CN117887699A - 来源于莫纳杆菌的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其用途 - Google Patents
来源于莫纳杆菌的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种来源于莫纳杆菌(CandidatusMoanabactertarae)的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶、其突变体以及用途。本发明首次提供了来源于莫纳杆菌(CandidatusMoanabactertarae)的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，该D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶及其突变体可用于高效催化D‑阿洛酮糖的合成。
Description
技术领域
本发明涉及功能酶技术领域，具体涉及一种来源于莫纳杆菌(CandidatusMoanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其突变体、其编码核酸分子、重组载体、重组细胞，以及该D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的制备方法和在制备D-阿洛酮糖中的用途。
背景技术
D-阿洛酮糖是D-果糖C3位置的差向异构体，是目前研究最热门的稀少糖，已经被美国FDA确认为普遍公认安全(GRAS)，在医药和食品等领域具有巨大的应用价值和市场前景。D-阿洛酮糖甜度约为蔗糖的70％，但能量值却只有蔗糖的10％，是理想的蔗糖替代品，而且具有抑制脂肪堆积，预防肥胖的效果。同时，在食品体系中添加D-阿洛酮糖可以起到提高凝胶性的作用，并且能与食品体系中的蛋白质发生美拉德反应而产生良好的化学风味。D-阿洛酮糖可通过化学法合成，但存在许多弊端，例如会产生严重的化学污染，形成不必要的副产物，反应步骤繁琐，反应条件苛刻等。相比于化学合成，具有生态友好性和高度特异性的酶法生物转化是更具优势的D-阿洛酮糖生产策略。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以以D-果糖为原料，通过C3位的差向异构一步合成D-阿洛酮糖，但目前大多数D-阿洛酮糖3-差向异构酶仍存在酶活低，热稳定性差等问题，限制了工业化应用。因此，有必要开发高酶活和热稳定性好的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
发明内容
本发明目的在于提供一种来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其突变体，旨在解决现有的D-阿洛酮糖3-差向异构酶在催化D-果糖时存在的酶活性和稳定性不高的问题。
为了实现上述发明目的，本发明从莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)中获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并进一步对其进行突变处理，得到在酶活性、转化率和稳定性方面均显著改善的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。
具体地，第一方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供了编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
第四方面，本发明提供了编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
第五方面，本发明提供了一种重组载体，其包含编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的核酸分子。
第六方面，本发明提供了一种重组细胞，其包含本发明所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述重组细胞诱导产生本发明提供的所述来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体。
第七方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的制备方法，包括：
对本发明提供的所述重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
从所述培养物中分离所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶和/或所述突变体。
第八方面，本发明提供了本发明所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶、所述核酸分子、所述突变体、所述重组载体、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体在制备D-阿洛酮糖中的用途。
第九方面，本发明提供了一种D-阿洛酮糖的制备方法，包括：
以本发明所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶、所述突变体、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体作为催化剂，对D-果糖进行催化反应，得到D-阿洛酮糖。
在一些实施方案中，所述催化反应的初始pH为6-8。
在一些实施方案中，所述催化反应的反应温度为50-60℃。
在一些实施方案中，所述催化反应的反应时间为3-10h。
在一些实施方案中，所述催化反应中，所述D-果糖的终浓度为300-700g/L，金属离子的终浓度为0.1-1mM，所述金属离子选自镁离子、钴离子、锰离子中的至少一种，优选镁离子。
本发明首次提供了一种来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，并进一步对其进行突变处理得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。本发明提供的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其突变体可以高效催化D-阿洛酮糖合成，对D-阿洛酮糖的生产和应用具有重要意义。同时，所述突变体在催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖时，酶活可达132.5U/mL，是原始酶的1.3倍；在50℃下的半衰期是560min，是原始酶的3.3倍，有利于提高D-阿洛酮糖的产量。
附图说明
图1为D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化合成D-阿洛酮糖的反应图；
图2为D-果糖的液相谱图；
图3为D-阿洛酮糖的液相谱图；
图4为D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化反应过程液相谱图。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
MELSCCIWALSESPGNALEQVSFAGFKSIDVCPGFLDTYEQIVRSQALELDVSCFGASFGLPDGISLDHEETFLRSQAVSYLEQGIQTSGELGANTVYVVPDKSEDRRNLSRYAHSLTLAADQAAAFGVKLCVEHFPGSALSTALGTIQYLRNIDHPNLFLLLDLGHLQISDENPAAIIDAAGSLLGYVHLDDNDGKDDLHLPLCDGILNLETLETTFQALYDNEYVGNVSLELSPNLDDPLDGLIRSRRVVEEFLNR
本发明实施例提供的来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以是天然、重组或合成的活性多肽。该活性多肽可以是天然纯化的产物、化学合成的产物，或是使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中产生的产物。
在一些实施方案中，所述来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如E.coliBL21(DE3))得到重组基因工程菌，然后将该重组基因工程菌进行诱导表达得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
相应地，编码该来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明实施例提供的所述核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。
编码来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核酸分子的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：
atggaattatcctgttgcatatgggcattgtcagagtctccgggaaatgcactcgagcaagtctcgtttgccggatttaagtcaatcgatgtttgtcctggttttttggatacctatgagcagattgtccggtctcaggctcttgaactagatgtctcctgctttggcgcatcctttggacttccggatggaatttccttggatcatgaggaaacttttctgcgaagccaagcggtttcctaccttgaacaagggatccaaactagtggtgaattgggcgctaatactgtctatgtcgttcccgataagtcggaagatcgcaggaatctttcacgctatgctcattcgcttaccttagcagcagatcaagctgcggcctttggggtaaaactgtgcgtggagcattttcctggaagcgcgctctcaaccgctctcggcactattcaatatttgagaaacatcgatcatcccaatctttttcttcttctggatctcggtcacttgcaaatatccgatgaaaatcctgccgccatcattgatgctgccggttctcttctcggatacgttcatcttgacgacaacgatgggaaagacgatttgcatcttcccctttgcgatgggatcttaaatctggaaacattggagactacttttcaagctctttatgacaatgagtatgtcggcaacgtcagcttagagctaagcccaaacctcgatgaccctctcgatggcctaatccgcagccgtcgagtagttgaggagtttctgaataggtga
本发明实施例还提供了来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
MELSCCIWALSESPGNALEQVSFAGFKSIDVCPGFLDTYEQIVRSQALELDVSCFGASFGLPDGISLDHEETFLRSQTVSYLEQGIQTGGELGANTVYVVTDKSEDRRNLSRYAHSLTLAADQAAAFGVKLCVERFPGSALSTALGTIQYLRNIDHPNLFLLLDLGHLQISDENPAAIIDAAGSLLGYVHLDDNDGKDDLHLPLCDGILNLETLETTFQALYDNEYVGNVSLELSPNLDDPLDGLIRSRRVVEEFLNR
所述突变体可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。
在一些实施方案中，上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如E.coli BL21(DE3))得到重组基因工程菌，然后将该重组基因工程菌进行诱导表达得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体。
相应地，编码该来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
编码来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体的核酸分子的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
atggaattatcctgttgcatatgggcattgtcagagtctccgggaaatgcactcgagcaagtctcgtttgccggatttaagtcaatcgatgtttgtcctggttttttggatacctatgagcagattgtccggtctcaggctcttgaactagatgtctcctgctttggcgcatcctttggacttccggatggaatttccttggatcatgaggaaacttttctgcgaagccaaacggtttcctaccttgaacaagggatccaaactggtggtgaattgggcgctaatactgtctatgtcgttaccgataagtcggaagatcgcaggaatctttcacgctatgctcattcgcttaccttagcagcagatcaagctgcggcctttggggtaaaactgtgcgtggagcgttttcctggaagcgcgctctcaaccgctctcggcactattcaatatttgagaaacatcgatcatcccaatctttttcttcttctggatctcggtcacttgcaaatatccgatgaaaatcctgccgccatcattgatgctgccggttctcttctcggatacgttcatcttgacgacaacgatgggaaagacgatttgcatcttcccctttgcgatgggatcttaaatctggaaacattggagactacttttcaagctctttatgacaatgagtatgtcggcaacgtcagcttagagctaagcccaaacctcgatgaccctctcgatggcctaatccgcagccgtcgagtagttgaggagtttctgaataggtga
本发明实施例提供的所述突变体的核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。
在一些实施方案中，所述突变体的核酸分子是以莫纳杆菌(CandidatusMoanabacter tarae)的基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到扩增片段后，在该扩增片段的基础上利用易错PCR方法获得。
本发明实施例还提供了一种重组载体，其包括编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的核酸分子。具体地，所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因。
在一些实施方案中，所述重组载体为pET-CMDAE或pET-ΔCMDAE26，分别是将编码上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核酸分子或上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体的核酸分子替换pET-28a(+)的XbaI和BamHI酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
本发明实施例还提供了一种重组细胞，其包括上述的重组载体。
在一些实施方案中，所述重组细胞诱导产生本发明提供的所述来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体。
在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法如下：
将所述重组载体转化到宿主细胞中，经诱导，得到表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体。
进一步地，所述重组载体为pET-CMDAE或pET-ΔCMDAE26，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
所述重组细胞可以是重组基因工程菌。重组基因工程菌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体时所使用的培养基可以是本领域可使重组基因工程菌生长并产生本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的培养基，优选LB培养基。
在一些优选实施方案中，所述重组细胞为重组菌W和重组菌26，
本发明对重组细胞或重组基因工程菌的培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使其正常生长并表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体即可。
在一些优选实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括：
(i)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因cmdae的扩增；
(ii)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体的基因Δcmdae的获得；
(iii)重组表达质粒pET-CMDAE和pET-ΔCMDAE的构建；
(iv)将重组表达质粒pET-CMDAE和pET-ΔCMDAE转化至宿主细胞中；
(v)经抗性培养基筛选得到阳性克隆。
本发明实施例还提供了一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的制备方法，包括：
1)对所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
2)从所述培养物中分离所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶和/或所述突变体。
本发明D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的制备方法中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的方法均为本领域的常规方法。
本发明实施例还提供了来源于莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体、所述核酸分子、所述重组载体、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体在制备D-阿洛酮糖中的用途。
本发明实施例还提供了一种D-阿洛酮糖的制备方法，包括：
以所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶、所述突变体、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体作为催化剂，对D-果糖进行催化反应，得到D-阿洛酮糖(如图1所示)。
在一些实施方案中，所述催化反应的反应温度为50-60℃，例如50℃、55℃、60℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选50℃；初始pH为6-8，可以用磷酸盐缓冲液(例如50mM的PBS)进行调整，例如调到pH 7.0。
在一些实施方案中，所述催化反应的反应时间为3-10h，例如3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选3h。
D-果糖作为催化反应的底物，在一些实施方案中，其终浓度为300-700g/L，例如300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选500g/L。
所述催化反应中还包含金属离子作为D-阿洛酮糖3-差向异构酶的辅助因子，所述金属离子选自镁离子、钴离子、锰离子中的至少一种，优选镁离子。所述金属离子的浓度为0.1-1mM，例如0.1mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选0.8mM。
在一些实施方案中，所述催化反应包括将本发明所述的重组细胞对D-果糖进行催化反应，以得到D-阿洛酮糖。
具体地，可以以所述重组细胞作为催化剂进行全细胞催化以生产D-阿洛酮糖，催化剂的用量为5-10mg细胞/g D-果糖，优选8mg细胞/g D-果糖。
应当理解的是，本发明提供的所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用；还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例来源于莫纳杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其用途的进步性能显著地体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物学领域常规的实验方法进行，包括但不限于M.R.格林所著《分子克隆实验指南》[Molecular Cloning:ALaboratory Manual]、Robert·F·Weaver所著《分子生物学》[Molecular Biology]等所述的实验方法，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
候选莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)在文献“Julian,Vosseberg,Joran,et al.Draft Genome Sequence of"Candidatus Moanabacter tarae,"Representing a Novel Marine Verrucomicrobial Lineage.[J].Microbiologyresource announcements,2018.”中已公开，公众可从万华化学集团股份有限公司获得。
pET-28a(+)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号为B540183。
实施例1：D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因序列的获得
(11)提取候选莫纳杆菌(Candidatus Moanabacter tarae)的基因组DNA；
(12)以步骤(11)获得的基因组DNA为模板，以引物1(5'-tctagaatggaattatcctgttgcatatgggca-3'，SEQ ID NO:5)和引物2(5'-ggatcctcacctattcagaaactcctcaactac-3'，SEQ ID NO:6)为引物对进行PCR，获得含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的PCR扩增片段。其中，D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：利用易错PCR技术获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因序列
易错PCR方法是在标准PCR的基础上改变和提高聚合酶的自然错误率。Taq聚合酶是最为常用的易错PCR聚合酶。与基本的PCR反应(1.5mM)相比，易错PCR反应通常含有更高浓度的氯化镁(7mM)，以稳定非互补对，除此之外还可以添加氯化锰来增加错误率。本实施例利用易错PCR技术，获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的突变体。
具体地，以实施例1的PCR扩增片段为模板，以引物1和引物2为引物按照如下反应体系进行易错PCR，共获得D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的96个突变体。
易错PCR反应体系：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg2+7mmol/L，加双蒸水至50μl。
实施例3：D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因(cmdae)的克隆和表达菌株的构建
(31)XbaI和BamHI双酶切实施例1获得的含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的PCR扩增片段，得到基因片段；XbaI和BamHI双酶切pET-28a(+)，得到载体片段；将基因片段和载体片段连接得到重组表达质粒，将其命名为pET-CMDAE，将该质粒送测序，结果与预期一致。
(32)将步骤(31)获得的重组表达质粒pET-CMDAE通过热激转入E.coli DH5α感受态细胞中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，培养得到相应的单克隆菌株，将其命名为H，再经过扩增质粒提取，得到pET-CMDAE质粒。将得到的质粒通过化学转化的方式转入E.coli BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，得到表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组菌W。
实施例4：D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因突变体的克隆和表达菌株的构建
按照实施例3的方法，利用实施例2获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的96个突变体分别构建重组质粒pET-ΔCMDAE1至pET-ΔCMDAE96，并获得表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的重组菌1-重组菌96。
实施例5：利用高通量筛选得到具有高效催化效率的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体
将实施例3和4中经过PCR验证正确的重组菌分别在5mL LB培养基中培养，同时加入IPTG诱导蛋白表达，16h后测量菌液的OD值，并用水稀释菌液使得OD值为2左右。将稀释后的菌液分别加入96孔板中进行反应，反应体系为200μL，包含10g/L D-果糖、0.8mM Mg2+并使用50mM PBS将初始pH调到7.0，在反应体系中按照1mg细胞/g D-果糖加入细胞。将制备的反应体系在50℃、120rpm的振荡混合器中孵育20min。反应结束后在95℃下加热5min后终止反应。
反应结束后，取50μl反应液加入50μl检测液(由PBS缓冲液(50mM，pH 7.0)配制含4mM NADH和0.5mg/mL核糖醇脱氢酶)，置于30℃恒温培养箱中反应10min，反应结束后在95℃下加热5min后终止反应，在选定340nm波长测定吸光度。
将吸光度最低的反应液所对应的菌株(重组菌26)进行质粒提取，提取后的质粒测序，得到编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因序列如SEQ ID NO:4所示，其编码的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。与SEQ ID NO:1所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列相比，该D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体具有如下突变：第78位的Ala突变为Thr，第89位的Ser突变为Gly，第101位的Pro突变为Thr，第135位的His突变为Arg。
实施例6：酶的制备及酶活测定
分别将实施例3获得的重组菌W和实施例4筛选得到的重组菌26进行扩大培养，扩大培养后将发酵液经离心(8000rpm，10min)、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到D-阿洛酮糖3-差向异构酶(原始酶)和其突变体(突变体酶)的冻干粉并于-80℃保存。
酶活力单位(U)的定义为：在实施例5的反应条件下，毎分钟催化生成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量或每分钟消耗1μmol D-果糖所需的酶量。
原始酶和突变体酶的酶活分别为101.9U/mL和132.5U/mL，相比于原始酶，突变体酶的酶活是其1.3倍。
在1L的三角瓶中加入500mL、500g/L D-果糖，0.8mM Mg2+离子，8mg细胞/g果糖，在50℃水浴锅反应，反应3h后突变体及其野生型转化D-果糖生产D-阿洛酮糖的转化率分别为32.1％和28.6％，突变体是野生型的1.12倍，野生型D-阿洛酮糖产量为143g/L，而突变体最终的D-阿洛酮糖产量可达到160.5g/L。
HPLC的具体方法如下：
(61)取1mL反应液在8000rpm的转速下离心1min；
(62)离心后小心吸取上清液100μL于2mL离心管中，并加入900μL超纯水；
(63)用1mL注射器吸取稀释后的发酵液上清600-800μL，并用0.22μm的滤膜进行过滤并加到相应的液相瓶中；
(64)将液相瓶放入样品架上，建好方法，开始分析。HPLC分析的具体程序如下：色谱仪：Agilent1260；检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)；进样：Agilent自动进样器；进样量10μL；色谱柱：Prevail Carbohydrate EScolumn-W(5μm，4.6×250mm，Agela Technologies，中国)；柱温40℃；流动相：70％乙腈；流速1mL/min。
其中，D-果糖的液相谱图如图2所示，D-阿洛酮糖的液相谱图如图3所示，D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化反应过程的液相谱图如图4所示。通过图4可以看出，D-果糖保留时间为16.46min，D-阿洛酮糖保留时间为17.52min。
实施例7：热稳定性测试
取少量实施例6中得到的原始酶和突变体酶的冻干粉，分别在50℃下孵育不同时间，按照实施例5中的反应条件进行反应测量残余酶活计算半衰期。两种酶的半衰期如表1所示。
表1
结果表明，突变体酶具有较好的热稳定性，在50℃下的半衰期由170min提升到了560min，提高了3.3倍。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.编码权利要求3所述突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2或权利要求4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体的制备方法，其特征在于，包括：
对权利要求6所述重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
从所述培养物中分离权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶和/或权利要求3所述突变体。
8.权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶、权利要求2所述核酸分子、权利要求3所述突变体、权利要求4所述核酸分子、权利要求5所述重组载体、权利要求6所述重组细胞和/或权利要求7所述制备方法制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体在制备D-阿洛酮糖中的用途。
9.一种D-阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，包括：
以权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶、权利要求3所述突变体、权利要求6所述重组细胞和/或权利要求7所述制备方法制备得到的D-阿洛酮糖3-差向异构酶或其突变体作为催化剂，对D-果糖进行催化反应，得到D-阿洛酮糖。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述催化反应的反应温度为50-60℃，初始pH为6-8，反应时间为3-10h；和/或
所述催化反应中，D-果糖的终浓度为300-700g/L，金属离子的终浓度为0.1-1mM，所述金属离子选自镁离子、钴离子、锰离子中的至少一种，优选镁离子。
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