaktors zur Verfügung stellt. Arbeiten über die Expression der Methionin Synthase, einem Cobalamin abhängigem Enzym, in E. coli, einem Wirt, der Cobalamin nicht synthetisiert, hat gezeigt, dass es möglich ist, ein aktives Cobalamin abhängiges Enzym zu exprimieren, indem die Cobalamintransportrate erhöht wird (siehe Amaratunga et al., 1996, Biochemistry 35: 2453-2463, mit dem Titel "A synthetic module for the metH gene permits facile mutagenesis of the cobalamin-binding Region of Escherichia coli methionine synthase: initial characterization of seven mutant proteins").
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen den Schritt der Erhöhens der Verfügbarkeit von Cobalmin für die heterologe Expression von aktiver Methylmalonyl-CoA Mutase in bestimmten Wirten, z.B. E. coli, ein. Insbesondere beinhalten diese Verfahren das Ziehen der Zellen in einem Medium, das Hydroxycobalmin und/oder andere Nährstoffe enthält, wie in Amaratunga et al. (siehe oben) beschrieben. Zusätzliche Verfahren zur Erhöhen der Verfügbarkeit von Cobalamin schließen konstitutive und/oder Überexpression von Vitamin B12 Transporterproteinen und/oder ihrer Regulatoren ein.
Ein geeignetes Methylmalonyl-CoA Epimerase (5.1.99.1) Gen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann aus Streptomyces coelicolor isoliert werden, das als GenBank Locus SC5F2A als Gen SC5F2A.13 berichtet wurde (hier als EP5 berichtet) oder aus S. coelicolor isoliert werden, das als GenBank Locus SC6A5 als Gen SC6A5.34 berichtet wurde (hier als EP6 bezeichnet, siehe Redenbach et al., 1996, Mol. Microbiol. 21(1), 77-96, mit dem Titel "A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3 (2) Chromosome"). Bis heute wurde keine biochemische Charakterisierung der Proteine, die durch die Gene EP5 und EP6 kodiert werden, ausgeführt; somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Verwendung dieser Gene, um Methylmalonyl-CoA Epimeraseaktivität einem Wirt bereitzustellen, bereit. Dass diese Gene Proteine mit Methylmalonyl-CoA Epimeraseaktivität kodieren, wird durch ihre Homologie mit der Sequenz einer 2-Arylpropionyl-CoA Epimerase aus Ratte gestützt (siehe Reichel et al., 1997, Mol. Pharmacol. 51: 576-582, mit dem Titel "Molecular cloning and expression of a 2-arylpropionyl-coenzyme A epimerase: a key enzyme in the inversion metabolism of ibuprofen," und Shieh & Chen, 1993, J. Biol. Chem. 268: 3487-3493, mit dem Titel "Purification and characterization of novel '2-arylpropionyl CoA epimerases' from rat liver cytosol and mitochondria"). Sowohl Ratten 2-Arylpropionyl-CoA Epimerase als auch Methylmalonyl-CoA Epimerase katalysieren die gleiche stereoisomerische Inversion, bei aber unterschiedlichen angebrachten chemischen Gruppen.
Die biochemische Charakterisierung eines Methylmalonyl-CoA Epimerase Enzyms, das aus Propionibacterium shermanii aufgereinigt wurde, wurde durchgeführt (siehe Leadlay, 1981, Biochem. J. 197: 413-419, mit dem Titel "Purification and characterization of methylmalonyl CoA epimerase from Propionibacterium shermanii," Leadlay & Fuller, 1983, Biochem. J. 213: 635-642, mit dem Titel "Proton transfer in methylmalonyl CoA epimerase from Propionibacterium shermanii: Studies with specifically tritiated (2R)-methylmalonyl CoA as substrate; Fuller & Leadlay, 1983, Biochem. J. 213: 643-650, mit dem Titel "Proton transfer in methylmalonyl CoA epimerase from Propionibacterium shermanii: The reaction of (2R)-methylmalonyl CoA in tritiated water"). Die DNA Sequenz des Gens, das für dieses Enzym aus Propionibacterium shermanii kodiert, wird durch diese Erfindung als SEQ ID NO: 1 in isolierter und rekombinanter Form bereitgestellt und wird in die Expressionsvektoren Wirtszellen der Erfindung aufgenommen. Geeignete Methylmalonyl-CoA Epimerase Gene können aus einer BLAST Recherche mit der S. shermanii Sequenz, die in Beispiel 1 unten bereitgestellt wird, isoliert werden. Bevorzugte Epimerasen zusätzlich zu der S. shermanii Epimerase schließen Gene, die durch Homologie mit der S. shermanii Sequenz, die auf Cosmid 8F4 aus dem S. coelicolor Genomsequenzierungsprojekt identifiziert wurden, und die B. subitilis Epimerase, die durch Haller et al., 2000, Biochemistry 39(16): 4622-4629 beschrieben wurde, ein.
Man kann auch S-Methylmalonyl-CoA aus R-Methylmalonyl-CoA herstellen, wobei ein Aktivität von Malonyl-CoA Decarboxylase A verwendet wird, die R-Methylmalonyl-CoA in Propionyl-CoA umwandelt. Wie oben beschrieben, kann dann Propionyl-CoA in S-Methylmalonyl-CoA durch Propionyl-CoA Carboxylase umgewandelt werden. Eine geeignete Malonyl-CoA Decarboxylase (4.1.1.9) für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann aus Saccharopolyspora erythraea isoliert werden, wie von Hsieh & Kolattukudy, 1994, J. Bacteriol. 176: 714-724, mit dem Titel "Inhibition of erythromycin synthesis by disruption of malonylcoenzyme A decarboxylase gene eryM in Saccharopolyspora erythraea" berichtet wurde. Alternativ können geeignete Malonyl-CoA Decarboxylase Gene aus jede der Quelle isoliert werden, die in der folgende Tabelle eines BLAST Rechercheberichts aufgeführt sind oder durch zusätzliche BLAST Recherchen.
Ergebnisse der BLAST Recherche der NCBI Datenbank für Malonyl-CoA Decarboxylase (DC)

gb|L05192|SERMALCOAD S. erythraea malonyl 664 0.0 (Suchsequenz)
emb|AL022268|SC4H2 Streptomyces coelicolor Cosmid 4H2 128 3e-28
emb|Z75555|MTCY02B10 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 109 1e-22
gb|AD000018|MSGY151 Mycobacterium tuberculosis Sequenz 109 1e-22
gb|AF141323.1|AF141323 Shigella flexneri SHI-2 95 5e-18
emb|X76100|ECIUC E. coli plasmid iucA, iucB und iucC Gene 92 3e-17
emb|AL116808.1|CNS01DGW Botrytis cinerea Stamm T4 cDNA 88 5e-16
gb|AF110737.1|AF 110737 Sinorhizobium meliloti Stamm 2011 84 9e-15
emb|AL109846.1|SPBC17G9 S.pombe Chromosom II Cosmid c17G9 71 7e-11
gb|L06163|PSEAAC Pseudomonas fluorescens Aminoglycosid 70 1e-10

Ein geeingnetes Propionyl-CoA Carboxylase (6.4.1.3) Gen zum Zwecke der vorliegenden Erfindung kann aus Streptomyces coelicolor isoliert werden, wie in GenBank Locus AF113605 (pccB), AF113604 (accA2) und AF113603 (accA1) von H. C. Gramajo und Kollegen berichtet wurde. Das Propionyl-CoA Carboxylase Genprodukt benötigt Biotin für seine Aktivität. Wenn die Wirtszelle kein Biotin herstellt, dann können die Gene für den Biotintransport auf die Wirtszelle transferiert werden. Selbst wenn die Wirtszelle Biotin herstellt oder transportiert, kann das endogene Biotin Transferaseenzym nicht ausreichend Aktivität besitzen (entweder aufgrund von Spezifitätsbeschränkungen oder aus anderen Gründen), um die Propionyl-CoA Carboxylase mit der Geschwindigkeit zu biotinylieren, die für Vorläufersynthese auf hohem Niveau notwendig ist. In diesem Fall kann man einfach der Wirtszelle ein genügend aktives Biotin Transferaseenzymgen zur Verfügung stellen, oder wenn es ein ein endogenes Transferasegen gibt, wie das birA Gen in E. coli, kann man einfach dieses Gen mit rekombinanten Verfahren überexprimieren. Es wurde über viele weitere Gene, die für Propionyl-CoA Carboxylasen kodieren, oder Acetyl-CoA Carboxylasen mit geringerer Substratspezifität, die Propionat einschließen, berichtet, und diese können als Quellen für dieses Gen verwendet werden, wie in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.
Ergebnisse der BLAST Recherche der NCBI Datenbank für Propionyl-CoA Decarboxylase (pccB)

gb|AF113605.1|AF113605 S. coelicolor Propionyl 1035 0.0 (Suchsequenz)
emb|X92557|SEPCCBBCP S. erythraea pccB, bcpA2, und orfX 800 0.0
emb|Z92771|MTCY71 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 691 0.0
dbj|AB018531|AB018531 Corynebacterium glutamicum dtsR1 686 0.0
gb|U00012|U00012 Mycobacterium leprae Cosmid B1308 686 0.0
dbj|AB018530|AB018530 Corynebacterium glutamicum dtsR Gen 612 e-174
gb|AE001742.1|AE001742 Thermotoga maritima Sektion 54 610 e-173
emb|AJ002015|PMAJ2015 Propionigenium modestum mmdD 589 e-167
dbj|AB007000|AB007000 Myxococcus xanthus MxppcB Gen 588 e-166
gb|L48340|MTBKATA Methylobacterium extorquens Katalase 588 e-166
gb|AE000952|AE000952 Archaeoglobus fulgidus Sektion 155 572 e-162
dbj|AP000005|AP000005 Pyrococcus horikoshii OT3 genomisch 570 e-161
emb|AJ248285.1|CNSPAX03 Pyrococcus abyssi vollständiges Genom 570 e-161
emb|AL031124|SC 1 C2 Streptomyces coelicolor Cosmid 1 C2 563 e-159
gb|L22208|VEIMCDC Veillonella parvula methylmalonyl CoA 558 e-157
gb|AF080235|AF080235 Streptomyces cyanogenus Landomycin 552 e-155
emb|AJ235272|RPXX03 Rickettsia prowazekii Stamm Madrid E 545 e-153
dbj|AB000886|AB000886 Sus scrofa mRNA for Propionyl CoA 539 e-152
ref|NM_000532.1|PCCB| Homo sapiens Propionyl Coenzyme A 538 e-151
emb|X73424|HSPCCBA Homo sapiens Gen für Propionyl CoA 538 e-151
gb|M14634|RATPCCB Rat mitochondrial Propionyl CoA 535 e-150
gb|S67325|S67325 Propionyl CoA Carboxylase beta Untereinheit 531 e-149
gb|U56964|CELF52E4 Caenorhabditis elegans Cosmid F52E4 367 e-143
emb|Z99116|BSUB0013 Bacillus subtilis vollständiges Genome 494 e-138
dbj|D84432|BACJH642 Bacillus subtilis DNA, 283 Kb Region 494 e-138
gb|AF042099|AF042099 Sulfolobus metallicus vermutlich 486 e-136
emb|AL022076.1|MTV026 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 483 e-135
gb|L04196|PRSTRANSC Propionibacterium shermanii 383 e-104
emb|AL023635.1|MLCB1243 Mycobacterium leprae Cosmid B1243 356 1e-96
emb|Z70692.1|MTCY427 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 353 1e-95
gb|L78825|MSGB1723CS Mycobacterium leprae Cosmid B1723 DNA 319 4e-93
gb|M95713|RERCOABETA Rhodococcus erythropolis 340 5e-92
emb|Z99113|BSUB0010 Bacillus subtilis vollständiges Genom 325 2e-87
gb|U94697|CCU94697 Caulobacter crescentus DNA Topoisomerase 270 6e-71
emb|Z95556|MTCY07A7 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 253 9e-66
emb|Y07660|MTACCBC M. tuberculosis accBC Gen 231 6e-59
emb|Z79700|MTCY10D7 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 229 2e-58
dbj|AB018557.1|AB018557 Streptomyces griseus cyaA Gen 228 5e-58
gb|U46844|MSU46844 Mycobacterium smegmatis Katalase 209 2e-52
emb|Z19555.1|CEF02A9 Caenorhabditis elegans Cosmid F02A9 105 9e-51
gb|M13573|HUMPCCB Human propionyl CoA Carboxylase beta 194 5e-48
gb|AF030576|AF030576 Acidaminococcus fermentans 170 9e-41
emb|Y13917|BSY13917 Bacillus subtilis ppsE, yngL, yngK 149 2e-34
emb|X69435|AFGCDA A. fermentans GCDA Gen für 107 1e-21
emb|Z82368|RPZ82368 R. prowazekii genomisches DNA fragment 93 2e-17
gb|AF025469|CELW09B6 Caenorhabditis elegans Cosmid W09B6 78 5e-13
gb|U87980|MRU87980 Malonomonas rubra vermutlich IS-element 78 7e-13
gb|AE001518|AE001518 Helicobacter pylori, Stamm J99 75 6e-12
gb|AE000604.1|AE000604 Helicobacter pylori 26695 Sektion 82 75 8e-12
gb|U89347|ACU89347 Acinetobacter calcoaceticus Malonat 74 1e-11
emb|AL021961|ATF28A23 Arabidopsis thaliana DNA 61 2e-11
gb|AE001591|AE001591 Chlamydia pneumoniae Sektion 7 73 2e-11
emb|Z46886|UMACCGEN U. maydis ACC Gen für Acetyl coa 71 1e-10
gb|U86128|SSPCCB1 Sus scrofa Propionyl CoA Carboxylase B 70 2e-10
emb|AJ006497|HSA006497 Homo sapiens PCCB Gen, Exons 11 70 2e-10
gb|AE001301|AE001301 Chlamydia trachomatis Sektion 28 69 5e-10
gb|U32724|U32724 Haemophilus influenzae Rd Sektion 39 68 8e-10
gb|U04358|PSU04358 Pseudomonas syringae pv. syringae Y30 68 8e-10

Propionyl CoA Carboxylase (accA2)

gb|AF113604.1|AF113604 S. coelicolor vermutlich 1101 0.0 (Suchsequenz)
gb|AF113603.1|AF113603 Streptomyces coelicolor vermutlich 1090 0.0
gb|AF126429.1|AF126429 Streptomyces venezuelae JadJ 967 0.0
emb|Z92771|MTCY71 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 758 0.0
emb|X92557|SEPCCBBCP S. erythraea pccB, bcpA2, und orfX Gene 753 0.0
emb|X92556|SEHGTABCP S. erythraea hgtA, bcpA1, und orf122 753 0.0
gb|U00012|U00012 Mycobacterium leprae Cosmid B 1308 746 0.0
emb|X63470|MLBCCPG M. leprae Gen für Biotin Carboxyl 743 0.0
gb|U35023|CGU35023 Corynebacterium glutamicum Thiosulfat 695 0.0
gb|U24659|SVU24659 Streptomyces venezuelae Glucose 599 e-170
gb|AE000742|AE000742 Aquifex aeolicus Sektion 74 413 e-113
gb|U67563|U67563 Methanococcus jannaschii Sektion 105 405 e-111
gb|L36530|MQSPYRCARB Aedes aegypti Pyruvat Carboxylase 400 e-110
gb|AF132152.1|AF132152 Drosophila melanogaster clone 396 e-108
gb|L09192|MUSMPYR Mus musculus Pyruvat Carboxylase 393 e-107
gb|U36585|RNU36585 Rattus norvegicus Pyruvat Carboxylase 391 e-107
gb|U32314|RNU32314 Rattus norvegicus Pyruvat Carboxylase 391 e-107
gb|L14862|ANAACCC Anabaena sS. (PCC 7120) 49.1 kDa Biotin 388 e-106
gb|U59234|SPU59234 Synechococcus PCC7942 Biotin 387 e-106
gb|U04641|HSU04641 Human Pyruvat Carboxylase (PC) mRNA 387 e-106
ref|NM_000920.1|PC| Homo sapiens Pyruvat Carboxylase (PC) 386 e-105
gb|AE001090|AE001090 Archaeoglobus fulgidus Sektion 17 383 e-104
dbj|D84432|BACJH642 Bacillus subtilis DNA, 283 Kb Region 382 e-104
emb|Z99116|BSUB0013 Bacillus subtilis vollständiges Genom 382 e-104
gb|AE000942|AE000942 Methanobacterium thermoautotrophicum 382 e-104
gb|S72370|S72370 Pyruvat Carboxylase human, Niere 380 e-104
dbj|D64001|SYCCPNC Synechocystis sS. PCC6803 vollständig 379 e-103
gb|L14612|PSEACCBC Pseudomonas aeruginosa Biotin carboxyl 376 e-103
gb|U32778|U32778 Haemophilus influenzae Rd Sektion 93 375 e-102
emb|Z36087|SCYBR218C S. cerevisiae Chromosom II 374 e-102
gb|U35647|SCU35647 Saccharomyces cerevisiae 10 Pyruvat 374 e-102
gb|J03889|YSCPCB Hefe (S. cerevisiae) Pyruvate Carboxylase 374 e-102
gb|U90879|ATU90879 Arabidopsis thaliana Biotin Carboxylase 374 e-102
emb|Z72584|SCYGL062W S. cerevisiae Chromosom VII 374 e-102
emb|X59890|SCPYC2G S. cerivisiae PYC2 Gen für Pyruvat 373 e-102
gb|AE000749|AE000749 Aquifex aeolicus Sektion 81 371 e-101
gb|AE001286|AE001286 Chlamydia trachomatis Sektion 13 370 e-101
gb|AE001604|AE001604 Chlamydia pneumoniae Sektion 20 369 e-100
gb|AF007100|AF007100 Glycine max Biotin Carboxylase 368 e-100
emb|Z95556|MTCY07A7 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 367 e-100
emb|Z19549|MTBCARBCP M. tuberculosis Gen für Biotin 367 e-100
gb|AF068249|AF068249 Glycine max Biotin Carboxylase 366 1 e-99
gb|L38260|TOBBCSO Nicotiana tabacum Acetyl CoA 363 7e-99
gb|U36245|BSU36245 Bacillus subtilis Biotin carboxyl 362 2e-98
gb|AF097728|AF097728 Aspergillus terreus Pyruvat 361 3e-98
emb|AJ235272|RPXX03 Rickettsia prowazekii Stamm Madrid E 360 1e-97
dbj|D83706|D83706 Bacillus stearothermophilus DNA 360 1e-97
gb|AE000744|AE000744 Aquifex aeolicus Sektion 76 358 3e-97
emb|AL109846.1|SPBC17G9 S. pombe Chromosom II 356 1e-96
dbj|D78170|D78170 Hefe DNA for Pyruvat Carboxylase 353 1e-95
gb|M79446|ECOFABG Escherichia coli Biotin Carboxylase Gen 352 2e-95
gb|M83198|ECOFABEGF Escherichia coli Biotin carboxyl 352 2e-95
gb|AE000404|AE000404 Escherichia coli K-12 MG1655 352 2e-95
gb|U18997.1|ECOUW67 Escherichia coli K-12 chromosomal 352 2e-95
gb|M80458|ECOA-COAC E. coli Biotin Carboxylase und Biotin 352 2e-95
gb|U51439|REU51439 Rhizobium etli Pyruvat Carboxylase 351 25 5e-95
emb|Y13917|BSY13917 Bacillus subtilis ppsE, yngL, yngK 348 3e-94
emb|Z99113|BSUB0010 Bacillus subtilis vollständiges Genom 348 3e-94
gb|AE001274.1|AE001274 Leishmania major Chromosom 1 347 6e-94
gb|AF042099|AF042099 Sulfolobus metallicus vermutlich 346 1e-93
emb|Z81052.1|CED2023 Caenorhabditis elegans Cosmid D2023 162 3e-92
emb|Z79700|MTCY10D7 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 341 4e-92
emb|Z99111|BSUB0008 Bacillus subtilis vollständiges Genom 340 1e-91
gb|U12536|ATU12536 Arabidopsis thaliana 3-30 methylcrotonyl 338 4e-91
emb|Y11106|PPPYC1 S. pastoris PYC1 Gen 338 4e-91
gb|AE001529|AE001529 Helicobacter pylori, Stamm J99 334 5e-90
gb|AE000553.1|AE000553 Helicobacter pylori 26695333 7e-90
emb|Y09548|CGPYC Co-rynebacterium glutamicum pyc Gen 333 1e-89
gb|AF038548|AF038548 Corynebacterium glutamicum Pyruvat 333 1e-89
ref|NM_000282.1|PCCA| Homo sapiens Propionyl Coenzyme 333 1e-89
gb|M22631|RATPCOA Ratte Alpha-pro-pionyl CoA Carboxylase 332 2e-89
gb|U08469|GMU08469 Glycin max 3-methylcrotonyl CoA 328 3e-88
emb|Z83018|MTCY349 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 318 4e-85
emb|AJ243652.1|PFL243652 Pseudomonas fluorescens uahA Gen 316 1e-84
emb|Z36077|SCYBR208C S. cerevisiae Chromosom II 312 2e-83
gb|M64926|YSC-UAMD Hefe urea amidolyase (DUR1.2) Gen 311 5e-83
emb|Z97025|BSZ97025 Bacillus subtilis nprE, yla[A, B, C, D, E, F 300 1e-79
emb|Z81074.1|CEF32B6 Caenorhabditis elegans Cosmid F32B6 131 7e-78
gb|U00024|MTU00024 Mycobacterium tuberculosis Cosmid tbc2 284 7e-75
gb|AD000009|MSGY2 Mycobacterium tuberculosis Sequenz 284 7e-75
gb|U34393|GMU34393 Glycine max Acetyl CoA Carboxylase 259 2e-67
gb|U49829|CELF27D9 Caenorhabditis elegans Cosmid F27D9 186 4e-59
emb|AJ010111.1|BCE010111 Bacillus cereus pycA, ctaA, ctaB 208 5e-52
gb|U19183|ZMU19183 Zea mays Acetyl-coenzyme A Carboxylase 208 5e-52
gb|U10187|TAU10187 Triticum aestivum Tam 107 206 2e-51
gb|AF029895|AF029895 Triticum aestivum Acetyl-coenzyme A 205 5e-51
gb|J03808|RATACACA Rat Acetyl-coenzyme A Carboxylase mRNA 204 8e-51
emb|X80045|0AACOAC O. aries mRNA für Acetyl CoA Carboxylase 203 1e-50
emb|X68968|HSACOAC H. sapiens mRNA für Acetyl CoA 203 2e-50
emb|AJ132890.1|BTA132890 Bos taurus mRNA für Acetyl 202 2e-50
gb|J03541|CHKCOACA Chicken Acetyl CoA Carboxylase mRNA 202 3e-50
dbj|D34630|ATHACCRNA Arabidopsis thaliana mRNA 199 2e-49
gb|L25042|ALFACCASE Medicago sativa Acetyl CoA Carboxylase 198 5e-49
emb|Z71631|SCYNR016C S. cerevisiae Chromosom XIV 193 2e-47
gb|M92156|YSCFAS3A Saccharomyces cerevisiae Acetyl CoA 193 2e-47
emb|Z49809|SC8261X S. cerevisiae Chromosom XIII Cosmid 8261 192 3e-47
emb|Z22558|SCHFA1GN S. cerevisiae HFA1 Gen 192 3e-47
dbj|D78165|D78165 Saccharomyces cerevisiae DNA 192 3e-47
emb|Z46886|UMACCGEN U. maydis ACC Gen für Acetyl coa 190 1e-46
ref|NM_001093.1|ACACB| Homo sapiens Acetyl Coenzyme A 181 5e-44

Propionyl CoA Carboxylase (accA1)

gb|AF113603.1|AF113603 S. coelicolor vermutlich 1101 0.0 (Suchsequenz)
gb|AF113604.1|AF113604 Streptomyces coelicolor vermutlich 1090 0.0
gb|AF126429.1|AF126429 Streptomyces venezuelae JadJ (jadJ) 967 0.0
emb|Z92771|MTCY71 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 758 0.0
emb|X92557|SEPCCBBCP S. erythraea pccB, bcpA2, und orfX Gene 753 0.0
emb|X92556|SEHGTABCP S. erythraea hgtA, bcpA1, und orf122 753 0.0
gb|U00012|U00012 Mycobacterium leprae Cosmid B1308 745 0.0
emb|X63470|MLBCCPG M. leprae Gen für Biotin Carboxyl 742 0.0
gb|U35023|CGU35023 Corynebacterium glutamicum Thiosulfat 694 0.0
gb|U24659|SVU24659 Streptomyces venezuelae Glucose 596 e-169
gb|AE000742|AE000742 Aquifex aeolicus Sektion 74 417 e-115
gb|U67563|U67563 Methanococcus jannaschii Sektion 105 413 e-114
gb|L36530|MQSPYRCARB Aedes aegypti Pyruvat Carboxylase 404 e-111
gb|AF132152.1|AF132152 Drosophila melanogaster Klon 400 e-110
gb|L09192|MUSMPYR Mus musculus Pyruvat Carboxylase 397 e-109
gb|U36585|RNU36585 Rattus norvegicus Pyruvat Carboxylase 395 e-108
gb|U32314|RNU32314 Rattus norvegicus Pyruvat Carboxylase 395 e-108
gb|L14862|ANAACCC Anabaena sS. (PCC 7120) 49.1 kDa Biotin 394 e-108
gb|U04641|HSU04641 Human Pyruvat Carboxylase (PC) mRNA 391 e-107
gb|U59234|SPU59234 Synechococcus PCC7942 Biotin Carboxylase 391 e-107
ref|NM_000920.1|PC| Homo sapiens Pyruvat Carboxylase (PC) 390 e-107
gb|AE001090|AE001090 Archaeoglobus fulgidus Sektion 17 389 e-106
gb|AE000942|AE000942 Methanobacterium thermoautotrophicum 386 e-105
gb|S72370|S72370 Pyruvat Carboxylase human, Niere 384 e-105
dbj|D84432|BACJH642 Bacillus subtilis DNA, 283 Kb Region 383 e-105
emb|Z99116|BSUB0013 Bacillus subtilis vollständiges Genom 383 e-105
dbj|D64001|SYCCPNC Synechocystis sS. PCC6803 383 e-104
gb|U35647|SCU35647 Saccharomyces cerevisiae Pyruvat 382 e-104
emb|Z36087|SCYBR218C S. cerevisiae Chromosom II 382 e-104
emb|Z72584|SCYGL062W S. cerevisiae Chromosom VII 381 e-104
gb|J03889|YSCPCB Hefe (S. cerevisiae) Pyruvate Carboxylase 381 e-104
gb|L14612|PSEACCBC Pseudomonas aeruginosa Biotin carboxyl 381 e-104
emb|X59890|SCPYC2G S. cerivisiae PYC2 Gen for Pyruvat 381 e-104
gb|U32778|U32778 Haemophilus influenzae Rd Sektion 93 380 e-104
gb|U90879|ATU90879 Arabidopsis thaliana Biotin Carboxylase 377 e-103
gb|AE000749|AE000749 Aquifex aeolicus Sektion 81 of 109 377 e-103
gb|AE001286|AE001286 Chlamydia trachomatis Sektion 13 375 e-102
gb|AE001604|AE001604 Chlamydia pneumoniae Sektion 20 374 e-102
gb|AF007100|AF007100 Glycine max Biotin Carboxylase 372 e-101
emb|Z95556|MTCY07A7 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 369 e-100
emb|Z19549|MTBCARBCP M. tuberculosis Gen für Biotin 369 e-100
gb|AF068249|AF068249 Glycine max Biotin Carboxylase 369 e-100
gb|L38260|TOBBCSO Nicotiana tabacum Acetyl CoA 367 e-100
gb|AF097728|AF097728 Aspergillus terreus Pyruvat 366 1e-99
gb|AE000744|AE000744 Aquifex aeolicus Sektion 76 of 109 364 4e-99
dbj|D83706|D83706 Bacillus stearothermophilus DNA 363 7e-99
gb|U36245|BSU36245 Bacillus subtilis Biotin carboxyl 363 7e-99
emb|AL109846.1|SPBC17G9 S. pombe Chromosom II 362 2e-98
emb|AJ235272|RPXX03 Rickettsia prowazekii Stamm Madrid E 361 3e-98
dbj|D78170|D78170 Hefe DNA für Pyruvat Carboxylase 359 2e-97
gb|M80458|ECOACOAC E. coli Biotin Carboxylase und Biotin 358 3e-97
gb|M79446|ECOFABG Escherichia coli Biotin Carboxylase Gen 358 3e-97
gb|M83198|ECOFABEGF Escherichia coli Biotin carboxyl 358 3e-97
gb|AE000404|AE000404 Escherichia coli K-12 MG1655 358 3e-97
gb|U18997.1|ECOUW67 Escherichia coli K-12 chromosomal 358 3e-97
gb|U51439|REU51439 Rhizobium etli Pyruvat Carboxylase 355 3e-96
emb|Y13917|BSY13917 Bacillus subtilis ppsE, yngL, yngK, 354 4e-96
emb|Z99113|BSUB0010 Bacillus subtilis vollständiges Genom 354 4e-96
gb|AE001274.1|AE001274 Leishmania major Chromosom 1 351 3e-95
gb|AF042099|AF042099 Sulfolobus metallicus vermutlich 350 9e-95
emb|Z79700|MTCY10D7 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 347 6e-94
emb|Z81052.1|CED2023 Caenorhabditis elegans Cosmid D2023 168 1e-93
emb|Y11106|PPPYC1 S. pastoris PYC 1 Gen 345 2e-93
emb|Z99111|BSUB0008 Bacillus subtilis vollständiges Genom 343 8e-93
ref|NM_000282.1|PCCA| Homo sapiens Propionyl Coenzyme 340 6e-92
gb|M22631|RATPCOA Rat alpha-propionyl CoA Carboxylase 340 1e-91
gb|U12536|ATU12536 Arabidopsis thaliana 3-Methylcrotonyl 339 2e-91
emb|Y09548|CGPYC Corynebacterium glutamicum pyc Gen 338 4e-91
gb|AF038548|AF038548 Corynebacterium glutamicum Pyruvat 338 4e-91
gb|AE001529|AE001529 Helicobacter pylori, Stamm J99 337 8e-91
gb|AE000553.1|AE000553 Helicobacter pylori 26695 336 1e-90
gb|U08469|GMU08469 Glycine max 3-methylcrotonyl CoA 329 2e-88
emb|AJ243652.1|PFL243652 Pseudomonas fluorescens uahA Gen 323 1e-86
emb|Z83018|MTCY349 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 321 3e-86
emb|Z36077|SCYBR208C S. cerevisiae Chromosom II 314 5e-84
gb|M64926|YSCUAMD Hefe urea amidolyase (DUR1.2) Gen 312 2e-83
emb|Z97025|BSZ97025 Bacillus subtilis nprE, yla[A, B, C, D, E, 303 1e-80
emb|Z81074.1|CEF32B6 Caenorhabditis elegans Cosmid F32B6 130 1e-78
gb|U00024|MTU00024 Mycobacterium tuberculosis Cosmid tbc2 287 6e-76
gb|AD000009|MSGY2 Mycobacterium tuberculosis Sequenz 287 6e-76
gb|U34393|GMU34393 Glycine max Acetyl CoA Carboxylase 262 3e-68
gb|U49829|CELF27D9 Caenorhabditis elegans Cosmid F27D9 190 2e-61
gb|U10187|TAU10187 Triticum aestivum Tam 107 213 2e-53
gb|U19183|ZMU19183 Zea mays Acetyl-coenzyme A Carboxylase 212 3e-53
emb|AJ010111.1|BCE010111 Bacillus cereus pycA, ctaA, ctaB 212 4e-53
gb|AF029895|AF029895 Triticum aestivum Acetyl-Coenzym 209 2e-52
gb|J03808|RATACACA Rat Acetyl-Coenzym A Carboxylase 205 4e-51
emb|X80045|0AACOAC O. aries mRNA für Acetyl CoA 205 5e-51
emb|X68968|HSACOAC H. sapiens mRNA für Acetyl CoA 204 8e-51
dbj|D34630|ATHACCRNA Arabidopsis thaliana mRNA 203 1e-50
emb|AJ132890.1|BTA132890 Bos taurus mRNA für Acetyl CoA 203 1e-50
gb|J03541|CHKCOACA Chicken Acetyl CoA Carboxylase mRNA 203 1e-50
gb|L25042|ALFACCASE Medicago sativa Acetyl CoA Carboxylase 202 2e-50
emb|Z71631|SCYNR016C S. cerevisiae Chromosom XIV 196 1e-48
gb|M92156|YSCFAS3A Saccharomyces cerevisiae Acetyl CoA 196 1e-48
emb|Z49809|SC8261X S. cerevisiae Chromosom XIII Cosmid 8261 195 4e-48
emb|Z22558|SCHFA1GN S. cerevisiae HFA1 Gen 195 4e-48
dbj|D78165|D78165 Saccharomyces cerevisiae DNA 195 4e-48
emb|Z46886|UMACCHEN U. maydis ACC Gen für Acetyl coa 188 5e-46
gb|L20784|CCXACOAC Cyclotella cryptica Acetyl CoA 182 2e-44

Die Fachleute werden erkennen, dass wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Vielzahl von DNA Verbindungen, die sich in ihren Nukleotidsequenzen unterscheiden, verwendet werden können, um für eine gegebene Aminosäuresequenz der Erfindung zu kodieren. Auf die nativen DNA Sequenzen, die für die biosynthetischen Enzyme in der obigen Tabelle kodieren, wird hier nur Bezug genommen, um eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung zu illustrieren, und die Erfindung schließt DNA Verbindungen jeder Sequenz ein, die die Aminosäuresequenzen der Polypeptide und Proteine der Enzyme kodiert, die in den Verfahren der Erfindung verwendet wird. In ähnlicher Weise kann ein Polypeptid typischerweise eine oder mehr Aminosäuresubstitutionen, Deletionen und Insertionen in seiner Aminosäuresequenz tolerieren, ohne eine gewünschte zu verlieren oder in signifikanter Weise zu verlieren. Die vorliegende Erfindung schließt solche Polypeptide mit alternativen Aninosäuresequenzen ein, und die Aminosäuresequenzen, die durch die DNA der hier gezeigten Sequenzen kodiert werden, illustrieren hier nur bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausführungsform DNA Moleküle in Form von rekombinanten DNA Expressionsvektoren oder Plasmiden bereit, wie unten detaillierter beschrieben werden wird, die ein oder mehr Vorläufer biosynthetische Enzyme kodieren. Im Allgemeinen können solche Vektoren entweder in dem Zytoplasma der Wirtszelle entweder replizieren oder in die chromosomale DNA der Wirtszelle integrieren. In jedem Fall kann der Vektor ein stabiler Vektor (d.h. der Vektor bleibt sogar über viele Zellteilungen nur unter selektivem Druck) oder ein transienter Vektor (d.h. der Vektor wird durch die Wirszellen allmählich mit steigender Anzahl der Zellteilungen verloren) sein. Die Erfindung stellt DNA Moleküle in isolierter (d.h. nicht rein, aber in einer Präparation in einer Häufigkeit und/oder Konzentration vorliegend, die nicht in der Natur gefunden wird) und gereinigter (d.h. im Wesentlichen frei von kontaminierenden Materialien oder im Wesentlichen frei von Materialien, mit denen die korrespondierende DNA in der Natur gefunden würde) Form bereit. In einer wichtigen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren für die heterologe Expression eines oder mehr der biosynthetischen Gene bereit, die bei S-Methylmalonyl-CoA Biosynthese und rekombinanten DNA Expressionvektoren, die bei dem Verfahren nützlich sind, involviert sind, zur Verfügung. Somit sind rekombinante Expressionsvektoren offenbart, die solche Nukleinsäuren einschließen. Der Begriff Expressionsvektor, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die in eine Wirtszellen oder zellfreies Transkriptions- oder Translationssystem eingeführt werden kann. Ein Expressionsvektor kann permanent oder transient in einer Zelle beibehalten werden, entweder als Teil der chromosomalen oder anderer DNA in der Zelle oder in jedem zellulären Kompartment, wie ein replizierender Vektor in dem Zytoplasma. Ein Expressionsvektor umfasst einen Vektor, der die Expression einer RNA antreibt, die typischerweise in ein Polypeptid in der Zelle oder in dem Zellextrakt translatiert wird. Für effiziente Translation von RNA in ein Protein enthält der Expressionsvektor auch typischerweise eine Ribosomen bindende Stelle Sequenz, die stromaufwärts vom Startcodon der kodierenden Sequenz des zu exprimierenden Gens positioniert ist. Andere Elemente wie Enhancer, Sekretionssignalsequenzen, Transkriptionsterminierungssequenzen und ein oder meherere Markergene, durch die Wirtszellen enthaltend den Vektor identifiziert und/oder selektiert werden können, können ebenfalls in einem Expressionsvektor vorhanden sein. Selektierbare Marker, d.h. Gene die Antibiotikaresistenz oder Sensitivität vermitteln, werden bevorzugt und verleihen einen selektierbaren Phänotyp in transformierten Zellen, wenn die Zellen in einem geeigneten Selektionsmedium gezogen werden.
Die zahlreichen Komponenten eines Expressionsvektors können weit variieren, abhängig von der beabsichtigten Verwendung des Vektors und der Wirtszelle(n), in denen die Vektoren replizieren oder Expression antreiben sollen. Expressionsvektorkomponenten geeignet für die Expression von Genen und dem Erhalt von Vektoren in E. coli, Hefe, Streptomyces und anderen gemeinhin verwendeten Zellen sind sehr bekannt und kommerziell verfügbar. Zum Beispiel schließen geeignete Promotoren zum Einbau in Expressionsvektoren diejenigen ein, die in eukaryotischen und prokaryotischen Wirtszellen funktionieren. Promotoren können regulatorische Sequenzen umfassen, die die Regulation von Expression relativ zum Wachstum der Wirtszelle ermöglichen oder die bewirken, dass die Expression eines Genes ein oder aus geschaltet wird in Antwort auf ein chemischen oder physikalischen Stimulus. Für E. coli und bestimmte andere bakterielle Wirtszellen, können Promotoren abgeleitet aus Genen für biosynthetische Enzyme, Antibiotikaresistenz verleihenden Enzyme und Phagenprotein verwendet werden und schließen, zum Beispiel, die Galactose, Lactose (lac), Maltose, Tryptophan (trp), Beta-Lactamase (bla), Bakteriophage Lambda PL, und T5 Promotoren ein. Zusätzlich können synthetische Promotoren, wie der tac Promotor (U.S. Patent Nr. 4,551,433) auch verwendet werden. Für E. coli Expressionsvektoren ist es nützlich einen E. coli Replikationsstart einzuschließen, wie aus pUC, p1P, P1I und pBR.
Somit enthalten rekombinante Expressionsvektoren wenigstens ein Expressionssystem, das selber zusammengesetzt ist aus wenigstens ein Teil der PKS und/oder andere biosynthetische Gen kodierende Sequenzen, die funktional mit einem Promotor und optional Terminationssequenzen verknüpft sind, die die Funktionhaben, die Expression der kodierenden Sequenz in kompatiblen Wirtszellen zu bewirken. Die Wirtszellen sind modifiziert durch Transformation mit den rekombinanten DNA Expresssionsvektoren der Erfindung, um die Expressionssystemsequenzen entweder als extrachromosomale Elemente oder integriert in das Chromosom zu enthalten. Die resultierenden Wirtszellen der Erfindung sind nützlich bei Verfahren, um PKS und Post-PKS Modifikationsenzyme wie auch Polyketide und Antibiotika und andere nützliche davon abgeleitete Verbindungen herzustellen.
Bevorzugte Wirtszellen zum Zwecke der Auswahl von Vektorkomponenten für Expressionsvektoren schließen Pilz Wirtszellen, wie Hefe, und prokaryotische Wirtszellen wie E. coli und Streptomyces ein, aber es können auch Säugerwirtszellen verwendet werden. In Wirten, wie Hefen, Pflanzen oder Säugerzellen, die normalerweise keine Polyketide produzieren, kann es notwendig sein, auch typischerweise durch rekombinante Mittel, geeignete Holo-ACP Synthasen bereitzustellen, um das rekombinant hergestellte PKS funktionsfähig zu machen. Die Bereitstellung solcher Enzyme wird beschrieben, zum Beispiel, in PCT Veröffentlichung Nr. WO 97/13845 und 98/27203.
Die rekombinanten Wirtszellen der Erfindung können alle der Polyketid biosynthetischen Gene oder nur eine Untergruppe derselben exprimieren. Zum Beispiel produziert die Wirtszelle unmodifizierte Polyketide, die Macrolid Aglycone genannt werden, wenn nur die Gene für eine PKS in einer Wirtszelle exprimiert werden, die sonst nicht Polyketid modifizierende Enzyme (wie Hydroxylierung, Epoxidierung oder Glycosylierungsenzyme) produzieren, die auf das produzierte Polyketid wirken können. Solche Macrolid Aglycone können durch ihre Zugabe zu der Fermentation eines Stammes, zum Beispiel, Streptomyces antibioticus oder Saccharopolyspora erythraea, die die benötigten Modifikationsenzyme enthalten, hydroxyliert und glycosiliert werden.
Es gibt eine Vielzahl von diversen Organismen, die Macrolid Aglycone modifizieren können, um Verbindungen bereitzustellen mit nützlichen Aktivitäten, oder die leicht modifiziert werden können diese zu besitzen. Zum Beispiel kann Saccharopolyspora erythraea 6-dEB in eine Vielzahl von nützlichen Verbindungen umwandeln. Das Erythronolid 6-dEB wird durch das eryF Genprodukt in Erythronolid B umgewandelt, das selbst durch das eryB Genprodukt glycosiliert wird, um 3-O-Mycarosylerythronolid B zu erhalten, das L-Mycarose am C-3 enthält. Das Enzym eryC Genprodukt wandelt dann diese Verbindung in Erythromycin D durch Glycosylierung mit D-Desosamin am C-5 um. Erythromycin D unterscheidet sich daher von 6-dEB durch Glycoslierung und Hinzufügung einer Hydroxylgruppe am C-6. Erythromycin D kann in Erythromycin B in einer Reaktion umgewandelt werden, die durch das eryC Genprodukt durch Methylierung des L-Mycarose Restes am C-3 katalysiert wird. Erythromycin D wird in Erythromycin C durch die Hinzufügung einer Hydroxylgruppe am C-12 in einer Reaktion umgewandelt, die durch das eryK Genprodukt katalysiert wird. Erythromycin A wird aus Erythromycin C durch Methylierung des Mycaroserestes in einer Reaktion erhalten, die durch das eryC Genprodukut katalysiert wird. Die unmodifizierten Polyketide, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, wie zum Beispiel, 6-dEB, das in E. coli produziert wurde, können an Kulturen von S. erythraea bereitgestellt und in die entsprechenden Derivate von Erythromycinen A, B, C und D gemäß dem Verfahren umgewandelt werden, das in den Beispielen unter bereitgestellt wird. Um sicherzustellen, dass nur die gewünschte Verbindung produziert wird, kann man eine S. erythraea ergA Mutante verwenden, die nicht in der Lage ist, 6-dEB zur produzieren, aber immer noch die gewünschten Umwandlungen durchführen kann (Weber et al., 1985, J. Bacteriol. 164(1): 425-433). Auch kann man andere Mutantenstämme einsetzen, wie eryB, eryC, eryG und/oder eryK Mutanten oder Mutantenstämme mit Mutationen in multiplen Genen, um eine bevorzugte Verbindung anzuhäufen. Die Umwandlung kann in großen Fermentern für die kommerzielle Produktion durchgeführt werden.
Darüber hinaus gibt es andere nützliche Organismen, die eingesetzt werden können, um die Verbindungen der Erfindung zu hydroxylieren und/glycosylieren. Wie oben beschrieben, können die Organismen Mutanten sein, die nicht in der Lage sind, das Polyketid, das normalerweise in dem Organismus produziert wird, zu produzieren, die Fermentation kann auf Platten oder in großen Fermentern durchgeführt werden, und die produzierten Verbindungen können nach der Fermentation chemisch geändert werden. Somit enthält Strepfomyces venezuelae, das Picromycin produziert, Enzyme, die eine Desosaminyl-Gruppe auf das C-5 Hydroxyl transferieren und eine Hydroxylgruppe auf die C-12 Position transferieren. Zusätzlich enthält S. venezuelae eine Glucosylierungsaktivität, die die 2'-Hydroxylgruppe des Desosaminzuckers glucosyliert. Diese letztere Modifikation reduziert die Antibiotikaaktivität, aber der Glucosylrest wird durch die enzymatische Wirkung vor der Freisetzung des Polyketids aus der Zelle entfernt. Ein anderer Organismus S. narbonensis enthält die gleichen Modifikationsenzyme wie S. venezuelae, außer der C-12 Hydroxylase. Somit stellt die vorliegende Erfindung die Verbindungen zur Verfügung, die durch Hydroxylierung und Glycosylierung der Macrolid-Aglycone der Erfindung durch Wirkung den in S. narbonensis und S. venezuelae endogenen Enzyme produziert werden.
Andere Organismen, die für das Herstellen von Verbindungen der Erfindung geeignet sind, schließen Micromonospora megalomicea, Streptomyces antibioticus, S. fradiae und S. thermotolerans ein. M megalomicea glycosyliert das C-3 Hydroxyl mit Mycarose, das C-5 Hydroxyl mit Desosamin und das C-6 Hydroxyl mit Megosamin und hydroxyliert die C-6 Position. S. antibioticus produziert Oleandomycin und enthält Enzyme, die die C-6 und C-12 Positionen hydroxylieren, das C-3 Hydroxyl mit Oleandrose glycosylieren und das C-5 Hydroxyl mit Desosamin und ein Epoxid am C-8-C-8a bilden. S. fradiae enthält Enzyme, die das C-5 Hydroxyl mit Mycaminose glysolieren und dann das 4'-Hydroxyl von Mycaminos mit Mycarose, eine Disaccharid bildent. S. thermotolerans enthält die gleichen Aktivitäten wie S. fradiae sowie Acylierungsaktivitäten. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen zur Verfügung, die durch Hydroxylierung und Glycosylierung von Macrolid-Aglyconen der Erfindung durch Wirkung der in M. megalomicea, S. antibioticus, S. fradiae und S. thermotolerans endogenen Enzyme produziert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und genetische Konstrukte zum Produzieren der glycosylierten und/oder hydroxylierten Verbindungen der Erfindung direkt in der Wirtszelle von Interesse zur Verfügung. Somit können die Gene, die für die Polyketid Modifikationsenzyme kodieren in den Wirtszellen der Erfindung eingeschlossen werden. Ein Mangel an adäquater Resistenz gegenüber einem Polyketid kann überkommen werden, indem der Wirtszelle ein MLS Resistenzgen bereitgestellt wird (ermE und mgt/lrm zum Beispiel), welches gegenüber zahlreichen 14-elementigen Macroliden eine Resistenz verleiht (siehe Cundliffe, 1989, Annu. Rev. Microbiol. 43: 207-33; Jenkins und Cundliffe, 1991, Gene 108: 55-62; und Cundliffe, 1992, Gene, 115: 75-84).
Die rekombinanten Wirtszellen der Erfindung können verwendet werden, um Polyketide zu produzieren (sowohl Macrolid Aglycone als auch ihre modifizierten Derivate), die natürlich vorkommen oder durch rekombinanten DNA Technologie produziert werden. In einer wichtigen Ausführungsform werden die rekombinanten Wirtszellen der Erfindung verwendet, um Hybrid PKS-Enzyme zu produzieren. Für Zwecke der Erfindung ist eine Hybrid PKS eine rekombinante PKS, die alle oder einen Teil von einem oder mehr Verlängerungsmodulen, Ladungsmodulen, und/oder Thioesterase/Cyclase Domäne einer ersten PKS und alle oder Teile eines oder mehr Verlängerungsmodule, Landungsmodule, und/oder Thioesterase/Cyclase Domänen einer zweiten PKS umfasst.
Die Fachleute werden erkennen, dass die gesamte oder ein Teil der ersten und zweiten PKS in einer Hybrid PKS der Erfindung nicht aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert werden muss. Zum Beispiel bestimmt nur ein kleiner Teil einer AT Domäne seine Spezifität (siehe PCT Patentanmeldung Nr. WO US99/15047 (PCT Patentveröffentlichung Nr. WO US 00/08138, und Lau et al., unten).
Der Stand der Technik in der DNA Synthese erlaubt dem Fachmann, de novo DNA Verbindungen zu konstruieren, die von einer ausreichenden Größe sind, um einen nützlichen Anteil eines PKS Moduls oder Domäne zu konstruieren. Somit können die gewünschten derivatisierten kodierenden Sequenzen synthetisiert werden mit standardgemäßen Festphasensyntheseverfahren wie den von Jaye et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 6331 beschriebenen, und Instrumente für die automatisierte Synthese sind kommerziell verfügbar von, zum Beispiel, Applied Biosystems, Inc. Solche synthetischen DNA Verbindungen sollen ein Teil einer PKS sein.
Eine Hybrid PKS kann zum Zweck der Erfindung nicht nur resultieren:

(i) aus Fusionen von heterologen Domänen, die in kodierenden Sequezen (wobei heterolog bedeutet, dass die Domänen in einem Modul abgeleitet sind aus wenigstens zwei unterschiedlichen natürlich vorkommenden Molekülen) abgeleitet sind, um eine Hybridmolekül kodierende Sequenz zu produzieren, die in einem PKS Gen enthalten ist, dessen Produkt in eine PKS eingebaut wird, aber auch:
(ii) aus Fusionen von heterologen Modulen kodierenden Sequezen (wobei heterologes Modul zwei Module bedeutet, die benachbart zueinander liegen und die in natürlich vorkommenden PKS Enzymen nicht nebeneinander liegen), um eine Hybridmolekül kodierende Sequenz zu produzieren enthalten in einem PKS Gen, dessen Produkt in eine PKS eingebaut wird,
(iii) aus der Expression eines oder mehrerer PKS Gene aus einem ersten PKS Gencluster mit einem oder mehreren PKS Genen aus einem zweiten PKS Gencluster, und
(iv) aus der Kombinationen der vorstehenden.

Zahlreiche Hybrid PKS, die diese zahlreichen Alternativen veranschaulichen, sind unten beschrieben.
Rekombinante Verfahren zum Manipulieren von modularen PKS Genen, um Hybrid PKS Enzyme herzustellen, sind beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,672,491; 5,843,718; 5,830,750; und 5,712,146; und in PCT Veröffentlichungen Nr. 98/49315 und 97/02358. Eine Vielzahl von genetischen Konstruktionsstrategien wurden mit DEBS verwendet, um zu demonstrieren, das die Strukturen von Polyketiden manipuliert werden können, um neue natürliche Produkte herzustellen, primär Analoge der Erythromycine (siehe die oben zitierten Patentveröffentlichungen und Hutchinson, 1998, Curr Opin Microbiol. 1: 319-329, und Baltz, 1998, Trends Microbiol. 6: 76-83).
Diese Techniken schließen ein: (i) Deletion oder Insertion von Modulen, um die Kettenlänge zu kontrollieren, (ii) Inaktivierung der Reduktions-/Dehydrationsdomänen, um die Beta-Kohlenstoff prozessierenden Schritte zu umgehen, (iii) Substitution von AT Domänen, um die Start- und Verlängerungseinheiten zu ändern, (iv) Hinzufügen von Reduktions-/Dehydrationsdomänen, um katalytische Aktivitäten einzuführen, und (v) Substitution von Ketoreduktase KR Domänen, um die Hydroxyl Stereochemie zu kontrollieren. Zusätzlich wurden konstruierte blockierte Mutanten von DEBS für die auf Vorläufer gerichtete Biosynthese von Analogen verwendet, die synthetische abgeleitete Starteinheiten einbauen. Zum Beispiel wurden mehr als 100 neue Polyketide durch Konstruktion von einzelnen oder kombinatorischen Änderungen in den multiplen Modulen von DEBS produziert. Hybrid PKS Enzyme basierend auf DEBS mit bis zu drei katalytischen Domäne Substitutionen wurden durch eine Kassettenmutagenese, in denen zahlreiche DEBS Domänen ersetzt wurden mit Domänen für die Rapamycin PKS, konstruiert (siehe Schweke et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92, 7839-7843), oder wurde eine oder mehrere der DEBS KR Domänen deletiert. Funktionale Einzeldomänenersetzungen oder Deletionen wurden kombiniert, um DEBS Enzyme mit Doppel oder Tripel katalytischen Domäne Ersetzungen zu erzeugen (siehe McDaniel et al., 1999, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96, 1846-1851).
Verfahren zum Erzeugen von Bibliotheken von Polyketiden wurden stark verbessert durch Klonierung von PKS Genen als eine Satz von drei oder mehr gegenseitig selektierbaren Plasmiden, jedes ein anderes Wildtyp oder mutiertes PKS Gen tragend, dann wurden alle möglichen Kombinationen des Plasmids mit Wildtyp, mutierten und Hybrid PKS kodierenden Sequenzen in den gleichen Wirt eingeführt (siehe U.S. Patentanmeldungs-Seriennr. 60/129,731, eingereicht am 16. Apr. 1999 und PCT Veröff. Nr. 98/27203). Dieses Verfahren kann auch beinhalten die Verwendung einer KS1° Mutante, die durch mutationale Biosynthese Polyketide produzieren kann, hergestellt aus Diketid Starteinheiten (siehe Jacobsen et al., 1997, Science 277, 367-369), wie auch die Verwendung eines trunkierten Gens, das zu 12-elementigen Macroiden führt oder eines verlängerten Gens, das zu 16-elementigen Ketoliden führt. Darüber hinaus kann durch Verwendung von zusätzlich einem oder mehreren Vektoren, die Polyketid Modifikationsenzym-Gene kodieren, eine große Sammlung von modifizierten Polyketiden hergestellt werden.
Die folgende Tabelle führt die Fundstellen auf, die veranschaulichende PKS Gene und korrespondierende Enzyme beschreiben, die verwendet werden können bei der Konstruktion der rekombinanten Hybrid PKSs und der korrespondierenden DNA Verbindungen, die sie kodieren. Auch präsentiert werden zahlreiche Fundstellen, die Schneidenzyme und die korrespondierenden Gene beschreiben, die im Einklang mit den hier beschriebenen Verfahren verwendet werden können.
Avermectin

U.S. Pat. Nr. 5,252,474 von Merck.
MacNeil et al., 1993, Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pS. 245-256, A Comparison of the Genes Encoding the Polyketide Synthases for Avermectin, Erythromycin, and Nemadectin.
MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125, Complex Organization of the Streptomyces avermitilis Gene encoding the avermectin polyketide synthase.

Candicidin (FR008)

Hu et al., 1994, Mol. Microbiol 14: 163-172.

Epothilone

PCT Pub. Nr. 00/031247 von Kosan

Erythromycin

PCT Pub. Nr. 93/13663 von Abbott.
US Pat. Nr. 5,824,513 von Abbott.
Donadio et al., 1991, Science 252: 675-9.
Cortes et al., 8 Nov. 1990, Nature 348: 176-8, An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea.

Glycosylierungsenzyme

PCT Pat. ApS. Pub. Nr. 97/23630 von Abbott.

FK-506

Motamedi et al., 1998, The biosynthetic gene cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK506, Eur. J. biochem. 256: 528-534.
Motamedi et al., 1997, Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant FK506, Eur. J. Biocliem. 244: 74-80.

Methyltransferase

US 5,264,355 , issued 23 Nov. 1993, Methylating enzyme from Streptomyces MA6858. 31-O-desmethyl-FK506 methyltransferase.
Motamedi et al., 1996, Characterization of methyltransferase and hydroxylase genes involved in the biosynthesis of the immunosuppressants FK506 and FK520, I. Bacterid. 178: 5243-5248.

FK-520

PCT Pub. Nr. 00/020601 von Kosan.
(siehe auch Nielsen et al., 1991, Biochem. 30: 5789-96 (enzymology of pipecolate incorporation).

Lovastatin

U.S. Pat. Nr. 5,744,350 von Merck.

Narbomycin (und Picromycin)

PCT Pub. Nr. 99/61599 von Kosan.

Nemadectin

MacNeil et al., 1993, supra.

Niddamycin

Kakavas et al., 1997, Identification and characterization of the niddamycin polyketide synthase gene from Streptomyces caelestis, J. Bacteriol. 179: 7515-7522.

Oleandomycin

Swan et al., 1994, Characterisation of a Strepfomyces antibioticus gene encoding a type I polyketide synthase which has an unusual coding sequence, Mol. Gen. Genet. 242: 358-362.
PCT Pub. Nr. 00/026349 von Kosan.
Olano et al., 1998, Analysis of a Streptomyces antibioticus chromosomal Region involved in oleandomycin biosynthesis, which encodes two glycosyltransferases responsible for glycosylation of the macrolactone ring, Mol. Gen. Genet. 259(3): 299-308.

Platenolide

EP Pat. ApS. Pub. Nr. 791,656 von Lilly.

Rapamycin

Schwecke et al., Aug. 1995, The biosynthetic gene cluster for the polyketide Rapamycin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7839-7843.
Aparicio et al., 1996, Organization of the biosynthetic gene cluster for Rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic domains in the modular polyketide synthase, Gene 169: 9-16.

Rifamycin

August et al., 13 Feb. 1998, Biosynthesis of the ansamycin antibiotic rifamycin: deductions from the molecular analysis of the n/biosynthetic Gen cluster of Amycolatopsis mediterranei S669, Chemistry & Biology, 5(2): 69-79.

Soraphen

U.S. Pat. Nr. 5,716,849 von Novartis.
Schupp et al., 1995, I. Bacteriology 177: 3673-3679. A Sorangium cellulosum (Myxobacterium) Gene Cluster for the Biosynthesis of the Macrolide Antibiotic Soraphen A: Cloning,
Characterization, and Homology von Polyketide Synthase Genes from Actinomycetes.

Spiramycin

U.S. Pat. Nr. 5,098,837 von Lilly.

Activatorgen

U.S. Pat. Nr. 5,514,544 von Lilly.

Tylosin

EP Pub. Nr. 791,655 von Lilly.
Kuhstoss et al., 1996, Gene 183: 731-6., Production of a novel Polyketide through the construction of a hybrid Polyketide synthase.
U.S. Pat. Nr. 5,876,991 von Lilly.

Spaltenzyme

Merson-Davies und Cundliffe, 1994, Mol. Microbiol. 13: 349-355.
Analysis of five tylosin biosynthetic genes from the tylBA Region of the Streptomyces fradiae genome.

Wie die obige Tabelle veranschaulicht, gibt es eine große Vielzahl von PKS Genen, die als leicht verfügbare Quellen für DNA und Sequenzinformation für die Verwendung in der Konstruktion von hybrider PKS-kodierender DNA dienen.
Bei der Konstruktion von Hybrid PKSs können bestimmte allgemeine Verfahren nützlich sein. Zum Beispiel ist oft von Vorteil den Rahmen des Moduls, das geändert werden soll, um die Hybrid PKS herzustellen, beizubehalten. Somit ist es, wenn einer wünscht DH und ER Funktionalitäten einem Modul hinzuzufügen, oft bevorzugt, die KR Domäne des originalen Moduls mit einem KR, DH und ER Domänen enthaltenen Segment eines anderen Moduls zu ersetzen, statt nur DH und ER Domänen einzuführen. Man kann die stereochemische Spezifität eines Moduls durch Ersetzen der KS Domäne mit einer KS Domäne aus einem Modul ändern, das eine andere Stereochemie spezifiziert (siehe Lau et al., 1999, "Dissecting the role of acyltransferase domains of modular Polyketide synthases in the choice and stereochemical fate of extender units" Biochemistry 38(5): 1643-1651). Man kann die Spezifität einer AT Domäne durch Ändern eines kleinen Segments der Domäne ändern (siehe Lau et al., oben). Man kann auch Vorteile aus bekannten Linker Regionen in PKS Proteinen ziehen, um Module von zwei verschiedenen PKSs zu verbinden, um ein Hybrid PKS zu erschaffen (siehe Gokhale et al., 16 Apr. 1999, Dissecting and Exploiting Intermodular Communication in Polyketide Synthases", Science 284: 482-485).
Die Hybrid PKS kodierenden DNA Verbindungen können sein und sind oft Hybride aus mehr als zwei PKS Genen. Selbst wo nur zwei Gene verwendet werden, gibt es oft zwei oder mehr Module in dem Hybridgen, in dem alle oder ein Teil der Module abgeleitet ist von einem zweiten (oder dritten) PKS Gen.
Auch beschrieben sind Bibliotheken von PKS Genen, PKS Proteinen und letztlich Polyketiden, die konstruiert sind durch das Erzeugen von Modifikationen in der PKS, so dass die produzierten Proteinkomplexe geänderte Aktivitäten hinsichtlich eines oder mehreren Aspekten haben, und somit Polyketide herstellen, die nicht das natürliche Produkt der PKS sind. Neue Polyketide können somit hergestellt werden, oder Polyketide können im Allgemeinen leichter mit diesem Verfahren hergestellt werden. Durch Bereitstellen einer großen Anzahl von verschiedenen Genen oder Genclustern abgeleitet aus einem natürlich vorkommenden PKS Gencluster, jeder davon wurde auf eine andere Weise aus dem nativen Cluster modifiziert, kann ein effektive kombinatorische Bibliothek von Polyketiden produziert werden als ein Ergebnis der multiplen Variationen dieser Aktivitäten. Wie unten weiter beschrieben werden wird, können die Maße und Schranken davon auf dem Polyketid, Protein und den kodierenden Nukleotidsequenz Niveaus beschrieben werden.
Somit gibt es wenigstens fünf Freiheitsgrade zum Konstruieren einer Hybrid PKS bezogen auf das Polyketid, das produziert werden wird. Zuerst wird die Polyketidkettenlänge bestimmt durch die Zahl der Verlängerungsmodule in der PKS, und die vorliegende Erfindung umfasst Hybrid PKSs, die 6 sowie weniger oder mehr als 6 Verlängerungsmodule enthalten. Zweitens wird die Natur des Kohlenstoffskeletts der PKS bestimmt durch die Spezifitäten der Acyl-Transferasen, die die Verlängerungsmodule an jeder Position bestimmen, z.B. Malonyl, Methylmalonyl, Ethylmalonyl oder substituiertes Malonyl. Drittens hat die Ladungsmodulspezifität auch einen Effekt auf das resultierende Kohlenstoffskelett des Polyketids. Das Ladungsmodul kann eine andere Starteinheit verwenden, wie Acetyl, Butyryl und ähliche. Wie oben bemerkt, umfasst ein anderes Verfahren zum Variieren der Ladungsmodulspezifität die Inaktivierung der KS Aktivität im Verlängerungsmodul 1 (KS1) und die Bereitstellung von alternativen Substraten, Diketide genannt, die chemisch synthetisierte Analoge von Verlängerungsmodul 1 Produkten sind, an das Verlängerungsmodul 2. Dieser Ansatz wurde veranschaulicht in PCT Veröffentlichungen Nr. 97/02358 und 99/03986, wobei die KS1 Aktivität durch Mutation inaktiviert wurde. Viertens wird der Oxidationszustand an zahlreichen Positionen des Polyketids bestimmt werden durch die Dehydratase- und Reduktase-Teile der Module. Dies wird das Vorliegen und den Ort der Keton und Alkohol Einheiten und C-C Doppelbindungen oder C-C Einzelbindungen in dem Polyketid bestimmen. Schließlich ist die Stereochemie des resultierenden Polyketids eine Funktion dreier Aspekte der Synthase. Ders erste Aspekt bezieht sich auf die AT/KS Spezifität, assoziiert mit substituierten Malonylen als Verlängerungseinheiten, die die Stereochemie nur betreffen, wenn der Reduktionszyklus fehlt oder wenn er nur eine Ketoreduktase enthält, da die Dehydratase die Chiralität entfernen würde. Zweitens kann die Spezifität der Ketoreduktase die Chiralität jedes Beta-OH bestimmen. Schließlich kann die Enoylreduktasespezifität für substituierte Malonyle als Verlängerungseinheiten die Stereochemie beeinflussen, wenn eine vollständige KR/DH/ER verfügbar ist.
Somit erlauben die modularen PKS Systeme im Allgemeinen und das Rapamycin PKS System im Besonderen, dass ein breiter Bereich von Polyketiden synthetisiert wird. Im Vergleich zu den aromatischen PKS Systemen akzeptieren die modularen PKS Systeme einen breiteren Bereich von Starteinheiten, einschließend aliphatische Monomere (Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isovaleryl, etc.), Aromate (Aminohydroybenzoyl), alizyklische Verbindungen (Cylohexanoyl) und heterozyklische Verbindungen (Thiazolyl). Bestimmte modulare PKS haben eine relaxierte Spezifität für ihre Starteinheiten (Kao et al., 1994, (siehe oben). Modulare PKS weisen auch eine beträchtliche Variationsmöglichkeiten bezogen auf die Wahl der Verlängerungseinheiten in jedem Kondensierungszyklus auf. Der Grad von Beta-Ketoreduktion nach einer Kondensationsreaktion kann durch genetische Manipulation verändert werden (Donadio et al., 1991, Science, supra; Donadio et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7119-7123). In ähnlicher Weise kann die Größe der Polyketid Produkte durch die Konstruktion von Mutanten mit der geeigneten Anzahl von Modulen variieren (Kao et al., 1994, J. Am. Chem. Soc. 116: 11612-11613). Letztlich sind modulare PKS Enzyme besonders bekannt für das Erzeugen eines eindrucksvollen Bereichs von asymmetrischen Zentren in ihren Produkten in einer hoch kontrollierten Weise. Die Polyketide, Antibiotika und anderen produzierten Verbindungen sind typischerweise einzelne stereoisomerische Formen. Obgleich die Verbindungen der Erfindung als Mischungen von Stereoisomeren auftreten, kann es in bestimmten Fällen vorteilhaft sein, individuelle Stereoisomere zu erzeugen. Somit ist das kombinatorische Potential innerhalb der modularen PKS Wege, basierend auf irgendeinem natürlich vorkommenden modularen, wie dem Rapamycin, PKS Gerüst praktisch unbegrenzt.
Während Hybrid PKS meistens produziert werden durch „Mischen und Anpassen" von Teilen der PKS kodierenden Sequenzen, können auch Mutationen in DNA, kodierend für eine PKS, auch verwendet werden, um ein Aktivität in dem kodierten Polypeptid einzuführen, zu ändern oder zu deletieren. Mutationen können an den nativen Sequenzen mit konventionellen Techniken ausgeführt werden. Die Substrate für Mutation können ein gesamter Cluster von Genen oder nur ein oder zwei davon sein; das Substrat für Mutation können auch Teile eines oder mehrerer dieser Gene sein. Techniken zur Mutation schließen ein die Herstellung von synthetischen Oligonukleotiden, die die Mutationen einschließen, und das Einführen der mutierten Sequenz in das Gen, das für eine PKS-Untereinheit kodiert, mit Restriktionsendonukleaseverdau (siehe, z.B., Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 448 Geisselsoder et al., 1987, BioTechniques 5: 786). Alternativ können die Mutationen bewirkt werden mit einem nicht passenden Primer (im Allgemeinen 10-20 Nukleotide lang), der mit der nativen Nukleotidsequenz hybridisiert, bei einer Temperatur unter der Schmelztemperatur der nicht passenden Duplex. Der Primer kann durch Einhalten der Primerlänge und Basenzusammensetzung innerhalb relativ geringer Grenzen spezifisch und durch Einhalten der mutierten Basen an einer zentralen Position hergestellt sein (siehe Zoller und Smith, 1983, Methods Enzymol. 100: 468). Die Primerverlängerung wird mit DNA Polymerase, Klonieren des Produkts und Selektieren der Klone, die mutierte DNA enthalten, die von dem Primer verlängerten Strang durch Auftrennung abgleitet wurde, bewirkt. Identifikation kann erreicht werden mit dem mutierten Primer als einer Hybridisierungssonde. Die Technik ist auch zum Erzeugen von multiplen Punktmutationen anwendbar (siehe z.B. Dalbie-McFarland et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409). PCR Mutagenese kann auch verwendet werden, um die gewünschten Mutationen zu bewirken.
Eine zufällige Mutagenese von ausgewählten Teilen der Nukleotidsequenzen, die für die enzymatischen Aktivitäten kodieren, kann auch durch zahlreiche verschiedene in der Technik bekannten Techniken erreicht werden, z.B. durch zufälliges Einführen eines Oligonukleotid Linkers in ein Plasmid, durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht, durch Einbau von inkorrekten Nukleotiden während in vitro DNA Synthese, durch zu Fehlern neigende PCT Mutagenese, durch Herstellen von synthetischen Mutanten oder durch Beschädigen der Plasmid DNA in vitro mit Chemikalien. Chemische Mutagene schließen zum Beispiel Natriumbisulfit, salpetrige Säure, Nitrosoguanidin, Hydroxylamin, Agenzien, die Basen beschädigen oder entfernen, wodurch normale Basenpaarung verhindert wird, wie Hydrazin oder Ameisensäure, Analoga von Nukleotid Vorläufern, wie 5-Bromourazil, 2-Aminopurin oder Acridin interkallierende Agenzien, wie Proflavin, Acriflavin, Quinacrin, und ähnliche ein. Im Allgemeinen werden Plasmid DNA oder DNA Fragmente mit chemischen Mutagenen behandelt, in E. coli transformiert und als ein Pool oder eine Bibliothek von mutierten Plasmiden vermehrt.
Beim Konstruieren einer erfindungsgemäßen Hybrid PKS können Regionen, die enzymatische Aktivität kodieren, d.h., Regionen, die korrespondierende Bereiche von verschiedenen PKS Synthasen oder von verschiedenen Orten in der gleichen PKS kodieren, erneut gewonnen werden, zum Beispiel durch Verwendung von PCR Techniken mit geeigneten Primern. Unter „korrespondierende" Aktivität kodierende Bereiche sind diejenigen Bereiche gemeint, die den gleichen allgemeinen Typ von Aktivität kodieren. Zum Beispiel „korrespondiert" eine KR Aktivität, die an einer Stelle eines Genclusters kodiert wird, mit einer KR kodierenden Aktivität an einer anderen Stelle des Genclusters oder eines anderen Genclusters. In ähnlicher Weise könnte ein vollständiger Reduktasezyklus als korrespondierend betrachtet werden. Zum Beispiel kann KR/DH/ER mit einer KR alleine korrespondieren.
Wenn der Ersatz einer bestimmten Targetregion in einer Wirts-PKS gemacht werden soll, kann dieser Ersatz mit geeigneten Restriktionsenzymen in vitro durchgeführt werden. Der Ersatz kann auch in vivo mit Rekombinationstechniken bewirkt werden, die homologe Sequenzen, die das Ersetzungsgen in einem Donor Plasmid und einer Rezeptorregion in einem Empfängerplasmid einrahmem, umfassen. Solche Systeme, die vorteilhafterweise Plasmide mit verschiedenen Temperatursensitivitäten einsetzen, sind beschrieben, zum Beispiel in PCT Veröffentlichung Nr. WO 96/40968. Die Vektoren, die verwendet werden, um die zahlreichen Schritte durchzuführen, um die die enzymatische Aktivität in den Wirts-PKS Genen zu ersetzen oder um die Mutationen in diesen Regionen der Wirts-PKS Gene zu unterstützen, können gewählt werden, Kontrollsequenzen zu enthalten, die mit den resultierenden kodierenden Sequenzen funktional in einer Weise verbunden sind, so dass die Expression der kodierenden Sequenzen in einem geeigneten Wirt bewirkt werden kann.
Jedoch können einfache Klonierungsvektoren auch verwendet werden. Wenn den Klonierungsvektoren, die verwendet werden, um PKS Gene zu erhalten, die für abgeleitete PKS kodieren, Kontrollsequenzen zur Expression fehlen, die funktional mit den kodierenden Nukleotidsequenzen verbunden sind, werden die Nukleotidsequenzen in geeignete Expressionsvektoren eingeführt. Dies muss nicht individuell getan werden, sondern ein Pool von isolierten kodierenden Nukleotidsequenzen kann in Expressionsvektoren eingeführt werden, die resultierenden Vektoren können in Wirtszellen transformiert oder transfiziert werden, und die resultierenden Zellen können zu individuellen Kolonien ausplattiert werden. Die Erfindung stellt eine Vielzahl von rekombinanten DNA Verbindungen zur Verfügung, in welchen die verschiedenen kodierenden Sequenzen für die Domänen und Module der PKS von nicht natürlicherweise vorkommenden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen flankiert werden.
Die verschiedenen PKS Nukleotidsequenzen können als individuelle Kassetten mit separaten Kontrollelementen in einen oder mehrere rekombinante Vektoren oder unter der Kontrolle von z.B. einem einzelnen Promotor kloniert werden. Die PKS Untereinheiten kodierenden Regionen können flankierende Restriktionsstellen einschließen, um die einfache Deletion und Insertion von anderen PKS Untereinheit kodierenden Sequenzen zu erlauben, so dass hybrid PKSs erzeugt werden können. Das Design solcher einzigartiger Restriktionsstellen ist dem Fachmann bekannt und kann unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erreicht werden, so wie Stellen-gerichtete Mutagenese und PCR.
Die Expressionsvektoren, enthaltend für Vielzahl von PKS Enzymen kodierende Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung von verschiedenen Polyketiden werden dann in die geeigneten Wirtszellen transformiert, um die Bibliothek zu erstellen. In einem unmittelbaren Ansatz wird eine Mischung solcher Vektoren in die ausgewählten Wirtszellen transformiert und die resultierenden Zellen in individuelle Kolonien plattiert und selektiert, um erfolgreiche Transformanten zu identifizieren. Jede individuelle Kolonie hat die Fähigkeit eine bestimmte PKS Synthase zu produzieren und letztendlich ein bestimmtes Poliketid. Typischerweise werden in einigen, den meisten oder allen Kolonien Duplikationen auftreten; die Untergruppe der transformierten Kolonien, die eine unterschiedliche PKS in jeder Mitgliedskolonie enthält, kann als Bibliothek angesehen werden. Alternativ können die Expressionsvektoren individuell verwendet werden, um Wirte zu transformieren, wobei die transformierten Wirte dann in eine Bibliothek zusammengefügt werden. Eine Vielfalt von Strategien ist verfügbar, um eine Vielzahl von Kolonien zu erhalten, wobei jede einen PKS Gencluster enthält, der vom natürlich vorkommenden Gencluster des Wirts abgeleitet ist, so dass jede Kolonie in der Bibliothek eine andere PKS und letztendlich ein unterschiedliches Polyketid produziert. Die Anzahl der verschiedenen Polyketide, die durch die Bibliothek produziert werden, beträgt typischerweise wenigstens vier, noch typischer wenigstens zehn und vorzugsweise wenigstens 20 und noch bevorzugter wenigstens 50, eine ähnliche Anzahl von verschiedenen veränderten PKS Genclustern und PKS Genprodukten widerspiegelnd. Die Anzahl der Mitglieder in der Bibliothek ist beliebig gewählt; jedoch machen die oben umrissenen Freiheitsgrade in Bezug auf die Variation von Start-, Extensionseinheiten, Stereochemie, Oxidationszustand und Kettenlänge die Produktion von ziemlich großen Bibliotheken möglich.
Verfahren zum Einbringen der rekombinanten erfindungsgemäßen Vektoren in geeignete Wirte sind dem Fachmann bekannt und schließen typischerweise die Verwendung von CaCl₂ oder Agenzien wie andere divalente Kationen, Lipofektion, DMSO, Protoplastentransformation, Infektion, Transfektion und Elektroporation ein. Die poliketidproduzierenden Kolonien können unter Verwendung bekannter Techniken identifiziert und isoliert werden und die produzierten Polyketide können weiter charakterisiert werden. Die von diesen Kolonien produzierten Polyketide können kollektiv in einem Panel verwendet werden, um eine Bibliothek zu repräsentieren, oder können individuell auf Aktivität hin untersucht werden.
Die erfindungsgemäßen Bibliotheken können daher auf vier Stufen betrachtet werden: (1) eine Vielzahl von Kolonien, jede mit einer unterschiedlichen PKS kodierenden Sequenz; (2) die von den kodierenden Sequenzen produzierten Proteine; (3) die Polyketide, die von den in eine Funktions-PKS zusammengesetzten Proteinen produziert werden; und (4) Antibiotika oder Verbindungen mit anderen gewünschten Aktivitäten, die von den Polyketiden abgeleitet sind.
Kolonien in den Bibliotheken werden induziert, um die relevanten Synthasen und somit die relevanten Polyketide zu produzieren, um eine Bibliothek von Polyketiden zu erhalten. Die in die Medien sekretierten Polyketide können auf eine Bindung an gewünschte Ziele durchmustert werden, wie Rezeptoren, Signalproteine und ähnliche. Die Überstände an sich können für das Screening verwendet werden, oder eine teilweise oder komplette Aufreinigung der Polyketide kann zuvor durchgeführt werden. Typischerweise umfassen solche Screening-Verfahren die Detektion des Bindens eines jeden Mitglieds der Bibliothek an einen Rezeptor oder einen anderen Zielliganden. Die Bindung kann entweder direkt oder mittels eines kompetitiven Assays detektiert werden. Mittel, um solche Bibliotheken auf ein Binden hin zu screenen sind in der Technik wohl bekannt. Alternativ können individuelle Polyketidmitglieder der Bibliothek gegen ein gewünschtes Ziel getestet werden. In diesem Fall können Screeningverfahren, bei denen die biologische Antwort des Ziels gemessen wird, leichter einbezogen werden. Die antibiotische Aktivität kann unter Verwendung von typischen Screeningassays verifiziert werden, so wie diese, die in Lerher et al., 1991, J. Immunol. Meth. 137: 167-173 und in den Beispielen unten beschrieben sind.
Die Erfindung stellt Verfahren für die Herstellung einer großen Anzahl an Polyketiden zur Verfügung. Diese Polyketide sind nützliche Zwischenprodukte bei der Bildung von Verbindungen mit antibiotischer oder anderer Aktivität durch Hydroxylierung, Epoxidation und Glykosylierungsreaktionen, wie oben beschrieben. Im Allgemeinen müssen die Polyketidprodukte der PKS weiter modifiziert werden, typischerweise durch Hydroxylierung und Glykosylierung, um eine antibiotische Aktivität aufzuweisen. Hydroxylierung resultiert in den neuen, erfindungsgemäßen Polyketiden, die Hydroxylgruppen am C-6 enthalten, was durch die Verwendung der Hydroxylase erreicht werden kann, die durch das eryF Gen kodiert wird, und/oder am C-12 enthalten, was durch die Verwendung der Hydroxylase erreicht werden kann, die durch das picK oder eryK Gen kodiert wird. Das oleP Gen ist ebenfalls in rekombinanter Form verfügbar, die verwendet werden kann, um das oleP Genprodukt in einer beliebigen Wirtszelle zu exprimieren. Eine Wirtszelle, wie eine Streptomyces Wirtszelle, oder eine Saccharopolyspora erythraea Wirtszelle, modifiziert das oleP Gen zu exprimieren, kann daher verwendet werden, um Polyketide zu produzieren, die das C-8-C-8a Epoxid umfassen, das in Oleandomycin vorhanden ist. Daher stellt die Erfindung solche modifizierten Polyketide bereit. Die Anwesenheit von Hydroxylgruppen an diesen Positionen kann die antibiotische Aktivität der resultiernden Verbindung relativ zum unhydroxylierten Gegenstück verstärken.
Verfahren zur Glykosylierung der Polyketide sind allgemein in der Technik bekannt; die Glykosylierung kann intrazellulär bewirkt werden durch zur Verfügung stellen der geeigneten Glykosylierungsenzyme, oder kann in vitro unter Verwendung von Mitteln zur chemischen Synthese bewirkt werden, wie hierin und in PCT Veröffenlichunsschrift Nr. WO 98/49315 beschrieben. Vorzugsweise wird die Glykosylierung mit Desosamin, Mycarose und/oder Megosamin in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren in rekombinanten Wirtszellen, die von der Erfindung zur Verfügung gestellt werden, bewirkt. Im Allgemeinen spiegeln die Ansätze zur Bewirkung der Glykosylierung diejenigen oben in Bezug auf Hydroxylierung beschriebenen wider. Die aufgereinigten Enzyme, aus nativen Quellen isoliert, oder rekombinant produziert, können in vitro verwendet werden. Alternativ, und wie bemerkt, kann eine Glykosylierung unter Verwendung endogener oder rekombinant produzierter intrazellulärer Glykosylasen intrazellulär bewirkt werden. Zusätzlich können synthetische chemische Verfahren eingesetzt werden.
Die antibiotischen modularen Polyketide können jegliche Anzahl von verschiedenen Zuckern enthalten, obgleich D-Desosamin, oder ein engverwandtes Analog davon, am gebräuchlichsten ist. Erythromycin, Picromycin, Megalomycin, Narbomycin und Methymycin enthalten Desosamin. Erythromycin enthält außerdem L-Cladinose (3-O-Methylmycarose). Tylosin enthält Mycaminose (4-Hydroxydesosamin), Mycarose und 6-Deoxy-D-Allose. 2-Acetyl-1-Bromodesosamin wurde als ein Donor zur Glykosylierung von Polyketiden von Masamune et al., 1975, J. Am. Chem. Soc. 97: 3512-3513 verwendet. Andere, scheinbar stabilere Donore schließen Glykosylfluoride, Thioglykoside und Trichloroacetimidate ein (siehe Woodward et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3215; Martin et al., 1997, J. Am. Chem. Soc. 119: 3193; Toshima et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117: 3717; Matsumoto et al., 1988, Tetrahedon Lett. 29: 3575). Die Glykosylierung kann ebenfalls unter Verwendung von Polyketid Aglykonen als Ausgangsmaterial und unter Verwendung von Saccharopolyspora erythreae oder Streptomyces venezuelae oder anderer Wirte bewirkt werden, um die Umwandlung durchzuführen, vorzugsweise unter Verwendung von Mutanten, die unfähig sind, Macrolide zu synthetisieren, wie oben diskutiert.
Daher kann eine große Auswahl an Polyketiden mittels der erfindungsgemäßen hybriden PKS Enzyme produziert werden. Diese Polyketide sind nützlich als Antibiotika und als Zwischenprodukte bei der Synthese anderer nützlicher Verbindungen. In einem wichtigen Apekt stellt die Erfindung Verfahren bereit, um antibiotische Verbindungen herzustellen, die in ihrer Struktur mit Erythromycin, einer wirksamen antibiotischen Verbindung, verwand sind. Die Erfindung stellt ebenfalls neue ketolide Verbindungen, Polyketide Verbindungen mit wirksamer antibiotischer Aktivität von signifikantem Interesse wegen der Aktivität gegen antibiotikaresistente Bakterienstämme, zur Verfügung (siehe Griesgraber et al., 1996, J. Antibiot. 49: 465-477). Die meisten, wenn nicht alle der bis heute hergestellten Ketolide werden unter Verwendung von Erythromycin A, ein Derivat von 6-dEB, als Zwischenprodukt synthetisiert (siehe Griesraber et al., supra; Agouridas et al., 1998, J. Med. Chem. 41: 4080-4100, U.S. Patent Nr. 5,770,579; 5,760,233; 5,750,510; 5,747,467; 5,747,466; 5,656,607; 5,635,485; 5,614,614; 5,556,118; 5,543,400; 5,527,780; 5,444,051; 5,439,890; 5,439,889; und PCT Veröffentlichungsschriften Nr. WO 98/09978 und 98/28316).
Wie oben angemerkt, können die erfindungsgemäßen hybriden PKS Gene in einer Wirtszelle exprimiert werden, die die biosynthetischen Desosamin, Megosamin und/oder Mycarose Gene und korrespondierenden Transferasegene enthält, sowie das/die benötigten Hydroxylase Gen(e), die entweder picK, megK oder eryK (für die C-12 Position) und/oder megF oder eryF (für die C-6 Position) sein können. Die resultierenden Verbindungen haben antibiotische Aktivität, können jedoch weiter modifiziert werden, wie in den oben referenzierten Patentveröffentlichungsschriften beschrieben, um eine gewünschte Verbindung mit verbesserten oder anderweitig gewünschten Eigenschaften zu ergeben. Alternativ können Aglycon Verbindungen in der rekombinanten Wirtszelle produziert werden und die gewünschten Glykosylierungs- und Hydroxylierungsschritte in vitro oder in vivo ausgeführt werden, im letzteren Fall durch zur Verfügung stellen des Aglycons an die umwandelnde Zelle, wie oben beschrieben.
Wie oben beschrieben, gibt es eine große Vielzahl von diversen Organismen, die Verbindungen wie die hierin beschriebenen modifizieren können, um Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die nützliche Aktivitäten haben, oder einfach modifiziert werden können, um nützliche Aktivitäten zu haben. Zum Beispiel kann Saccharopolyspora erythraea 6-dEB in eine Vielzahl von nützlichen Verbindungen umwandeln. Die von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten Verbindungen können Kulturen von Saccharopolyspora erythraea zur Verfügung gestellt werden und zu den korrespondierenden Derivativen von Erythromycinen A, B, C und D, in Übereinstimmung mit den unten zur Verfügung gestellten Beispielen, umgewandelt werden. Um sicher zu stellen, dass lediglich die gewünschte Verbindung produziert wird, kann eine S. erythraea eryA Mutante verwendet werden, die unfähig ist, 6-dEB zu produzieren, aber dennoch die gewünschten Umwandlungen durchführen kann (Weber et al., 1985, J. Bacteriol. 164(1): 425-433). Es können auch andere Mutantenstämme eingesetzt werden, wie eryB, eryC, eryG und/oder eryK Mutanten, oder Mutantenstämme, die Mutationen in mehreren Genen aufweisen, um die bevorzugte Verbindung anzuhäufen. Die Umwandlung kann ebenfalls in großen Fermentern für eine kommerzielle Produktion ausgeführt werden. Jedes der Erythromycine A, B, C und D hat antibiotische Aktivität, obwohl Erythromycin A die höchste antibiotische Aktivität hat. Weiterhin kann jede dieser Verbindungen unter Behandlung mit einer milden Säure ein C-6 bis C-9 Hemiketal mit Motilidaktivität bilden. Für die Bildung von Hemiketalen mit Motolidaktivität sind Erythromycine B, C und D bevorzugt, da das Vorhandensein eines C-12 Hydroxyls die Bildung einer inaktiven Verbindung erlaubt, das ein gebildetes Hemiketal zwischen C-9 und C-12 aufweist.
Die vorliegende Erfindung stellt daher durch Hydroxylierung und Glykosylierung produzierte Verbindungen der erfindungsgemäßen Verbindungen bereit, durch die Wirkung von Enzymen, die für Saccharopolyspora erythraea und Mutantenstämme von S. erythraea endogen sind. Solche Verbindungen sind nützlich als Antibiotika oder als Motilide, direkt, oder nach chemischer Modifikation. Für die Verwendung als Antibiotika, können die erfindungsgemäßen Verbindungen direkt ohne weitere chemische Modifikation verwendet werden. Erythromycine A, B, C und D haben alle antibiotische Aktivität und die korrespondierenden erfindungsgemäßen Verbindunegn, die aus einer Modifizierung der Verbindungen durch Saccharopolyspora erythraea resultieren, haben ebenfalls antibiotische Aktivität. Diese Verbindungen können jedoch chemisch modifiziert werden, um andere erfindungsgemäße Verbindungen mit wirkungsvoller antibiotischer Aktivität zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel kann die Alkylierung von Erythromycin am C-6 Hydroxyl verwendet werden, um wirkungsvolle Antibiotika zu produzieren (Clarithromycin ist C-6-O-methyl), und andere nützliche Modifikationen sind beschrieben, zum Beispiel in Griesgraber et al., 1996, J. Antibiot. 49: 465-477, Agouridas et al., 1998, J. Med. Chem. 41: 4080-4100, U.S. Patent Nr 5,770,579; 5,760,233; 5,750,510; 5,747,467; 5,747,466; 5,656,607; 5,635,485; 5,614,614; 5,556,118; 5,543,400; 5,527,780; 5,444,051; 5,439,890; 5,439,889; und PCT Veröffentlichungsschriften Nr. WO 98/09978 und 98/28316.
Für die Verwendung als Motilide können die erfindungsgemäßen Verbindungen direkt ohne weitere chemische Modifizierungen verwendet werden. Erythromycin und einige Erythromycinanaloge sind wirkungsvolle Agonisten des Motilinrezeptors, die klinisch als prokinetische Agenzien verwendet werden können, um eine Phase III von migrierenden Motorkomplexen zu induzieren, um ösophagiale Peristaltik und LES Druck in Patienten mit GERD zu steigern, um ein gastritisches Entleeren bei Patienten mit gastritischer Parese zu beschleunigen und um Gallenblasenkontraktionen bei Patienten nach einer Gallensteinentfernung und bei Diabetis mit autonomer Neuropathie zu stimulieren (siehe Omura et al., 1987, Macrolides with gastrointestinal motor stimulating activity, J. Med. Chem. 30: 1941-3). Die korrespondierenden erfindungsgemäßen Verbindungen, die aus einer Modifizierung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch Saccharopolyspora erythraea resultieren, haben ebenfalls Motilidaktivität, besonders nach Umwandlung, die auch in vivo stattfinden kann, zum C-6 bis C-9 Hemiketal durch Behandlung mit milder Säure. Verbindungen, die das C-12 Hydroxyl nicht aufweisen sind besonders bevorzugt für die Verwendung als Motilinagonisten. Diese Verbindungen können jedoch auch weiter chemisch modifiziert werden, um andere erfindungsgemäße Verbindungen mit wirkungsvoller Motilidaktivität bereitzustellen.
Weiterhin, und wie oben erwähnt, gibt es andere nützliche Organismen, die eingesetzt werden können, um die erfindungsgemäßen Verbindungen zu hydroxylieren und/oder glykosylieren. Wie oben beschrieben, können die Organismen Mutanten sein, die unfähig sind, die Ketolide zu produzieren, die normalerweise in diesem Organismus produziert werden, die Fermentierung kann auf Platten oder in großen Fermentern durchgeführt werden und die produzierten Verbindungen können nach der Fermentierung chemisch verändert werden. Zusätzlich zu Saccharopolyspora erythraea können auch Streptomyces venezuelae, S. narbonensis, S. antibioticus, Micromonospora megalomicea, S. fradie und S. thermotolerans verwendet werden. Zusätzlich zur antibiotischen Aktivität können die erfindungsgemäßen Verbindungen, die durch Behandlung mit Enzymen von M. megalomicea produziert wurden, auch antiparasitäre Aktivität haben. Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verbindungen bereit, die durch Hydroxylierung und Glykosylierung durch die Aktion der endogenen Enzyme von S. erythraea, S. venezuelae, S. narbonensis, S. antibioticus, M. megalomicea, S. fradie und S. thermotolerans produziert werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aus den Fermentationsbrühen dieser kultivierten Zellen isoliert und mittels Standardprozeduren aufgereinigt werden. Die Verbindungen können einfach für die Bereitstellung von erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Verbindungen können in Form eines pharmazeutischen Präparats, zum Beispiel in fester, halbfester oder flüssiger Form, verwendet werden. Das Präparat wird eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen als einen aktiven Bestandteil enthalten, in Beimischung zu einem organischen oder anorganischen Trägerstoff oder Arzneimittelträger, der geeignet ist für die äußerliche, enterale oder parenterale Verabreichung. Der aktive Inhaltsstoff kann vermischt werden, zum Beispiel mit üblichen ungiftigen, pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen für Tabletten, Pellets, Kapseln, Suppositorien, Emulsionen, Suspensionen und jeglicher anderen Form, die für die Verwendung geeignet ist.
Die Trägerstoffe, die verwendet werden können, schließen ein Wasser, Glukose, Laktose, Akaziengummi, Gelatine, Mannitol, Stärkepaste, Magnesiumtrisilikat, Talkum, Maisstärke, Keratin, kolloides Kieselgel, Kartoffelstärke, Harnstoff und andere Trägerstoffe, die für die Verwendung in der Herstellung von Präparaten geeignet sind in fester, halbfester oder verflüssigter Form. Zusätzlich können unterstützende stabilisierende, verdickende und färbende Agenzien und Parfüms verwendet werden. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Hydroxypropylmethylzellulose verwendet werden, im Wesentlichen wie beschrieben in U.S. Patent Nr 4,916,138, oder mit einem Tensid, im Wesentlichen wie beschrieben in EPA Patentveröffentlichungsschrift Nr. 428,169.
Orale Dosierungsformen können im Wesentlichen wie von Hondo et al., 1987, Transplantation Proceedings XIX, SupS. 6: 17-22 beschrieben, hergestellt werden. Dosierungsformen für die äußerliche Anwendung können wie im Wesentlichen in EPA Patentveröffentlichungsschrift Nr 423,714 beschrieben, hergestellt werden. Die aktive Verbindung ist in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge enthalten, die ausreichend ist, den gewünschten Effekt auf den Krankheitsverlauf oder den Krankheitszustand zu erzielen.
Für die Behandlung von Zuständen und Krankheiten, die durch eine Infektion hervorgerufen wurden, kann eine erfindungsgemäße Verbindung oral, topisch, parenteral, durch Inhalationsspray, oder rektal verabreicht werden, in Dosierungseinheitsformulierungen, die konventionelle ungiftige pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, Adjuvanzien und Träger enthalten. Der Begriff parenteral, wie hier verwendet, schließt subkutane Injektionen und intravenöse, intramuskuläre und intrasternale Injektionen oder Infusionstechniken ein.
Die Dosierungshöhen der erfindungsgemäßen Verbindungen liegen im Bereich von ungefähr 0.01 mg bis ungefähr 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise von ungefähr 0.1 mg bis ungefähr 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Die Dosierungshöhen sind nützlich bei der Behandlung der oben aufgeführten Konditionen (von ungefähr 0.7 mg bis ungefähr 3.5 mg pro Patient pro Tag, einen 70 kg schweren Patienten angenommen). Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf einer intermittierenden Basis verabreicht werden, d.h. in halbwöchentlichen, wöchentlichen, halbmonatlichen oder monatlichen Intervallen.
Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, die mit dem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine einzelne Dosierungsform zu produzieren, variiert abhängig vom behandelten Wirt und der jeweiligen Verabreichungsform. Zum Beispiel kann eine Formulierung, die für die orale Verabreichung an Menschen gedacht ist, von 0.5 mg bis 5 g des aktiven Agenz enthalten, vermischt mit einer angemessenen und dienlichen Menge an Trägermaterial, welches von ungefähr 5 Prozent bis ungefähr 95 Prozent der Gesamtzusammensetzung variieren kann. Die Dosierungseinheitsformen enthalten im Allgemeinen von ungefähr 0.5 mg bis ungefähr 500 mg des aktiven Inhaltsstoffes. Für die äußerliche Anwendung können die erfindungsgemäßen Verbindungen im Bereich von, zum Beispiel, 0.00001 Gewichtsprozent bis 60 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0.001 Gewichtsprozent bis 10 Gewichtsprozent, und noch bevorzugter von ungefähr 0.005 Gewichtsprozent bis 0.8 Gewichtsprozent formuliert werden.
Es versteht sich jedoch, dass die spezifische Dosierungshöhe für einen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängig ist. Diese Faktoren schließen ein die Aktivität der spezifischen eingesetzten Verbindung; das Alter, Körpergewicht, der generelle Gesundheitszustand, das Geschlecht und die Ernährungsweise des Subjekts; die Zeit und Route der Verabreichung und die Rate der Ausscheidung des Arzneimittels; ob eine Kombination von Arzneimitteln bei der Behandlung verwendet wird; und die Schwere der jeweiligen Erkrankung oder Kondition für die die Therapie angestrebt wird.
Nach der oben bereitgestellten detaillierten Beschreibung der Erfindung, werden die folgenden Beispiele zum Zwecke der Veranschaulichung der Erfindung gegeben und sollen nicht als eine Limitierung des Umfangs der Erfindung oder der Ansprüche ausgelegt werden.
Beispiel 1
Herstellung von Methylmalonyl-CoA in E. coli
Dieses Beispiel beschreibt in Teil A die Klonierung und Expression der Methylmalonyl-CoA Mutase und, in Teil B, die Klonierung und Expression der Methylmalonyl-CoA Epimerase in E. coli.
A. Klonierung und Expression der Methylmalonyl-CoA Mutase
Methylmalonyl-CoA Mutase wurde aus Propionibacterium shermanii kloniert und in E. coli exprimiert. Das Holoenzym mm-CoA Mutase wurde durch Kultivierung von Zellen in der Gegenwart von Hydroxocobalamin erhalten und es wurde gezeigt, dass es ohne die Zugabe von Vitamin B12 aktiv ist. Methylmalonyl-CoA wurde in vivo produziert, wie gesehen durch die CoA Analyse unter Verwendung eines panD Stamms von BL21 (DE3).
Um die modulare Poliketidproduktion in E. coli zu unterstützen, stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien bereit, um (S)-Methylmalonyl-CoA, welches normalerweise nicht in E. coli vorhanden ist, zu produzieren, durch Überexpression der mm-CoA Mutase und der mm-CoA Epimerase in E. coli. Eine aktive, FLAG-getaggte Version der mm-CoA Mutase aus S. cinnamonensis wurde in XL1Blue Zellen exprimiert, die in der Gegenwart von Hydroxocobalamin in einem synthetischen, vitaminfreien Medium kultiviert wurden, um das aktive Holoenzym zu produzieren. Die CoA Level in den Zellen wurden durch Fütterung von markiertem β-Alanin analysiert; zu diesem Zweck ist es von Vorteil, einen panD Stamm zu haben, der β-Alanin auxotroph ist. Die Mutase DNA rearrangierte im panD Stamm von SJ16, einem recA* Stamm, so dass die CoA Analyse ohne panD ausgeführt werden musste. Dieses resultierte in einem niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis, jedoch konnten erhöhte mm-CoA Levels dennoch detektiert werden. Als eine Alternative zu den S. cinnamonensis Genen stellt die Erfindung eine mm-CoA Mutase aus S. shermanii bereit, die in einen E. coli Expressionsvektor kloniert ist, die ohne Zugabe von Vitamin B12 aktiv ist und die mm-CoA Levels in E. coli in einem panD Stamm, der mit der Mutase DNA kompatibel ist, erhöht.
Propionibacterium freudenreichii subsS. shermanii wurde aus einem Stich in Tomatensaftagar erhalten, der abgeleitet war von einer gefriergetrockneten Probe von NCIMB, Schottland (NCIMB # 9885). E. coli Stamm gg3, eine panD Version von BL21 (DE3) wurde für die CoA Analyse verwendet. E. coli Stämme gg1 und gg2, recA^– Versionen des SJ16 panD Stamms, wurden ebenfalls verwendet. Der PKK** Vektor ist eine Version von pKK223-3, in welchem die Klonierungsregion verändert wurde, um von Nde1 bis EcoR1 zu reichen und eine zusätzliche Nde1 Stelle deletiert wurde. Kultivierung von S. shermanii und Präparation von genomische DNA wurde wie in der Literatur beschrieben durchgeführt.
Subklonierung der Methylmalonyl-CoA Mutase aus S. shermanii in E. coli wurde wie folgt durchgeführt. Das Gen für die mm-CoA Mutase besteht aus zwei Untereinheiten, mutA und mutB, die mittels PCR aus S. shermanii genomischer DNA in einer Gesamtzahl von vier Fragmenten amplifiziert wurden. Natürlich vorkommende Restriktionsstellen wurden verwendet, um das Gen zusammenzusetzen. Einzigartige Restriktionsstellen wurden an beiden Enden des Gens für Klonierungszwecke eingeführt und das Startcodon für das mutB Gen wurde von GTG nach ATG geändert. Wie unten illustriert, wurden diese vier Fragmente in einen Bluescript^TM (Stratagene) Vektor kloniert, sequenziert und dann zusammengesetzt, um das komplette Mutasegen zu bilden. Das Gen wurde dann in die Expressionsvektoren pET22b und pKK** zwischen die Restriktionsstellen Nde1 und HindIII kloniert, um pET-MUT und pKK**-MUT zu bilden.
pET-MUT wurde in kompetente Zellen BL21(DE3) transformiert und später in gg3 Zellen, die eine panD Version von BL21(DE3) sind. pKK**-MUT wurde in SJ16 panD und in XL1 Blue transformiert. Die DNA wurde mittels Screening von verschiedenen Kolonien mit Nde1 und HindIII getestet, um festzustellen ob das Mutasegen noch vorhanden war, oder rearrangiert worden war.
Für die SDS-PAGE Analyse wurden Zellen des Stamms BL21(DE3), enthaltend pET-MUT (und pET allein als Kontrolle) aerob bei 27°C in MUT Medium mit 100 μl/ml Carbenicillin (carb) gezogen (MUT Medium besteht aus M9 Salzen, Glucose, Thiamin, Spurenelementen und Aminosäuren, wie zuvor für die Expression der Methioninsynthase beschrieben (Amaratunga, M., et al., A synthetic module fort he metH gene permits facile mutagenesis of the cobalaminbinding region of Escherichia coli methionine synthase: initial characterization of seven mutant proteins. Biochemistry, 1996. 35(7): S. 2453-63). Übernachtkulturen (250 μl) wurden verwendet, um 25 ml MUT Medium (carb) zu inokulieren, die bei 27°C bis zu einer OD₆₀₀ von ungefähr 0.5 gezogen wurden. Die Kulturen wurden dann mit IPTG mit einer 1 mM Endkonzentration induziert. Zwei Kulturen wurden für drei Stunden bei 27°C belassen, während Duplikatkulturen für zwei Stunden bei 37°C kultiviert wurden. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt und die Pellets wurden vor der Analyse bei –80°C gelagert. Die Zellen wurden mittels Sonikation lysiert und sowohl die lösliche als auch die unlösliche Phase wurde mittels SDS-PAGE untersucht. Diese Prozedur wurde für die Zellen des XL1 Blue Stamms wiederholt, die pKK**-MUT enthielten.
Für die Expression von aktiver mm-CoA Mutase (mit Hydroxocobalamin) wurden Zellen des Stammes gg3, enthaltend pET-MUT (und pET aleine als Kontrolle) in MUT Medium (carb) und 5 μM beta-Alanin für ungefähr 20 Stunden bei 27°C herangezogen. Die folgenden Schritte wurden in einer Dunkelkammer mit einem roten Sicherheitslicht durchgeführt: 125 ml Flaschen, jede enthaltend 25 ml des MUT Mediums mit carb und 5 μM β-Alanin und in Aluminiumfolie eingewickelt, wurden mit 5 μM Hydroxocobalamin angeimpft und danach mit 250 μl von den jeweiligen Startkulturen. Nach Schütteln über Nacht bei 27°C wurden die Kulturen mit einer Endkonzentration von 1 mM IPTG angeimpft und für weitere 4:45 Stunden gezogen, zu welchem Punkt sie gesammelt wurden (in in Aluminiumfolie eingewickelten Falcon Röhrchen) durch Zentrifugation bei 4000 rpm für 10 Minuten. Die Pellets wurden vor den Assays im Dunklen bei –80°C aufbewahrt.
Der Mutaseassay wurde wie folgt durchgeführt. Alle Schritte wurden im Dunklen oder unter einem roten Sicherheitslicht durchgeführt. Die Pellets aus 20 ml Kultur wurden aufgetaut, in Puffer C gewaschen (50 mM Kaliumphosphat pH 7.4, 5 mM EDTA, 10% Glycerin) und in 0.5 ml von Puffer C resuspendiert, der Proteaseinhibitoren enthielt (1 Tablette pro 10 ml des Puffers). Nach Sonification auf Eis wurde der Extrakt durch Zentrifugation bei 4°C für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf Microfuge geklärt; der Überstand wurde dem Assay unterzogen. Enzymassays enthielten, in einem Endvolumen von 100 μl, 0.2 mM (2R,2S)-Methylmalonyl-CoA Mutase, Mutaseextrakt und Puffer C enthaltend Proteaseinhibitoren. Reaktionen für Assays mit Vitamin B12 wurden wie oben ausgeführt, enthielten jedoch 0.01 mM Vitamin B12, in welchem Fall das Mutaseextrakt mit Vitamin B12 in einem Gesamtvolumen von 75 μl für 5 Minuten bei 30°C vor dem Beginn der Reaktion mit Methylmalonyl-CoA inkubiert wurde. Nach der gewünschten Länge der Inkubation bei 30°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 50 μl 10% Trichloressigsäure (TCA) gestoppt und für ungefähr 10 Minuten auf Eis gestellt. Zelltrümmer und präzipitiertes Protein wurden durch Zentrifugation für 5 Minuten in einer Eppendorf Microfuge bei 4°C entfernt. Ein Aliquot (100 μl) des Überstands wurde in die HPLC injiziert um die Umwandlung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA zu quantifizieren.
Ein Zeitpunkt wurde 20 Minuten nach der Inkubation bei 30°C genommen und die Probe wurde auf die Umwandlung von mm-CoA zu Succinyl-CoA hin untersucht. Alle Schritte wurden ausschließlich unter einem roten Sicherheitslicht durchgeführt, bis die Reaktion durch Zugabe von TCA gestoppt war.
Die CoA Analyse wurde wie in der Literatur beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 5 μM Hydroxocobalamin zum Zeitpunkt der IPTG Induktion zugegeben wurden und die Röhrchen in Aluminiumfolie gewickelt und bei 27°C anstatt 30°C kultiviert wurden. Die CoA Peaks, die jeweils ungefähr in einer Minute eluierten wurden manuell gesammelt, wie auch eine Probe ungefähr eine Minute vor und nach jedem Peak. In einigen Tets, wurden Fraktionen alle 30 Sekunden gesammelt. Alle Proben wurden im Szintillationszähler ausgezählt.
Die zwei Untereinheiten des Gens, welches für die Methylmalonyl-CoA Mutase kodiert, sind translatorisch gekoppelt – das GTG Startcodon der downstream gelegenen Untereinheit mutB überlappt mit dem ATG Codon von mutA. Der GTG Valin-Start wurde in einen ATG Methionin-Start mutiert (was keinerlei andere Aminosäuren verändert), da E. coli den Methionin-Start effizienter nutzt. Die Sequenzierung des mm-CoA Mutasegens brachte eine Diskrepanz zwischen der beobachteten und der veröffentlichten Sequenz ans Tageslicht. Ein „GC" statt eines „CG" änderte zwei Aminosäuren von Asp, Val in Glu, Leu. Die Kristallstruktur der mm-CoA Mutase aus S. shermanii zeigte, dass die zwei Aminosäuren tatsächlich Glu und Leu sind, so dass die publizierte Sequenz fehlerhaft ist. Das mm-CoA Mutasegen wurde in zwei unterschiedliche E. coli Expressionssysteme subkloniert: pET, welches unter der Kontrolle des starken T7 Promotors steht und pKK, welches den leaky tac Promoter verwendet. Zuerst war es erforderlich, Stämme zu finden, in denen die Mutase DNA nicht rearrangierte. Es wurde zuvor beobachtet, dass eine FLAG-getaggte Version der Mutase aus S. cinnamonensis in SJ16 panD und in BL21(DE3) rearrangierte, welches beide recA⁺ Stämme sind, jedoch nicht in XL1 Blue, der recA^– ist. Diese Mutase DNA (S. shermanii) rearrangierte ebenfalls in den SJ16 Zellen aber nicht in den BL21(DE3) Zellen. Daher wurde eine panD Version von BL21(DE3) hergestellt (gg3) zur Verwendung mit dem pET Vektor. Eine recA^– Version von SJ16 wurde ebenfalls hergestellt (gg1, gg2) für die Verwendung mit dem pKK System; jedoch rearrangierte die Mutase DNA ebenfalls in diesem Stamm.
Verschiedene Wachstumsbedingungen wurden getestet, um Bedingungen zu finden, bei welchen die zwei Untereinheiten der Mutase in ungefähr äquimolarem Verhältnis in der löslichen Phase exprimiert wurden. Im Allgemeinen machte es den Eindruck, dass die höhere Temperatur von 37°C dazu führte, dass die Mutase überwiegend in der unlöslichen Form auftauchte. Anzucht bei ausschließlich 27°C führte zu löslichem Protein mit einem ungefähr gleichem Verhältnis der Untereinheiten.
3 zeigt den Vergleich von in vivo Acyl-CoA Leveln in BL21(DE3) panD Stämmen mit und ohne mm-CoA Mutase. Für jedes CoA wurde das Verhältnis der Menge im Stamm, der die Mutase enthielt zu der der Menge im Kontrollstamm bestimmt. Interessanterweise war Malonyl-CoA ungefähr 25-fach und Succinyl-CoA ungefähr 3-fach erhöht. Acetyl-CoA und CoA waren nur etwas erhöht und Propionyl-CoA wurde in keinem Fall detektiert.
Um die aktive Mutase in vivo zu exprimieren war es nötig, Zellen in einem definierten Medium (MUT Medium) heranzuziehen, welches die Aufnahme des Vitamin B12 Vorläufers Hydroxocobalamin erlaubt; dies ist ähnlich zu einem bekannten Protokoll für die Expression von aktiver Methioninsynthase, die ebenfalls B12 benötigt. Zellextrakte, die die Mutase überexprimierten, zeigten eine Umwandlung von mm-CoA zu Succinyl-CoA ohne die Zugabe von Vitamin B12. Lediglich ein Zeitpunkt (bei 20 Minuten) wurde getestet, um die Aktivität zu bestätigen; die spezifische Aktivität der Mutase wurde nicht bestimmt.
Daher wurde Methylmalonyl-CoA Mutase als aktives Holoenzym in E. coli exprimiert und Methylmalonyl-CoA wurde in vivo produziert. Da es eine langsame, spontane chemische Epimerisierung zwischen (R)- und (S)-mm-CoA gibt (ungefähr 3% in 15 Minuten), kann es hilfreich sein, die relativen Mengen dieser Diastereomere in Zellen zu bestimmen, die die Mutase überexprimieren. Ausreichend (S)-mm-CoA kann vorhanden sein, um die Polyketidproduktion in einigen Zellen ohne die Zugabe von Epimerase zu erlauben. Um die letztendliche Produktion von Polyketiden in E. coli zu ermöglichen, kann das Mutasegen in das Chromosom der BL12 panD Zelle oder einer anderen Wirtszelle eingebracht werden.
2 zeigt die Herstellung von pSK-MUT, worin vier PCR Fragmente sequenziert und zusammengesetzt wurden, um das komplette Mutasegen in pSK-bluescript zu bilden.
In nachfolgenden Experimenten wurde die spezifische Aktivität der Mutase bestimmt und eine eingehende CoA Analyse erstellt. Wie in 3 gezeigt, wurden die CoA Levels in den Zellen erneut unter Verwendung eines panD Stammes analysiert, der β-Alanin auxotroph ist. ³H-β-Alanin wurde an die Zellen gefüttert und in die Acyl-CoAs eingebaut, die mittels HPLC aufgetrennt und gezählt wurden. Die CoA Pools für Zellextrakte mit und ohne Mutase, sowie mit und ohne Hydroxocobalamin, wurden untersucht.
Um zu testen, ob Acyl-CoAs in TCA degradieren, wurden die folgenden Tests durchgeführt. Der CoA-Mix bestand aus jeweils 1.6 mM Malonyl-, Methylmalonyl-, Succinyl-, Acetyl- und Propionyl-CoA, plus 0.5 mM CoA. Ein Aliquot (10 μl) dieses Mixes wurde zu 100 μl 10% TCA gegeben, 50 μl wurden sofort in die HPLC zur CoA Analyse injiziert und der Rest wurde umgehend auf Trockeneis eingefroren. Die gefrorene Portion wurde dann aufgetaut und sofort in die HPLC geladen. Wiederum wurden 10 μl des CoA Mixes zu 100 μl 10% TCA gegeben, 50 μl wurden für 15 Minuten auf Eis belassen und dann in die HPLC injiziert, der Rest wurde bei 4°C über Nacht belassen und am nächsten Morgen in die HPLC injiziert. Die Fläche unter jedem Peak wurde vermerkt. Derselben Prozedur wurde gefolgt, jedoch unter Verwendung einer Mischung von TCA und Puffer A aus dem Mutaseassay.
Die hier beschriebene CoA Analyse wird an Zellen ausgeführt, die in 10% TCA lysiert sind. Daher ist es wichtig zu bestimmen, ob CoAs signifikant in TCA und einer Mischung aus TCA und Puffer A des Mutaseassays degradieren. Die Tests zeigten, dass das Prozent jeder CoA relativ zu dem totalen CoA Pool, sowie zur Gesamtmenge an CoA, nach dem Gefrieren/Auftauen, nach dem Belassen auf Eis für 15 Minuten und nach dem Belassen bei 4°C über Nacht, konstant blieb. Daher sind CoAs in TCA und im Mutaseassay-Puffer nachdem die Zellen lysiert sind oder nachdem die Assays fertig gestellt sind und vor der HPLC Analyse, stabil.
Obwohl die CoAs in TCA und Puffer bei 4°C stabil sind, degradierten sie bei 30°C, d.h. bei der Temperatur, bei der der Mutaseassay durchgeführt wurde. Innerhalb von fünf Minuten unter Assaybedingungen, hydrolysierten ungefähr 4% des Methylmalonyl-CoA zu CoA. Das Succinyl-CoA hydrolisierte mit einer vergleichbaren Rate. Daher ist der Mutaseassay für extrem quantitative Ergebnisse suboptimal.
Wenn 0.2 mM Methylmalonyl-CoA mit einem Roh-Lysat von Zellextrakten inkubiert wurde, die Mutase überexprimierten, wurde Succinyl-CoA produziert. Es wurde kein Succinyl-CoA beobachtet, wenn Methylmalonyl-CoA mit Lysaten des Kontrollstamms inkubiert wurde (enthaltend den Plasmidvektor, jedoch ohne die Mutasegene). Unter diesen Expressions- und Assaybedingungen wurde eine spezifische Aktivität von ungefähr 0.04 U/mg in den Roh-Extrakten beobachtet. Wenn Zellen, die die Mutase überexprimierten in MUT Medium ohne Hydroxocobalamin herangezogen wurden, wurde keine Mutaseaktivität beobachtet; jedoch konnte Mutaseaktivität durch Zugabe von Vitamin B12 in vitro beobachtet werden. Die Zugabe von Vitamin B12 zu Extrakten, die in der Gegenwart von Hydroxocobalamin herangezogen wurden, resultierte in erhöhter Mutaseaktivität, was nahelegt, dass eine signifikante Menge an exprimierter Mutase als das Apoenzym vorliegt. Dies kann aufgetreten sein, da das Enzym schneller exprimiert wurde als dass Hydroxocobalamin in die Zellen transportiert werden konnte, oder weil der Vitamin B12 Cofaktor während der Präparation des Extrakts verloren ging.
4 zeigt den Vergleich von in vivo Acyl-CoA Level mit und ohne die Mutase und mit und ohne Hydroxocobalamin. In den Zellen, die die Mutase überexprimieren und die in Hydroxocobalamin herangezogen wurden, machte Methylmalonyl-CoA 13% des gesamten CoA Pools aus, während in den anderen Zellen kein Methylmalonyl-CoA detektierbar war. Der Hintergrundspiegel der Zählungen ist ungefähr 0.25% der Gesamtzahl der Zählungen der CoAs, was nahe legt, dass jegliches Methylmalonyl-CoA, das in E. coli Stämmen vorhanden ist, die die Mutase nicht überexprimieren, höchstens 0.25% des gesamten CoA Pools ausmacht, oder 2% der Menge an Methylmalonyl-CoA, die in dem Stamm beobachtet wurde, der die Mutase überexprimiert. Die Zusammensetzung des CoA Pools, die für den E. coli panD Stamm beobachtet wurde, ist konsistent mit der, die zuvor für E. coli panD Mutanten beobachtet wurde, die auf Glucose herangezogen wurden.
Daher wurde die Methylmalonyl-CoA Mutase aus S. shermanii als aktives Holoenzym in E. coli überexprimiert und es wurde gezeigt, dass sie (2R)-Methylmalonyl-CoA in vivo produziert. Die Umwandlung von (2R)- zu (2S)-Methylmalonyl-CoA über die Methylmalonyl-CoA Epimerase sollte einen angemessenen Vorrat des korrekten Isomers von Methylmalonyl-CoA bereitstellen, um eine heterologe Produktion von komplexen Polyketiden in E. coli zu unterstützen.
4 zeigt die Ergebnisse der CoA Analyse von E. coli, das die Methylmalonyl-CoA Mutase überexprimiert. Die Levels von ³H werden gezeigt, die in den aus der HPLC gesammelten Fraktionen von zellfreien Extrakten aus E. coli detektiert wurden, die mit β-Alanin gefüttert wurden, enthaltend entweder den pET Kontrollvektor und kultiviert ohne Hydroxocobalamin (durchgehende Linie), pET kultiviert mit Hydroxocobalamin (gestrichelt-gepunkted), pET, die Mutase überexprimierend und ohne Hydroxocobalamin kultiviert (gepunktet), oder pET, die Mutase überexprimierend und mit Hydroxocobalamin kultiviert (gestrichelt).
B. Klonierung und Expression der Methylmalonyl-CoA Epimerase
Die Methylmalonyl-CoA Epimerase aus Propionibacterium shermanii wurde aufgereinigt und verwendet um die N-terminale Proteinsequenz, sowie die interne Peptidsequenz von LysC-erzeugten Peptiden zu erhalten. Das Epimerasegen wurde kloniert unter Verwendung von Hybridisierungssonden, die anhand der Peptidsequenzen erstellt wurden.
Propionibacterium freudenreichii subsS. shermanii wurde erhalten und kultiviert, wie in Teil A beschrieben. Die Aufreinigung der mm-CoA Epimerase aus S. shermanii basierte auf einer Abwandlung der veröffentlichten Prozedur. Die Prozedur verwendete eine 10 l Kultur, die mittels Sonication lysiert wurde, gefolgt von Säulenchromatographie in der Reihenfolge: DE-52, Hydroxyapatit, Phenylsepharose, MonoQ Anionenaustauscher und C-8 RP HPLC.
Alle Schritte wurden bei 4°C ausgeführt, mit Ausnahme der C-8 RP HPLC, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde und alle Puffer enthielten 0.1 mM PMSF falls nicht anderweitig angegeben. Der Epimeraseassay wurde im Wesentlichen wie in der Literatur angegeben durchgeführt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bradfordverfahrens bestimmt. Die Gesamtausbeute der Epimeraseaktivität wurde nicht bestimmt.
Genauer wurde Zellpaste (75 g) in 50 ml Puffer (50 mM Tris-HCL pH 7.5, 0.1 M KCl, 0.2 mM PMSF, 1 mM EDTA) resuspendiert und unter Verwendung einer Macrospitze mit einem Durchmesser von 1.2 cm sonifiziert. Die Zellen wurden zweimal für 30 Sekunden mit Pulsen von 0.5 Sekunden AN und 0.3 Sekunden AUS beschallt, jedes Mal mit einer Leistungseinstellung von 4, gefolgt von fünf Mal für 30 Sekunden, jedes mal bei einer Leistungseinstellung von 6. Ein klarer und bernsteinfarbener Überstand (53.5 ml) wurde nach Zentrifugation für 35 Minuten bei 12.000 Upm erhalten.
Das Roh-Extrakt von oben wurde auf eine Säule (Durchmesser 2.5 cm, Höhe 15 cm) von 73 ml DE-52 Harz, äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M KCl, gegeben. Die Säule wurde bei 1 ml/min mit drei Säulenvolumen des vorstehenden Puffers gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten bis 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M KCl über sieben Säulenvolumen. Sechs ml Fraktionen wurden gesammelt und einem Assay auf Epimeraseaktivität hin unterzogen. Die Epimerase wurde überwiegend im Durchfluss und in einigen frühen Fraktionen gefunden. Der Durchfluss und aktive Fraktionen wurden vereinigt (325 ml) und gegen 4 Liter 50 mM Tris-HCl ph 7.5, 10% Glycerin, gefolgt von 4 Litern 10 mM Natriumphosphat pH 6.5, 10% Glycerin (Endvolumen 250 ml), dialysiert.
Eine 7.5 ml Hydroxyapatit-Biogel-HTR-Gelsäule (Durchmesser 1.5 cm, Höhe 16 cm) wurde mit 10 mM Natriumphosphat pH 6.5, 5% Glycerin äquilibriert. Nach Laden der Enzymlösung (unter Verwendung von wiederholten Injektionen) und Waschen mit drei Säulenvolumen des obigen Puffers, wurde ein Gradient bis 200 mM Natriumphosphat pH 6.5, 5% Glycerin über 20 Säulenvolumen gefahren bei einer Flussrate von 1 ml/min. Die 2 ml Fraktionen wurden einem Assay auf Epimeraseaktivität hin unterzogen und Fraktionen, die Epimeraseaktivität enthielten wurden zu einer Gesamtmenge von 99 ml vereinigt.
Zu der obigen 99 ml Probe wurde festes Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 1.5 M langsam und unter Rühren hinzugegeben bei 4°C über 30 Minuten. Diese Suspension (100 ml) wurde mittels wiederholter Injektion auf eine 6.6 ml Säule (1 cm × Höhe 8.5 cm) aus Phenylsepharose Resin, äquilibriert in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 1.5 M Ammoniumsulfat, geladen. Die Säule wurde bei 1 ml/min mit drei Säulenvolumen dieses Puffers gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten bis 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.5, 10% Glycerin, über 24 Säulenvolumen. Nach Untersuchung der 3 ml Fraktionen auf Epimeraseaktivität hin, wurden die Fraktionen, die Epimeraseaktivität enthielten, vereinigt und gegen 50 mM Tris-HCl pH 7.5 dialysiert.
Eine Mono Q 5/5 vorgepackte Säule wurde mit 25 mM Tris-HCl pH 7.5 bei 0.5 ml/min äquilibriert. Die Probe aus dem vorhergehenden Schritt wurde auf die Säule geladen, die dann mit 5 Säulenvolumen des obigen Puffers gewaschen wurde, gefolgt von einem linearen Gradienten bei 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 M NaCl, 5% Glycerin über 50 Säulenvolumen. Die 1 ml Fraktionen wurden einem Assay auf Epimeraseaktivität unterzogen. Einige Fraktionen, die Epimeraseaktivität enthalten, wurden getrennt gelagert; die Fraktion mit der höchsten Aktivität wurde für den nächsten Aufreinigungsschritt verwendet.
Eine Umkehrphasensäule wurde mit Wasser enthaltend 0.1% Trifluoressigsäure äquilibriert; 120 μl (konzentriert aus 0.5 ml der obigen aktiven Fraktion unter Verwendung eines Amicon MicroKonzentrators) wurden auf die Säule injiziert bei einer Flussrate von 0.2 ml/min und für fünf Minuten mit dem obigen Lösungsmittelsystem gewaschen. Danach wurde ein linearer Gradient über 50 Minuten zu Acetonitril enthaltend 0.1% Trifluoressigsäure gefahren. Die Peaks wurden per Hand gesammelt und der zu der Epimerase korrespondierende Peak (wie durch SDS/PAGE bestimmt) wurde vollständig getrocknet, in Wasser resuspendiert und bei –80°C gelagert.
Für den Lys C vermittelten Verdau der HPLC-aufgereinigten Epimerase, wurde die aus der Umkehrphasen-HPLC gesammelte Epimerasefraktion (11751rp2-B, 200 μl) vollständig getrocknet und in 40 μl Wasser resuspendiert. Zu 30 μl der Probe wurden 5 μl 1 M Tris/HCl, pH 8, 1.5 μl 0.1 M DTT, 2 μl Lys C Protease (0.2 μg) gegeben. Eine Kontrollreaktion enthielt alle obigen Komponenten bis auf die Epimerase. Die Reaktionen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Ein Aliquot der Reaktion (5 μl) wurde auf 60 μl mit Wasser verdünnt und auf die HPLC geladen, unter Verwendung desselben HPLC Programms das für die Aufreinigung der Epimerase verwendet wurde. Die analytische HPLC zeigte, dass der Lys C Verdau nicht vollständig war. Ein weiteres Aliquot von Lys C (0.2 μg) wurde den Reaktionen hinzugegeben und die Inkubation wurde über Nacht bei 37°C fortgesetzt. Nach der Inkubation über Nacht wurde ein Aliquot der Reaktion (5 μl) mit Wasser auf 60 μl verdünnt und der HPLC unterzogen. Die HPLC zeigte, dass der Verdau vollständig war. Der Rest der Reaktion wurde auf die HPLC geladen und individuelle Peaks wurden manuell gesammelt. Die HPLC der Kontrollreaktion zeigte keine signifikanten Peptidfragmente, die aus dem Selbstverdau von Lys c herrührten.
Ein Aliquot der reinen Epimerase sowie ein Peptid, das aus der oben beschriebenen Prozedur gesammelt wurde, wurden einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterzogen. Auf den obigen Aminosäuresequenzen basierend wurden einige degenerierten Primer generiert, wie unten beschrieben, die einzigartige Restriktionsstellen in jedes Ende der letztendlichen PCR Produkte einfügten. Diese Primer wurden in der PCR mit S. shermanii genomischer DNA verwendet, um ein 200 Basenpaarprodukt zu erhalten, dass in einen Bluescript^TM (Stratagene) Vektor kloniert wurde und zum Sequenzieren geschickt wurde.
Eine Cosmi-Bibliothek von S. shermanii wurde hergestellt, im Wesentlichen wie im Stratagene Cosmid Handbuch beschrieben. Der Titer der Cosmi-Bibliothek betrug ungefähr 11 cfu (colony forming units) pro μl, mit einer Gesamtausbeute von 5556 cfu. Eine Plasmidbibliothek von S. shermanii wurde hergestellt durch Verdau von S. shermanii genomischer DNA mit SacI und Ligation der resultierenden Mischung in einen Bluescript^TM Vektor, der ebenfalls mit SacI geschnitten war. Um die durchschnittliche Insert-Größe (2 kb) zu ermitteln, wurden 10 zufällige Klone mit SacI verdaut. Die Ligationsmischung wurde 5 Mal re-transformiert, vereinigt und auf eine große LB (carb) Platte ausplattiert, resultierend in einem Rasen von Kolonien, die zusammen gekratzt wurden und in LB als die Plasmidbibliothek resuspendiert wurden. Der Titer dieser Plasmidbibliothek war ungefähr 64,000 cfu pro μl.
Verschiedne degenerierte Primer, basierend auf den Aminosäuresequenzen, wurden hergestellt und in der PCR mit S. shermanii genomischer DNA verwendet, um ein 180 Basenpaar Produkt zu erhalten, dass in einen Bluescript^TM Vektor kloniert und sequenziert wurde. Verschiedene unterschiedliche Sonden wurden hergestellt. Die erste Sonde wurde unter Verwendung des Random-Priming-Verfahrens hergestellt, um entweder ³²P oder Digoxigenin in das Epimerasefragment einzubauen. Eine Sonde wurde aus dem klonierten Fragment mittels Amplifizierung der Fragmente über PCR unter Verwendung des Digoxigenin-Markierungsverfahrens hergestellt. Das PCR Produkt wurde über ein Gel isoliert, quantifiziert und zur Sondierung der Cosmidbibliothek verwendet. Kolonien, die an die Sonde hybridisierten, wurden von der Ausgangsplatte wiederausgestrichen und fünf Kolonien von den wiederausgestrichenen Platten ausgewählt, die Cosmide isoliert und die inserierten Sequenzen mittels PCR nach dem Epimerasegen gescreent. Einige Cosmide, die mittels PCR positiv für die Epimerase DNA Sequenz getestet wurden, wurden einer DNA Sequenzierung unterzogen, unter Verwendung Epimerase-spezifischer Primer. Das Cosmid mit der Bezeichnung 117-167-A7 enthielt die gesamte Epimerasesequenz.
Die Sequenz des putativen Epimerasegens enthalten in Cosmid 117-167-A7 wurde mit der bereits bekannten N-terminalen Epimerasesequenz aligned. Die mehreren hundert Basenpaare stromabwärts von dieser Sequenz wurden in alle drei angelagert übersetzt und ein Stopcodon wurde in einem der Leserahmen gefunden, das ein Protein mit der erwarteten Größe ergab. Die Gesamtsequenz wurde verwendet, um die Proteindatenbank mittels BLAST Analyse zu durchsuchen und die Sequenz zeigte eine hohe Homologie zu der Sequenz einer putativen Epimerase aus S. coelicolor, die in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert worden war. PCR Primer wurden auf der DNA Sequenz der geklonten S. shermanii Epimerase erstellt und das Gen wurde aus S. shermanii genomischer DNA amplifiziert, mit NdeI und BamHI Stellen am 5'-Ende, eine interne NdeI Stelle in der Nähe des 5'-Endes wurde zerstört und NheI und AvrII Stellen wurden am 3'-Ende eingeführt. Nach der PCR wurde das 447 bp Produkt in einen Bluescriptvektor (143-6-11) kloniert und sequenziert. Außerdem wurden vier weitere Sequenzierungsprimer erstellt, um eine mehrfache Abdeckung des Epimerasegens zur Verfügung zustellen. Die gesamte Epimerasegensequenz, die von der vorliegenden Erfindung in isolierter und rekombinanter Form zur Verfügung gestellt wird, wird unten als SEQ ID NO: 1 zur Verfügung gestellt und die Proteinsequenz der Epimerase wird unten zur Verfügung gestellt als SEQ ID NO: 2. Das Epimerasegen wurde dann in einen pET Expressionsvektor kloniert; das Konstrukt wurde pET-epsherm genannt.
Für die Klonierung des Epimerasegens aus B. subtilis (beschrieben von Haller et al., oben) und S. coelicolor (aus Cosmid 8F4 des S. coelicolor Genom Sequenzierungs Projekts), wurden Primer erstellt, um diese Gene per PCR aus deren respektiven genomischen DNAs zu erhalten und um entweder eine PacI oder NdeI Stelle am 5'-Ende und eine NsiI Stelle am 3'-Ende einzubauen. Die PCR Produkte wurden in einen Bluescript^TM Vektor kloniert und sequenziert. Mutationsfreie Klone wurden für die S. coelicolor Epimerase erhalten, jedoch enthielt die B. subtilis Epimerase zwei Punktmutationen in allen drei getesteten Klonen: C nach T bei Basenpaar 37 und G nach A bei Basenpaar 158. Wenn die PCR für dieses Epimerasegen wiederholt wurde und das Produkt kloniert und sequenziert wurde, waren dieselben Mutationen vorhanden, was nahelegt, dass die Originalsequenz fehlerhaft war. Die klonierten Epimerasen aus B. subtilis und S. coelicolor wurden als NdeI/NsiI Fragmente in einen Zwischenvektor 116-172a, ein Bluescript^TM pET Plasmid enthaltend den T-7 Promotor und Terminatorsequenzen, kloniert. Die klonierten Epimerasen aus B. subtilis und S. coelicolor sind pET-epsub beziehungsweise pET-epcoel. Die Epimerasegene wurden ebenfalls zusammen mit dem T7 Promotor als PacI/NsiI Fragmente ausgeschnitten, wie unten schematisch gezeigt
---PacI---T7 Promotor------Epimerasegen--------NsiI---
und in den PacI/NsiI geschnittenen Vektor 133-gb kloniert, um ein einzelnes Operon zu bilden mit dem Epimerasegen downstream zu den zwei Mutasegenen lokalisiert. Das Epimerasegen aus S. shermanii wurde wie oben kloniert, nur dass es in 116-172a als ein NdeI/AvrII Fragment kloniert wurde, ausgeschnitten zusammen mit dem T7 Promotor als ein PacI/NheI Fragment und in 133-9b zwischen PacI und NheI Stellen kloniert. Die Konstrukte sind pET-mutAB-T7-epsherm, pET-mutAB-T7-epsub und pET-mutAB-T7-epcoel.
Als eine Alternative zu der Mutase von S. shermanii, S. coelicolor und B. subtilis, kann mittels PCR aus E. coli genomischer DNA das einzelne Gen für Sbm (sleeping beauty mutase) kloniert werden. Genomische DNA aus E. coli BL21(DE3)/PanD wurde unter Verwendung eines von Qiagen gekauften Kits präpariert. Das Gen für Sbm (sleeping beauty mutase, eine Methylmalonyl-CoA Mutase) wurde mittels PCR amplifiziert aus E. coli BL21(DE3)/PanD genomischer DNA. Das PCR Fragment wurde über ein Gel isoliert, in PCRscript kloniert und sequenziert, um einen mutationsfreien Klon 143-11-54 zu erhalten. Als ein NdeI/SacI Fragment ausgeschnitten, wurde sbm in pET22b kloniert, von dort als ein NdeI/XhoI Fragment in pET16b, um einen N-terminalen His-Tag einzuführen (143-49-2). Sbm wurde ebenfalls zwischen NdeI und SpeI in 116-95B.43 kloniert, ein pET22b Vektor, der das anschließende Klonieren der Epimerasegene downstream zu sbm erlaubt. Das Kontrukt wurde 143-40-39 genannt.
Zellen des Stamms BL21(DE3), enthaltend pET-epsherm, pET-epcoel, pET-epsub, oder einen Kontroll-pET Vektor, wurden über Nacht bei 37°C in 2 ml LB, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, herangezogen. Die Ausgangskultur (250 μl) wurde verwendet, um 25 ml LB, enthaltend 100 μg/ml Carbenicillin, zu inokulieren. Die Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer OD von ungefähr 0.4 gezogen, dann mit IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM induziert und für weitere 3 Stunden bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 Upm für 10 Minuten gesammelt, die Pellets wurden vor dem Assay bei –80°C gelagert. Die Epimerase aus S. shermanii wurde in E. coli gut exprimiert; SDS Gelanalyse zeigte ein überexprimiertes Protein bei ungefähr 22 kDa. Die S. coelicolor Epimerase wurde ebenfalls gut exprimiert, bei einem Molekulargewicht von ungefähr 19 kDa und die B. subtilis Epimerase wurde exprimiert, jedoch meistens in inclusion bodies (eine schwache Bande ist bei ungefähr 19 kDa vorhanden), was durch eine Verwendung von alternativen Expressionssystemen überwunden werden kann.
Die Epimeraseaktivität wurde in Roh-Extrakten von E. coli gemessen, die entweder pET-epsherm, pET-epcoel, pET-epsub, oder einen Kontroll-pET Vektor enthielten. Der Epimeraseassay koppelt Transcarboxylase, die (S)-Methylmalonyl-CoA in Propionyl-CoA umwandelt, an Malatdehydrogenase, die NADH zu NAD⁺ umwandelt, und produziert eine Absorbtion bei 340 nm. Der Assay wird mit einer racematischen Mischung von (R,S)-Methylmalonyl-CoA gestartet; wenn das (S)-Isomer wie unten beschrieben verbraucht wird, wird eine gleichbleibende Hintergrundrate beobachtet, die ungefähr ein Zehntel der Anfangsrate ist. Wenn dem Assay ein Extrakt zugegeben wird, das eine Epimerase enthält, wird das (R)-Isomer in das (S)-Isomer umgewandelt, was in einer weiteren Abnahme der Absorption resultiert. In Roh-n E. coli Extrakten wird jedoch eine signifikante Hintergrundrate beobachtet, wahrscheinlich aufgrund einer endogenen NADH Oxidase. Daher muss die Epimerase auf einem ausreichend hohen Level exprimiert werden, um zu schließen, dass sie aktiv ist. Der Assay wurde wie folgt durchgeführt.
Das Pellet von ungefähr 20 ml Kultur wurde aufgetaut und in 2 ml 1 × Assaypuffer, enthaltend eine Proteaseinhibitor-Cocktail-Tablette, resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Sonication zerstört (zwei Sonicationszyklen für 30 Sekunden, jeder bei einer Leistungseinstellung von 2 [Puls AN 0.5 sec/Puls AUS 0.5 sec]). Nach Zentrifugation für 10 Minuten bei 13,000 Upm in einer Eppendorf Zentrifuge, wurden die Überstände für den Assay aufbewahrt. Methylmalonyl-CoA Epmieraseaktivität wurde unter Verwendung des modifizierten Verfahrens von Leadlay et al., Biochem. J. 197: 413-419, „Purification and characterization of methylmalonyl CoA epimerase from Propionibacterium shermanii" (1981), einem Assay unterzogen. Die Assays wurden bei 30°C ausgeführt mit einer Plastikküvette mit 1 cm Pfadlänge in einem Endvolumen von 1.5 ml. Die Reaktionsmischungen enthielten 0.2 M Kaliumphosphatpuffer pH 6.9, 0.1 M Ammoniumsulfat, 5 mM Natriumpyruvat, 0.08 mM (2R,2S)-Methylmalonyl-CoA, 0.05 Units teilweise aufgereinigter Transcarboxylase, 0.16 mM NADH und 2.5 Einheiten Malatdehydrogenase. Die Reaktion wurde durch (2R,2S)-Methylmalonyl-CoA gestartet und die Abnahme der Absorption bei 340 nm wurde überwacht, das Verschwinden des 2S-Isomers widerspiegelnd. Wenn die Abnahme der Absortion bei 340 nm den Grundspiegel erreichte (gewöhnlich ungefähr 10% der anfänglichen Transcarboxylaserate), wurde ein Extrakt, enthaltend Epimerase, zugegeben und eine weitere Abnahme in der Absorption wurde beobachtet. Die Chemikalien und Enzyme, die in diesem Epimeraeassay verwendet wurden, wurden über Sigma bezogen, mit Ausnahme der Transcarboxylase, die als Roh-Präparation von Case Western Reserve erhalten wurde.
Die Roh-Extrakte, die sowohl die S. shermanii als auch S. coelicolor Epimerasen enthielten, hatten spezifische Aktivitäten (ungefähr 30 Einheiten/mg), wenigstens zehnmal höher als die der Kontrolle. Jedoch wurde in den Extrakten enthaltend die B. subtilis Epimerase keine Aktivität über dem Hintergrundlevel beobachtet, wahrscheinlich weil diese nicht mit einem ausreichend hohen Level exprimiert wurde, oder, wie oben angemerkt, weil diese als unlösliche inclusion bodies exprimiert wurde. Das pET-mutAB-T7-epsherm Konstrukt wurde ebenfalls in E. coli exprimiert. Das resultierende Roh-Extrakt enthielt Epimeraseaktivität, die signifikant über dem Hintergrundlevel war; daher ist die Epimerase in diesem Konstrukt funktionsfähig. Die Mutase behinderte nicht im Epimeraseassay, weil diese Zellen ohne die Zugabe von Hydroxocobalamin herangezogen wurden, dem Cofaktor für die Mutaseaktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl aktive Mutase als auch aktive Epimerase in einer E. coli Zelle exprimiert werden können. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die Methylmalonyl-CoA Epimerase aus S. shermanii in E. coli kloniert und exprimiert wurde und aktiv war und, dass die putative Epimerase aus S. coelicolor eine Methylmalonyl-CoA Epimerase ist. Diese Gene können in das Chromosom eines E. coli PanD Stamms integriert werden und für die Produktion von Polyketiden verwendet werden, die komplett oder teilweise aus Methylmalonyl-Coa aufgebaut sind.
Beispiel 2
Produktion von Methymalonyl-CoA in Hefe
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Stammes von Saccharomyces cerevisiae, der für die Polyketid-Überproduktion optimiert ist. Insbesondere beschreibt dieses Beispiel die Konstruktion von Hefe-Wirtszellen, die (i) Substrate und post-translationale Modifikationsenzyme produzieren, die nötig sind, um Polyketide zu exprimieren, die von modularen Polyketidsynthasen hergestellt wurden; (ii) die nötigen Ernährungsdefizite haben, um eine positive Selektion von wenigstens drei kompatiblen Plasmiden zu erlauben; und/oder (iii) geeignet sind, um eine radioaktive Markierung von Acyl-CoA Pools und Polyketidsynthase zu erlauben und demonstriert, dass solche Stämme eine modulare PKS exprimieren können und ein komplexes Polyketid in Mengen produzieren können, die für die gewerbliche Entwicklung geeignet sind. Referenzen werden in diesem Beispiel mittels einer Nummer zitiert, die mit der nummerierten Liste der Referenzen unten korrespondiert.
Mit angemessenen Stammmodifikationen ist S. cerevisiae ein idealer Wirt für die Polyketidproduktion. S. cerevisiae ist fähig, sehr hohe Levels an Polyketiden zu produzieren. Das Einbringen des Gens für die iterative PKS, 6-MSAS, zusammen mit dem Gen für Sfp, einer P-pant Transferase aus B. subtilis, führte zur Produktion von beeindruckenden 2 g/l 6-MSA in Schüttelflaschen ohne Optimierung; Kealy, J. T., et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9). Die Genetik der Hefe ist sehr gut bekannt. Gene können einfach in das Chromosom inseriert werden und die gesamte Genomsequenz stellt relevantes Wissen bezüglich von Stoffwechselwegen und neutraler Insertionsstellen bereit. Zusätzlich sind einige starke, kontrollierbare Promotoren verfügbar. In Hefe haben Proteine, im Vergleich mit E. coli, eine geringere Tendenz, inclusion bodies zu bilden. Hefe hat eine relativ kurze Verdopplungszeit im Vergleich mir nativen, polyketid-produzierenden Organismen. S. cerevisiae hat eine Verdopplungszeit von 1 bis 2 Std, verglichen mit 4 bis 24 Std für einen typischen Polyketid-Produzenten, was offensichtliche Vorteile bei der genetischen Entwicklung, Prozessentwicklung und großtechnischen Produktion hat.
Die Tatsache, dass Hefe als Einzelzelle wächst, stellt einen weiteren Vorteil über filamentöse Organismen dar (typische Polyketid-Produzenten). Myceliale Fermentationen sind viskos und verhalten sich häufig wie nicht-newtonische Flüssigkeiten. Diese flüssige Rheologie stellt ein signifikantes Hindernis für den Prozesswissenschaftler dar, sowohl im Hinblick auf einen gleichmäßigen Nährstofftransport an die Zellen, als auch bei der Handhabung der Fermentationsbrühe. Der Einsatz von Hefezellen als Wirt umgeht solche Hindernisse sogar bei hohen Zellkonzentrationen. Wegen der langen Historie von Hefe bei der Einzelzell-Proteinproduktion und der Expression von rekombinanten Proteinen, wurden skalierbare Fermentationsprotokolle für Hefe entwickelt. Hefe kann bis zu sehr hohen Zelldichten (> 100 g/l Biomasse) in fed-batch Fermentationen herangezogen werden, verglichen mit typischen Polyketid-Produzenten (10-20 g/l Biomasse). Daher würde Hefe, im Vergleich mit Organismen mit der gleichen spezifischen Produktivität (g Polyketid/g Biomasse/Tag), eine höhere volumetrische Produktivität (g Polyketid/UTag) zur Verfügung stellen. Schließlich ist S. cerevisiae von der FDA als „Generell als sicher angenommener" (GRAS) Organismus klassifiziert. Die GRAS Klassifizierung wird die Genehmigung von Wirkstoffen erleichtern, die in Hefe produziert wurden, verglichen mit denen, die in anderen Wirtszellen produziert wurden.
S. cerevisiae hat auch Nachteile als Wirt für die Polyketid Biosynthese, die meisten davon sind mit der Tatsache verbunden, dass Hefe sich nicht für die Produktion von Polyketiden entwickelte. Hefe enthält kein Methylmalonyl-CoA, ein nötiger Vorläufer für die Biosynthese von vielen Polyketiden. Hefe enthält keine geeignete P-pant Transferase, die fähig ist, die nötigen post-translationalen Modifikationen der ACP Domänen einer PKS durchzuführen. Die Codons von Hefe sind in Richtung A + T verzerrt, während die meisten Polyketid-Produzenten viele G + C Codons haben; daher kann Hefe eine geringe Menge von einigen tRNAs haben, die für die PKS Genexpression benötigt werden. Die Korrektur dieser Defizite wird in diesem Beispiel beschrieben und die Erfindung stellt weiterhin modifizierte Hefewirtszellen zur Verfügung, die nützlich sind, eine Erfolgsanalyse zu ermöglichen.
Andere fallweise potentielle Probleme mit Hefe schließen die Möglichkeit ein, dass einige Polyketidprodukte giftig sein können, oder zusätzliche Modifikationen für die Reifung (z.B. Glykosylierung, P450 Hydroxylierung) benötigen. Verschiedene Verfahren, die von der Erfindung zur Verfügung gestellt werden, können zur Umgehung diese Probleme herangezogen werden, falls diese auftreten sollten. Für die Toxizität kann die Produktion kontrolliert werden, in der stationären Wachstumsphase stattzufinden (wie mit der 6-MSA Produktion); Resistenzfaktoren des Wildtyp-Wirts können in den Hefewirt eingebracht werden (z.B. Methylierung von Ribosomen für manche Antibiotika); ein für das Polyketid ungiftiger Vorläufer kann produziert und ex vivo umgewandelt werden (Herstellung von z.B. 6-dEB in einem Stamm und Umwandlung in Erythromycin) und weitere. Zusätzlich können Modifikationen am Polyketid erreicht werden durch Klonierung und Expression von modifizierenden Enzymen im Wirtsstamm, durch chemische oder enzymatische Transformation, und/oder biosynthetischer Transformation in einem zweiten Stamm (konvertiere z.B. 6-dEB Analoge zu Erythromycinanalogen durch Fütterung von 6-dEB an einen Streptomyces oder Saccharopolyspora Stamm, der zur Glykosylierung und P450 Hydroxylierung fähig ist).
Die meisten modularen PKSs benötigen entweder Malonyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA oder beides als Quelle für 2-Kohlenstoffeinheiten zur Polyketid-Biosynthese. Die Malonyl-CoA Pools in Hefe sind völlig ausreichend für die Polyketidproduktion, wie durch die Produktion von großen Mengen an 6-MSA in Hefe belegt wird. Jedoch produziert S. cerevisiae kein (2S)-Methylmalonyl-CoA und besitzt keine Biosynthesewege für die Methylmalonyl-CoA Biosynthese. Daher muss ein heterologer Biosyntheseweg in S. cerevisiae eingebracht werden, um die Biosynthese von Polyketiden zu unterstützen, die (2S)-Methylmalonyl-CoA als einen Vorläufer verwenden.
Es gibt drei Routen oder Biosynthesewege für die Synthese von Methylmalonyl-CoA, die in Hefe konstruiert werden können, wie in 5 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass diese Wege Methylmalonyl-CoA in E. coli produzieren und verwendet werden können, Methylmalonyl-CoA in Hefe zu produzieren. Dieses Beispiel beschreibt die Identifikation eines Systems für die Methylmalonyl-CoA Produktion in Hefe und ein Verfahren zum Einbringen desselben in das Hefechromosom.
Der Vitamin B12 abhängige Methylmalonyl-CoA Mutaseweg produziert (2R)-Methylmalonyl-CoA aus Succinyl-CoA. Das (2R)-Methylmalonyl-CoA wird zum (2S)-Diastereomer über die Methylmalonyl-CoA Epimerase umgewandelt, wie oben gezeigt. Diese Enzyme sind in einer Vielzahl von Organismen vorhanden, jedoch nicht in Hefe; BLAST-Recherchen der verfügbaren genomischen Datenbanken brachten wenigstens 10 Methylmalonyl-CoA Mutasen und 10 Methylmalonyl-CoA Epimerasen in verschiednen Organismen hervor. Die Propionibacterium shermanii Methylmalonyl-CoA Mutase wurde in E. coli als ein Apo-Enzym exprimiert, welches die Zugabe von Vitamin B12 für die in vitro Aktivität benötigt (McKie, N. et al., Adenosylcobalamin-dependent methylmalonyl-CoA mutase from Propionibacterium shermanii. Active holoenzyme produced from Escherichia coli. Biochem J, 1990. 269(2): S. 293-8); Durch die Verwendung eines Mediums, das die Aufnahme des Vitamin B12 Vorläufers Hydroxocobalamin erlaubt (Amaratunga, M. et al., A synthetic module fort he metH gene permits facile mutagenesis of the cobalamin-binding region of Escherichia coli methionine synthase: initial characterization of seven mutant proteins. Biochemistry, 1996. 35(7): S. 2453-6) und in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren kann das aktive S. shermanii Methylmalonyl-CoA Mutase Holoenzym in E. coli exprimiert werden und (2R)-Methylmalonyl-CoA in solchen Zellen produziert werden. Zusätzlich kann die einzelne Untereinheit Methylmalonyl-CoA Mutase aus E. coli eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Gene bereit, die für die Methylmalonyl-CoA Epimerase aus B. subtilis, S. shermanii und S. coelicolor kodieren und Verfahren zu deren Verwendung bei der Umwandlung von (2R)-Methylmalonyl-CoA zum gebrauchten (2S)-Diastereomer. Ein bevorzugtes Verfahren ist es, die Methylmalonyl-CoA Mutase aus E. coli in Hefe zu exprimieren, da sie ein einzelner ORF ist und die nötigen Codons reichlich in Hefe vorhanden sind. Alternativ kann das S. shermanii Enzym verwendet werden.
PCC katalysiert die biotin-abhängige Carboxylierung von Propionyl-CoA um (2S)-Methylmalonyl-CoA zu produzieren, wie oben gezeigt; der Weg beinhaltet auch ein Biotin Carrier Protein/Biotincarboxylase. In S. coeclicolor, haben Rodriguez und Gramajo Gene für PCC (pccB) und ein Biotin Carrier Protein/Biotincarboxylase (accA1) identifiziert (Rodriguez, E. und H. Gramajo, Genetic and biochemical characterization of the alpha and beta components of a propionyl-CoA carboxylase complex of Streptomyces coelicolor A3(2). Microbiology, 1999. 145(Pt 11): S. 3109-19). Einbringen von S. coelicolor pcc8 und pccA1 in E. coli, zusammen mit der Propionyl-CoA Ligase (als Vorrat an Propionyl-CoA), resultiert in der Produktion von Methylmalonyl-CoA in diesem Organismus. Eine Suche der Genomdatenbank brachte B. subtilis als eine zusätzliche Quelle der in den PCC Weg involvierten Enzyme hervor.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die S. coelicolor pcc8 und pccA1 in Hefe exprimiert werden, da diese in E. coli exprimiert werden und funktionsfähig sind. Sollte sich herausstellen, dass der Codongebrauch bei der Expression der S. coelicolor Gene in Hefe suboptimal ist, können Homologe aus B. subtilis eingesetzt werden. Sollten die Levels an Propionyl-CoA subotpimal für PCC sein, kann eine Propionyl-CoA Ligase im Hefewirt co-exprimiert werden. Intrazelluläres Propionyl-CoA kann in E. coli stark erhöht werden, durch die Expression der Salmonella Propionyl-CoA Ligase, PrpE und durch Supplementierung des Wachstumsmediums mit Propionat, wie unten beschrieben. Ein weiteres Verfahren zur Produktion von (2S)-Methylmalonyl-CoA, das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, verwendet die matB und matC gene aus Rhizobium (An, J.H. und Y.S. Kim, A gene cluster encoding malonyl-CoA decarboxylase (MatA), malonyl-CoA synthetase (MatB) and a putative dicarboxylate carrier (MatC) in Rhizobium trifolii-cloning, sequenzing, and expression of the enzymes in Escherichia coli. Eur J Biochem, 1998. 257(2): S. 395-402) oder aus S. coelicolor (siehe Schema oben). Die matABC Gene kodieren für einen Biosyntheseweg, der Malonat zu Acetyl-CoA umwandelt, durch die Bildung von Malonyl-CoA über MatB und folgender Decarboxylierung durch MatA. MatB, die Malonyl-CoA Ligase akzeptiert auch Methylmalonat als Substrat (An, J.H. und Y.S. Kim, A gene cluster encoding malonyl-CoA decarboxylase (MatA), malonyl-CoA synthetase (MatB) and a putative dicarboxylate carrier (MatC) in Rhizobium trifolii-cloning, sequenzing, and expression of the enzymes in Escherichia coli. Eur J Biochem, 1998. 257(2): S. 395-402); und katalysiert die Bildung von Methylmalonyl-CoA. Die Substrate Malonat und Methylmalonat betreten die Zelle durch einen Diazidtransporter, dem Produkt des matC Gens. Khosla et al. haben gezeigt, dass wenn E. coli, enthaltend das Rhizobium matBC, mit (2R,2S)-Methylmalonyl gefüttert wird, (2R,2S)-Methylmalonyl-CoA produziert wird. Weiterhin wird, wenn einem S. coelicolor Stamm, die Gene für die Synthese des Polyketidaglycons 6-Deoxyeythronolid B (6-dEB) exprimierend und Rhizobium matBC enthaltend, Methylmalonat gefüttert wird, eine 3-fache Steigerung in der Produktion von 6-dEB beobachtet. In Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung können die matB und matC Gene aus Rhizobium in Hefe exprimiert werden, da diese in E. coli und S. coelicolor exprimiert werden und die Proteine funktionsfähig sind, oder alternativ die matBC Gene aus S. coelicolor.
Aktive PKSs benötigen post-translationale Phosphopantetheinylierung an jedem ACP von jedem Modul, aber Hefe beinhaltet keine P-pant Transferase mit der benötigten Spezifität (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9). Vorhergehende Arbeiten (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9) haben gezeigt, dass Einbringen des B. subtilis P-pant Transferasegens, sfp, in Hefe in einem exprimierten Sfp resultiert, das fähig ist, eine iterative PKS, 6-MSAS, zu modifizieren. Gokhale et al. demonstrierten, dass die ACP Domänen in der DEBS PKS Substrate für Sfp sind, daher ist Sfp ein allgemeines Modifizierungsenzym für PKSs (Gokhale, R.s., et al., Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketid synthases. Science, 1999. 284(5413): S. 482-5). In bevorzugten Hefezellen der Erfindung ist das sfp Gen in eine neutrale Stelle des Hefechromosoms inseriert.
Bei der Entwicklung eines Systems zur Produktion von Polyketiden und bei der Optimierung der Fermentationsprozeduren, ist die Fähigkeit zur Messung intrazellulärer Konzentrationen an Substraten (d.h. Acyl-CoAs) und an PKS von Vorteil. In den meisten Zellen sind CoA Ester nicht in ausreichenden Mengen vorhanden, um eine direkte Messung über HPLC unter Verwendung von ultravioletter Detektion oder andere einfacher Detektionsverfahren zu erlauben. In E. coli ist das Verfahren der Wahl, um CoA Pools zu quantifizieren, die Fütterung von [³H] β-Alanin an eine Mutante, die defizient in der Aspartatdecarboxylase ist (PanD), die kein endogenes β-Alanin produzieren kann (Jackowski, S. und C.O. Rock, Regulation of coenmzyme A biosynthesis. J Bacteriol, 1981. 148(3): S. 926-32). Der PanD Stamm bringt ungefähr eine zehnfache höhere Radioaktivität in CoA Pools ein, als wildtyp E. coli. Da β-Alanin ein direkter Vorläufer von CoA ist, betritt die radioaktive Markierung den CoA Pool ohne Verdünnung und Acyl-CoA kann mittels HPLC aufgetrennt und über eine Radioaktivitätsmessung quantifiziert werden. Da es keine Verdünnung des Radioisotops gibt, spiegelt die gemessene Radioaktivität die exakte intrazelluläre Konzentration des Acyl-CoAs wider.
Die BLAST-Recherchen ergaben kein E. coli panD Homolog im Hefegenom; Hefe kann jedoch ein β-Alanin- oder Pantothenatauxotroph sein. Tatsächlich benötigt Hefe für die CoA Biosynthese entweder exogenes Pantothenat, das die Zelle übder den Fen2p Transporter betritt, oder exogenes β-Alanin, das über die allgemeine Aminosäure Permease (Gap1p) eintritt (Stolz, J. und N. Sauer, The fenpropimorph resistance gene FEN2 from Saccharomyces cerevisiae encodes a plasma membrane H+-pantothenate symporter. J Biol Chem, 1999. 274(26): S. 18747-52). [³H] β-Alanin wird in die CoA Pools von Hefe eingebaut (siehe unten), jedoch ist es gegenwärtig unbekannt, ob eine Isotopenverdünnung auftritt, wegen endogener β-Alanin Produktion durch irgendeinen unbekannten Weg. Um eine Quantifizierung zu ermöglichen kann daher die spezifische Aktivität von CoA Pools in Hefe, die mit exogenem [³H] β-Alanin markiert sind, bestimmt werden. Zellen, die Polyketide produzieren, exprimieren im Allgemeinen niedrige Levels von PKSs mit hohem molekularem Gewicht, die kaum mittels SDS-PAGE detektierbar sind, unter Verwendung von Proteinfärbungen. Die Fähigkeit CoA mit [³H] β-Alanin zu markieren kann ebenfalls verwendet werden, um eine PKS zu quantifizieren, die in den Wirtszellen exprimiert wird, da die Phosphopantetheineinheit des CoA, enthaltend β-Alanin, in jedem Modul einer PKS auf die ACP Domäne transferiert wird. Daher kann, die spezifische Aktivität von markierten intrazellulären CoAs kennend, eine PKS einfach über Radioaktivität nach SDA-PAGE quantifiziert werden.
Der G + C Gehalt der meisten PKS Gene liegt im Bereich von 60 bis 70%, während der von Hefegenen 40% ist. Daher sind manche tRNAs, die gebraucht werden, um PKS Gene zu translatieren, in Hefe selten (aber nicht abwesend). Jedoch wurden viele Gene mit einem hohen G + C Gehalt in Hefe exprimiert. Als Beispiel wird das große (1560 bp) DHFR-TS Gen aus Leishmania major (63% G + C) gut in Hefe exprimiert trotz der Tatsache, dass es zahlreiche Codons enthält, die in Hefe selber verwendet werden (Grumont, R., W. Sirawaraporn und D.V. Santi, Heterologous expression of the bifunctional thymidylate synthase-dihydrofolate reductase from Leishmania major. Biochemistry, 1988. 27(10): S. 3776-84). Weiterhin, wie untern angemerkt, wird PKS 6-MSAS (G + C = 58%) ebenfalls gut in Hefe exprimiert (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9). Daher kann die allgemeine Anwendbarkeit eines Hefeexpressionssystems ohne anfängliche Besorgnis für potentielle „Codon Usage"-Probleme gezeigt werden. Nichtsdestotrotz stellt die vorliegende Erfindung verschiedene Verfahren zur Verfügung, um ein „Codon Usage"-Problem zu lösen, dass mit bestimmten Polyketiden beobachtet wird, wenn eine bestimmte PKS nicht gut in Hefe exprimiert wird.
Als erstes können die Codons am 5' Ende des Gens geändert werden, um diese widerzuspiegeln, die häufiger in Hefegenomen gefunden werden. Batard et al. (Batard, Y. et al., Increasing expression of P450 and P450-reductase proteins from monocots in heterologous systems [In Process Citation]. Arch Biochem Biophys, 2000. 379(1): S. 161-9) wandte erfolgreich ein ähnliches Verfahren an, um Weizengene für ein P450 und eine P450 Reduktase mit hohem G + C Gehalt (56%) und einer starken, für Hefe unvorteilhaften Neigung der Codon Usage in Hefe zu exprimieren. Ein anderes Verfahren ist es, Hefe tRNA Gene mit Anticodons einzuführen, die modifiziert wurden, um Codons zu repräsentieren, die in PKS Sequenzen üblich sind. Ein ähnliches Verfahren wurde erfolgreich in E. coli verwendet, um die Expression von hoch G + C Genen zu steigern (Carstens, C.-S., et al., New BL21-CodonPlus^TM Cells Correct Codon Bias in GC-Rich Genomes. Startegies Newsletter from Stratagene CorS., 2000. 13(1): S. 31-33), einschließlich PKS Gene aus Actinomyceten. Ein drittes Verfahren ist es, das Gen mit für die Expression in Hefe optimierten Codons chemisch zu synthetisieren. Die Kosten für eine Kontraktionssynthese eines 30,000 bp Gens (z.B. ~6-Modul PKS), inklusive Sequenzverifikation, ist ungefähr $3 pro Base, oder ungefähr $100,000. Für ein wertvolles Produkt (z.B. Epothilon) sind die Kosten nicht untragbar.
In einer illustrativen Ausführungsform der Erfindung wird ein Hefestamm, der defizient für Ura, Trp, His und Leu Biosynthese ist, als ein Wirt eingesetzt, um die Selektion von Plasmiden zu erlauben, die diese Marker enthalten. Dieser Wirt wird modifiziert in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung, durch Einbringen von Genen, die das benötigte Methylmalonyl-CoA Substrat und P-pant Transferase für die post-translatorischen Modifikationen der PKSs produzieren. Diese werden vorzugsweise in das Hefechromosom integriert, da sie für die Produktion von jedem Polyketid nötig sind. Um die funktionelle Expression der Substratgene zu validieren, können die Methylmalonyl-CoA Pools gemessen werden. Für die Validierung der P-pant Transferaseaktivität kann 6-MSAS coexprimiert werden und [³H] Phosphopantetheinylierung des Enzyms, sowie die 6-MSA Produktion gemessen werden. Sollte irgendeine davon defizient sein, kann die Genekopienzahl erhöht werden.
Für die PKS Genexpression können replizierende Vektoren, basierend auf dem 2 Micron Replikon, verwendet werden, da Plasmide für die Analyse gerettet werden müssen, sollte ein Problem auftauchen. Ein typischer modularer PKS Gencluster (z.B. 3 ORFs, jeweils ~10 kB, wie in Erythromycin) kann auf drei oder mehr Vektoren eingeführt werden; solche Plasmide (enthaltend Ura, Trp und Leu Marker) sind verfügbar und ähnlich zu denen, die in den Studien zu 6-MSAS Expression in Hefe verwendet wurden. Ein PKS bestehend aus drei großen Proteinen kann funtionell aus separat exprimierten Genen rekonstituiert werden (Xue, Q., et al., A multiplasmid approach to preparing large libraries of polyketides. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(21): S. 11740-5). Sobald ein System für eine bestimmte PKS von Interesse etabliert ist, kann das PKS Gen in stabile, neutrale Stellen des Chromosoms integriert werden.
Bevorzugte Promotoren schließen den glukose-unterdrückbaren Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2) Promotor und den Galaktose-induzierbaren (GAL1) Promotor ein. Ersterer wurde verwendet, um große Mengen des Polyketids 6-MSA in Hefe zu produzieren und letzterer ist hochgradig kontrollierbar durch Galaktose im Medium.
Eine Modell-modulare PKS, die verwendet werden kann, um den Hefewirt zu optimieren, ist die gut untersuchte DEBS1. In diesem modularen System wurde der erste ORF der modularen PKS für die Erythromycin Biosynthese (DEBS1) an eine Thioesterasedomäne (TE) fusioniert und produziert ein leicht detektierbares Triketid Lakton, wenn in S. coelicolor exprimiert, und kürzlicher in E. coli (Keo, C.M., et al., Engineered biosynthesis of a triketide lactone from an incomplete modular polyketide synthase. J. Am. Chem. Soc., 1994. 116(25): S. 11612-11613; Cortes J., et al., Repositioning of a domain in a modular polyketide synthase to promote specific chain cleavage. Science, 1995. 268(5216): S. 1478-9). Das Gen enthält 2 PKS Module, ist ungefähr 12 kB groß und produziert ein Protein, das 300 kDa groß ist. Dieses Modell erlaubt es, den konstruierten Wirt hinsichtlich der Acyl-CoA Levels und post-translationalen Modifikationen, zu optimieren, die PKS hinsichtlich des G +C Gehalts zu optimieren und die benötigten analytischen Verfahren zu entwickeln. Nach der Optimierung für DEBS1 kann jede gewünschte modulare PKS exprimiert werden.
Es wurde zuvor gezeigt, dass das Pilzgen, kodierend für die 6-Methylsalicylsäuresynthase (6-MSAS) aus Penicillium patulum in S. cerevisiae und E. coli exprimiert wurde und dass das Polyketid 6-Methylsalicylsäure (6-MSA) produziert wurde (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9). In sowohl bakteriellen, als auch Hefewirten benötigte die Polyketidproduktion die Coexpression von 6-MSAS und einer heterologen Phosphopantetheinyltransferase (Sfp), die nötig war, um die exprimierte Apo-PKS in das Holoenzym umzuwandeln. Die Produktion von 6-MSA in E. coli war sowohl Temperatur- als auch Gglycerin-abhängig und die Speigel der Produktion (~60 mg/l) waren niedriger als jene des nativen Wirts S. patulum. In Hefe wurden die 6-MSAS und sfp Gene von getrennten replizierenden Plasmiden coexprimiert und die Genexpression wurde durch den glukoseunterdrückbaren Alkohohldehydrogenase 2 (ADH2) Promotor getrieben. In einer nicht optimierten Schüttelflaschenfermentation produzierte das Hefesystem 6-MSA mit Leveln von 2,000 mg/l. Dieses war der erste Bericht über die Expression eines intakten PKS Gens in Hefe oder E. coli und demonstrierte das extrem hohe Levels an Polyketiden in Hefe produziert werden können.
Zuvor wurde ein Zweivektorsystem für die heterologe Expression der drei Gene, umfassend den DEBS Polyketid Gencluster, entwickelt (Ziermann, R. Betlach, M., A Two-Vector System fort he Production of Recombinant Polyketides in Streptomyces. J. Ind. Microbiol. Biotech., 2000, 24: 46-50). Individuelle DEBS Gene und paarweise Kombinationen von zweien solcher Gene wurden jeweils downstream zu dem Actinorhodin (actI) Promotor in zwei kompatible Streptomyces Vektoren kloniert: den autonom replizierenden Vektor pKAO127 'kan' und den integrierenden Vektor pSET152. Wenn die resultierenden Plasmide entweder simultan oder nacheinander in den heterologen Wirt, Streptomyces lividans K4-114, transformiert wurden, wurde das Polyketidprodukt 6-dEb produziert. Diese Arbeit zeigte, dass die DEBS Gene getrennt und auf separaten Plasmiden exprimiert werden konnten und dass eine effiziente trans-Komplementierung von modularen Polyketidensynthase-Untereinheitproteinen im heterologen Wirt stattfand.
Ein Dreiplasmidsystem für die heterologe Expression von DEBS wurde entwickelt, um die kombinatorische Biosynthese von Polyketiden, die durch Typ I modulare PKSs hergestellt werden, zu ermöglichen (Xue, Q., et al., A multiplasmid approach to preparing large libraries of polyketides. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(21): S. 11740-5). Die eryA PKS Gene, kodierend für die drei DEBS Untereinheiten, wurden individuell in drei kompatible Strepfomyces Vektoren kloniert, die gemeinsam selektierbare Antibiotikaresistenzmarker trugen. Ein Stamm von Streptomyces lividans, der mit allen drei Plasmiden transformiert wurde, produzierte 6-dEB mit einem Level, das ähnlich zu dem eines Stamms war, der mit einem einzelnen Plasmid transformiert wurde, dass alle drei Gene enthielt. Die Nützlichkeit dieses Systems für die kombinatorische Biosynthese wurde mittels Produktion einer großen Bibliothek mit mehr als 60 modifizierten Polyketidmakrolaktonen demonstriert, unter Verwendung von Versionen jedes Plasmid, die erstellt wurden, definierte Mutationen zu enthalten. Kombinationen dieser Vektorsätze wurden in S. lividans eingeführt, was in Stämmen resultierte, die einen große Bereich von 6-dEB Analogen produzierten. Dieses Verfahren kann ausgedehnt werden auf jegliche modulare PKS und hat das Potential tausende von neuen natürlichen Produkten zu produzieren, einschließlich welchen, die aus weiteren Modifikationen der PKS Produkte mittels Schneideenzymen abgeleitet sind. Weiterhin stellt die Fähigkeit die modularen PKSs (wie DEBS) von drei separaten Plasmiden zu exprimieren, Vorteile in der Kommerzialisierung der Polyketidproduktion bereit, durch die heterologe Expression von modularen PKSs in Hefe und E. coli, in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die translatorisch gekoppelten Gene mutA und mutB, kodierend für die β- und α-Untereinheiten von Methylmalonyl-CoA Mutase aus Propionibacterium shermanii, mittels PCR amplifiziert und in einen E. coli Expressionsvektor inseriert, enthalten einen T7-Promotor. Das natürlicherweise vorkommende Startodon GTG für mutB wurde zu ATG geändert, um Expression zu erlauben (Amaratunga, M., et al., A synthetic module fort he metH gene permits facile mutagenesis of the cobalamin-binding region of Escherichia coli methionine synthase: initial characterization of seven mutant proteins. Biochemistry, 1996. 35(7): S. 2453-63). Die heterologe Expression des Mutasegens in Medium enthaltend [³H] β-Alanin und den Adenosylcobalamin (Coenzym B₁₂) Vorläufer Hydroxocobalamin, erzielte die aktive Methylmalonyl-CoA Mutase. HPLC Analyse von E. coli BL21(DE3)/panD Extrakten, enthaltend die Mutasegene, wiesen auf eine Produktion von Methylmalonyl-CoA hin, die 13% des intrazellulären CoA Pools ausmachte (gezeigt in 6). Diese Arbeit demonstriert, das ein Biosyntheseweg für ein wichtiges PKS Substrat in einen heterologen Wirt eingebracht werden kann und dass die intrazelluläre Konzentration von Acyl-CoAs gemessen werden kann. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, kann ebenfalls das Methylmalonyl-CoA Mutasegen (sbm) aus E. coli, das eine Codon Usage näher an der Hefe hat und für ein einzelnes Polypeptid kodiert, eingesetzt werden (Haller, T. et al., Discovering new enzymes and metabolic pathways: conversion of succinate to propionate by Escherichia coli. Biochemistry, 2000. 39(16): S. 4622-9).
6 zeigt die Acyl-CoA Analyse von E. coli, die Methylmalonyl-CoA Mutase überexprimierend. Der Spiegel von ³H, das in den aus der HPLC gesammelten Fraktionen von zellfreien Extrakten aus [³H] β-Alanin gefütterten E. coli detektiert wurde, die entweder den pET Kontrollvektor (durchgezogene Linie) oder pET, die Mutase überexprimierend (gestrichelte Linie) enthielten, wird gezeigt.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Methylmalonyl-CoA Epimerase aus Propionibacterium shermanii aufgereinigt und die N-terminate und interne Proteinsequenz wurde erhalten. Degenerierte Primer, basierend auf den Aminosäuresequenzen, wurden erstellt und verwendet, um ein 180 bp PCR Produkt aus S. shermanii genomischer DNA zu isolieren. Die Methylmalonyl-CoA Epimerasegene aus B. subtilis (Haller, T. et al., Discovering new enzymes and metabolic pathways: conversion of succinate to propionate by Escherichia coli. Biochemistry, 2000. 39(16): S. 4622-9) und S. coelicolor können ebenfalls in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Propionyl-CoA wird in E. coli SJ16 Zellen, die in der Gegenwart von [³H] β-Alanin, mit oder ohne die Zugabe von Propionat im Wachstumsmedium gezogen werden, nicht detektiert. Wenn E. coli SJ16 Zellen mit einem pACYC-abgeleiteten Plasmid transformiert wurden, das das Salmonella typhimurium Propionyl-CoA Ligasegen (prpE) unter der Kontrolle des lac Promotors enthielt, wurde eine geringe Menge an Propionyl-CoA in Zellextrakten beobachtet (~0.2% des gesamten CoA Pools). Wenn 5 mM Natriumpropionat im Kulturmedium enthalten waren, wurde ungefähr 14-fach mehr Propionyl-CoA produziert (~3% des gesamten CoA Pools).
7 zeigt die Acyl-CoA Analyse in S. cerevisiae. Das Level von ³H, das in den aus der HPLC gesammelten Fraktionen von zellfreien Extrakten aus [³H] β-Alanin gefütterten S. cerevisiae detektiert wurde, nach einem Wachstum von 24 Stunden (durchgezogene Linie), 48 Stunden (gestrichelte Linie) und 66 Stunden (gepunktete Spur), ist gezeigt. Der Hefe Stamm InvSc1 (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9), gezogen in synthetischem YNB Medium ohne Pantothenat und β-Alanin, wurde für die Acyl-CoA Analyse verwendet. β-Alanin-ausgehungerte Hefekulturen wurden mit [³H] β-Alanin gefüttert und die Kulturen für 24, 48 und 66 Stunden bei 30°C gezogen. Die Zellen wurden mit Glasperlen zerstört in der Gegenwart von 10% kalter TCA und die Acyl-CoAs wurden mittels HPLC aufgetrennt und durch Szintillationszählung gezählt. Die Hefe CoA Pools waren mit [³H] markiert, aber das Ausmaß der Isotopenverdünnung verbleibt unklar. Die spezifische Aktivität an gesamtem CoA in diesen Stämmen kann gemessen werden, um das Ausmaß an Isotopenverdünnung sicherzustellen.
Für PKS Gene und anfängliche Studien der Stoffwechselweggene kann der analoge Satz von Bluescript Klonierungsvektoren und Hefe 2 Micron replizierenden Shuttle Vektoren, die bei der 6-MSA Produktion verwendet wurden eingesetzt werden (Keale, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9). Bei diesen Vektoren wird die Hefeexpression durch den Alkoholdehydrogenase 2 (ADH2) Promotor angetrieben, der stark von Glukose unterdrückt wird und der hoch aktiv wird bei Glukosemangel, der auftritt, wenn die Kultur eine hohe Dichte erreicht. Beide Vektorsätze haben eine „gemeinsame Klonierungskassette", die von 5' nach 3' einen Polylinker (L1), den ADH2 (oder anderen) Promotor, eine NdeI Restriktionsstelle, einen Polylinker (L2) einen ADH2 (oder anderen) Terminator und einen Polylinker (L3) enthält. Aufgrund von überzähligen Restriktionsstellen in den Hefe Shuttle Vektoren, werden interessierende Gene zunächst in intermediäre Bluescript Klonierungsvektoren über die NdeI Stelle eingeführt, um ein ATG Startcodon zu erzeugen und eine downstream gelegene Restriktionsstelle im L2 Polylinker, die den Bluescript und Hefe Shuttle Vektoren gemeinsam ist (gezeigt in 8). Die Promotor-Gen Kassette wird dann als ein L1-L2 Fragment ausgeschnitten und in den Hefe Expressionsvektor tranferiert, der den transkriptionalen Terminator enthält.
Wirtsstämme für Modellsysteme schließen gewöhnlich verfügbare Hefestämme mit Ernährungsdefizienzen (Ura, Trp, His, Leu) ein, die wenigstens drei replizierende Vektoren enthalten können (siehe unten). Wenn es nötig ist, mehr als drei PKS Gene gleichzeitig zu exprimieren, können mehrere Promotor-PKS Gen-Terminator Kassetten in den selben Vektor kloniert werden, oder ein vierter replizierender Vektor mit einem unterschiedlichen Ernährungsmarker (d.h. Leu) oder einem Antibiotikamarker (d.h. G418) verwendet werden. Auch ein analoger Satz von Bluescript Klonierungs- und Hefe Expressions-/Shuttlevektoren kann generiert werden, die einen galaktose-induzierbaren Promotor enthalten. Das Galaktosepromotor-Gal4 Aktivatorsystem ist strenger reguliert, als der ADH2 Promotor und kann vorteilhaft oder nötig sein für die Expression von Proteinen, die für Hefe giftig sind (Mylin, L.M., et al., Regulated GAL4 expression cassette providing controllable and high-level output from high-copy galakctose promoters in yeast. Methods Enzymol, 1990. 185: S. 296-308).
Gene, die in die Produktion von Substraten involviert sind (z.B. Methylmalonyl-CoA und/oder Propionyl-CoA) und das sfp Gen, können vorzugsweise stabil in das Hefechromosom integriert werden in einer angemessenen Kopienzahl, um die adäquaten Levels der gewünschten Acyl-CoAs und post-translatorischen PKS Modifikationen zu produzieren. Gene können zunächst in den intermediären Bluescript Vektor wie beschrieben eingeführt werden. Dann kann das Fragment, enthaltend die Promotor-Gen-Terminator Kassette als ein L1-L3 Fragment in einen Hefe „delta integration" Vektor transferiert werden (Lee, F.W. und N.A. Da Silva, Improved efficiency and stability of multiple cloned gene insertions at the delta sequences of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 1997. 48(3): S. 339-45; Lee, F.W. und N.A. Da Silva, Sequential delta-integration fort he regulated insertion of cloned genes in Saccharomyces cerevisiae. Biotech Prog, 1997. 13(4): S. 368-73), beide erlauben die chromosomale Integration der Kassetten in einen oder mehr der ca. 425 Delta Sequenzen, die über das Hefechromosom verteilt sind (siehe 9). Diese Vektoren haben Klonierungsstellen, die kompatibel mit denen im den L1-L3 Linkern sind, um einen direkten Transfer der Promotor-Gen-Terminator Kassetten als L1-L3 Fragment zu erlauben. Sie enthalten ebenfalls den auschneidbaren Ura3 Selektionsmarker, der von zwei bakteriellen hisG Repeats („URA Blaster") flankiert wird, was die Insertion von mehreren identischen oder unterschiedlichen Genen in das Hefechromosom mittels repetitiven Integrationen erlaubt. Nach Selektion auf Genintegration hin auf Medium ohne Uracil, wird das Ura3 Genfragment entfernt, mittels Selektion auf Markerverlust über excisionale Rekombination mittels positiver Selektion mit 5-Fluorootischer Säure (FOA), die das Ura3 Gen für Hefe giftig macht. Dieses erlaubt die Einführung von stabilen Wegen, die für Acyl-CoA Vorläufer benötigt werden und Sfp in Hefe, während die Konservierung des Ura Markers seine anschließende Verwendung in Plasmiden erlaubt, die andere Gene enthalten.
Die Einzelgenmutase Sbm (Sleeping beauty mutase) aus E. coli (Haller, T. et al., Discovering new enzymes and metabolic pathways: conversion of succinate to propionate by Escherichia coli. Biochemistry, 2000. 39(16): S. 4622-9) kann wie folgt kloniert werden. Auf der DNA Sequenz basierend erzeugte Primer wurden verwendet um das sbm Gen aus E. coli genomischer DNA als ein NdeI-L2 Fragment per PCR zu amplifizieren. Die allgemeine Strategie zur Klonierung von Genen in Hefe Expressionsvektoren folgt der von Kealy et al. (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9) (siehe 9). Zuerst können die Gene als NdeI-L2 Fragmente in den intermediären Bluescript Klonierungsvektor kloniert werden. Die Promotor-Gen-Terminator Kassette kann dann als ein L1-L3 Fragment ausgeschnitten werden, in den Hefe integrierenden Vektor transferiert werden, mit L1/L3 geschnitten werden und in das Hefechromosom wie oben beschrieben eingeführt werden. Als eine Alternative zu Sbm kann die Zweigenmutase aus S. shermanii verwendet werden; die translatorisch gekoppelten Gene sind jeweils per PCR als NdeI-L2 Fragmente amplifiziert worden und können wie oben beschrieben in Hefe integriert werden.
Die für matABC kodierenden Gene wurden in einen Bluescript Vektor (An, J.H. und Y.S. Kim, A gene cluster encoding malonyl-CoA decarboxylase (MatA), malonyl-CoA synthetase (MatB) and a putative dicarboxylate carrier (MatC) in Rhizobium trifolii-cloning, sequenzing, and expression of the enzymes in Escherichia coli. Eur J Biochem, 1998. 257(2): S. 395-402) kloniert. Die matB (Methylmalonyl-CoA Ligase) und matC (Dicarboxylsäuretransporter) Gene können per PCR isoliert werden, jedes als ein NdeI-L2 Fragment und in das Hefechromosom wie oben beschrieben und unten im Schema gezeigt, integriert werden. Mit matBC transformierte Hefe wird mit Methylmalonylsäure behandelt und der Zellextrakt kann auf Methylmalonyl-CoA hin analysiert werden.
Die pcc8 und accA1 Gene, die in den Propionyl-CoA Carboxylierungsweg in S. coelicolior involviert sind, können mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert werden. Wie in 9 gezeigt, können die Gene in den intermediären Bluescript Vektor zwischen NdeI und L2 kloniert werden und dann in den Hefe intergrierenden Vektor über L1/L3 transferiert werden. Die S. coelicolor Gene, die sich als wirkungsvoll in E. coli zeigten, können exprimiert werden; Sollte die Codon Usage suboptimal sein, können B. subtilis Orthologe eingesetzt werden (oben diskutiert).
9 zeigt ein allgemeines Verfahren zum Klonieren von Genen in Hefe Expressionsvektoren.
In einer Ausführungsform coexprimieren die rekombinanten Hefe Wirtszellen die B. subtilis P-pant Transferase, Sfp, mit einer PKS, um die Apo-PKS in ihre Holo-Fom umzuwandeln. Das sfp Gen ist auf Bluescript^TM (Stratagene) Klonierungs- und Hefe Shuttle-/Expressionsvektoren erhältlich und ist funktionell in Hefe (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9), sodass einfach stabile Stämme, die dieses Gen exprimieren konstruiert werden können. Eine bis mehrere Kopien (wie als optimal bestimmt) des sfp Gens können in die Delta Sequenzen im Hefechromosom, wie oben beschrieben, eingeführt werden. Die Aktivität des integrierten sfp Gens kann mittels Coexpression von 6-MSAS auf einem replizierenden Vektor, durch Messung der Sfp-abhängigen 6-MSA Produktion getestet werden (Kealy, J.T. et al., Production of a polyketide natural product in nonpolyketide-producing prokaryotic and eukaryotic hosts. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): S. 505-9) und durch Quantifizierung des Einbaus von [³H] β-Alanin in die ACP Domäne der PKS (siehe unten). Dies erlaubt die Bestimmung der optimalen Anzahl von Kopien des sfp Gens, die für eine maximale Polyketidproduktion benötigt werden.
Das Gen für die modulare PKS, DEBS1 + TE, ist als ein NdeI-EcoRI Fragment erhältlich, welches einfach in einen Hefe Shuttle-/Expressionsvektor, wie in 9 gezeigt, eingeführt werden kann. Hefestämme, die DEBS1 + TE exprimieren, werden auf die [³H]-Phosphopantetheinylierung der PKS und die Produktion von Triketidlakton mittels Flüssigchromatographie/Massenspektometrie hin analysiert
³H Markierung von intrazellulärem Acyl-CoA wird wie folgt ausgeführt. Zellen werden mit [³H] β-Alanin (verfügbar mit 50 Ci/mmol) in definiertem Medium ohne Pantothenat behandelt, was es dem radioaktiven Vorläufer von Pantothenat ermöglicht, in den CoA Pool zu gelangen. Die Zellen werden dann zerstört, CoA Ester mittels HPLC getrennt und die Radioaktivität mittels flüssigem Szintillationszählen wie oben beschrieben quantifiziert.
Saccharomyces cerevisiae Wirtszellen werden angezogen und Extrakte wie folgt hergestellt. Definiertes Minimal-YNB-Medien (1 ml) ohne Pantothenat, aber enthaltend 1 μM β-Alanin, werden mit einer einzelnen Kolonie von S. cerevisiae (InvSc1 oder Fen2b Deletionsstamm) von einer YPD Platte angeimpft. Die Kultur wird bis zur stationären Phase herangezogen und 10 μl der stationären Kultur werden verwendet, um das obige Medium ohne β-Alanin und Pantothenat zu inokulieren. Die Kultur wird für 4 Stunden inkubiert und 10 μl der „ausgehungerten" Kultur werden verwendet, um Medien (1 ml) anzuimpfen, dass 10 μCi [³H] β-Alanin (50 Ci/mmol; 0.2 μM Endkonzentration β-Alanin) zu inokulieren. Nach Wachstum der Kulturen für angemessene Zeiten, werden die Zellen aus einer 1 ml Kultur mittels Zentrifugation gesammelt und mit Wasser gewaschen. Die Zellen werden in 200 μl 10% kalter Trichloressigsäure (TCA) resuspendiert, die Standard unmarkierte Acyl-CoAs als Chromotographiemarker enthält (Malonyl-, Methylmalonyl-, Succinyl-, Acetyl-, Propionyl-CoA und CoA). Die Zellen werden durch Vortexen mit Glaskugeln zerstört und der Überstand mittels HPLC analysiert.
Die HPLC wird unter Verwendung einer 150 × 4.6 mm 5 μ ODS-3 INERTSIL HPLC Säule, bezogen von Metachem Technology, durchgeführt. HPLC Puffer A ist 10 mM Natriumphosphat monobasisch, 75 mM Natriumacetat, pH 4.6 und Puffer B ist 70% Puffer A, 30% Methanol. Die HPLC Säule wird mit 10% Puffer B bei einer Flussrate von 1 ml/min äquilibriert. Nach der Injektion wird ein linearer Gradient bis 40% Puffer B über 35 Minuten angelegt, gefolgt von einer linearen Gradienten bis 90% Puffer B über 20 Minuten. Der Gradient erlaubt die Basislinien Trennung der Standard Acyl-CoAs. Das Eluat wird bei 260 nm überwacht und Fraktionen werden gesammelt und in einem Szintillationszähler gezählt.
Die Bestimmung der spezifischen Aktivität des gesamten CoA Pools wird wie folgt durchgeführt. S. cerevisiae Kulturen werden mit 100 μCi an [³H] β-Alanin wie oben beschrieben markiert. Die Hefezellen werden zerstört und der Extrakt wird mit 100 μM Hydroxylamin, pH 8.5 behandelt, um alle Acyl-CoAs zu CoA umzuwandeln. Das markierte CoA wird mittels HPLC isoliert, wie oben beschrieben und zu Acetyl-CoA mit der E. coli Acetyl-CoA Synthase (Sigma) umgewandelt, unter Verwendung von [¹⁴C]-Acetat als Substrat. Das [³H, ¹⁴C]-Acetyl-CoA wird mittels HPLC aufgetrennt und die dualen Markierungen mittels Szintillationszählung quantifiziert. Die mmol CoA wird durch ¹⁴C bestimmt und die spezifische Aktivität von CoA wird aus den ³H dpm pro mmol CoA bestimmt. Die Isotopenverdünnung, die die endogene Produktion von β-Alanin widerspiegelt, wird über die spezifische Aktivität der [³H] CoA/spezifischer Aktivität [³H] β-Alanin, die im Test verwendet wurde, berechnet.
Die Analyse der PKS Expressionslevel wird wie folgt durchgeführt. Jede ACP Domäne jeden Moduls einer aktiven PKS wird post-translational modifiziert mit Phosphopantethein abgeleitet von CoA. Unter Verwendung von Hefezellen, behandelt mit [³H] β-Alanin (oben beschrieben), kann die PKS mit hoch spezifisch aktiven Tritium markiert werden. Das Protein wird mittels SDS-PAGE aufgetrennt, eluiert und die Radioaktivität mittels flüssiger Szintillationszählung bestimmt.
Beispiel 3
Umwandlung von Erythronoliden zu Erythromycinen
Eine Probe eine Polyketids (~50 bis 100 mg) wird in 0.6 ml Ethanol aufgelöst und auf 3 ml mit sterilem Wasser verdünnt. Diese Lösung wird verwendet, um eine drei Tage alte Kultur von Saccharopolyspora erythraea WHM34 (eine eryA Mutante), die auf einer 100 mm R2YE Agarplatte bei 30°C herangezogen wurde, zu überschichten. Nach Trocknung wird die Platte bei 30°C für vier Tage inkubiert. Der Agar wird zerhackt und dann dreimal mit 100 ml Portionen von 1% Triethylamin in Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte werden kombiniert und evaporiert. Das Roh-Produkt wird mittels präparativer HPLC (C-18 reverse Phase, Wasser-Acetonitrilgradient enthaltend 1% Essigsäure) gereinigt. Fraktionen werden mittels Massenspektrometrie analysiert und jene enthaltend eine reine Verbindung werden gepoolt, neutralisiert mit Triethylamin und zu einem Sirup evaporiert. Der Sirup wird in Wasser gelöst und drei Mal mit gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte werden kombiniert, einmal mit gesättigtem, wässrigen NaHCO₃ gewaschen, über Na₂SO₄, getrocknet, gefiltert und evaporiert, um ~0.15 mg des Produkts zu ergeben. Das Produkt ist eine glykosylierte und hydroxylierte Verbindung, korrespondierend zu Erytromycin A, B, C und D aber sich davon unterscheidend, wie die zur Verfügung gestellte Verbindung sich von 6-dEB unterschied.
Beispiel 4
Messung der antibakteriellen Aktivität
Die antibakterielle Aktivität wird unter Verwendung von entweder Scheibendiffusionsassays mit Bacillus cereus als Testorganismus, oder durch Messung der minimalen inhibitorischen Konzentrationen (MIC) in flüssiger Kultur gegen sensitive und resistente Stämme von Staphylococcus pneumoniae bestimmt.
Beispiel 5
Auswertung der antiparasitären Aktivität
Verbindungen können eingehends in vitro gescreent werden unter Verwendung von Kulturen von S. falciparum FCR-3 und K1 Stämmen, danach in vivo unter Verwendung von Mäusen, die mit S. berghei infiziert sind. Die Toxizität für Säugerzellen kann in FM3A oder KB Zellen bestimmt werden. Verbindungen können ebenfalls auf ihre Aktivität gegen S. berghei gescreent werden. Verbindungen werden ebenfalls in Tierstudien und klinischen Versuchen getestet, um die antiparasitäre Aktivität breit zu testen (antimalarisch, Trypanosomiasis und Leishmaniasis).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinante E. coli-Wirtszelle zur wirksamen Herstellung von 2S-Methylmalonyl-CoA, umfassend einen oder mehrere Expressionsvektoren, wobei die Expressionsvektoren in Kombination umfassen: a) Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene mutA und mutB; und b) ein Methylmalonyl-CoA-Epimerase-Gen.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene entweder aus Propionibacterium sheramnii oder Streptomyces cinnamonensis stammen.
Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Epimerasegen aus Propionibacterium sheramnii mit der Nukleotidsequenz abgeleitet ist:
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend wenigstens ein modulares Polyketid-Synthase (PKS)-Gen.
Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei das Polyketid durch eine durch das PKS-Gen in der Wirtszelle hergestellte modulare Polyketid-Synthase (PKS) hergestellt wird, und das PKS-Gen in einem Vektor enthalten ist, der sich extrachromosomal repliziert oder in chromosomaler DNA der Wirtszelle integriert ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in einem Medium, das Hydroxocobalamin enthält.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welche zwei Expressionsvektoren umfasst, wobei einer von diesen in chromosomaler DNA der Zelle integriert ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welche zwei Expressionsvektoren umfasst, wobei einer von diesen ein Plasmid ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene die Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene mutA und mutB aus Propionibacterium shermanii sind.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene die Methylmalonyl-CoA-Mutase-Gene mutA und mutB aus Streptomyces cinnamonensis sind.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei ein oder mehrere der Gene unter der Kontrolle eines Promotors von einem E. coli-Gen ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 4 bis 11, wobei die PKS eine 6-Desoxyerythronolid-B-Synthase ist.
Rekombinate E. coli-Wirtszelle, umfassend ein Propionyl-CoA-Carboxylase (pcc) Expressionssystem, das die pccB- und accA1-Gene von S. coelicolor umfasst, wobei das pcc-Expressionssystem ein Enzym herstellt, das in der Lage ist, 2S-Methylmalonyl-CoA zu synthetisieren und ferner wenigstens ein Expressionssystem für eine modulare Polyketid-Synthase (pks) umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 13, ferner umfassend ein Phosphopantetheinyl-Transferase-Expressionssystem.
Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Phosphopantetheinyl-Transferase das sfp-Gen von Bacillus subtilis ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Wirtszelle ferner ein Expressionssystem für Biotin-Transferase umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei das Expressionssystem für Biotin-Transferase das birA-Gen von E. coli ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die PKS Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das Polyketid 6-Desoxyerythronolid-B (6-dEB) ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polyketids, umfassend die Kultivierung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 4 bis 19 unter Bedingungen, welche die Expression des PKS-Gens ermöglichen, um eine funktionelle PKS herzustellen, wobei das 2S-Methylmalonyl-CoA hergestellt wird und die funktionelle PKS ein Polyketid synthetisiert, das das 2S-Methylmalonyl-CoA einbaut.