CN112410274B

CN112410274B - 一种生产子囊霉素的基因工程菌及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN112410274B
Application number: CN201910784365.0A
Authority: CN
Inventors: 陈少欣; 余志拓; 杨松柏; 张正玉; 赵苗苗
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2039-08-23
Also published as: CN112410274A

Abstract

本发明提供了一种生产子囊霉素的基因工程菌，其为天然生产子囊霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中过表达accA2、accB和accE基因的工程菌。本发明还提供了该基因工程菌的制备方法和用途。利用本发明所述基因工程菌，可有效提高子囊霉素的产量；利用本发明所述基因工程菌生产子囊霉素，成本较低，适于工业化生产。

Description

一种生产子囊霉素的基因工程菌及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生产子囊霉素的基因工程菌及其制备方法和用途。

背景技术

子囊霉素(ascomycin,FK520)产自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicusvar.ascomyceticus ATCC 14891)，其化学式为C₄₃H₆₇NO₁₂，分子量为789.99，属于大环内酯类化合物，具有良好的免疫抑制活性，其衍生物吡美莫斯作为治疗特异性皮炎的一线药物。目前子囊霉素主要通过微生物发酵法生产，但是发酵水平较低，限制了子囊霉素的临床应用和市场前景。在天然生产子囊霉素的吸水链霉菌中，子囊霉素主要是聚酮合酶催化各类前体组成的，主要包括丙二酰-CoA、乙基丙二酰-CoA、甲基丙二酰-CoA、哌啶甲酸、二羟基环己烷羧酸等众多前体。其中，丙二酰-CoA是由2分子的乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶的作用下缩合而成。目前没有报道在子囊霉素产生菌株中针对乙酰-CoA羧化酶进行定向改造以促进子囊霉素的合成。而乙基丙二酰-CoA则是由巴豆酰-CoA还原酶催化合成，目前已有专利和文献报道使用外源巴豆酰-CoA还原酶整合到子囊霉素产生菌株中，提高子囊霉素的产量。但是已报道的子囊霉素发酵水平都很低，不能满足工业化生产的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中微生物发酵法生产的子囊霉素产量较低的缺陷，提供了一种生产子囊霉素的基因工程菌及其制备方法和应用。利用本发明所述基因工程菌，可有效提高子囊霉素的产量；利用本发明所述基因工程菌生产子囊霉素，成本较低，适于工业化生产。

现有技术中提高子囊霉素产量的手段有很多种，对前体进行改进只是其中的一种辅助方式，并且这些针对前体的改造方式有很多种选择，本发明人在经过大量的实验后，意外发现可以从催化其中1个前体丙二酰-CoA的酶入手进行研究，并且从众多的乙酰-CoA羧化酶编码基因中选出特定的乙酰-CoA羧化酶编码基因accA2、accB和accE(最早在天蓝色链霉菌中被发现，accA2、accB和accE基因组合在一起共同组成一个完整的乙酰-CoA羧化酶)，将这些基因在子囊霉素产生菌株中进行过表达时，能够显著提高子囊霉素的产量。

为了解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种生产子囊霉素的基因工程菌，其为天然生产子囊霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中过表达accA2、accB和accE基因的工程菌。

较佳地，所述基因工程菌为在所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌的基因组中整合了accA2、accB和accE基因的工程菌，所述整合的位点优选为attB位点，更优选ΦC31attB位点。

较佳地，所述基因工程菌为包含含有accA2、accB和accE基因的重组表达载体的工程菌；所述重组表达载体的骨架可以为质粒pSET-152。

较佳地，所述accB位于accE上游，所述accA2位于所述accB上游、或位于所述accE下游、或位于所述accB和所述accE之间。

较佳地，所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌为吸水链霉菌S.hygroscopicusvar.ascomyceticus ATCC 14891。

较佳地，所述accA2、accB和accE基因编码的氨基酸序列的NCBI登录号分别为NP_629074.1、NP_629669.1和NP_629670.1；更佳地，所述accA2、accB和accE基因的核苷酸序列的GeneID分别为1100362、1100975和1100976。

较佳地，所述基因工程菌是在天然生产子囊霉素的吸水链霉菌中还过表达fkbS基因(编码巴豆酰-CoA还原酶的基因，巴豆酰-CoA还原酶能够催化巴豆酰-CoA合成乙基丙二酰-CoA，后者是形成子囊霉素结构的关键前体之一)的工程菌；所述fkbS基因编码的氨基酸序列优选如序列表中SEQ ID NO:4所示；所述fkbS基因的核苷酸序列优选如序列表中SEQID NO:3所示；更佳地，所述基因工程菌在所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌的基因组中整合了fkbS基因。

为了解决上述技术问题，本发明的第二方面提供了一种制备如本发明第一方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括下列步骤：

1)构建过表达accA2、accB和accE基因的重组表达载体；

2)将构建的重组表达载体转化到中间宿主菌；

3)将带有重组表达载体的所述中间宿主菌与天然生产子囊霉素的吸水链霉菌进行接合培养；

较佳地，所述重组表达载体的骨架为质粒pSET-152。

较佳地，所述的中间宿主菌为大肠杆菌，优选大肠杆菌ET12567。

较佳地，所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌为吸水链霉菌ATCC14891。

较佳地，所述的接合培养为在MS培养基培养，培养温度为28℃。

较佳地，所述重组表达载体还包括fkbS基因。

为了解决上述技术问题，本发明的第三方面提供了一种制备子囊霉素的方法，包括将如本发明第一方面所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得子囊霉素。

较佳地，所述发酵的发酵培养基包括以下组分：甘油6％、酵母提取物2％、黄豆饼粉2％、磷酸二氢钾0.02％、微量元素；所述百分比为各组分占所述发酵培养基的质量体积百分比(克/毫升)；

更佳地：所述微量元素包括以下组分：FeSO₄·7H₂O 0.001％、ZnSO₄·7H₂O0.001％、CuSO₄·5H₂O 0.00001％，所述百分比为各组分占所述发酵培养基的质量体积百分比(克/毫升)；和/或，所述发酵培养基的pH值为6.5±2。

较佳地，所述发酵的温度为25～30℃，优选28℃。

较佳地，所述发酵的培养时间为6～10天，优选8天。

较佳地，所述发酵的培养转速为180～250rpm，优选200rpm。

较佳地，所述制备子囊霉素的方法还包括先将所述基因工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，然后将所得培养物转接至发酵培养基；

更佳地，

所述种子培养基的培养温度为25～30℃，优选28℃；和/或，所述种子培养的时间为1～2天；和/或，所述种子培养的转速为180～250rpm，优选200rpm；和/或，所述种子培养基的pH值为7.0±2；和/或，所述转接的接种量(体积比)为5～20％，优选10％。

为了解决上述技术问题，本发明的第四方面提供了如本发明第一方面所述的基因工程菌在制备子囊霉素中的用途。

本发明中，过表达一般是指将目的基因的序列与骨架质粒构建成质粒载体，通过接合转移或者转化等手段，获得该基因产物大量积累的生物体。基因过表达的作用主要与基因本身编码蛋白的功能有关。一般来讲，过表达会导致该蛋白的含量增高，如果在细菌中过表达，有利于批量生产。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明通过在天然生产子囊霉素的吸水链霉菌中过表达乙酰-CoA羧化酶(ACCase)编码基因accA2、accB和accE，增加了子囊霉素合成的必须前体丙二酰-CoA的供给，从而提高子囊霉素的产量。在本发明某一较佳实施例中，利用吸水链霉菌ATCC 14891构建的一株子囊霉素高产菌株中，子囊霉素的产量高达2320.1mg/L，较原始菌株ATCC 14891提高了约185.1％。在本发明另一较佳实施例中，同时过表达基因accA2，accB和accE和基因fkbS时构建的一株子囊霉素高产菌株中，子囊霉素的产量高达2511.4mg/L，较原始菌株ATCC 14891提高了约208.6％。利用本发明所述基因工程菌生产子囊霉素，成本较低，适于工业化生产。

附图说明

图1为实施例1中的FK520液相检测图谱。

图2为pSET-A2BE质粒图谱。

图3为pSET-fkbS-A2BE质粒图谱。

图4为pSET-acc质粒图谱。

图5为pSET-fkbL质粒图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但这仅仅是一些例子，而非对本发明的限定，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中，本发明还包括未在这里示例的全部的许多改变或修饰。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明所用的菌株、质粒、试剂和仪器

本发明涉及放线菌S.hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC 14891采购自美国模式培养物集存库(ATCC)。用于构建过表达质粒的pSET-152购自TaKaRa公司。用于做为PCR模板的PLCB1-A2BE质粒来自[J].Metabolic Engineering,2019:153-167。用于接合转移的Escherichia coli ET12567购自TaKaRa公司。

本发明中使用的DNA胶回收纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，所有限制性内切酶和DNA聚合酶都购自Takara公司，同源重组试剂盒购自Vazyme公司，乙腈购自Amethyst Chemicals公司，其他常规试剂均为国产分析纯或进口分装。

本发明中使用的恒温发酵摇床购自上海知楚仪器有限公司，1200型高效液相色谱仪购自Agilent Technologies公司。

本发明所用的培养基

1.MS培养基：

甘露醇20g/L，黄豆饼粉20g/L，琼脂20g/L；121℃灭菌30分钟。

2.种子培养基：

玉米浆8g/L，葡萄糖10g/L，棉籽饼粉3g/L，磷酸二氢钾1g/L,pH7.0；121℃灭菌30分钟。

3.发酵培养基：

甘油60g/L、酵母提取物20g/L、黄豆饼粉20g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、微量元素(FeSO₄·7H₂O,0.01g/L ZnSO₄·7H₂O,0.01g/L CuSO₄·5H₂O,0.0001g/L)；pH 6.5；121℃灭菌30分钟。

实施例1

将产子囊霉素的原始菌株S.hygroscopicus ATCC 14891接种于装有20ml上述种子培养基的250ml摇瓶中，28℃，200rpm，生长2天。再将种子液以10％的接种量(体积比)转接至装有25ml上述发酵培养基的250ml摇瓶中进行发酵培养，28℃，200rpm，发酵周期为8天。取300μl所得发酵液，用丙酮稀释5倍，超声处理20min后，12000rpm离心3min，取上清用0.22μm滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC的条件：色谱柱为Hypersil BDS C18,5um,4.6mm*150mm；流动相为水：乙腈＝35：65(v/v)；柱温为55℃；检测波长为210nm；流速为1.0ml/min。通过HPLC液相方法(结果如图1所示)测得发酵液中子囊霉素的产量为813.8mg/L(子囊霉素的计算方法是通过本领域常规的定量方法-内标法进行测定，具体可以参照AMB Express,2019,9(1):25)。

实施例2过表达质粒pSET-A2BE的构建

利用引物A2BE-F/A2BE-R从质粒PLC1-A2BE中扩增出目的片段accA2BE(包含编码乙酰-CoA羧化酶的基因accA2(GeneID:1100362，对应的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_629074.1)、accB(GeneID:1100975，对应的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_629669.1)和accE(GeneID:1100976，对应的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_629670.1))，PCR条件如下：使用质粒PLC1-A2BE作为模板，加入20μmol/L的上下游引物A2BE-F/A2BE-R，使用PrimeSTARGXL DNA Polymerase按以下循环条件进行：98℃·5min；(68℃·4min)*30次；68℃·10min。利用胶回收试剂盒回收目的片段。然后用同源重组的方式(利用同源重组试剂盒)将目的片段accA2BE插入到质粒pSET-152的NdeI/AscI位点，从而构建组合过表达质粒pSET-A2BE(见图2)。

所用引物序列如下：

A2BE-F：

5’-AACCACTCCACAGGAGGACCCATATGGTGCGCAAGGTGCTCATCG-3’(SEQ ID NO:1)

A2BE-R：

5’-TGGAAAGACGACAAAACTTTGGCGCGCCTCAGCGCCAGCTGTGCG-3’(SEQ ID NO:2)

实施例3工程菌FK-OA2BE的构建

将实施例2中所得质粒pSET-A2BE转化至ET12567感受态细胞后，通过常规的接合转移的方式将其导入ATCC 14891的ΦC31 attB位点中，在添加了萘啶酮酸和安普霉素的MS培养基、温度为28℃的条件下进行培养，得到接合子。将所得接合子接种于添加了安普霉素的MS平板上，于28℃传代培养，得到基因accA2、accB和accE过表达菌株FK-OA2BE。将FK-OA2BE参照实施例1中的培养条件进行发酵培养，经HPLC液相检测FK-OA2BE中子囊霉素产量为2320.1mg/L，较原始菌株ATCC 14891提高185.1％。

实施例4组合过表达质粒pSET-fkbS-A2BE的构建

利用引物fkbS-A2BE-F’/fkbS-A2BE-R’从质粒PLC1-A2BE中扩增出目的片段accA2BE，利用引物fkbS-F’/fkbS-R’从S.hygroscopicus ATCC 14891的基因组中扩增得到巴豆酰-CoA还原酶编码的fkbS基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。再以fkbS和accA2BE为扩增模板，加入引物fkbS-A2BE-F’/fkbS-R’，通过overlap PCR获得fkbS和accA2BE的拼接片段。PCR条件参照实施例2。然后用同源重组(利用同源重组试剂盒)的方式将fkbS-accA2BE片段插入到质粒pSET-152的NdeI/EcoRV位点，从而构建组合过表达质粒pSET-fkbS-A2BE(见图3)。

fkbS-F’：

5’-AACCACTCCACAGGAGGACCCATATGATGCGTGACATTCTTCAGGCGT-3’(SEQ ID NO:5)

fkbS-R’：5’-TCACCGCACCCCCTCGG-3’(SEQ ID NO:6)

fkbS-A2BE-F’：

5’-CCGAGGGGGTGCGGTGAGTGCGCAAGGTGCTCATCG-3’(SEQ ID NO:7)

fkbS-A2BE-R’：

5’-TATGACATGATTACGAATTCGATATCTCAGCGCCAGCTGTGCG-3’(SEQ ID NO:8)

实施例5工程菌FK-OASN的构建

将实施例4中所得的pSET-fkbS-A2BE转化ET12567感受态细胞后，通过接合转移的方式将其导入ATCC 14891的ΦC31 attB位点中，在添加了萘啶酮酸和安普霉素的MS培养基、温度为28℃的条件下进行培养，得到接合子。将所得接合子接种于添加了安普霉素的MS平板上，于28℃传代培养，得到工程菌株FK-OASN。在实施例1相同的培养条件下进行发酵并进行检测，结果显示在组合过表达菌株FK-OASN中，FK520产量达到2511.4mg/L，较原始菌株ATCC 14891提高208.6％。

由实施例4和5的结果可知，同时过表达基因accA2、accB、accE以及基因fkbS时存在协同效应。

对比例1工程菌株FK-Oacc的构建

利用引物acc-F/acc-R从吸水链霉菌ATCC 14891的基因组中扩增出编码乙酰-CoA羧化酶的基因acc(序列如序列表中SEQ ID NO:9所示)。PCR条件为：使用吸水链霉菌ATCC14891基因组作为模板，加入20μmol/L的上下游引物acc-F/acc-R，使用PrimeSTAR GXL DNAPolymerase按以下循环条件进行：98℃·5min；(68℃·2min)*30次；68℃·10min。利用胶回收试剂盒回收目的片段。然后用同源重组的方式将目的片段acc插入到质粒pSET-152的NdeI/AscI位点，从而构建过表达质粒pSET-acc(见图4)。

所用引物序列如下：

acc-F：

5’-aaccactccacaggaggacccatatgATGACCGGAACGAACTCACCC-3’(SEQ ID NO:10)

acc-R：

5’-tggaaagacgacaaaactttggcgcgccTCAACGGGGTAGCCCGATG-3’(SEQ ID NO:11)

将过表达质粒pSET-acc转化至ET12567感受态细胞后，通过接合转移的方式将其导入ATCC 14891的ΦC31 attB位点，在添加了萘啶酮酸和安普霉素的MS培养基、温度为28℃的条件下进行培养，得到接合子。将所得接合子接种于添加了安普霉素的MS平板上，于28℃传代培养，得到工程菌株FK-Oacc。在实施例1相同的培养条件下进行发酵并进行检测，结果显示在组合过表达菌株FK-Oacc中，FK520产量达到853.1mg/L，较原始菌株ATCC14891没有明显的提高。同时也可以看出，在过表达菌株内源性表达的基因时，其效果并不一定会优于过表达同类型的外源性基因。

对比例2工程菌株FK-OfkbL的构建

在子囊霉素的生物合成过程中，fkbL(NCBI Accession No:AAF86391.1)编码的环化脱氨酶FkbL，能够催化赖氨酸形成哌啶甲酸，同样是形成子囊霉素合成的关键前体，它参与构成子囊霉素大环结构中特殊的五元哌啶环结构。利用引物fkbL-F/fkbL-R从吸水链霉菌ATCC 14891的基因组中扩增出编码环化脱氨酶的基因fkbL。PCR条件为：使用吸水链霉菌ATCC 14891基因组作为模板，加入20μmol/L的上下游引物fkbL-F/fkbL-R，使用PrimeSTARGXL DNA Polymerase按以下PCR条件进行：98℃·5min；(68℃·1min)*30次；68℃·10min。利用胶回收试剂盒回收目的片段。然后用同源重组的方式将目的片段fkbL插入到质粒pSET-152的NdeI/AscI位点，从而构建过表达质粒pSET-fkbL(见图5)。

所用引物序列如下：

fkbL-F：

5’-aaccactccacaggaggacccatatgATGCAGACCAGGGTCCTGCG-3’(SEQ ID NO:12)

fkbL-R：

5’-tggaaagacgacaaaactttggcgcgccTCACCATGGCAGCGAGTACG-3’(SEQ ID NO:13)

将过表达质粒pSET-fkbL转化ET12567感受态细胞后，通过接合转移的方式将其导入ATCC 14891的ΦC31 attB位点，在添加了萘啶酮酸和安普霉素的MS培养基、温度为28℃的条件下进行培养，得到接合子。将所得接合子接种于添加了安普霉素的MS平板上，于28℃传代培养，得到工程菌株FK-OfkbL。在实施例1相同的培养条件下进行发酵，结果显示在组合过表达菌株FK-OfkbL中，FK520产量达到783.9mg/L，低于原始菌株ATCC 14891的产量。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求数所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院

<120> 一种生产子囊霉素的基因工程菌及其制备方法和用途

<130> P19012986C

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A2BE-F

<400> 1

aaccactcca caggaggacc catatggtgc gcaaggtgct catcg 45

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A2BE-R

<400> 2

tggaaagacg acaaaacttt ggcgcgcctc agcgccagct gtgcg 45

<210> 3

<211> 1359

<212> DNA

<213> Streptomyces hygroscopicus

<400> 3

atgcgtgaca ttcttcaggc gttggagtcc ggcgacgcag gagagggtga tttccggaac 60

ttaaagattc ctgagaatta ccggggagcc gtggtactcg ctgacgagat acacatgttc 120

gaaggtctgc ggacccatga gaagcacccc gataaatcgc tgcacgtgcg cgatgtgccg 180

actcccgagc cggcccccgg cgaggtgctc gtcgccgtgc tcgccagcgc gatcaactac 240

aacaccgtat ggagcgcgct cttcgagccg atccccacgt ttcacttcct cgctcggtac 300

gggcggaccg gcgccgcggc caagcggcac gacctgccct atcacgtggt cgggtccgat 360

ctggccggtg tcgtcctgcg caccggcgac ggcgtggtgg actggaagcc cggcgaccgc 420

gtcgtcgcgc actgtctcag cgtcgacctg cacacgcccc acggtcacga cgacgcgatg 480

ctcgaccccg agcagcggat atggggcttc gagacgaact tcggcggcct cgccgagatc 540

gccctggtca aggcgaacca gttgatgccg aagcccgcgc acctgacctg ggaggaggcg 600

gccggctccg ggctggtgaa ctcgaccgcc taccggcagc tggtgtcccg gaacggcgcc 660

cggatgaagc agggcgacgt cgtcctgatc tggggagccg ggggcgggct cggttcgtac 720

gccacccagc tcgtcctcaa cggcggtggc atcccggtct gcgtcgtctc ggacgagcgc 780

aaggccgacc tggtccgcgc ccagggcgcg gagctggtca tcaaccgggc cgcggagggg 840

taccgcttct ggaccgacga cgaccggcag gatcccagcg agtggaagcg cttcggcaag 900

cggatccggg agctgaccgg cggtgacgat cccgacatcg tgttcgagca cccggggcgc 960

gcgacgttcg gcgcgagtgt ctacgtgaca cgtcggggtg gcacgatcgt cacctgcgcg 1020

tcaacctcgg gatacgagca cgcctttgac aatcggtacc tgtggatgtc cgtgaagcgg 1080

atcatcggta cccacttcgc gaactatcgt gaggcgtggg aggcgaaccg cctgatctgc 1140

aaggggatgg tgcacccgac gctgtcggtg acctacccgc tcgacgacgt cgggtcggcg 1200

gtgcgcgatg tgcatcgcaa tgtgcacaac ggcaaagtcg gcgtcctctg tctggcgccg 1260

gaggagggat ggggcgtgac cgacccggag atgcgggaga agcacttggc cgagatcacc 1320

cggttccggg ctccccaggt cgcggccgag ggggtgcgg 1359

<210> 4

<211> 453

<212> PRT

<213> Streptomyces hygroscopicus

<400> 4

Met Arg Asp Ile Leu Gln Ala Leu Glu Ser Gly Asp Ala Gly Glu Gly

1 5 10 15

Asp Phe Arg Asn Leu Lys Ile Pro Glu Asn Tyr Arg Gly Ala Val Val

20 25 30

Leu Ala Asp Glu Ile His Met Phe Glu Gly Leu Arg Thr His Glu Lys

35 40 45

His Pro Asp Lys Ser Leu His Val Arg Asp Val Pro Thr Pro Glu Pro

50 55 60

Ala Pro Gly Glu Val Leu Val Ala Val Leu Ala Ser Ala Ile Asn Tyr

65 70 75 80

Asn Thr Val Trp Ser Ala Leu Phe Glu Pro Ile Pro Thr Phe His Phe

85 90 95

Leu Ala Arg Tyr Gly Arg Thr Gly Ala Ala Ala Lys Arg His Asp Leu

100 105 110

Pro Tyr His Val Val Gly Ser Asp Leu Ala Gly Val Val Leu Arg Thr

115 120 125

Gly Asp Gly Val Val Asp Trp Lys Pro Gly Asp Arg Val Val Ala His

130 135 140

Cys Leu Ser Val Asp Leu His Thr Pro His Gly His Asp Asp Ala Met

145 150 155 160

Leu Asp Pro Glu Gln Arg Ile Trp Gly Phe Glu Thr Asn Phe Gly Gly

165 170 175

Leu Ala Glu Ile Ala Leu Val Lys Ala Asn Gln Leu Met Pro Lys Pro

180 185 190

Ala His Leu Thr Trp Glu Glu Ala Ala Gly Ser Gly Leu Val Asn Ser

195 200 205

Thr Ala Tyr Arg Gln Leu Val Ser Arg Asn Gly Ala Arg Met Lys Gln

210 215 220

Gly Asp Val Val Leu Ile Trp Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Ser Tyr

225 230 235 240

Ala Thr Gln Leu Val Leu Asn Gly Gly Gly Ile Pro Val Cys Val Val

245 250 255

Ser Asp Glu Arg Lys Ala Asp Leu Val Arg Ala Gln Gly Ala Glu Leu

260 265 270

Val Ile Asn Arg Ala Ala Glu Gly Tyr Arg Phe Trp Thr Asp Asp Asp

275 280 285

Arg Gln Asp Pro Ser Glu Trp Lys Arg Phe Gly Lys Arg Ile Arg Glu

290 295 300

Leu Thr Gly Gly Asp Asp Pro Asp Ile Val Phe Glu His Pro Gly Arg

305 310 315 320

Ala Thr Phe Gly Ala Ser Val Tyr Val Thr Arg Arg Gly Gly Thr Ile

325 330 335

Val Thr Cys Ala Ser Thr Ser Gly Tyr Glu His Ala Phe Asp Asn Arg

340 345 350

Tyr Leu Trp Met Ser Val Lys Arg Ile Ile Gly Thr His Phe Ala Asn

355 360 365

Tyr Arg Glu Ala Trp Glu Ala Asn Arg Leu Ile Cys Lys Gly Met Val

370 375 380

His Pro Thr Leu Ser Val Thr Tyr Pro Leu Asp Asp Val Gly Ser Ala

385 390 395 400

Val Arg Asp Val His Arg Asn Val His Asn Gly Lys Val Gly Val Leu

405 410 415

Cys Leu Ala Pro Glu Glu Gly Trp Gly Val Thr Asp Pro Glu Met Arg

420 425 430

Glu Lys His Leu Ala Glu Ile Thr Arg Phe Arg Ala Pro Gln Val Ala

435 440 445

Ala Glu Gly Val Arg

450

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fkbS-F’

<400> 5

aaccactcca caggaggacc catatgatgc gtgacattct tcaggcgt 48

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fkbS-R’

<400> 6

tcaccgcacc ccctcgg 17

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fkbS-A2BE-F’

<400> 7

ccgagggggt gcggtgagtg cgcaaggtgc tcatcg 36

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fkbS-A2BE-R’

<400> 8

tatgacatga ttacgaattc gatatctcag cgccagctgt gcg 43

<210> 9

<211> 2226

<212> DNA

<213> Streptomyces coelicolor

<400> 9

atgaccggaa cgaactcacc ccgcgtctcc cgcgcctccc gcctctcccg cgcctcggcc 60

cgtgagctga tcgaggccgt cgtcgacccc ggcagctggt acggctggga cgagccggtg 120

gagatcacta cggaggaccc cgactaccgg gccgacctgg agcgggctcg ggagcgcacc 180

gggctggacg agtcggtcat caccggtgag gggcgtatcg aggggcgccg ggtggcgctg 240

gtcgcctgcg agttccgctt cctggccggt tcgataggcg tcgccgcggg ggagcggctg 300

gtacgggccg tggagcgggc cacggcggag cgactgccgc tgctggcgac accggcgtcg 360

ggcgggaccc ggatgcagga gggtacggtc gcgttccttc agatggtgaa ggtggccgcg 420

gcgatcacgg accacaaggc ggcgggcctg ccgtacctcg tgcacctccg ccaccccacg 480

accggcggcg tcctcgcctc ctggggctcc ctcggccacg tcaccgccgc cgagccgggc 540

gccctcatcg gcttcatggg cccgcgggtg cacgaggccc tgtacgggga ggagttcccg 600

cccggtgtgc agaacgccga gaacctgatg caccacggcc tgatcgacgc ggtcctcccg 660

ctgagccgcc tgtcgggcgt ggcggcacgc gtgctgaggg ttctctgcgc gggcgacgcc 720

gcgaccggcc acgccacggg tgcggagacc ggggcgcccc cgccctccgc ctccacctcc 780

ggcgccgggc cggaggcgga ggcgctcggg cgaggtgcgg acaccgcggc cgggcccgcc 840

ccgacggcgg gtgcggcact cgcccccgac cagccgaggg acgcaggcgg ggtctccacc 900

gggcccgcgc ccggcacacc gggtgacgcg cctggcggga cgccggggcg acgtggggat 960

gtcgcggccg ggggtggccc gacggtcgcg cgtggcgccg agcgggacgc gagtggtgcc 1020

gatgctgcgg aggcggggtc ggcggccccg acgtcggccc cgccttccgg cgctctgccc 1080

ggggcgggag cgggcggtcg acgtgggggt tcgtcggccg ggggtggccc gacggtcgcg 1140

cgtggcgccg agcgggacgc gagtggtgcc gatgccgtgg aggcggggtc ggcggccccg 1200

acgtcggccc cgccttccgg cgctctgccc agggcgggag cgggcggtcg gcgtggggat 1260

gtcgcggccg ggggcgccgg gggcgtgggg cccgcgcacg atcaggccgg ggtcactgcc 1320

ttcgccgggg cgggaggggg cggcggggta cccgacgacg cagaggtggg ggcggcggtg 1380

ccgtccgccg aggagtcgat ccgggcgtcg cggcgggccg aacggcccgg tttgcgggat 1440

ctgctgcggg tcgccgccga ggatgtgagc ccgctcagcg gcacgggggc cggcgagcac 1500

gatcccgggt tgttgctggc gctcgcccgc gtcgggggga cgccctgcgt cgtcctcggc 1560

cacaaccggc gcagtgcccg taagggcgac acggccgacg ggccggggga ggggcaggcg 1620

ctggggccgg cggggttgcg gaccgcgcgg cgcgggatgc ggatcgccgc cgagctcggg 1680

ctgccgctgc tcaccgtcat cgacaccgcg ggcgccgcgc tcagccgcga ggccgaggag 1740

ggcgggctcg ccggggagat agcgcggtgc ctcgccgaca tggtgaccct gcccgcgccc 1800

accctctgcc tgctgctcgg ccagggcgcc ggtggcgccg cgctcgcgct gctgcccgcc 1860

gaccgggtcg tcgcggcgcg ccacgcctgg ctgtcgccgc tgccgccgga gggcgcctcc 1920

gcgatcctcc accgcaccac ggagcgggcg tacgaggtcg ccgcccgcca gggcgtacgc 1980

tccgccgacc tcctcgccca gggcatcgtc gaccggatcg tggaggagga cggggagacg 2040

gaccgggaca ccgcccggac ccctgacgct tcccgggccg gggacgcttc ccgcaccgcc 2100

gacgccttcc tcggccgcct cggccgtctc ctgggcgacg aactcgccgc gctgcgcgcc 2160

caggacccgg acgagcggct cgctgcgcgc cgcgtccgcc agcgcggcat cgggctaccc 2220

cgttga 2226

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> acc-F

<400> 10

aaccactcca caggaggacc catatgatga ccggaacgaa ctcaccc 47

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> acc-R

<400> 11

tggaaagacg acaaaacttt ggcgcgcctc aacggggtag cccgatg 47

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fkbL-F

<400> 12

aaccactcca caggaggacc catatgatgc agaccagggt cctgcg 46

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> fkbL-R

<400> 13

tggaaagacg acaaaacttt ggcgcgcctc accatggcag cgagtacg 48

Claims

1.一种生产子囊霉素的基因工程菌，其特征在于，其为天然生产子囊霉素的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中过表达accA2、accB和accE基因的工程菌；所述accA2、accB和accE基因编码的氨基酸序列的NCBI登录号分别为NP_629074.1、NP_629669.1和NP_629670.1。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述accA2、accB和accE基因的核苷酸序列的GeneID分别为1100362、1100975和1100976。

3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为在所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌的基因组中整合了accA2、accB和accE基因的工程菌，或所述基因工程菌为包含含有accA2、accB和accE基因的重组表达载体的工程菌。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述整合的位点为attB位点。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述整合的位点为ΦC31 attB位点。

6.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述accB位于accE上游，所述accA2位于所述accB上游；

和/或，所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌为吸水链霉菌ATCC 14891。

7.如权利要求1～6任一项所述的基因工程菌，其特征在于，其是在天然生产子囊霉素的吸水链霉菌中还过表达fkbS基因的工程菌；所述fkbS基因编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述fkbS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

9.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌在所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌的基因组中整合了fkbS基因。

10.一种制备如权利要求1～9任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

1)构建过表达accA2、accB和accE基因的重组表达载体；

2)将构建的重组表达载体转化到中间宿主菌；

3)将带有重组表达载体的所述中间宿主菌与天然生产子囊霉素的吸水链霉菌进行接合培养。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体的骨架为质粒pSET-152；和/或，所述的中间宿主菌为大肠杆菌；和/或，所述天然生产子囊霉素的吸水链霉菌为吸水链霉菌ATCC 14891；和/或，所述的接合培养为在MS培养基培养，培养温度为28℃；和/或，所述重组表达载体还包括fkbS基因。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的中间宿主菌为大肠杆菌ET12567。

13.一种制备子囊霉素的方法，其特征在于，包括将如权利要求1～9任一项所述的基因工程菌发酵，从发酵液中获得子囊霉素。

14.如权利要求13所述的制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述发酵的发酵培养基包括以下组分：甘油6％、酵母提取物2％、黄豆饼粉2％、磷酸二氢钾0.02％、微量元素；所述百分比为各组分占所述发酵培养基的质量体积百分比，单位为克/毫升。

15.如权利要求14所述的制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述微量元素包括以下组分：FeSO₄·7H₂O 0.001％、ZnSO₄·7H₂O 0.001％、CuSO₄·5H₂O 0.00001％，所述百分比为各组分占所述发酵培养基的质量体积百分比，单位为克/毫升；

和/或，所述发酵培养基的pH值为6.5±2；

和/或，所述发酵的温度为25～30℃；和/或，所述发酵的培养时间为6～10天；和/或，所述发酵的培养转速为180～250rpm。

16.如权利要求15所述的制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28℃；所述发酵的培养时间为8天；和/或，所述发酵的培养转速为200rpm。

17.如权利要求13-16任一项所述的制备子囊霉素的方法，其特征在于，其还包括先将所述基因工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，然后将所得培养物转接至发酵培养基。

18.如权利要求17所述的制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述种子培养基的培养温度为25～30℃；所述种子培养的时间为1～2天；和/或，所述种子培养的转速为180～250rpm；和/或，所述种子培养基的pH值为7.0±2；和/或，所述转接的接种量为5～20％。

19.如权利要求18所述的制备子囊霉素的方法，其特征在于，所述种子培养基的培养温度为28℃；和/或，所述种子培养的转速为200rpm；和/或，所述转接的接种量为10％。

20.如权利要求1～9任一项所述的基因工程菌在制备子囊霉素中的用途。