CN117603930B - 一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌，属于酶工程技术领域。本发明鉴定了粘着箭菌的西罗血红素合酶序列，筛选出了影响西罗血红素合酶活性的关键位点，并对相关位点进行了氨基酸突变，获得了还原活性降低的西罗血红素合酶突变体P137L。在粘着箭菌中原位表达该西罗血红素合酶突变体，可使改造后的粘着箭菌VB12效价相比原始菌株提升21.0%，具有显著的进步。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达突变型西罗血红素合酶的重组菌，属于酶工程技术领域。
背景技术
维生素 B12 (又称钴胺素，VB12 ) 是人体生长发育的必需营养素，是一类含有钴的咕啉类化合物总称，最早作为“抗恶性贫血因子”于1926年被发现。可以促进红细胞生长发育、叶酸的利用，或者以辅酶的形式参与催化体内的、氨基酸、脂肪酸代谢等多种重要的反应。维生素B12的分子结构极为复杂，其全化学合成需要多达70余个的反应步骤，且成本昂贵，故目前几乎都是通过微生物发酵的方式来生产维生素B12。目前工业化生产中有厌氧和好氧两种途径，最常用的菌株有：厌氧发酵的费氏丙酸杆菌（Propionibacteriumfreudenreichii）和谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）；好氧发酵的脱氮假单胞菌（Pseudomonas denitrificans）。我们实验室目前使用粘着箭菌（Ensifer adhaerens）来生产维生素 B12。为了较少代谢副产物对维生素 B12产量的影响，拟应用基因弱化技术来影响粘着箭菌中维生素 B12的生物合成。
在B12代谢通路中，西罗血红素是代谢副产物，生产菌株积累西罗血红素会相应的减少B12的积累，如果能减少西罗血红素的合成，就能有更多的原料用来合成B12。西罗血红素在生物中的主要作用是亚硝酸还原酶的辅基，会将6个电子转移到底物亚硝酸上，而CysG（西罗血红素合酶）是合成西罗血红素的必要基因，它的高酶活会使西罗血红素积累增加，从而使B12产量受限。
发明内容
本发明提供了突变型西罗血红素合酶CysG，在出发序列的基础上，具有第137位的氨基酸突变。
在一种实施方式中，所述突变是在SEQ ID NO.1所示出发序列的基础上，将第137位脯氨酸突变为亮氨酸，获得的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，所述基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了表达所述突变型西罗血红素合酶的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞为粘着箭菌（Ensifer adhaerens）。
在一种实施方式中，所述粘着箭菌为粘着箭菌（Ensifer adhaerens）CGMCCNo.23306，已公开于公开号为CN114231450A的专利申请文件中。
在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以粘着箭菌CGMCC No.23306为宿主，表达SEQ ID NO.3所示的西罗血红素合酶。
本发明还提供了一种提高粘着箭菌维生素B12生产能力的方法，所述方法是将粘着箭菌的西罗血红素合酶氨基酸序列的第137位脯氨酸突变为亮氨酸。
在一种实施方式中，所述粘着箭菌为粘着箭菌CGMCC No.23306。
在一种实施方式中，所述西罗血红素合酶的出发序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述突变型西罗血红素合酶和/或所述重组微生物细胞在生产维生素B12中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述突变型西罗血红素合酶在粘着箭菌中表达，并利用所述微生物发酵生产维生素B12。
本发明还提供一种生产维生素B12的方法，是将所述重组微生物细胞在发酵培养基中发酵一段时间。
在一种实施方式中，所述发酵是在含赤砂糖、甜菜碱、磷酸氢二铵、硫酸铵、七水硫酸锌、5,6-DMBI、六水氯化钴、三氯化铁的培养基中，于30~35℃发酵至少144小时。
在一种实施方式中，所述发酵是在32℃，250 rpm发酵至少144小时。
在一种实施方式中，用于发酵的培养基含赤砂糖、甜菜碱、磷酸氢二铵、硫酸铵、七水硫酸锌、5,6-DMBI、六水氯化钴、三氯化铁的培养基中，于30-34℃，230-270rpm条件下发酵至少144小时。
本发明还提供了所述重组微生物细胞或所述方法在生产维生素B12或含维生素B12的产品中的应用。
有益效果：
（1）本发明鉴定了粘着箭菌来源的西罗血红素合酶（CysG1、CysG2，分别具有SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列），并对西罗血红素合酶的氨基酸结构进行了分析，筛选出了影响西罗血红素合酶活性的关键位点，并对相关位点进行了氨基酸突变，获得了还原活性降低的西罗血红素合酶突变体P137L。
（2）本发明在粘着箭菌中原位表达了西罗血红素合酶突变体，使改造后的粘着箭菌VB12效价相比原始菌株提升了21.0%，具有显著的进步。
附图说明
图1为西罗血红素合成途径及cysG催化路径；
图2为沙门氏菌、大肠杆菌、粘着箭菌基因组、粘着箭菌质粒1、巨大芽孢杆菌、酿酒酵母的CysG基因N端比对结果。
具体实施方式
培养基：
种子培养基：甜菜糖蜜30g/L；5,6-DMBI 0.03g/L；磷酸氢二铵2g/L；硫酸铵1g/L；七水硫酸锌0.015g/L；六水氯化钴0.004g/L；消泡剂0.8g/L。
发酵培养基：赤砂糖 50 g/L，甜菜碱10g/L，磷酸氢二铵 1g/L；硫酸铵 5 g/L；七水硫酸锌 0.007g/L ；5,6-DMBI 0.005g/L；六水氯化钴0.015g/L；三氯化铁 2g/L。
检测方法：
OD600的测定方法：将 2mL 发酵液以 12000 rpm的转速离心 10 min，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 2 mL 的 0.9% NaCl的缓冲液中。用分光光度计在 600 nm 处下测定生物量用于测量细胞浓度，即为OD600。
VB12浓度的测定：用液相色谱外标法检测发酵液中的VB12浓度。取发酵液5mL于25mL具塞比色管中，加入0.5 mL醋酸和1ml的8%亚硝酸钠，用长针头刮一点消泡剂（5-10mg）于比色管下部，将产生的气泡晃入液面以下。轻轻混匀后沸水浴30 min，待样品冷却至室温后，用纯化水定容至比色管25 mL刻度线处，摇匀。用0.45μm的微孔滤膜过滤至棕色液相小瓶中，液相检测。
检测条件为：色谱柱C18（EcLipse XDB-C18,5μm,4.6×150mm）；流动相：水:乙腈=90:10(v/v), 流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL；检测波长：550nm。
VB12效价=检测值×50（稀释倍数）。
实施例1 CysG保守位点确定及突变片段的构建
通过比对沙门氏菌，大肠杆菌，粘着箭菌，巨大芽孢杆菌，酿酒酵母的CysG氨基酸序列，在粘着箭菌（Ensifer adhaerens）CGMCC No.23306（已公开于公开号为CN114231450A的专利申请文件）的西罗血红素合酶序列中找出了6个高度保守位点。结合保守位点分析和PAM位置确定，共选择了4个突变位点进行尝试，分别是CysG1（SEQ ID NO.1所示）上的L74，P137；CysG2（SEQ ID NO.2所示）上的G139，P142。将分别构造单碱基编辑质粒PCZL-CBE-CysG1-L74，PCZL-CBE-CysG1-P137，PCZL-CBE-CysG2-G139，PCZL-CBE-CysG2-P142，来进行着四个位点的氨基酸突变。其中，将SEQ ID NO.1所示CysG1第137位脯氨酸突变为亮氨酸获得的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该突变体的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
质粒构建：以基因编辑质粒PCZL-CBE-1（SEQ ID NO.5所示）/PCZL-CBE-2（SEQ IDNO.6所示）为模板，构建相对应位点的单碱基编辑质粒。
表1 扩增片段信息
表2引物序列
实施例2 表达突变酶的重组菌的构建
将实施例1得到的片段经电泳跑胶、回收（苏州优益兰迪生物科技有限公司的UEDNA凝胶回收试剂盒）后，使用生工Ready-to-Use Seamless Cloning Kit将回收到的片段50℃，25分钟处理后化转至实验室保藏的大肠杆菌感受态细胞中，在含20mg/L氯霉素抗性平板上37℃过夜培养，利用验证筛选阳性克隆，获得单碱基编辑质粒，即PCZL-CBE-CysG1-L74，PCZL-CBE-CysG1-P137，PCZL-CBE-CysG2-G139，PCZL-CBE-CysG2-P142。
质粒转化：使用电击转化的方法将构建好的重组质粒PCZL-CBE-CysG1-L74，PCZL-CBE-CysG1-P137，PCZL-CBE-CysG2-G139，PCZL-CBE-CysG2-P142导入到粘着箭菌（Ensiferadhaerens） CGMCC No.23306中。
感受态制备：在前一天完成按照1:50接种，使用TYC培养基30℃，200rpm培养过夜。第二天早上在OD600达到0.8左右时取出，将摇瓶放在冰上预冷后，分装到50ml离心管中，4000rpm，4℃，10分钟离心取沉淀。倾倒上清后，用少量冰浴过的0.9%生理盐水回溶后用20ml的0.9%生理盐水重悬菌体2次，同样4000rpm，4℃，10分钟。再用预冷的10%甘油5ml重悬2次，最后用1ml（根据菌体量而定，可分装。菌浓应达到1×109~3×109/ml）10%甘油回溶后分装在1.5ml离心管中，每管体积为100ul。
电击转化：从-80℃冰箱取出感受态细胞放置在冰上解冻，等待2-5分钟融化后加入构建成功的质粒 400ng，混匀后在冰上放置20-30分钟。将混合物转移到提前预冷的电击杯中，延壁加入，轻轻敲击使混合物落到电转杯的底部，防止有气泡产生。将电转杯外壁的水分擦拭干净，将电击杯放到仪器中，电击一次，电压常数2.5 kV；时间常数4ms。电击结束后迅速取出电转杯，吸取1ml的复苏液（TYC）到电转杯中，混匀后将混合液完整的转移到离心管中，混匀。离心管在30℃，200rpm的条件下复苏3小时。最后离心浓缩，使用TYC平板涂布（含氯霉毒），30℃培养直至得到单菌落转化子，一般约需3-5天。
单菌落转化子测序验证：使用基因组上的引物对PCYW-CysG1G-F，PCYW-CysG1G-R对转化子的基因组进行扩增后，经由测序得到正确编辑的菌株，分别命名为PCJZ-CysG1-L74F，PCJZ-CysG1-P137L，PCJZ-CysG2-G139N，PCJZ-CysG2-P142L。
实施例3 表达突变酶的重组菌的摇瓶发酵
挑取新鲜活化的实施例2构建的重组菌株PCJZ-CysG1-L74F，PCJZ-CysG1-P137L，PCJZ-CysG2-G139N，PCJZ-CysG2-P142L和粘着箭菌（Ensifer adhaerens） CGMCC No.23306单克隆接种在含有5ml种子培养基的试管中，30℃，200rpm，培养20小时。然后将上述种子液按照10%接种量转接至含有25ml发酵培养基的250ml挡板三角瓶中，30℃，250rpm，培养144h后测定细胞质量（OD600）、VB12。
摇瓶144小时后，4个突变菌株的OD600与效价如表3所示，其中OD600与效价已取3瓶平均数。
表3 不同菌株的发酵结果
从折后效价（效价/OD600）可以看到，CysG氨基酸突变后可使VB12效价提升4.6%-21.0%，证明尿卟啉原III经CysG突变体催化后，还原活性降低，可能会导致流向前钴啉2（Precorrin-2）的通量上升，最后引起VB12效价提升。表达上述突变体的重组菌中效价提升效果最好的是菌株PCJZ-CysG1-P137L，提升幅度达到21.0%。
对比例1：
具体实施方式同实施例1~3，区别在于，还对CysG1构建了G85N突变，结果显示，表达该突变体的重组菌VB12效价相比出发菌株降低9.2%。
表4 含不同突变的菌株的发酵结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.突变型西罗血红素合酶，其特征在于，在SEQ ID NO.1所示出发序列的基础上，将第137位脯氨酸突变为亮氨酸。
2.编码权利要求1所述突变型西罗血红素合酶的基因。
3.表达权利要求1所述突变型西罗血红素合酶的重组微生物细胞。
4.根据权利要求3所述的表达权利要求1所述突变型西罗血红素合酶的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为粘着箭菌(Ensifer adhaerens)。
5.根据权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，以粘着箭菌CGMCC No.23306为宿主，表达SEQ ID NO.3所示的西罗血红素合酶。
6.一种提高粘着箭菌维生素B12生产能力的方法，其特征在于，将粘着箭菌的西罗血红素合酶氨基酸序列的第137位脯氨酸突变为亮氨酸，所述西罗血红素合酶氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粘着箭菌为粘着箭菌CGMCCNo.23306。
8.一种生产维生素B12的方法，其特征在于，将权利要求3～5任一所述的重组微生物细胞在含赤砂糖、甜菜碱、磷酸氢二铵、硫酸铵、七水硫酸锌、5,6-DMBI、六水氯化钴、三氯化铁的培养基中，于30～35℃发酵至少144小时。
9.权利要求3～5任一所述的重组微生物细胞，或权利要求6～8任一所述的方法在生产维生素B12或含维生素B12的产品中的应用。
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